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Cromatografia Líquida

Prof. Rafael SousaDepartamento de Química - [email protected]

Notas de aula: www.ufjf.br/baccan

Analítica V Aula 11: 05-03-13

PRÓXIMA AULA TEÓRICA (Eletroforese Capilar):12-03-13, às 08:15h, como Prof. Marcone

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL)em Inglês

Interação diferenciada dos componentes da amostra entre

FASE ESTACIONÁRIA e uma FASE MÓVEL

sólido

oulíquido

líquidoCrom. líquida (CL)

Uma das diferenças entre a CG e a CL são as configurações experimentais:

Sólido

líquido sobre um sólido

FASEESTACIONÁRIA

CONFIGURAÇÃOEXPERIMENTAL

PLANAR

COLUNA

Ex de interação analito - FE

Equilíbrio FE – FM (partição na crom. Líquido-líquido)

� Diferente para as substâncias diferentesPolaridade

Tamanho

Cromatografia planar

Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente dividido

FM (capilaridade) � separação

� Fácil realização� Análises quali e quantitativas

� Baixo custo� Baixas

- Resolução e- Repetibilidade- Reprodutibilidade

Cromatografia em coluna

Convencional (Clássica)

Solvente

Fase estacionária

Suporte inerte

Líquida de alta eficiência - CLAE (HPLC)

- Colunas verticais (FM - gravidade)- Análises quali e quantitativas- Baixo custo- Baixa frequência- Desempenho regular

- Colunas e FM – altas pressões- Análises quali e quantitativas- Desempenho analítico satisfatório- Rapidez analítica, automação- Custo elevado ...

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

- Amplamente utilizada- Dentre as modalidade mais importantes da cromatografia- Vem se desenvolvendo desde a década de 70

NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA

� Necessidade de calibração

RESULTADO : Amostras x Padrões(cromatograma)

Subdivisões da CLAE

Tipo de FE e o MECANISMO de separação

Cromatografia líquido-sólido: CLS� FE é um sólido �� mecanismo de adsorção

Cromatografia líquida de fase ligada: CLFL�FE é um líquido ligado quimicamente a um suporte sólido

�� mecanismo de partição

Cromatografia líquido-líquido: CLL� FE é um líquido que recobre um sólido

�� mecanismo de partição

Cromatografia por exclusão: CE

� FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controladaAplicação importante: análise de polímeros (GPC)

Cromatografia de troca iônica: CTI

� FE sólida contém grupos NR3+ (para troca

aniônica) ou grupos SO3- (para troca catiônica)

Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc)

Mesmo mecanismo estudado da Prática 10 !

Cromatografia por afinidade: CA

� FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivacom proteínas e anticorpos

Cromatografia quiral: CQ

� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirseletivamente com compostos quirais

Separação e Sinal analítico

FM

FM

FM

FM

FM

FM + componente separado

Cromatograma

Tempo de retenção

Sin

al

Entendendo o cromatograma

Diferentes espécies � SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr(tr= tempo de retenção � medida em função do tempo)

saca

rin

aaspartame

be

nza

lde

ído

Informações

quali e

quantitativas

Tempo de retenção

Resposta do detector

Muita interaçãoPouca interação

Análise quantitativa

Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picoscromatográficos com áreas diferentes

�� Necessidade de calibração:

�Relaciona-se as áreas dos picos com as concentrações

� Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES

Resposta do detector

Concentração do padrão, no tr específico

Equação de reta

Configuração instrumentalComponentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta

eficiência:

� Cada componente: função no processo analítico

Sistema de bombeamento

Reservatóriode FM

Válvula deamostragem

Colunacromatográfica

Detector

Processador-Registrador


Reservatóriode FM



Detector Registrador

frasco de plástico

ouvidro

+

Solvente(s) orgânico(s)

CiclohexanoTetracloreto de carbonoToluenoEtanolAcetato de etilaMetanolAcetonitrilaÁgua

(VERIFICAR TABELAS)

eliminação departículas maiores

que 5 µm

retirada de gasesDissolvidos

Ultrasomou

Borbulhamento gases inertes

USO(preparação diária)

CUIDADOS

Ordem crescentede polaridade

Água


Reservatóriode FM




� Impulsionar a FM para dentro da coluna com vazão constante e reprodutível

� BOMBAS DE ALTA PRESSÃO

Composição constanteeluição ISOCRÁTICA

Composição variávelEluição por GRADIENTE ou

Eluição por programação de solvente

Bomba de seringa

Bomba pneumática

Amostras complexasCompostos de polaridade

muito diferente

Bomba recíproca

Proporção doSolvente mais polar


Reservatóriode FM




Ex: Bomba recíproca (uma das mais usadas)

Desvantagens:

Vazão pulsada � amortecedorCavitação (bolhas) devido à compressão

Vantagem:

Mudança da fase móvel

Para coluna


Reservatóriode FM




Dispositivo de aço inoxidável com uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna

ALÇA TROCÁVEL �� Volumes de 2 a 1000 µL


Reservatóriode FM




Coluna �� tubo de aço inoxidável �� separação

Capacidade: dimensões

Фi= 1 – 20 mm

L= 3 – 25 cm(limitado pela P trabalho)

FEPartículas com Ф na faixa de µmUso de partículas pequenas�� melhor separação (aumenta N)

+

FM

DUAS COMBINAÇÕES

Fase reversa

Fase normal

FE apolar (baixa polaridade)FM polar

FE polarFM apolar (baixa polaridade)

EFICIÊNCIA DA COLUNA

� REPRESENTADADA POR “N”“Número de pratos teóricos”

N = 16 tr

W

2

�� Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação

� Não implica em rapidez ! Esta é dada pela Altura do prato (H): H= L / N,

em que valores pequenos referem-se a colunas “rápidas”

- Determina a resolução do cromatograma- Relacionada ao no de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FM

Sin

al d

o d

etec

tor

Tempo de retenção

Detecção dos componentes �� conforme saem da coluna

Deve-se obter UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA

�� Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE)

a) Detectores que respondem à concentração�� SINAL proporcional à CONCENTRAÇÃO

Ex: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluorescência

MAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEIS

b) Detectores que respondem à massa �� SINAL proporcional a um FLUXO DE MASSA por unidade de tempo

Ex: Detectores eletroquímicos e de condutividade elétrica


Reservatóriode FM




MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADIENTE

Considerações práticas

� Várias configurações instrumentais podem ser empregadas

determinação de vários tipos de substâncias(mesmo em amostras complexas)

sistema à alta pressão: checar vazamentos

As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamno resultado

para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padrõesinternos

(substância com características físico-químicas semelhantes às do analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida)

Questões

1- Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia líquidade alta eficiência (CLAE) e explique, brevemente, a função de cada um deles.

2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes emanalgésicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases móveisdiferentes e em modo isocrático (X: 70% MeOH/ 30% água; Y: 60% MeOH/ 40%água; Z: 40% MeOH/ 60% água). Considerando essas informações, responda qualé o composto mais polar e qual das fases móveis você utilizaria para fazer essamesma separação.

X Y Z

Referências

Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A.Principles of Instrumental Analysis5th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998

Harris, D. C.Análise Química Quantitativa7a ed., LTC – Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008

Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S.Fundamentos de Cromatografia1a ed., Editora UNICAMP: Campinas, 2006

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