project mutamba

KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br

CNPJ: 05.758.608/0001-01

Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100

Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital

Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151

1. DADOS CADASTRAIS DO SOLICITANTE

NOME: Paulo Antônio Rodrigues Gouveia

ENDEREÇO: Rua Goianesia, nº78, Conjunto Urbanístico.

CIDADE: Araguaina - TO CEP: 77818-772

CNPJ/CPF: 388.684.581-87 INSCRIÇÃO ESTADUAL: ---

2. DADOS AMOSTRA

IDENTIFICAÇÃO DO PRODUTO: “Extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia.

TOTAL AMOSTRA: 5 frascos. LOCAL DE PRODUÇÃO: Fornecido pelo solicitante.

LOTE: --- VALIDADE: ---

3. ENSAIOS

ENSAIOS REALIZADOS: Purificação do “extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da

atividade antiviral (HIV) in vitro.

4. EXECUÇÃO DOS ENSAIOS

KYOLAB LABORATÓRIO LTDA.

CNPJ: 05.758.608/0001-01

Rua Lauro Vanucci, 1020 – Jd. Santa Cândida – Campinas-SP

CEP: 13087-548

RESPONSÁVEL PELO ENSAIO: Thaís Barbizan Ferreira da Costa e Dr. Amilcar Tanuri

DATA DE RECEBIMENTO DA AMOSTRA: Fevereiro/2012

Período de realização do ensaio: Abril/Maio 2012

Data emissão do relatório: 01/06/2012

Kyolab, 01 de junho de 2012.


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RELATÓRIO TÉCNICO

Purificação do “extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da atividade

antiviral (HIV) in vitro.

1. Identificação da amostra

Extrato aquoso de Guazuma ulmifolia fornecido pelo solicitante.

2. Objetivos

Purificação do extrato aquoso e avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro.

3. Método

3.1 Purificação do extrato aquoso: Foi realizada uma filtração do extrato

fornecido e após uma partição líquido – líquido com hexano e butanol, como pode

ser observado no fluxograma 1. O hexano extraiu muito pouco, com isso, não se

obteve uma massa significativa. Foi realizada uma Cromatografia em Camada

Delgada para uma comparação da composição química das diferentes amostras

obtidas com a partição. Para avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro, foram

enviadas as amostras: Fração butanólica (BuI), Fração aquosa (AQI) e extrato

total após a filtração (TI).


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Fluxograma 1: Partição líquido/líquido extrato aquoso de Guazuma ulmifolia.

- Funil de separação; - 200mL Hexano; - Agitação e separação das fases.

Extrato aquoso Guazuma

V= 200mL

Fr. Hexânica

Fr. Aquosa

Fr. Aquosa FR. BuOH 1

- 200mL Butanol; - Agitação;

- Separação das fases.

Fr. Aquosa M = 1,4662g

FR. BuOH 2

m = 166,7mg

- 100mL Butanol; - Agitação; - Separação das fases.

Agrupamento das duas frações.


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Cromatografia em Camada Delgada:

3.2 Teste de ação antiviral das frações (BUI e AQI) e extrato (TI), vindos da

Guazuma ulmifolia usando células MT4.

3.2.1 Vírus padrão: isolado NL4-3 (subtipo B, padrão) purificado de

passagem em cultura de células MT-4. Título: 103 TCID50 / ml.

3.2.2 Linhagem celular utilizada: MT-4, linhagem linfocitária estabelecida

em cultura, CD4+, expressando co-receptores CCR5 e CXCR4 do HIV-1. Célula

formadora de sincício (SI) e muito sensível à infecção pelo HIV-1.

Pontos:

1) Extrato aquoso após filtração;

2) Fração Aquosa;

3) Fração Butanólica.

Eluente:

Acetato de etila: Ác. Fórmico: Água ( 90:5:5)

Revelador:

Solução de Anisaldeído.


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3.2.3 Desenho do ensaio: Infecção em placa de 96 poços, contendo 104

células/poço, infectadas com MOI (multiplicidade de infecção) de 0,002

(recomendação do NIH= 0,001 a 0,01). As três amostras (BUI, TI, e AQI) vindos

da Guazuma ulmifolia, foram diluídos em DMSO a 20mg/ml e posteriormente

diluído em meio base RPMI 1640 para 200µg/ml no primeiro poço das células

infectadas previamente com o isolado HIV-1 NL4-3 (subtipo B). Depois as células

foram expostas a concentrações decrescentes da droga, a partir de fator de 5 de

diluição. O meio de cultura utilizado foi o RPMI 1640 adicionado de 10% de soro

fetal bovino, antibióticos estreptomicina/penicilina a 1% e L-glutamina a 0,2mgml.

O poço mais concentrado possuía concentração final de 200µg/ml, seguindo-se as

diluições sucessivas de 5 vezes como indicado: 40µg/ml, 8µg/ml, 1,6 µg/ml,

0,32µg/ml. No último e nono poço, foi mantido como controle da infecção, sem a

presença da droga. Cada linha de 10 poços de infecção foi produzida em

sextuplicata, para tratamento estatístico posterior. Um quarto “array” (linha) de 10

poços de células foi exposto à diluição seriada da droga, como descrito, mas sem

a presença de vírus, para análise de citotoxidade da droga, nesta faixa de

concentração. A infecção, mantida em estufa CO2 5% a 37°C, foi acompanhada

diariamente por microscopia óptica de fase, para análise do aparecimento de

sincícios, o que acontece geralmente no quarto dia pós-infecção.

3.2.4 Revelação do ensaio: A técnica utilizada de coloração CellTiter-Blue

Assay da Promega para medida da viabilidade celular, foi utilizada no sexto dia

p.i., a fim de permitir a diferenciação de viabilidade celular pós formação de

sincício. Após coloração, a placa de 96 poços será lida em fluorimetro 560. Ex.

/590. Em. Os resultados foram analisados em matriz Microsoft Excel p/ Windows

(Office 98), efetuando-se a correção do branco, e a plotagem em gráfico da


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frequência de emissão do ensaio (em porcentagem, usando como padrão 100% a

emissão de poço de células viáveis sem infecção) como medida da viabilidade

celular. O valor de 50% da emissão do padrão foi considerado como ponto de

“cutoff” para o cálculo do EC50 (concentração inibitória da droga em 50% da

infecção) após obtenção, no gráfico, da equação da curva de regressão

logarítmica (ou semi-logarítmica).

Um novo experimento com a amostra Bu1 foi realizado para corroborar os

dados anteriores e também confirmar efeito anti-HIV desta amostra.


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4. Resultados

Observam-se abaixo os dados brutos do ensaio com as amostras de Guazuma

ulmifolia.

Experimento 1:

ug/ml 100 20 4 0.8 0.16 0.032 0.0064 0.00128 0 MOCK

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3218.536 3787.642 3054.273 3029.623 3050.815 2942.556 2838.061 3266.952 3856.086 21463.08

3742.886 3349.466 2993.495 2921.36 3504.554 3313.594 3368.63 3508.849 3831.135 14058.51

3791.326 3862.401 3165.824 3175.966 3471.753 3284.441 3324.773 3071.067 4265.1 20294.67

3111.216 19477.83 4366.21 2674.602 3761.903 3076.742 6052.958 3048.72 7240.043 7477.002

3035.973 11976.43 8528.929 5251.845 4034.446 6046.562 9489.978 7767.46 10664.81 12772.81

3018.325 10846.91 24493.36 10675.08 10511.61 11035.92 13717.92 7460.173 11631.7 14904.05

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4678.774 4786.826 3640.615 3197.269 2969.581 3167.663 3161.772 2945.539 2893.992 15247.06

3648.367 4698.749 3396.308 3033.221 2937.966 3177.718 3185.137 2912.907 3171.715 16203.14

4505.607 4855.646 3050.558 3060.215 2851.461 3222.067 3087.069 3152.385 3232.763 19429.31

3478.071 11082.36 20798.67 3092.523 6175.344 9931.44 6314.826 6791.282 7868.27 11966.43

3464.056 18769.24 23575.37 6290.354 11040.51 12574.45 6861.942 10059.75 20465.64 22468.87

3466.57 30047.38 42701.53 20304.38 21610.14 33459.76 23847.6 20340.6 24218.94 29270.19

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3780.665 6687.205 4030.617 3735.877 3343.416 3349.616 3335.424 3387.817 3535.693 21099.38

3725.434 9439.628 3754.924 3216.574 3391.877 3571.244 3594.279 3599.979 3483.987 20940.39

3694.26 6138.598 3697.187 3453.84 3268.927 3461.059 3536.97 3485.578 3595.887 28091.88

3706.6 9131.073 9456.156 4017.167 6634.354 4801.022 3718.691 4119.047 19062.17 10836.41

3751.745 13926.65 13667.83 5648.854 28670.71 11885.63 6658.553 3977.721 6637.935 13054.59

3786.029 21043.8 35402.97 20247.16 40455.04 36367.43 14835.89 9229.815 14016.52 23878.32

AQ1

T1

BU1


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Figura 1: Sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1, TN1, e AQ1. Pode-se verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 ( 30%) na concentração de 20ug/ml.

Experimento 2:

Seguem abaixo os dados da repetição do experimento com a amostra Bu1.

ug/ml 120 24 4.8 0.96 0.192 0.0384 0.00768 0.001536 0 MOCK

1823.828 7267.684 3611.812 3179.984 3606.229 3365.61 3273.242 4442.716 4141.916 33535.09

1754.799 7431.17 3269.485 3695.089 3082.308 4431.423 3857.433 3150.869 3247.724 33003.2

1744.599 6982.898 4333.729 4048.463 3943.282 4972.181 3180.402 3760.187 4009.271 31025.81

1723.314 7768.199 3425.291 4360.88 3168.434 3841.711 3847.31 3339.885 3148.082 35635.67

1745.994 26911.6 31401.27 34002.62 32780.6 31191.5 33799.98 34284.94 3049.602 35846.08

1811.232 27341.41 35005.58 33018.74 33096.76 34080.29 34062.86 35448.51 3335.248 33422.74


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Figura 2: Repetição do experimento anterior com o extrato BU1. O histograma mostra sobrevivência da célula MT4 infectada com vírus HIV-1 pNL43 com um MOI de 0,01 e simultaneamente a citotoxidade com diferentes concentrações da amostra BU1. Podemos verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 ( 30%) na concentração de 24ug/ml. Repare que a citotoxidade do BU1 ainda é muito alta e encobre o efeito antiviral.


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5. Conclusões Como visto no primeiro experimento, a amostra com atividade antiviral mais

marcante foi a BU1. O segundo experimento, validou e pode-se observar a

sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1,

TN1 e AQ1. Verifica-se uma proteção parcial das células com a amostra BU1

(30%) na concentração de 20ug/ml. Contudo, a amostra não protegeu a totalidade

das células porque ainda há muitos compostos tóxicos na mesma. Há

necessidade de purificação a partir da planta in natura para realização e repetição

dos testes.

____________________________ Luiz Francisco Pianowski

Presidente

project mutamba

Health & Medicine