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PRISCILA ELISA SILVEIRA

Plasticidade sináptica à curto prazo na junção neuromuscular: papel de diferentes mecanismos de depuração de cálcio

e do receptor de IP3.

Belo Horizonte 2010

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PRISCILA ELISA SILVEIRA

Plasticidade sináptica à curto prazo na junção neuromuscular: papel de diferentes mecanismos de depuração de cálcio

e do receptor de IP3.

Tese submetida ao departamento de

Fisiologia e Biofísica do Instituto de

Ciências Biológicas na Universidade

Federal de Minas Gerais, como requisito

parcial para obtenção do grau de Doutor

em Ciências.

Orientador: Profa. Dra. Lígia Araújo Naves Kushmerick

Co-orientador: Prof. Dr. Christopher Kushmerick

D.Sci. Jordi Molgó

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Eletrofisiologia Celular (ELETROCEL) do

Departamento de Fisiologia e Biofísica – Instituto de Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Minas Gerais e no Laboratoire de Neurobiologie Cellulaire et Moleculaire do

Centre National de la Recherche Scientifique em Gif-sur-Yvette/França.

Dedico este trabalho aos meus pais, José Roberto e

Vera Lúcia, pelo amor incondicional e por serem os

grandes alicerces da minha vida.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, primeiramente, fonte de amor e vida.

À CAPES por proporcionar o desenvolvimento deste trabalho.

À Dra. Lígia Araújo Naves Kuschmerick e ao Dr. Christopher Kuschmerick, pela confiança,

aprendizado e orientação na realização deste trabalho.

Aos meus irmãos Fernando e Leandro pelo apoio e companheirismo constantes.

Ao Antônio por todo amor, carinho e respeito.

À Rose pela amizade e cumplicidade.

Aos amigos e colegas do Laboratório Eletrocel (Miguel José Lopes, Sílvia Guatimosim, Éder,

Ricardo, Adriano, Naiara, Luciana, Verônica, Fabíola, Pedro, Mariana, Fabrício, Marcinha,

Enéas, Aline e Amanda) pelo convívio e aprendizado.

À equipe do Dr. Jordi Molgó (Evelyne Benoit, Roland Bournaud, Sabine de la Porte, Patricia

Villeneuve, Sébastien Schlumberger, Agnese Bontadi, Emmanuelle Girard, Klara Rozman,

Cesare Colassante, Enrique Jaimovich, Romulo Araoz e Nadine Garrido) que tão bem me

receberam e pelo crescimento científico e pessoal.

Às amizades da UFMG que permanecem, Kátia, Lúcio, Viviane, Ana Paula Araújo, Ana

Paula Côrrea, Juliana, Laura, Samuel, Daniel, Adaliene, Luciana, Maira e Patrícia.

Aos professores do Departamento de Fisiologia e Biofísica e Farmacologia, principalmente à

Dra. Adelina Martha dos Reis, pelo apoio e confiança em meu trabalho.

À Celinha pelo carinho e disposição em ajudar sempre que necessário.

Aos amigos, Ana Cristina, Janice, Gisele, Flávia, Fábio, Rebeca, Monique, Uriatan, Rodrigo

Sírio, Priscilla, Rodrigo Cardoso, Ivna e Charles, que souberam compreender a minha

ausência e torcem por mim.

Aos colegas e amigos residentes da Maison du Brésil em Paris. Vocês foram essenciais nos

momentos mais difíceis e nos mais alegres também. Amizade e saudade toda a vida.

Aos que colocaram pedras no meu caminho e que me deram exemplos do que não ser.

“Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir um castelo...” (Fernando Pessoa)

Ao meu instrumento de pesquisa, as rãs. Sem elas nada disso teria sido possível. Com elas

pude perceber as semelhanças e diferenças entre nós, seres humanos, e os animais, e

acima de tudo aprender a respeitá-los.

“A sabedoria não se transmite, é preciso que nós

a descubramos fazendo uma caminhada que

ninguém pode fazer em nosso lugar e que

ninguém nos pode evitar, porque a sabedoria é

uma maneira de ver as coisas.”

(MARCEL PROUST)

LISTA DE ABREVIATURAS

2-APB - 2-Aminoethyl diphenyl borate

ACh – acetilcolina

AChE – enzima acetilcolinesterase

BAPTA, AM - 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid

tetrakis(acetoxymethyl ester)

Ca+2 – íon cálcio

CaCl2 – cloreto de cálcio

CCCP – carbonilcianeto-3-clorofenilhidrazona

CEDA, SE – (5-(and-6)-carboxyeosin diacetate, succinimidyl ester)

CGP 31157 - 7-Chloro-5-(2-chlorophenyl)-1,5-dihydro-4,1-benzothiaze pin-2(3H)-one

CICR – liberação de cálcio induzida pelo cálcio

CPA – ácido ciclopiazônico

DAG – diacilglicerol

DMSO – dimetilsulfóxido

EGTA - Ethylene glycol tetraacetic acid

EPP – potencial de placa motora

EPP1 – potencial de placa motora seguido do 1º estímulo

EPP2 – potencial de placa motora seguido do 2º estímulo

fMEPPs – frequência dos potenciais de placa motora miniatura

F – facilitação

Gq/11 – proteína G heteromérica

HEPES - 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-

N′-(2-ethanesulfonic acid)

ICICR – liberação de cálcio induzida pelo inositol trifosfato

IP3 – inositol trifosfato

IP3R – receptor de inositol trifosfato

JNM – junção neuromuscular

KCl – cloreto de potássio

LiCl – cloreto de lítio

LTP – potenciação de longa duração

M1 – receptor muscarínico do tipo 1

M2 – receptor muscarínico do tipo 2

MCU – uniporter mitocondrial

MeOH – metanol

MEPP – potencial de placa em miniatura

Mg+2 – íon magnésio

MgCl2 – cloreto de magnésio

Na+ – íon sódio

NaCl – cloreto de sódio

NaOH – hidróxido de sódio

NCX – trocador sódio cálcio

NCXm – trocador sódio cálcio mitocondrial

PbTx-3 - brevetoxina

pH – potencial hidrogeniônico

PKC – proteína quinase do tipo C

PLC – fosfolipase do tipo C

PMCA – cálcio ATPase da membrana plasmática

PMR1/ATP 2 C1 – cálcio ATPase do tipo P

RE – retículo endoplasmático

Ru360 - (μ)[(HCO2)(NH3)4Ru]2OCl3

Ry - rianodina

RyR – receptor de rianodina

SERCA- cálcio ATPase do retículo saco-endoplasmático

SNARE – soluble N-ethylmaleimide factor attachment protein receptors

SNC – sistema nervoso central

Tg – tapsigargina

U-73122 - 1-[6-((17b-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl)amino)hexyl]-1H-pyrrole-2,5-dione

V – Volt

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Animal após destruição do sistema nervoso central..........................................33

FIGURA 2 – Foto mostrando a mesa onde eram realizados os experimentos em JNM........34

FIGURA 3 – Organograma do sistema para a aquisição dos dados.....................................35

FIGURA 4 – Registro da diferença de potencial medida fora e dentro de uma

célula......................................................................................................................................36

FIGURA 5 – Registro dos potenciais de placa motora evocados na presença de 6 µM de d-

tubocurarina............................................................................................................................38

FIGURA 6 – Registro dos potenciais de placa motora espontâneos.....................................38

FIGURA 7 – Potenciais de placa motora registrados com pulsos pareados nos diferentes

intervalos entre os pulsos, na presença de curare.................................................................40

FIGURA 8 – Facilitação por pulsos pareados com intervalo de 10 ms na presença de curare.

Projeção do primeiro EPP para o cálculo da amplitude do segundo EPP.............................40

FIGURA 9 – Exemplo de um protocolo de Depressão e seu registro no programa Clampfit

9.2...........................................................................................................................................42

FIGURA 10 – Exemplo de ajuste da curva de Depressão pela equação Explinear...............43

FIGURA 11 – Gráfico representativo da recuperação mostrando os pontos correspondentes

para o cálculo da recuperação final, potenciação e tempo para recuperar

50%.........................................................................................................................................44

FIGURA 12 - Organograma da situação experimental...........................................................45

FIGURA 13 - Efeito do BAPTA-AM no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................49

FIGURA 14 - Efeito da tapsigargina no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................51

FIGURA 15 - Efeito do CEDA no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................54

FIGURA 16 - Efeito do CGP no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................57

FIGURA 17 - Efeito do Ru360 no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................60

FIGURA 18 - Efeito do Ringer Lítio no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................63

FIGURA 19 – Efeito do bloqueio dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio

intracelular na depressão final................................................................................................65


intracelular na depressão (análise da intersecção no eixo y).................................................66


intracelular na constante de decaimento da

depressão...............................................................................................................................67


intracelular na recuperação final.............................................................................................68


intracelular na potenciação.....................................................................................................69


intracelular na facilitação por pulsos pareados.......................................................................70

FIGURA 25 – Efeito da PbTx-3 na frequência dos potenciais de placa motora miniatura.....71

FIGURA 26 – Potenciais de placa motora miniatura representativos registrados em solução

de Ringer 0 Ca+2 + 2,5 mM EGTA (A) e após 30 minutos de incubação com 50 nM de PbTx-

3 (B)........................................................................................................................................72

FIGURA 27 – Efeito da TTX sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3............72

FIGURA 28 – Efeito da tapsigargina sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3-

................................................................................................................................................73

FIGURA 29 – Efeito do 2-APB sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3.........74

FIGURA 30 – Efeito do U-73122 sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3.....74

FIGURA 31 - Efeito da Rianodina no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................76

FIGURA 32 - Efeito do bloqueio do receptor de rianodina pela rianodina na Facilitação por

pulsos pareados.....................................................................................................................77

FIGURA 33 - Efeito do 2-APB no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................79

FIGURA 34 - Efeito do bloqueio do receptor de IP3 pelo 2-APB na Facilitação por pulsos

pareados.................................................................................................................................80

FIGURA 35 - Efeito do U-73122 no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e

Potenciação............................................................................................................................82

FIGURA 36 – Efeito do bloqueio da fosfolipase C na facilitação por pulsos pareados..........83

LISTA DE TABELAS

TABELA I - Soluções nutridoras............................................................................................32

TABELA II – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Tapsigargina.............................52

TABELA III – Facilitação por pulsos pareados – Controle x CEDA.......................................55

TABELA IV – Facilitação por pulsos pareados – Controle x CGP.........................................58

TABELA V – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Ru360.......................................61

TABELA VI – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Ringer Lítio..............................64

TABELA VII – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Rianodina...............................77

TABELA VIII – Facilitação por pulsos pareados – Controle x 2-APB....................................80

TABELA IX – Facilitação por pulsos pareados – Controle x U-73122...................................83

RESUMO

Mecanismos de depuração do cálcio são importantes para a homeostase celular, mas sua

importância na plasticidade sináptica à curto prazo não está completamente esclarecida.

Nós comparamos a contribuição dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio na

depressão sináptica e na facilitação por pulsos pareados. O retículo endoplasmático (RE) é

considerado um estoque de cálcio intracelular. O cálcio liberado pelo RE pode ocorrer pela

estimulação dos receptores de rianodina (RyR) ou pelas receptores de inositol trifosfato

(IP3R). No intuito de esclarecer sobre sua presença na junção neuromuscular e sua

importância na plasticidade sináptica, nós investigamos o mecanismo de ação da

brevetoxina-3 (PbTx-3), uma toxina conhecida por aumentar a concentração de IP3 e liberar

cálcio intracelular via IP3Rs. Nós também estudamos o papel dos IP3Rs e dos RyRs em

duas formas de plasticidade sináptica à curto prazo na junção neuromuscular: depressão e

facilitação por pulsos pareados.

Nosso estudo foi realizado na preparação nervo-músculo cutâneo peitoral de rãs. Utilizamos

o registro intracelular para medir a liberação espontânea, a depressão e a facilitação por

pulsos pareados.

Verificamos que o BAPTA-AM diminui a depressão, evidenciando a importância do cálcio

intracelular neste fenômeno. O bloqueio da Ca+2-ATPase do retículo endoplasmático

(SERCA) aumentou a depressão e a facilitação por pulsos pareados, entretanto o bloqueio

dos outros mecanismos de depuração do cálcio (Ca+2-ATPase da membrana plasmática,

uniporter e trocador Na+/Ca+2 mitocondriais) não apresentou alterações nestes parâmetros.

Estes resultados sugerem uma importante contribuição da SERCA na depuração de cálcio

nestes fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo. O bloqueio do trocador Na+/Ca+2

da membrana plasmática aumentou a depressão e diminuiu a facilitação por pulsos

pareados. A interpretação da substituição do sódio extracelular pelo lítio não é conclusiva,

pois o lítio pode alterar o potencial de ação pré-sináptico.

Nos experimentos com a PbTx-3 verificamos que esta toxina aumenta a liberação

espontânea. A tetrodotoxina e a tapsigargina impedem tal efeito, indicando sua relação com

a entrada de sódio e a liberação de cálcio de estoques intracelulares. Verificamos o

envolvimento do IP3R e da fosfolipase C (PLC) através da utilização de dois antagonistas: o

2-APB, um bloqueador do IP3R e o U-73122, um inibidor da PLC. O 2-APB e o U-73122

inibiram o aumento da liberação espontânea. Nossos resultados sugerem que a PbTx-3

promove a liberação de cálcio de estoques intracelulares sensíveis ao IP3 no terminal pré-

sináptico ocasionando aumento da liberação espontânea e este efeito depende da diferença

de potencial elétrico.

No estudo do papel dos IP3Rs na plasticidade sináptica à curto prazo verificamos que o 2-

APB diminui a depressão, mas não apresenta efeito na facilitação por pulsos pareados. A

PLC e os RyRs estão envolvidos na depressão sináptica e na facilitação por pulsos

pareados, visto que o U-73122 e a rianodina diminuem a intensidade destes fenômenos.

Nossos resultados sugerem o envolvimento da PLC e dos RyRs na depressão sináptica e

na facilitação por pulsos pareados, enquanto que o IP3R está envolvido somente na

depressão sináptica.

Nosso estudo esclarece sobre o mecanismo de ação da PbTx-3 e mostra evidências sobre a

presença do IP3R na junção neuromuscular e de seu papel na plasticidade sináptica à curto

prazo. Com relação aos mecanismos de depuração do cálcio nós sugerimos um maior

envolvimento da SERCA na depressão sináptica e na facilitação por pulsos pareados.

Palavras-chaves: junção neuromuscular, acetilcolina, depuração de cálcio, receptor de

inositol trifosfato e plasticidade sináptica.

SUMMARY

Mechanisms of calcium clearance are important for calcium homeostasis, but their role in

short-term plasticity is incompletely understood. We compared the contribution of different

mechanisms of calcium clearance in synaptic depression and paired pulse facilitation. The

endoplasmic reticulum (ER) is a well-characterized intracellular store of calcium. Calcium

release from the ER can be evoked by stimulation of the ryanodine receptor (RyR) or the

inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor (IP3R). To clarify the presence of IP3Rs at the

neuromuscular junction and its role in synaptic plasticity we investigated the mechanism of

action of brevetoxin-3 (PbTx-3), a toxin known generate IP3 and release calcium from the ER

by activating IP3Rs. We also searched for the role of IP3Rs and RyR in two forms of short-

term plasticity at the neuromuscular junction: depression and paired pulse facilitation.

Our studies were carried out on cutaneous pectoris nerve-muscle preparations from frogs.

We recorded spontaneous release, paired pulse facilitation and synaptic depression using

intracellular recording.

We show that treating the neuromuscular junction with BAPTA-AM decreased depression.

These data indicate that intracellular calcium is important for synaptic depression. Blockage

of the endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) increased depression and paired pulse

facilitation, whereas blockage of others mechanisms of calcium clearance (plasma

membrane Ca2+-ATPase, mitochondrial Ca2+ uniporter and mitochondrial Na+-Ca2+

exchanger) was without effect on these parameters. These results suggest an important and

major involvement of SERCA in calcium clearance during these phenomena of short-term

synaptic plasticity. Blockage of plasma membrane Na+-Ca2+ exchanger by substituting Li+ for

Na+ increased depression and decreased paired pulse facilitation. However the interpretation

of the effect of Li+ substitution is not straightforward, because it may also affect the

presynaptic action potential.

In addition, we show that PbTx-3 markedly enhanced spontaneous quantal transmitter

release. Tetrodotoxin and thapsigargin prevented these effects, indicating that it is related to

Na+ entry and to calcium release from intracellular stores. We verified the involvement of

IP3R and phospholipase C (PLC) by using two antagonists: 2-APB, a blocker of IP3R and U-

73122, a PLC inhibitor. Both of the treatments blocked the effect of PbTx-3 on spontaneous

quantal transmitter release sugesting PbTx-3 elicits Ca2+ release from the IP3 sensitive

intracellular Ca2+ stores of the presynaptic nerve terminal leading to an enhancement of

spontaneous transmitter release and that this effect depends on voltage.

In order to evaluate the involvement of IP3Rs in short-term plasticity we used 2-APB. Our

results show that 2-APB decreased depression, but had no effect on paired pulse facilitation.

PLC and RyRs are involved on synaptic depression and paired pulse facilitation. Our results

show that U-73122 and rianodine decreased depression and paired pulse facilitation. These

results suggest an involvement of PLC and RyRs in synaptic depression and facilitation.

IP3Rs are involved only in synaptic depression.

Our study clarifies the mechanism of action of PbTx-3, shows additional evidence for the

presence of IP3R at the neuromuscular junction and its role in short-term synaptic plasticity.

Concerning the mechanism of calcium clearance we suggest a major involvement of SERCA

in synaptic depression and paired pulse facilitation.

Keywords: neuromuscular junction, acetylcholine, calcium clearance, inositol (1,4,5)-

trisphosphate receptor and synaptic plasticity.

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO 21

1.1. JUNÇÃO NEUROMUSCULAR 21

1.2. NEUROTRANSMISSÃO COLINÉRGICA 23

1.3. PLASTICIDADE SINÁPTICA 24

II. OBJETIVOS 29

III. MATERIAIS E MÉTODOS 30

3.1. MATERIAIS 30

3.1.1. ANIMAIS 30

3.1.2. EQUIPAMENTOS 30

3.1.3. DROGAS E REAGENTES 31

3.1.4. SOLUÇÕES 32

3.2. MÉTODOS 33

3.2.1. PREPARAÇÃO NERVO-MÚSCULO 33

3.2.2. SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE DADOS 34

3.2.3. REGISTROS ELETROFISIOLÓGICOS 36

3.2.4. PROTOCOLOS DE PLASTICIDADE SINÁPTICA À CURTO PRAZO 39

3.3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL 44

3.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 45

IV. RESULTADOS 47

4.1. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO INTRACELULAR DE CÁLCIO SOBRE A RESPOSTA AO

ESTÍMULO TETÂNICO. 47

4.2.1. BLOQUEIO DA CÁLCIO-ATPASE DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO 50

4.2.2. BLOQUEIO DA CÁLCIO-ATPASE DA MEMBRANA PLASMÁTICA 53

4.2.3. BLOQUEIO DO TROCADOR NA+/CA

+2 DA MITOCÔNDRIA 56

4.2.4. BLOQUEIO DO UNIPORTER MITOCONDRIAL 59

4.2.5. BLOQUEIO DO TROCADOR NA+/CA

+2 DA MEMBRANA PLASMÁTICA 62

4.3. IMPORTÂNCIA DO RECEPTOR DE IP3 DO TERMINAL PRÉ-SINÁPTICO NO AUMENTO DA ENTRADA

DE SÓDIO, NA DEPRESSÃO E NA FACILITAÇÃO POR PULSOS PAREADOS. 71

4.3.1. EFEITO DA BREVETOXINA NA LIBERAÇÃO ESPONTÂNEA 71

4.3.2. BLOQUEIO DO RECEPTOR DE RIANODINA 75

4.3.3. BLOQUEIO DO RECEPTOR DE IP3 78

4.3.4. BLOQUEIO DA FOSFOLIPASE C 81

V. DISCUSSÃO 84

5.1. ANÁLISE DA LIBERAÇÃO DE NEUROTRANSMISSORES NA JUNÇÃO NEUROMUSCULAR 84

5.2. PLASTICIDADE SINÁPTICA 86

5.2.1. DEPRESSÃO SINÁPTICA 86

5.2.2. FACILITAÇÃO POR PULSOS PAREADOS 88

5.3. EFEITO DOS DIFERENTES MECANISMOS DE DEPURAÇÃO DO CÁLCIO INTRACELULAR SOBRE A

DEPRESSÃO E A FACILITAÇÃO POR PULSOS PAREADOS 89

5.4. EFEITO DA BREVETOXINA NA LIBERAÇÃO ESPONTÂNEA 95

5.5. EFEITO DOS RECEPTORES DE RIANODINA E DE IP3 SOBRE A DEPRESSÃO E A FACILITAÇÃO

POR PULSOS PAREADOS 97

VI. CONCLUSÃO 101

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 102

ANEXO I – PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS 117

ANEXO II – ARTIGOS EM PROCESSO DE ELABORAÇÃO E SUBMISSÃO 122

I. INTRODUÇÃO

1.1. Junção neuromuscular

A junção neuromuscular (JNM), também denominada de placa motora ou de junção

mioneural, é a região de comunicação especializada onde sinais são transmitidos de um

neurônio a uma célula muscular (KATZ, 1966). Em virtude da grande dimensão da fibra

muscular e da acessibilidade, a JNM foi a primeira sinapse química de vertebrados a ser

bem caracterizada, e onde as bases da teoria quântica da liberação de neurotransmissores

foram estabelecidas (KATZ, 1966; VAN DER KLOOT & MOLGÓ, 1994).

Muitas das propriedades funcionais da JNM de rã foram elucidadas inicialmente por B. Katz

e colaboradores na Inglaterra. Seus estudos produziram as bases do conhecimento sobre a

transmissão química (DELL CASTILLO & KATZ, 1953, 1954a, b; FATT & KATZ, 1952; KATZ

& MILEDI, 1965, 1967). Estudos realizados nesta sinapse servem de suporte para o estudo

da neurotransmissão colinérgica no Sistema Nervoso Central (SNC) e em outras espécies

(VAN DER KLOOT & MOLGÓ, 1994). Além disso, vários mecanismos de modulação da

neurotransmissão descobertos na junção neuromuscular foram verificados posteriormente

no SNC, reforçando que a JNM é um modelo adequado para estudar a neurotransmissão

colinérgica (WOOD & SLATER, 2001).

As fibras musculares são inervadas por motoneurônios mielinizados que se originam do

corno anterior da medula espinhal (RUFF, 2003). As sinapses químicas da JNM apresentam

três estruturas distintas e interligadas: o terminal pré-sináptico, a fenda sináptica e o aparato

de recepção pós-sináptico. O terminal pré-sináptico da JNM contém vesículas, mitocôndrias

e retículo endoplasmático (BIRKS et al., 1960; WESTRUM & GRAY, 1986). O axônio motor

dá origem em sua porção distal a um conjunto de ramos terminais não mielinizados de 1,5

μm de diâmetro que percorrem sulcos rasos na superfície da fibra muscular por extensões

de aproximadamente 100 μm (BIRKS et al., 1960; DE ROBERTIS & BENNETT, 1955;

DULHUNTY & FRANZINI-ARMSTRONG, 1975; KATZ, 1966). Esta região é recoberta por

um tipo de célula glial denominada célula de Schwann. Estudos recentes sugerem que estas

células são capazes de modular a neurotransmissão (AULD & ROBITAILLE, 2003;

CASTONGUAY & ROBITAILLE, 2001; ROBITAILLE, 1998). Ao longo do terminal pré-

sináptico encontram-se as zonas ativas identificadas pela concentração de vesículas

sinápticas de aproximadamente 50 nm de diâmetro que apresentam acetilcolina (ACh) em

seu interior (JAHN & SUDHOF, 1994). O número de vesículas presentes em cada JNM é de

aproximadamente 3 x 106 (BIRKS et al., 1960; DE ROBERTIS & BENNET, 1955). A zona

ativa é uma região especializada na liberação dos neurotransmissores para a fenda

sináptica, pois apresenta uma maquinaria especializada para tal secreção. O grande número

de mitocôndrias no terminal nervoso supre a demanda metabólica da síntese e liberação de

neurotransmissores (BIRKS et al., 1960). Ainda compondo o terminal pré-sináptico estão

presentes os canais para cálcio sensíveis à voltagem, dispostos em fileiras e associados à

zona ativa. A disposição dos canais para cálcio nas zonas ativas permite um rápido aumento

na concentração intracelular de cálcio de cerca de 100 a 1000 nM nas regiões do terminal

nervoso onde a fusão de vesículas ocorre (AUGUSTINE et al., 1991; ROBITAILLE et al.,

1990; SMITH & AUGUSTINE, 1988; ZHAI & BELLEN, 2004).

O terminal pós-sináptico constitui a superfície da fibra muscular, recoberta por uma

membrana basal, e é especializado na resposta rápida e específica à liberação de

neurotransmissores pelo terminal pré-sináptico. A terminação axônica e a célula muscular

são separadas pela fenda sináptica, que apresentam espessura de 50 a 100 nm (WOOD &

SLATER, 2001) e onde existe um material amorfo, rico em carboidratos, e também a enzima

acetilcolinesterase (AChE) (BIRKS et al., 1960; WOOD & SLATER, 2001). Cada vesícula

sináptica libera cerca de 10.000 moléculas de ACh na fenda sináptica (KUFFLER &

YOSHIKAMI, 1975; MARTIN, 1966; MILEDI et al., 1983). Um potencial de ação no terminal

nervoso ocasiona a fusão de 50 a 300 vesículas sinápticas (KATZ & MILEDI, 1979). A AChE

na lâmina basal da membrana pós-sináptica e na fenda sináptica hidrolisa a ACh na fenda

sináptica. Grande parte da ACh liberada na fenda sináptica é hidrolisada antes de alcançar

os receptores nicotínicos. A concentração da AChE é de aproximadamente 3.000

moléculas/µm² na membrana pós-sináptica (MCMAHAN et al., 1978), que é cerca de 5 a 8

vezes menor que a concentração de receptores para a ACh (LAND et al., 1981). O terminal

pós-sináptico apresenta um grande número de receptores nicotínicos. A concentração de

receptores nicotínicos na placa motora é de cerca de 15.000 a 20.000 receptores/µm2

(LAND et al., 1981; RUFF, 1986). O arranjo dos receptores permite a detecção rápida e

eficiente da ACh liberada durante a exocitose (HALL & SANES, 1993).

Portanto, a estrutura da junção neuromuscular possibilita a integração entre o sistema

nervoso e as células musculares, constituindo também o principal modelo experimental para

estudo das funções sinápticas colinérgicas em virtude de sua simplicidade morfológica, de

suas dimensões amplas e de sua acessibilidade quando comparada, por exemplo, com uma

sinapse entre neurônios no sistema nervoso central (SANES & LICHTMAN, 2001).

1.2. Neurotransmissão colinérgica

A transmissão sináptica na JNM envolve a liberação de neurotransmissores presentes nas

vesículas sinápticas e a ativação dos receptores pós-sinápticos. Para que tal fenômeno

ocorra é necessária a despolarização do terminal pré-sináptico, abertura dos canais de

cálcio sensíveis à voltagem e influxo do íon cálcio (PARNAS et al., 2000). Além dos canais

para cálcio, estão presentes canais para potássio no terminal nervoso, incluindo o canal de

potássio ativado por cálcio. Há evidências de que estes canais são componentes das zonas

ativas (ROBITAILLE et al., 1993a, b) e que estão envolvidos em limitar a duração da

despolarização do terminal nervoso, e assim limitar a entrada de cálcio e a liberação do

transmissor.

A ACh presente em uma única vesícula é frequentemente referida como um quantum de

transmissor. A exocitose espontânea de vesículas ocorre na maioria dos terminais nervosos

já estudados. Na JNM esta liberação espontânea origina pequenas despolarizações de

cerca de 0,5 mV na membrana da fibra muscular, sendo denominadas de potenciais de

placa motora em miniatura (MEPPs, do inglês miniature end plate potential). A frequência de

ocorrência destes potenciais em miniatura é geralmente é de 1 a 10 por segundo (VAN DER

KLOOT, 1991). O potencial de placa motora em miniatura, também denominado de

potencial de placa espontâneo, apresenta o mesmo formato dos potenciais de placa motora

ou potenciais evocados (EPP, do inglês end plate potential), sendo que a amplitude dos

potenciais evocados, quando apresenta valores até 6 a 8 mV, é geralmente um valor

múltiplo dos potenciais espontâneos. Além disso, ambos respondem de forma equivalente

quando inibidos por curare. (DEL CASTILLO & KATZ, 1954b; FATT & KATZ, 1952; MARTIN,

1966). Estas evidências proporcionaram a formulação da teoria quântica da liberação de

neurotransmissores.

No motoneurônio em condições fisiológicas, o impulso nervoso causa a liberação de 20 a

200 quanta, dependendo da espécie, em uma fração de milissegundos. Na JNM de rã a

duração da corrente de placa motora (EPC) é de 2 ms (VAN DER KLOOT, 1991; WOOD &

SLATER, 2001) e o tempo entre a liberação do neurotransmissor e sua resposta é de 0,5 ms

(BALDO et al., 1986; BARRET & STEVENS, 1972). Os quanta atuam em conjunto para

originar uma grande despolarização na região da JNM, o potencial de placa motora. O

número médio de quanta liberado por um impulso nervoso em uma junção neuromuscular é

conhecido como o conteúdo quântico do potencial de placa motora. O conteúdo quântico

pode ser determinado eletrofisiologicamente, e é comumente utilizado na mensuração da

liberação evocada do transmissor (WOOD & SLATER, 2001).

A ACh liberada na fenda sináptica se difunde por esta estrutura, e caso alcance a superfície

externa da membrana plasmática muscular da placa motora, liga-se a uma proteína

receptora específica denominada de receptor nicotínico (um canal para cátions dependente

de ligante). A combinação de duas moléculas de ACh com sua proteína receptora leva à

abertura deste canal, originando a despolarização denominada de potencial de placa. A

despolarização é transitória porque a ação de ACh é interrompida por sua hidrólise pela

acetilcolinesterase e pela alteração conformacional do receptor nicotínico (KUFFLER &

YOSHIKAMI, 1975; LINDER et al., 1984).

A JNM apresenta um fator de segurança alto, de tal maneira que um potencial de ação pré-

sináptico tem sempre como resposta um potencial de ação pós-sináptico. Entretanto, em

certas doenças neuromusculares, como na miastenia gravis, essa margem de segurança

está reduzida (ANTOZZI, 2003; VICENT, 2002). Como a JNM representa o último elo entre

o SNC e o desencadeamento da atividade motora, doenças que afetam sua função

apresentam sérias consequências clínicas (MCCONVILLE & VICENT, 2002). Portanto, é de

interesse entender os mecanismos que controlam a liberação de acetilcolina nesta sinapse.

1.3. Plasticidade sináptica

A plasticidade sináptica consiste na habilidade do Sistema Nervoso de alterar a função em

reposta a mudanças nas aferências em situações fisiológicas e patológicas. Nestes casos, é

verificada que a margem de segurança está alterada, pois em situações de estimulação

repetitiva verifica-se o aumento ou a diminuição da liberação de neurotransmissores, o que

ocasiona alteração da eficácia sináptica e consequentemente alteração da força muscular,

caso este fenômeno ocorra na JNM. A plasticidade sináptica foi descoberta por técnicas de

eletrofisiologia, sendo o registro eletrofisiológico das respostas sinápticas (potenciais ou

correntes sinápticas) capaz de verificar se a função sináptica foi modificada. Estudos dos

fenômenos de plasticidade auxiliam no esclarecimento da fisiologia neuromuscular e na

elucidação da etiologia de distúrbios que apresentam eficácia sináptica alterada como

ocorre em doenças neurodegenerativas e também no desenvolvimento de novos e mais

eficazes tratamentos (MCCONVILLE & VICENT, 2002).

De acordo com a duração do fenômeno a plasticidade sináptica pode ser caracterizada

como de curto ou de longo prazo. A plasticidade sináptica de curto prazo apresenta duração

de milissegundos a poucos minutos e a de longo prazo apresenta duração de minutos,

horas, dias ou até a vida inteira, sendo que neste caso ocorre síntese de proteínas e

alterações morfológicas (BLISS, 1990; LINDEN & CONNOR, 1995; PAN & ZUCKER, 2009;

ZUCKER & REGEHR, 2002). Neste trabalho consideramos somente a plasticidade sináptica

à curto prazo por esta estar mais diretamente relacionada à alterações no terminal pré-

sináptico da JNM.

A plasticidade sináptica à curto prazo na JNM é comumente classificada como depressão,

facilitação, aumentação e potenciação de acordo com o estímulo e duração deste para sua

geração e consequente alteração na liberação de neurotransmissores (aumento ou redução)

(MAGLEBY & ZENGEL, 1976b, 1982; ZUCKER, 1989).

A depressão pode ser definida como a diminuição da liberação de neurotransmissores

durante a estimulação repetida, sendo uma consequência da estimulação nervosa em

soluções de cálcio normal. A magnitude da depressão está diretamente relacionada à

quantidade de ACh liberada pelo terminal nervoso (TAKEUCHI, 1958; THIES, 1965). Alguns

estudos sugerem que a depleção dos pools de ACh está associada à depressão

neuromuscular (OTSUKA et al., 1962). O terminal nervoso contém uma determinada

quantidade de quantas disponíveis para a liberação imediata, pool de vesículas prontamente

liberáveis. Parte deste estoque é liberado a cada potencial de ação. Se os potenciais de

ação ocorrem mais frequentemente do que o repreenchimento do estoque, a liberação

quântica por estímulo diminui (LILEY & NORTH, 1953).

Diferentemente do que ocorre na depressão, nos processos de facilitação, aumentação e

potenciação a estimulação nervosa repetitiva ocasiona o aumento da liberação de ACh

(MAGLEBY & ZENGEL, 1975a,b).

A facilitação é mais facilmente visualizada quando o terminal nervoso é estimulado duas

vezes, sendo o intervalo entre os pulsos de milissegundos ou dezenas de milissegundos.

Neste caso, o segundo EPP apresenta maior amplitude e é designado como “facilitado”. À

medida que o intervalo entre os pulsos aumenta a facilitação diminui. A facilitação pode

ocorrer pelo aumento na concentração de uma ou mais substâncias seguidas do potencial

de ação. Katz e Miledi (1968) sugerem que esta substância seja o íon cálcio. Parte do cálcio

que entra no terminal após o primeiro pulso é depurado lentamente, portanto a entrada de

cálcio após o segundo potencial de ação é adicionada ao cálcio residual já presente,

aumentando a liberação de neurotransmissores (BITTNER & SCHATZ, 1981; DODGE &

RAHAMIMOFF, 1967; STOCKBRIDGE & HINES, 1982).

A aumentação diferencia-se da facilitação porque apresenta um decaimento mais lento. Sua

constante de decaimento, 7 segundos, é intermediária entre as constantes da facilitação e

da potenciação (MAGLEBY & ZENGEL, 1976a, b).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rahamimoff%20R%22%5BAuthor%5D

A potenciação consiste no aumento do número de quantas liberados por um potencial de

ação, assim como também um aumento da liberação espontânea. Pode desenvolver-se

após um único estímulo nervoso, mas é mais aparente após a estimulação de alta

frequência e em situações de baixa concentração de cálcio (MAGLEBY & ZENGEL, 1975a).

A constante de decaimento encontra-se entre 6 segundos a 2 minutos de acordo com as

condições de estimulação (MAGLEBY & ZENGEL, 1975b).

O cálcio é o principal segundo mensageiro envolvido nos processos de neurotransmissão e

plasticidade sináptica. Como vários tipos celulares os neurônios apresentam fontes de cálcio

intra e extracelulares e as utilizam para a liberação de neurotransmissores (BERRIDGE,

1998). Em condições basais existe um equilíbrio entre os mecanismos de influxo e efluxo de

cálcio que mantêm sua concentração citosólica baixa entre 10 a 100 nM. Quando ocorre a

despolarização da membrana celular e estimulação das células por despolarização do

potencial de membrana, transmissores químicos ou estímulos mecânicos como pressão ou

estiramento, ocorre um aumento na concentração intracelular de cálcio que pode alcançar 1

M ou mais, dependendo do tipo celular. O aumento da concentração citoplasmática é

necessário para que o cálcio exerça suas funções (CARAFOLI & BRINI, 2000). Os influxos

de cálcio, originários de porções restritas da membrana plasmática, fazem com que o

aumento da concentração deste íon possa ser transitório e delimitado a pequenos volumes

do citoplasma. Isso ocorre devido à pequena mobilidade do cálcio no citoplasma e à alta

eficiência de vários sistemas sequestradores que restauram rapidamente a concentração do

cálcio aos níveis normais, sem que o restante do citoplasma seja influenciado (BERRIDGE

et al., 2003., DODGE & RAHAMIMOFF, 1967).

No terminal pré-sináptico da JNM o retículo endoplasmático (RE) é a principal organela

responsável por estocar e liberar o cálcio. O íon cálcio pode ser liberado pelos receptores de

rianodina (RyR) e pelos receptores de inositol trifosfato (IP3R) presentes nesta organela

(BERRIDGE, 1998; COLLIN et al., 2005; FILL & COPELLO, 2002; NOWYCKY & THOMAS,

2002; PAREKH, 2003).

Os mecanismos de remoção do cálcio citoplasmático são importantes para a manutenção

da atividade neuronal (GWAG et al., 1999; JANH et al., 2006). A extrusão do cálcio para o

meio extracelular pode ser realizada por duas famílias de proteínas: o trocador Na+/Ca+2

(NCX) e a cálcio-ATPase da membrana plasmática (PMCA). Além disso, o cálcio intracelular

pode ser removido do citoplasma por uma variedade de tampões, bombas e transportadores

específicos de organelas. A recaptação para o RE é regulada por uma família de cálcio-

ATPases de retículo sarco-endoplasmático (SERCA) (BERRIDGE et al., 2003). A

recaptação pela mitocôndria é mediada pelo uniporter mitocondrial (MCU), já a recaptação


pelo complexo de Golgi é mediada pela cálcio-ATPase do tipo P (PMR1/ATP2C1)

(NOWYCKY & THOMAS, 2002).

A etiologia de algumas doenças neuromusculares está relacionada ao comprometimento na

depuração do cálcio intracelular (GUATTEO et al., 2007). Em outras, a sinalização do cálcio,

envolvendo os RyR e IP3R é que está comprometida (CHEN et al., 2008; GAILLY, 2002).

Este fato reforça a importância de estudos da sinalização do cálcio intracelular na JNM.

Existem vários estudos que correlacionam o cálcio de organelas intracelulares e a

neurotransmissão (BERRIDGE et al., 2003). Com relação aos mecanismos de depuração do

cálcio intracelular já se sabe quais apresentam um papel fisiológico na neurotransmissão e

na plasticidade sináptica de diversas sinapses, como citado acima. Jensen et al. (2007)

verificaram que a PMCA é importante na cinética da depuração pré-sináptica de cálcio em

terminais excitatórios da região CA3 do hipocampo. O bloqueio da PMCA aumenta a

facilitação por pulsos pareados, além de aumentar a frequência das correntes pós-sinápticas

excitatórias miniaturas sem alterar o tamanho destas. Castonguay e Robitaille (2001)

verificaram que os estoques intracelulares de cálcio na JNM de rã, mais especificadamente

o RE, atuam como um mecanismo de depuração do cálcio para limitar a duração e a

liberação de neurotransmissores. Bennett et al. (2007) desenvolveram um modelo

matemático do sequestro de cálcio e o aplicaram às observações experimentais dos

transientes de cálcio na JNM em diferentes protocolos de estimulação seguidos do bloqueio

de diferentes vias de depuração de cálcio. O modelo matemático foi desenvolvido levando-

se em consideração parâmetros de diferentes sinapses, pois nem todos os parâmetros

relacionados à depuração do cálcio na junção neuromuscular são conhecidos. Verificou-se

que diferentes mecanismos de sequestro de cálcio apresentam contribuições diferenciadas.

No entanto, não existem trabalhos que quantifiquem eletrofisiologicamente e comparem a

importância de diferentes mecanismos de depuração em fenônemos de plasticidade à curto

prazo na JNM.

Nos neurônios do SNC, principalmente no hipocampo e no cerebelo, a plasticidade sináptica

é mediada pela liberação de cálcio induzida pelo cálcio (CICR, do inglês Ca2+-induced Ca2+

release) e pela liberação de cálcio dependente de inositol trifosfato (IP3) (CARTER et al.,

2002; EMPTAGE et al., 2001; INOUE et al., 1998; LAURI et al., 2003). Alguns trabalhos

evidenciam que nas junções neuromusculares de rã e de camundongo de que a liberação

de cálcio de estoques intracelulares pode modular a liberação de neurotransmissores

(BRAILOIU & MIYAMOTO, 2000; BRAILOIU et al., 2003; DROPIC et al., 2005; HACHISUKA

et al., 2007; KUBOTA et al., 2005; NARITA et al., 2000; PIRIZ et al., 2003). Com relação aos

RyR, seu papel na neurotransmissão, na plasticidade sináptica e sua presença no terminal

pré-sináptico já estão bem esclarecidos (KUBOTA et al., 2005; NARITA et al., 1998, 2000).

No entanto, existem somente evidências indiretas da presença do IP3R no terminal pré-

sináptico da JNM, como o trabalho de Brailoiu e Miyamoto (2000), onde foi verificada que a

admistração de IP3 ocasiona um aumento do conteúdo e do tamanho quântico.

Posteriormente este mesmo grupo de pesquisadores verificaram que a modulação da

liberação de neurotransmissores pela serotonina na JNM de lagostina envolve estoques de

cálcio intracelulares sensíveis à rianodina e ao IP3 (DROPIC, et al., 2005). Yang et al. (2001)

verificaram que neurotrofinas do tipo 3 induzem potenciação da transmissão sináptica na

junção neuromuscular de girino e este efeito está relacionado à ativação dos IP3Rs. No

entanto, não há estudos que identifiquem a presença do IP3R no terminal pré-sináptico e

nem esclareçam seu papel em fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo na JNM.

Tendo em vista as evidências da correlação de doenças neuromusculares e sinalização de

cálcio intracelular, a inexistência de estudos eletrofisiológicos que quantifiquem e comparem

a participação de diferentes mecanismos de depuração do cálcio na plasticidade sináptica à

curto prazo e do papel dos IP3R nestes fenômenos, neste trabalho nós nos propusemos a

aprofundar o estudo da regulação do cálcio intracelular em alguns fenômenos de

plasticidade à curto prazo. Para a realização deste estudo utilizamos os registros

eletrofisiológicos, considerados ferramentas úteis e fidedignas para avaliar informações de

forma qualitativa e quantitativa da liberação de neurotransmissores.

A plasticidade sináptica é um fenômeno complexo e amplo. Escolhemos verificar nossos

objetivos em fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo, pois esta apresenta funções

fisiológicas importantes como a ativação de sinapses silenciosas e a indução da plasticidade

sináptica à longo prazo (MUKHAMEDYAROV, et al., 2009). Os mecanismos envolvidos nas

alterações das respostas sinápticas não estão completamente elucidados. O esclarecimento

dos mecanismos fisiológicos envolvidos é importante e deve ser realizado com diferentes

técnicas nas diversas sinapses, uma vez que mecanismos distintos podem estar envolvidos

na neurotransmissão.

II. OBJETIVOS

Verificar a importância dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio

intracelular em fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo. Os mecanismos

de depuração estudados foram:

Cálcio-ATPase do retículo endoplasmático;

Cálcio-ATPase da membrana plasmática;

Trocador sódio-cálcio mitocondrial;

Uniporter mitocondrial;

Trocador sódio-cálcio da membrana plasmática.

Verificar a presença do receptor de inositol trifosfato através da utilização da

brevetoxina do tipo 3, uma toxina cujo efeito está relacionado ao aumento da

concentração intracelular de inositol trifosfato e à liberação de cálcio via ativação dos

receptores deste segundo mensageiro.

Verificar a importância do receptor de rianodina do terminal pré-sináptico na

depressão e na facilitação por pulsos pareados.

Verificar a importância do receptor de inositol trifosfato do terminal pré-sináptico na

depressão e na facilitação por pulsos pareados.

III. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

3.1.1. Animais

Realizamos experimentos com rãs (Lithobates catesbeianus e Rana temporaria) de ambos

os sexos, pesando entre 20 e 70 g. Os animais foram criados em ranário e mantidos no

laboratório de Eletrofisiologia Celular (ICB-UFMG) e no Laboratoire de Neurobiologie

Cellulaire et Moleculaire (CNRS-Gif sur Yvette/França), em tanque com água corrente.

Nosso estudo foi aprovado pelos comitês de éticas em experimentação animal do Brasil

(CETEA/UFMG) (protocolo n° 164/2007) e da França.

3.1.2. Equipamentos

3.1.2.1. Sistema para aquisição de dados:

Estimulador Grass SD9 ou S48 (Astro-Med Inc., EUA);

Ociloscópio (Tektronix, Beaverton, EUA);

Micromanipulador (World Precision Instruments, EUA);

Microscópio esteroscópio PGH Rundfunk – Fernsehen (Carl Zeiss, Alemanha);

Amplificador I – Dagan 8500 (Dagan Co., Minneapolis, EUA) ou Axoclamp-2A (Axon

Instruments, EUA);

Amplificador II – Ectron 750 (Ectron Co., EUA) ou Grass AC/DC strain gage (Astro-

Med Inc., W. Warnick, EUA);

Conversor A/D Labmaster (Axon Instruments, EUA);

Microcomputador contendo o software SES (Strathclyde Electrophysiology Software -

University of Strathclyde, Escócia);

3.1.2.2. Material cirúrgico: tesouras, pinças anatômicas e alfinetes para insetos;

3.1.2.3. Câmara de acrílico contendo Sylgard® (EUA) em sua base;

3.1.2.4. Mesa antivibratória TMC (EUA);

3.1.2.5. Estirador de Microeletrodos modelo PN-30 (Narishige; Japão) ou DKI modelo

700 C (Tujunga, CA, EUA);

3.1.2.6. Balanças Eletrônicas (OHAUS – presicion standard, EUA e BEL engineering

Mark 210 A, EUA);

3.1.2.7. Medidor de pH – Handylab 1 (SCHOTT – Alemanha);

3.1.2.8. Capilares GC150F-15 (Clark Electromedical Instruments – Inglaterra);

3.1.2.9. Pipetadores automáticos (Daigger, Finlândia; Boeco, Alemanha; Oxford

Benchmate, Japão).

3.1.3. Drogas e reagentes

1-[6-((17b-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl)amino)hexyl]-1H-pyrrole-2,5-dione

(U-73122) (Calbiochem – EUA).

2-Aminoethyl diphenyl borate (2-APB) (Sigma-Aldrich – França).

7-Chloro-5-(2-chlorophenyl)-1,5-dihydro-4,1-benzothiaze pin-2(3H)-one (CGP

37157) (Tocris, EUA).

BAPTA, AM (1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid

tetrakis(acetoxymethyl ester) (Molecular Probes – EUA).

Brevetoxina (PbTx-3) (Latoxan, França).

CEDA, SE (5-(and-6)-carboxyeosin diacetate, succinimidyl ester) (Invitrogen,

Molecular Probes – EUA).

d-tubocurarina (Sigma-Aldrich - EUA).

(μ)[(HCO2)(NH3)4Ru]2OCl3 (Ru360) (Calbiochem – EUA).

Tapsigargina (Tg) (ALOMONE LABS - Jerusalém, ISRAEL).

Tetrodotoxina (TTX) Sigma (Sigma-Aldrich, França)

Rianodina (Ry) (Sigma-Aldrich – França).

3.1.4. Soluções

Utilizamos quatro soluções nutridoras que foram preparadas a partir de soluções estoques

de sais, diluídas em água mili-Q, e que tiveram o seu pH ajustado a 7,4 com NaOH.

TABELA I - Soluções nutridoras

SAL Ringer normal (mM)

Ringer Lítio (mM)

Ringer Mg+2

I (mM)

Ringer Mg+2

II (mM)

NaCl 115 ______ 115 115

LiCl ______ 115

KCl 2,5 2,5 2,5 2,5

CaCl2 1,8 1,8 ______ ______

MgCl2 ______ ______ 2 1,8

HEPES* 5 5 5 5

EGTA** ______ ______ 2,5 ______

*4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid).

** Ethylene glycol tetraacetic acid.

O eletrodo de registro foi preenchido com uma solução de KCl 3 M.

3.2. Métodos

3.2.1. Preparação nervo-músculo

O animal a ser utilizado teve o Sistema Nervoso Central destruído com o uso de um estilete

introduzido no forame atlo-occipital, seguido de destruição do encéfalo e da medula

espinhal. Após este procedimento o animal foi fixado em decúbito dorsal, através das

extremidades distais de seus membros, em uma prancha. O músculo cutâneo peitoral com

seu nervo foi dissecado, sendo que durante todo o procedimento cirúrgico, o músculo e o

nervo foram umedecidos com solução de Ringer (FIG.1).

FIGURA 1 – Animal após destruição do sistema nervoso central, pronto para sofrer a dissecação (acima e à

esquerda). Acima e à direita, dissecação do nervo e do músculo cutâneo peitoral. Na figura abaixo, o músculo cutâneo peitoral e seu nervo fixados na câmara de acrílico.

3.2.2. Sistema de aquisição de dados

O sistema de aquisição de dados era montado em cima de uma mesa antivibratória (TMC,

EUA), que sustentava a preparação neuromuscular. Sobre esta mesa havia um “eletrodo de

sucção” sustentado por uma haste e conectado a uma seringa (5 ml), a qual sofria uma leve

pressão negativa para se obter a interiorização do nervo. Na mesa também se encontrava

um micromanipulador, que sustentava e conectava o prendedor de microeletrodos,

permitindo sua aproximação lenta e precisa da junção neuromuscular (FIG. 2).

FIGURA 2 – Foto mostrando a mesa onde eram realizados os experimentos em JNM.

A diferença de potencial transmembrana era captada pelo eletrodo de registro em relação

ao eletrodo de aterramento presente na solução. O sinal era enviado ao pré-amplificador,

que o enviava ao amplificador I, que apresentava duas saídas, ambas com um ganho de

10X e filtragem passa-baixa de 10 KHz: a) uma que era filtrada (passa-alta – 0,1 Hz) para

remover o potencial de repouso antes de ser amplificada 50 a 1000X (cinquenta a mil

vezes) pelo amplificador II; b) a segunda saída dirigia-se direto ao osciloscópio para a

visualização do sinal (FIG. 3). A digitilização foi realizada por um conversor A/D Lab Master

com frequência de amostragem de 20 KHz.

Eletrodo de

referência

Eletrodo de registro

Eletrodo estimulado

rr Mesa

antivibratória

Eletrodo Pré-amplificador Amplificador I

Filtro passa-alta

Amplificador II

Conversor A/D controlado pelo computador

Programa para aquisição de dados

Osciloscópio

50 a 1000 x

10 x

Sistema para aquisição de dados

50 a 10000 x

Potenciais pós-sinápticos

fo= 0,1 Hz

FIGURA 3 – Organograma do sistema para a aquisição dos dados.

Os sinais digitalizados foram registrados pelo programa STRATHCLYDE

ELETROPHYSIOLOGY SOFTWARE, fornecido pelo Dr. John Dempster da Universidade de

Strathclyde (Glasgow, Escócia).

3.2.3. Registros eletrofisiológicos

3.2.3.1. Medida dos potenciais de placa

Empalamento

Amplificador de voltagem e

osciloscópio

Fibra muscular

Eletrodo

extracelular

Vm

(m

V)

+ 60

0

- 90

Potencial de repouso

Tempo (ms)

Eletrodo

de registroEmpalamento


osciloscópio

Fibra muscular

Eletrodo

extracelular

Vm

(m

V)

+ 60

0

- 90


Tempo (ms)

Empalamento


osciloscópio

Fibra muscular

Eletrodo

extracelular

Vm

(m

V)

+ 60

0

- 90


Tempo (ms)

Eletrodo

de registro

FIGURA 4 – Registro da diferença de potencial medida fora e dentro de uma célula.

O microeletrodo intracelular foi utilizado para registrar os potencias de placa motora.

Mensuramos as variações do potencial de membrana da fibra muscular na região da placa

motora. O registro foi realizado pela diferença de potencial do eletrodo de referência

(denominado zero ou aterramento) em relação ao eletrodo de registro. Quando ambos estão

fora da célula, nenhuma diferença de potencial é registrada. Assim que o eletrodo de

registro é inserido na célula o osciloscópio mostra a mudança de potencial, ou seja, o

potencial de repouso da membrana. (FIG. 4).

Inicialmente realizamos o registro do potencial de membrana, através do empalamento da

célula muscular monitorada no osciloscópio. O empalamento era aceito quando uma

deflexão brusca de pelo menos -70 mV ocorria. No entanto, os registros eram realizados em

células que apresentavam um potencial de membrana entre -80 a -90 mV. Como o registro

dos potenciais ocorria em fibras que apresentavam diferentes potenciais de repouso

corrigimos a amplitude destes potenciais para -90 mV (KATZ & THESLEFF, 1957; VAN DER

KLOOT & COHEN, 1984) considerando o potencial de reversão de -15 mV (TAKEUCHI &

TAKEUCHI, 1960). A amplitude dos potenciais também foi corrigida pela somação não-

linear (MARTIN, 1955).

A localização do empalamento com relação à placa motora foi avaliada de acordo com os

potenciais obtidos. Os potenciais de placa eram observados, primeiramente, no osciloscópio

e depois na tela do microcomputador. Estes devem apresentar baixo tempo de subida (1

ms) e amplitude elevada, pois quanto mais longe da junção menor seria o sinal, ou seja, o

sinal é inversamente proporcional à distância. Deste modo o registro era realizado o mais

próximo possível da placa motora com o mínimo de perda eletrotônica e com uma proporção

sinal/ruído adequada, permitindo a visualização clara e total do potencial de placa evocado

sem gerar dúvidas durante sua análise.

Os microeletrodos de borosilicato, utilizados no registro intracelular, eram confeccionados

em um estirador de pipetas modelo PN-30 (Narishige) ou DKI modelo 700 C. Os

microeletrodos eram preenchidos com KCl (3M) e inseridos dentro da célula muscular na

região das junções neuromusculares. Estes apresentavam um diâmetro pequeno (< 1 μm) e

resistência de 5 a 15 MΩ.

3.2.3.2. Medidas da liberação evocada

Para o estudo de potenciais de placa evocados, o nervo foi sugado por um eletrodo

conectado ao estimulador. Inicialmente determinamos o limiar de excitação muscular

(tensão elétrica mínima para a qual ocorre contração muscular). Os registros dos potenciais

de placa evocados foram realizados com estímulos supralimiares (3 a 5 vezes o limiar) para

garantir a excitação da fibra pré-sináptica estudada (FIG. 5).

10 ms

5 mV

FIGURA 5 – Registro dos potenciais de placa motora evocados na presença de 6 µM de d-tubocurarina.

3.2.3.3. Medidas da liberação espontânea

0,5 mV

50 ms

0,5 mV

50 ms

FIGURA 6 – Registro dos potenciais de placa motora espontâneos.

A liberação espontânea foi medida através do empalamento da célula muscular e registro

dos potencias de placa motora em miniatura (MEPPs), antes e após o tratamento com a

droga. Foram registrados 100 (cem) MEPPs e sua frequência foi calculada de acordo com o

intervalo de tempo (FIG. 6).

Para o registro dos potenciais espontâneos não havia a necessidade de preservação do

nervo. Nos experimentos realizados com brevetoxina do tipo 3 utilizamos solução de Ringer

livre de Ca+2 com 2 mM Mg+2 e 2 mM EGTA.

3.2.4. Protocolos de Plasticidade Sináptica à curto prazo

Para o estudo de dois fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo utilizamos o

protocolo de facilitação por pulsos pareados e o de depressão. Nos protocolos utilizados

realizamos a mensuração da amplitude dos potenciais de placa evocados.

3.2.4.1. Facilitação por pulsos pareados

No protocolo da facilitação registramos 35 (trinta e cinco) pulsos pareados com frequência

de 0,2 Hz, duração de pulso de 100 μs e intervalo entre os pulsos que variavam entre 5 - 60

ms (FIG. 7). Em alguns casos, quando o intervalo entre os pulsos era de 15 ms ou menos, o

potencial de placa motora gerado pelo primeiro estímulo ultrapassava o potencial de placa

motora gerado pelo segundo estímulo. Nestes casos a amplitude do segundo potencial de

placa motora era calculada do seu pico até a projeção do primeiro potencial de placa motora

(FIG. 8).

FIGURA 7 – Potenciais de placa motora registrados com pulsos pareados nos diferentes intervalos entre os pulsos, na presença de curare. Potencial de repouso –92 mV.

FIGURA 8 – Facilitação por pulsos pareados com intervalo de 10 ms na presença de curare. Projeção do primeiro EPP para o cálculo da amplitude do segundo EPP. Potencial de repouso –92 mV.

A facilitação foi calculada pela seguinte fórmula:

o F = (EPP2 –EPP1) / EPP1, onde

EPP1: média da amplitude dos dez últimos EPPs seguidos do 1º estímulo,

EPP2: média da amplitude dos dez últimos EPPs seguidos do 2º estímulo.

Portanto, a facilitação era definida como o aumento na média da amplitude do potencial de

placa motora seguido do segundo estímulo em relação a média da amplitude do potencial

seguido do primeiro estímulo.

3.2.4.2. Depressão

No protocolo de depressão registramos os potenciais de placa motora durante a estimulação

basal com uma frequência de 0,2 Hz e duração de pulso de 100 µs por três minutos. Em

seguida estimulamos o terminal nervoso a uma frequência de 20 Hz durante um minuto para

o desencadeamento da depressão. Após o término do trem de alta frequência retornamos a

estimulação inicial de 0,2 Hz por mais cinco minutos para o registro da recuperação da

depressão (FIG. 9). Nos gráficos em que expressamos a amplitude dos potenciais de placa

motora durante as estimulações em função do tempo, plotamos somente a amplitude dos

vinte últimos potenciais antes da estimulação de alta frequência e a amplitude de todos os

potenciais de placa motora foi normalizada com a média destes últimos vinte potenciais

durante a estimulação basal de 0,2 Hz.

Estimulação basal_0,2 Hz Estimulação de alta

freqüência_20 HzEstimulação_0,2 Hz

Registro do Potencial de

Repouso

Registro dos EPPs

Depressão Recuperação da

Depressão

Depressão




Repouso

Registro dos EPPs


Depressão




Repouso

Registro dos EPPs


Depressão

Depressão

FIGURA 9 – Exemplo de um protocolo de Depressão e seu registro no programa Clampfit 9.2.

Durante o estímulo tetânico a amplitude dos EPPs decai rapidamente e exponencialmente

até certo ponto. Após esta primeira fase de decaimento a amplitude dos EPPs continua a

decair, porém mais lentamente e de forma linear. Os dados das amplitudes dos EPPs foram

utilizados para ajustar uma equação com a seguinte fórmula:

o Explinear: y = p1*exp(-x/p2) + p3 + p4*x.

P1 e P2 são a amplitude e a constante de tempo (tau) do componente de decaimento

exponencial. P3 e P4 representam a intersecção no eixo y e a inclinação da fase de

decaimento linear (FIG. 10). Tanto o parâmetro P1 quanto o prolongamento do parâmetro

P3 no eixo y (intersecção) representam a quantidade de depressão da primeira fase de

decaimento exponencial da depressão. No entanto, como em alguns casos verificamos uma

facilitação da liberação de neurotransmissores seguida de um decaimento desta,

consideramos somente o parâmetro P3 para a análise da quantidade de depressão

encontrada.

Portanto, em nosso estudo analisamos a constante de decaimento e a intersecção que

referem-se à velocidade de instalação do fenômeno de depressão e a quantidade de

depressão, respectivamente.

0 10 20 30 40 50 60

0,0

0,5

1,0

Data: Etanol_060607D

Model: ExpLinear

Equation: y = p1*exp(-x/p2) + p3 + p4*x

Weighting:

y No weighting

Chi^2/DoF = 0.00084

R^2 = 0.9648

p1 0.62344 ±0.02235

p2 2.40568 ±0.16654

p3 0.24603 ±0.00916

p4 -0.00474 ±0.0003

Tempo (s)

Po

ten

cia

l d

e p

lac

a m

oto

ra (

pro

po

rçã

o d

o c

on

tro

le)

FIGURA 10 – Exemplo de ajuste da curva de Depressão pela equação Explinear. O traço azul representa o

prolongamento do parâmetro P3 e sua intersecção no eixo y.

Também analisamos a depressão final obtida pela comparação da amplitude dos 5 últimos

EPPs do trem de estímulos de alta frequência com a amplitude basal dos EPPs.

Após o estímulo tetânico a amplitude dos EPPs se recupera e para quantificar o processo de

recuperação medimos os seguintes parâmetros:

Recuperação final: comparação da amplitude dos 5 últimos EPPs 200 s após o trem

de estímulos de alta frequência, quando a recuperação já estava estabilizada, com a

amplitude basal dos EPPs (FIG. 11).

Tempo para a recuperação de 50%: interpolação linear entre o ponto anterior e o

posterior a recuperação de 50%. O último ponto durante o trem de alta frequência foi

considerado 0% de recuperação e o valor aos 200 s após o final do trem foi

considerado 100% de recuperação (FIG. 11).

Potenciação: diferença entre a média do maior EPP e de seus adjacentes anterior e

posterior e a recuperação final (FIG. 11).

0 50 100 150 200

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6P

ote

nc

ial

de

pla

ca

mo

tora

(p

rop

orç

ão

do

co

ntr

ole

)

Tempo (s)

Recuperação final

Potenciação

50 % de

recuperação

FIGURA 11 – Gráfico representativo da recuperação mostrando os pontos correspondentes para o cálculo da recuperação final, potenciação e tempo para recuperar 50%.

3.3. Protocolo experimental

O curare na concentração de 6 µM foi utilizado para o bloqueio da contração muscular nos

experimentos onde registramos os potenciais de placa evocados. O curare era sempre

adicionado à preparação 30 minutos antes do início dos registros eletrofisiológicos, e logo

em seguida a sua adição, a droga ou o veículo de diluição eram adicionados à preparação,

dependendo da situação experimental. A câmara utilizada para a incubação dos músculos

apresentava um volume de 4 a 5 mL e o volume adicionado de curare, das drogas e dos

veículos de diluição era 400 a 1000 vezes menores, de forma que a diluição era

insignificante e a concentração final destes não era alterada de forma considerável.

Para o estudo do bloqueio do trocador NCX da membrana plasmática realizamos a perfusão

da preparação nervo-músculo com a solução de Ringer Lítio após o registro da depressão e

da facilitação por pulsos pareados em solução de Ringer normal. A perfusão apresentava

duração de 20 minutos e o registro dos protocolos iniciava-se 20 minutos após o término

desta. Os registros, controle e experimental, eram realizados na mesma fibra muscular sem

perda do empalamento.

O BAPTA-AM, a tapsigargina, a CEDA, o CGP 37157, o Ru360, a Rianodina, o 2-APB, o U-

73122, a PbTx-3 e os veículos de diluição foram adicionados diretamente ao banho

proveniente de soluções estoques. Os registros eram iniciados 30 minutos após a adição

das drogas ou veículos ao banho. Em um mesmo músculo realizamos o registro de diversas

fibras e este era utilizado somente uma vez para cada situação experimental. Cada grupo,

controle e experimental, apresentava 3 a 5 músculos diferentes, sendo realizado o registro

de 2 a 7 fibras em cada.

Os registros da frequencia dos MEPPs, da facilitação por pulsos pareados, da depressão e

da recuperação da depressão foram realizados após o tratamento com as drogas, com os

veículos de diluição ou com as diferentes soluções nutridoras. Os experimentos com os

veículos de diluição das drogas e os realizados em solução de Ringer normal fizeram parte

dos nossos grupos controles.

Os experimentos controles e experimentais eram realizados de forma intercalada e na

mesma época do ano no intuito de reduzir a variabilidade.

Segue abaixo um esquema representativo dos protocolos (FIG. 12). A descrição de cada

protocolo encontra-se no Anexo I.

FIGURA 12 - Organograma da situação experimental.

3.4. Análise estatística

O teste de normalidade Shapiro-Wilk foi aplicado para observar se as variáveis estudadas

possuíam distribuição normal. As variáveis que não exibiam distribuição normal foram

submetidas à transformação logarítmica (log 10). Utilizamos o teste t de Student não

pareado para comparação entre os grupos experimentais e seus respectivos controles. O

teste t de Student pareado foi utilizado para a comparação dos grupos controles e

experimentais quando a preparação foi perfundida com solução de Ringer lítio. No entanto,

em alguns casos utilizamos o teste t de Student não pareado como na ocorrência da perda

de algum experimento da amostra. A análise One-Way ANOVA seguida do post-test de

Newman-Keuls foi utilizada para a comparação dos diferentes grupos experimentais quando

a preparação foi tratada com PbTx-3. A análise Two-Way ANOVA seguida do post-test de

Bonferroni foi utilizada para a análise da facilitação por pulsos pareados. Diferenças foram

consideradas significativas ao nível de p < 0,05. Os resultados foram expressos como média

erro padrão da média (EPM) e o n significa o número de fibras registradas. Os resultados

dos dados que não apresentaram distribuição normal e que foram submetidos à

transformação logarítmica foram expressos como média desvio padrão da média (DP).

IV. RESULTADOS

4.1. Influência da concentração intracelular de cálcio sobre a resposta ao estímulo

tetânico.

Durante uma estimulação nervosa prolongada frequentemente se observa diminuição da

resposta pós-sináptica, fenômeno conhecido como depressão. Este fenômeno tem origens

pré e/ou pós sinápticas. Com o intuito de verificar a variação da depressão em diferentes

concentrações de cálcio, nós utilizamos o BAPTA-AM, um quelante de cálcio intracelular, na

concentração de 100 µM. Estes experimentos tiveram como objetivo avaliar o quanto da

depressão obtida com nosso protocolo é de origem pré-sináptica. Nossa hipótese de

trabalho foi que concentrações elevadas de cálcio intracelular levam à maior depressão em

decorrência de uma maior liberação de neurotransmissores. Nossos resultados mostram

que o BAPTA-AM diminuiu a amplitude dos EPPs antes da tetania de 2,20,2 mV (n=18)

para 1,30,1 mV (n=16), p=0,0003 (FIG. 13A). Nós também observamos que a depressão

foi menor nas preparações tratadas com BAPTA-AM. A depressão final diminuiu de 97±2%

(n=15) para 61±4% (n=15), p=2x10-8 (FIG. 13E e 19). Estes experimentos sugerem que

nosso protocolo é sensível a variações da concentração intracelular de cálcio.

Estudos anteriores mostraram que a facilitação é dependente da concentração de cálcio

intracelular (MUKHAMEDYAROV et al., 2009; TANABE & KIJIMA, 1992; VAN DER KOOT &

MOLGÓ, 1993).

Com relação à recuperação da depressão e a potenciação também verificamos que estes

fenômenos são sensíveis a concentração de cálcio intracelular. Nossos resultados mostram

que o BAPTA-AM aumentou a intensidade e a velocidade da recuperação e da potenciação.

A recuperação final aumentou de 922% (n=17) para 11511% (n=15), p=0,04 (FIG. 13F e

22) e o tempo necessário para a recuperação diminuiu de 26,5±2,2 s (n=15) para 12,6±3,1 s

(n=12), p=0,0009. Já a potenciação aumentou de 102% (n=16) para 277% (n=15), p=0,02

(FIG. 13G e 23).

Em nossos experimentos subsequentes nós utilizamos a depressão sináptica como

indicador da concentração de cálcio intracelular, para verificarmos a participação de

diferentes sistemas de depuração do cálcio intracelular. Nós também pesquisamos o efeito

do bloqueio dos diferentes sistemas sobre a facilitação por pulsos pareados.

Controle BAPTA-AM 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

(n=16)

EP

P (

mV

)

***

(n=18)

Controle BAPTA-AM 0

20

40

60

80

100

(n=13)(n=15)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

***

Controle BAPTA-AM 0

5

10

15

20

25

30

35

40

(n=15)(n=16)

% P

ote

nc

iaç

ão

*

Controle BAPTA-AM 0

20

40

60

80

100

120

(n=15)(n=17)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l *

0 100 200 300 400 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6 0,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

BAPTA-AM

0,2 Hz20 Hz

0 100 200 300 400 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,60,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

BAPTA-AM

Controle

20 Hz

A B C

D

E F G

FIGURA 13 - Efeito do BAPTA-AM (100 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ± EPM,

*p<0,05 e ***p<0,001. Nas figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

4.2. Importância dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular em

fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo.

4.2.1. Bloqueio da Cálcio-ATPase do retículo endoplasmático

A tapsigargina é um bloqueador específico da cálcio-ATPase do retículo endoplasmático

(SAGARA & INESI, 1991; THASTRUP et al., 1990) e nos a utilizamos na concentração de 2

µM para verificarmos a contribuição de tal mecanismo de depuração do cálcio intracelular

nos fenômenos de depressão e facilitação por pulsos pareados. O controle foi realizado com

o veículo de diluição etanol a 0,028%.

Nossos resultados mostram que a tapsigargina aumentou a amplitude dos EPPs antes da

tetania de 4,30,5 mV (n=23) para 7,10,9 mV (n=19), p=0,01 (FIG. 14A). Nós também

observamos que a depressão foi maior nas preparações tratadas com tapsigargina. A

depressão final aumentou de 76±3% (n=15) para 87±4% (n=13), p=0,03 (FIG. 14E e 19).

Nossos resultados também indicam uma maior depressão verificada por uma intersecção

mais baixa no eixo y de 0,550,04 (n=15 a 16) para 0,390,05 (n=11 a 12), p=0,02 (FIG. 20).

O tempo para a instalação da depressão diminuiu de 5,91,5 (n=15) para 2,60,4 (n=13),

p=0,04 (FIG. 21). Com relação à recuperação final, verificamos que esta aumentou de

863% (n=14) para 1002% (n=10), p=0,002 (FIG. 14F e 22).

Nós também observamos um aumento na facilitação por pulsos pareados quando o intervalo

entre os pulsos foi de 5 a 15 ms (FIG. 24A e tabela II).

Controle Tapsigargina0

20

40

60

80

100

(n=14)(n=16)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l *

Controle Tapsigargina 0

2

4

6

8

10

(n=19)

EP

P (

mV

)

*

(n=23)


5

10

15

20

(n=11)(n=16)

% P

ote

nc

iaç

ão


20

40

60

80

100

(n=10)(n=14)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l **

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,20,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Tapsigargina

0,2 Hz 20 HzA B C

D

E F G

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

Tapsigargina

20 Hz

FIGURA 14 - Efeito da tapsigargina (2 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ± EPM,

*p<0,05 e **p<0,01. Nas figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

TABELA II – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Tapsigargina

Intervalo entre os pulsos (ms)

Controle

(n = 16)

2 µM Tapsigargina

(n = 6 a 9)

P

5 1,52 0,06 1,96 0,15** 0,004

10 1,06 0,04 1,38 0,06 ** 0,006

15 0,87 0,05 1,07 0,06 * 0,02

20 0,78 0,04 0,86 0,05 0,28

30 0,65 0,04 0,76 0,05 0,14

40 0,53 0,04 0,58 0,04 0,47

50 0,39 0,03 0,49 0,04 0,09

60 0,30 0,03 0,36 0,06 0,22

4.2.2. Bloqueio da Cálcio-ATPase da membrana plasmática

No intuito de verificarmos a contribuição da Ca+2 ATPase da membrana plasmática como

mecanismo de depuração nos fenômenos de depressão e facilitação por pulsos pareados,

utilizamos a CEDA na concentração de 20 µM para bloqueá-la. O controle foi realizado com

o veículo de diluição DMSO a 0,17%.

Nossos resultados não evidenciam nenhuma diferença nos parâmetros estudados na

depressão e nem na facilitação por pulsos pareados.

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4 0,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

CEDA

0,2 Hz 20 Hz

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,40,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz20 Hz

Controle CEDA 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

(n=14)

EP

P (

mV

)

(n=22)

Controle CEDA 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(n=11)(n=17)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

Controle CEDA 0

2

4

6

8

10

(n=11)(n=11)

% P

ote

nc

iaç

ão

Controle CEDA0

20

40

60

80

100

120

140

(n=12)(n=14)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l

100 110 120 130 140

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

CEDA

Controle

20 Hz

A B C

D

E F G

FIGURA 15 - Efeito do CEDA (20 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ± EPM. Nas

figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

TABELA III – Facilitação por pulsos pareados – Controle x CEDA


Controle

(n = 10 a 16)

20 µM CEDA

(n = 8 a 11)

P

5 0,72 0,09 0,78 0,09 0,70

10 0,62 0,07 0,59 0,03 0,75

15 0,56 0,03 0,60 0,04 0,40

20 0,44 0,04 0,49 0,05 0,42

30 0,29 0,04 0,34 0,04 0,42

40 0,22 0,03 0,23 0,03 0,80

50 0,15 0,04 0,19 0,03 0,43

60 0,14 0,03 0,16 0,02 0,63

4.2.3. Bloqueio do trocador Na+/Ca+2 da mitocôndria

O trocador Na+/Ca+2 mitocondrial (NCXm) tem o papel de extrudar o cálcio recaptado pela

mitocôndria (GARCÍA-CHACÓN et al., 2006; WHITE & REYNOLDS, 1997; ZHONG et al.,

2001), mas em situações de aumento da concentração intracelular de cálcio, ele pode atuar

de modo reverso e recaptar o cálcio citoplasmático (GRIFFITHS, 1999; SMETS et al., 2004).

Portanto, decidimos verificar o papel deste trocador como mecanismo de depuração do

cálcio intracelular e para isso utilizamos o bloqueador CGP 37157 na concentração de 50

µM (COX et al., 1993). O controle foi realizado com o veículo de diluição DMSO a 0,05%.

Nossos resultados indicam uma maior depressão verificada por uma intersecção mais baixa

no eixo y de 0,530,07 (n=14 a 15) para 0,320,03 (n=8 a 10), p=0,03 (FIG. 20) e também

um aumento no tempo para a instalação desta de 7,41,4 s (n=14 a 15) para 15,94,5 s

(n=8 a 10), p=0,04 (FIG. 21). Entretanto, um resultado mais condizente com a função do

trocador NCXm refere-se à recuperação e a potenciação. Nossos resultados mostram um

aumento no tempo da recuperação de 17,2±1,7 s (n=18) para 22,3±1,6 s (n=17), p=0,03.

Verificamos também uma diminuição na potenciação de 133% (n=18) para 51% (n=18),

p=0,004 (FIG. 16G e 23).

Controle CGP 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(n=17)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

(n=18)Controle CGP

0

2

4

6

8

10

12

14

16

(n=18)

% P

ote

nc

iaç

ão

**

(n=18)

Controle CGP 0

20

40

60

80

100

(n=20)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l

(n=18)

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,40,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

CGP

0,2 Hz 20 Hz

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

CGP

20 Hz

Controle CGP 0

1

2

3

4

5

6

7

(n=21)

EP

P (

mV

)

(n=18)

A B C

D

E F G

FIGURA 16 - Efeito do CGP (50 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ± EPM, **p<0,01.

Nas figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

TABELA IV – Facilitação por pulsos pareados – Controle x CGP


Controle

(n = 11)

50 µM CGP

(n = 7 a 11)

p

5 1,78 0,11 1,58 0,09 0,22

10 1,45 0,09 1,36 0,06 0,50

15 1,19 0,07 1,12 0,05 0,45

20 1,05 0,06 1,01 0,10 0,72

30 0,83 0,06 0,80 0,02 0,71

40 0,62 0,05 0,61 0,05 0,80

50 0,52 0,04 0,52 0,03 0,98

60 0,39 0,03 0,42 0,03 0,61

4.2.4. Bloqueio do uniporter mitocondrial

No intuito de verificarmos a contribuição do uniporter mitocondrial como mecanismo de

depuração nos fenômenos de depressão e facilitação por pulsos pareados, utilizamos o

bloqueador Ru360 na concentração de 10 µM para bloqueá-lo (MATLIB et al., 1998). O

controle foi realizado com o veículo de diluição, água deoxigenada no mesmo volume

utilizado do Ru360, 10 µl.

Com relação aos parâmetros analisados na depressão verificamos que as preparações

tratadas com o Ru360 apresentaram uma diminuição da depressão verificada pela

intersecção maior no eixo y de 0,450,07 (n=7 a 9) para 0,640,04 (n=9 a 12), p=0,03 (FIG.

20).

Controle Ru360 0

10

20

30

40

50

60

70

(n=19)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

(n=13)Controle Ru360

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

(n=22)

% P

ote

nc

iaç

ão

(n=12)Controle Ru360

0

20

40

60

80

100

(n=22)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l

(n=12)

0 100 200 300 4000,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,20,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

0 100 200 300 4000,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,20,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Ru360

0,2 Hz 20 Hz

Controle Ru360 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

(n=23)

EP

P (

mV

)

(n=13)

A B C

D

E F G

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

Ru360

20 Hz

FIGURA 17 - Efeito do Ru360 (10 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ± EPM. Nas

figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

TABELA V – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Ru360


Controle

(n = 9 a 13)

10 µM Ru360

(n = 19 a 22)

p

5 0,94 0,06 1,04 0,06 0,34

10 0,83 0,08 0,80 0,04 0,75

15 0,73 0,06 0,64 0,02 0,14

20 0,74 0,05 0,70 0,01 0,33

30 0,54 0,03 0,47 0,01 0,07

40 0,44 0,02 0,38 0,01 0,06

50 0,33 0,02 0,29 0,02 0,33

60 0,21 0,02 0,23 0,01 0,51

4.2.5. Bloqueio do trocador Na+/Ca+2 da membrana plasmática

O trocador Na+/Ca+2 da membrana plasmática pode ser bloqueado através da utilização de

uma solução extracelular, onde o íon sódio é substituído pelo lítio (HERMONI et al., 1987).

Nossos resultados mostram que as preparações incubadas com Ringer lítio apresentaram

uma diminuição na amplitude dos EPPs durante o estímulo de baixa frequência de 4,20,5

mV (n=14) para 2,80,4 mV (n=14), p=0,002 (FIG.18A). Nós também observamos um

aumento na depressão final de 727% (n=11) para 805% (n=11), p=0,01 (FIG.18E e 19) e

uma diminuição na potenciação de 163% (n=9) para 62% (n=8), p=0,02 (FIG.18G e 23).

Com relação à facilitação por pulsos pareados verificamos uma menor facilitação por pulsos

pareados quando o intervalo entre os pulsos foi de 5-50 ms (FIG. 24E e tabela VI).

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,20,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Lítio

0,2 Hz 20 Hz

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,20,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

Controle Lítio 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

(n=11)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

*

(n=11)

Controle Lítio 0

1

2

3

4

5

(n=14)

EP

P (

mV

)

**

(n=14)

Controle Lítio 0

5

10

15

20

25

(n=9)

% P

ote

nc

iaç

ão

*

(n=9)Controle Lítio

0

20

40

60

80

100

120

(n=9)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l

(n=7)

A B C

D

E F G

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

Lítio

20 Hz

FIGURA 18 - Efeito do Ringer Lítio no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os pontos representam a média ± EPM, *p<0,05 e

**p<0,01. Nas figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

TABELA VI – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Ringer Lítio


Controle

(n = 10)

Ringer Lítio

(n = 10)

p

5 1,29 0,11 0,66 0,11 *** 0,0008

10 0,95 0,11 0,45 0,05 ** 0,001

15 0,88 0,06 0,49 0,09 ** 0,001

20 0,72 0,09 0,47 0,09 * 0,01

30 0,64 0,05 0,36 0,06 ** 0,001

40 0,44 0,05 0,21 0,04 *** 0,0004

50 0,34 0,05 0,18 0,05 ** 0,002

60 0,25 0,03 0,17 0,06 0,23

BAPTA-AM Tapsigargina CEDA CGP Ru360 Ringer Lítio0

20

40

60

80

100

10 M50 M20 M2 M

*

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

Controle

Experimental

***

*

100 M

FIGURA 19 – Efeito do bloqueio dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular na

depressão final. As barras representam a média ± EPM. *p<0,05 e ***p<0,001.

Tapsigargina CEDA CGP Ru360 Ringer Lítio0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

10 M50 M20 M

*

*

Inte

rse

cç

ão

no

eix

o y

Controle

Experimental

*

2 M

FIGURA 20 – Efeito do bloqueio dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular na depressão (análise da intersecção no eixo y). As barras representam a média ± EPM. *p<0,05.

Tapsigargina CEDA CGP Ru360 Ringer Lítio0

5

10

15

20

25

*

50 M 10 M20 M2 M

Co

ns

tan

te d

e d

ec

aim

en

to

Controle

Experimental

*

FIGURA 21 – Efeito do bloqueio dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular na constante de decaimento da depressão. As barras representam a média ± EPM. *p<0,05.


20

40

60

80

100

120

50 M2 M 20 M 10 M

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l

Controle

Experimental*

**

100 M

FIGURA 22 – Efeito do bloqueio dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular na recuperação final. As barras representam a média ± EPM. *p<0,05 e **p<0,01.


5

10

15

20

25

30

35

50 M 10 M20 M2 M

% P

ote

nc

iaç

ão

Controle

Experimental

***

*

100 M

FIGURA 23 – Efeito do bloqueio dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular na potenciação. As barras representam a média ± EPM. *p<0,05 e **p<0,01.

0 10 20 30 40 50 600,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

*

**

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1


Controle (n = 6 a 9)

2 M Tapsigargina (n = 16)

**

0 10 20 30 40 50 600,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1


Controle (n = 11)

50 M CGP (n = 7 a 11)

0 10 20 30 40 50 600,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1



20 M CEDA (n = 8 a 11)

0 10 20 30 40 50 600,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1



10 M Ru360 (n = 19 a 22)

0 10 20 30 40 50 600,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

*****

**

****

***

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1


Controle (n = 10)

Ringer Lítio (n = 10)

*

A B

C D E

FIGURA 24 – Efeito do bloqueio dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular na facilitação por pulsos pareados. Os símbolos representam a

média ± EPM, *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

4.3. Importância do receptor de IP3 do terminal pré-sináptico no aumento da entrada

de sódio, na depressão e na facilitação por pulsos pareados.

4.3.1. Efeito da Brevetoxina na liberação espontânea

Utilizamos a PbTx-3 para verificarmos a presença do receptor de IP3 na junção

neuromuscular, visto que já é conhecido seu efeito de aumento da concentração de IP3 e da

liberação de cálcio intracelular via IP3R e em outras preparações (LIBERONA et al., 2008).

Nossos resultados confirmam que a PbTx-3 na concentração de 50 nM aumenta a

frequência dos MEPPs de 0,32±0,17 Hz (n=7) para 75,59±64,48 Hz (n=7), p=3x10-9 (FIG. 25

e 26) (MEUNIER et al., 1997).

Controle PbTx-3

1

10

100

fME

PP

s (

Hz)

***

50 nM

FIGURA 25 – Efeito da PbTx-3 na frequência dos potenciais de placa motora miniatura. As barras

representam a média ± DP, ***p< 0,001.

0,5 mV

50 ms

A

B

FIGURA 26 – Potenciais de placa motora miniatura representativos registrados em solução de Ringer 0 Ca

+2 + 2,5 mM EGTA (A) e após 30 minutos de incubação com 50 nM de PbTx-3 (B).

Com o objetivo de verificarmos o envolvimento da entrada de Na+ no aumento da liberação

espontânea, nós utilizamos a tetrodotoxina (TTX) na concentração de 1 µM. Verificamos um

bloqueio no aumento da liberação espontânea pela PbTx-3 nas preparações tratadas

previamente com TTX (Controle: 0,40±0,04 Hz, n=4; PbTx-3: 75,59±64,48 Hz, n=7; TTX:

0,42±0,50 Hz, n=7; TTX + PbTx-3: 0,48±0,55 Hz, n=7) (FIG. 27).

1

10

100

1 M TTX +

50 nM PbTx-3

fME

PP

s (

Hz)

***

Controle 50 nM PbTx-3 1 M TTX

FIGURA 27 – Efeito da TTX sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3. (Escala logarítmica). As

barras representam a média ± DP, ***p< 0,001.

No intuito de verificarmos a possibilidade de que a entrada de Na+ pela PbTx-3 pode

ocasionar a liberação de cálcio de estoques intracelulares, nós utilizamos a tapsigargina na

concentração de 400 nM. Nossos resultados evidenciam que a tapsigargina quando

aplicada sozinha aumenta a frequência dos MEPPs. No entanto, na presença de

tapsigargina o aumento da frequência de MEPPs com a PbTx-3 foi menor do que em sua

ausência (Controle: 0,35±0,13 Hz, n=20; PbTx-3: 77,90±10,59 Hz, n=17; Tg: 7,02±5,39 Hz,

n=63; Tg + PbTx-3: 26,64±10,08 Hz, n=22) (FIG. 28).

0,1

1

10

100

**

**

fME

PP

s (

Hz)

***

Controle 50 nM PbTx-3 400 nM Tg 400 nM Tg +

50 nM PbTx-3

FIGURA 28 – Efeito da tapsigargina sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3. (Escala logarítmica). As barras representam a média ± DP, ** p<0,01 e ***p< 0,001.

Utilizamos o bloqueador dos receptores de IP3, 2-APB (BILMEN & MICHELANGELI, 2002;

MARUYAMA et al., 1997), para verificarmos o envolvimento deste receptor no efeito da

PbTx-3 sobre a liberação espontânea. Nossos resultados mostram que o 2-APB na

concentração de 10 µM bloqueou o aumento da liberação espontânea (Controle: 0,32±0,17

Hz, n=7; PbTx-3: 75,59±64,48 Hz, n=7; 2-APB: 0,44±0,17 Hz, n=4; 2-APB + PbTx-3:

1,31±1,00 Hz, n=3, p=0,005) (FIG. 29).

1

10

100

*

***

fME

PP

s (

Hz)

Controle 50 nM PbTx-3 10 M 2-APB 10 M 2-APB +

50 nM PbTx-3

FIGURA 29 – Efeito do 2-APB sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3. (Escala logarítmica).

As barras representam a média ± DP, *p<0,05 e ***p< 0,001.

Como a fosfolipase C está envolvida na formação do IP3, nós também verificamos seu

possível envolvimento no efeito da PbTx-3 (MAJERUS, 1992). Utilizamos o inibidor da

fosfolipase C, U-73122, (BLEASDALE et al., 1990; SHIA et al., 2008) na concentração de 5

µM e verificamos o bloqueio do aumento da liberação espontânea (Controle: 0,32±0,17 Hz,

n=7; PbTx-3: 75,59±64,48 Hz, n=7; U-73122: 1,15±0,85 Hz, n=8; U-73122 + PbTx-3:

2,46±3,15 Hz, n=8, p=0,0001) (FIG. 30).

1

10

100

**

fME

PP

s (

Hz)

***

Controle 50 nM PbTx-3 5 M U-73122 5 M U-73122 +

50 nM PbTx-3

FIGURA 30 – Efeito do U-73122 sobre o aumento da fMEPPs ocasionado pela PbTx-3. (Escala logarítmica). As barras representam a média ± DP, ** p<0,01 e ***p< 0,001.

4.3.2. Bloqueio do receptor de Rianodina

No intuito de verificarmos a contribuição do receptor de rianodina nos fenômenos de

depressão e facilitação por pulsos pareados, utilizamos a rianodina na concentração de 10

µM para bloqueá-lo (MEISSNER, 1986; OGAWA, 1994). O controle foi realizado com o

veículo de diluição etanol a 0,1%.

Nossos resultados mostram uma diminuição da depressão final de 783% (n=12) para

419% (n=8), p=0,0003 (FIG. 31E). Também verificamos uma diminuição da intensidade da

depressão pela intersecção mais alta no eixo y de 0,490,04 (n=12) para 0,700,04 (n=6),

p=0,01 e um aumento no tempo de sua instalação de 4,21,1 s (n=12) para 14,16,0 s

(n=6), p=0,03.

Com relação à facilitação por pulsos pareados verificamos uma diminuição da facilitação

quando o intervalo entre os estímulos foi de 5-15 ms (FIG. 32 e tabela VII).

Controle Rianodina 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

(n=13)

EP

P (

mV

)

(n=17)

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,40,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,40,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Rianodina

0,2 Hz 20 Hz


10

20

30

40

50

60

70

80

90

(n=12)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

***

(n=8) Controle Rianodina 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

(n=6)(n=13)

% P

ote

nc

iaç

ão


20

40

60

80

100

120

(n=8)(n=16)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l

A B C

E

D

F G

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)Tempo (s)

Rianodina

Controle

20 Hz

FIGURA 31 - Efeito da Rianodina (10 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ±

EPM,***p<0,001. Nas figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

0 10 20 30 40 50 600,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

***

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1



10 M Rianodina (n = 9 a 11)**

FIGURA 32 - Efeito do bloqueio do receptor de rianodina pela rianodina na Facilitação por pulsos

pareados. Os pontos representam a média ± EPM, *p<0,05 e **p<0,01.

TABELA VII – Facilitação por pulsos pareados – Controle x Rianodina


Controle

(n = 12 a 14)

10 µM Rianodina

(n = 9 a 11)

p

5 1,16 0,05 0,80 0,12 ** 0,006

10 0,92 0,03 0,73 0,08 * 0,03

15 0,85 0,03 0,67 0,04 ** 0,004

20 0,75 0,03 0,71 0,02 0,36

30 0,59 0,02 0,53 0,03 0,15

40 0,49 0,01 0,49 0,04 0,89

50 0,38 0,02 0,40 0,02 0,51

60 0,29 0,02 0,25 0,02 0,30

4.3.3. Bloqueio do receptor de IP3

No intuito de verificarmos a contribuição do receptor de IP3 nos fenômenos de depressão e

facilitação por pulsos pareados, utilizamos o 2-APB na concentração de 10 µM para

bloqueá-lo (BILMEN & MICHELANGELI, 2002; MARUYAMA et al., 1997). O controle foi

realizado com o veículo de diluição metanol a 0,002%. Apesar do fato do 2-APB inibir a

Ca+2-ATPase do retículo endoplasmático e de também ser um bloqueador da entrada de

cálcio operada por estoques (BOOTMAN et al., 2002), utilizamos uma concentração que não

apresentou efeito sobre a frequência (FIG. 29) e a amplitude (dado não mostrado) dos

MEPPs.

Nossos resultados mostram uma diminuição da depressão final de 923% (n=14) para

677% (n=16), p=0,002 (FIG. 33E). Verificamos também um aumento no tempo de

instalação da depressão de 0,90,2 s (n=10) para 3,50,9 s (n=13 a 15), p=0,02.

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,80,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

2-APB

20 Hz0,2 Hz

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8 0,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

Controle 2 APB 0

20

40

60

80

100

(n=16)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

**

(n=14)

Controle 2 APB 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

(n=18)

EP

P (

mV

)

(n=17)

Controle 2 APB 0

1

2

3

4

5

6

7

8

(n=15)

% P

ote

nc

iaç

ão

(n=14)Controle 2 APB

0

20

40

60

80

100

120

140

(n=15)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l

(n=14)

A B C

D

E F G

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

2-APB

Controle

20 Hz

FIGURA 33 - Efeito do 2-APB (10 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ±

EPM,**p<0,01. Nas figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

0 10 20 30 40 50 600,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1



10 M 2-APB (n = 12 a 13)

FIGURA 34 - Efeito do bloqueio do receptor de IP3 pelo 2-APB na Facilitação por pulsos pareados.

TABELA VIII – Facilitação por pulsos pareados – Controle x 2-APB


Controle

(n = 6 a 12)

10 µM 2-APB

(n = 12 a 13)

p

5 0,87 0,04 0,96 0,05 0,32

10 0,78 0,04 0,78 0,03 0,99

15 0,71 0,03 0,79 0,02 0,07

20 0,72 0,04 0,66 0,02 0,18

30 0,50 0,02 0,49 0,01 0,67

40 0,39 0,02 0,35 0,01 0,18

50 0,28 0,03 0,25 0,01 0,41

60 0,21 0,01 0,20 0,01 0,81

4.3.4. Bloqueio da fosfolipase C

A formação de IP3 requer a ativação da fosfolipase C (MAJERUS, 1992). Portanto,

utilizamos o inibidor da fosfolipase C, U-73122, (BLEASDALE et al.,1990; SHIA et al.,2008)

na concentração de 5 µM no intuito de verificarmos seu papel nos fenômenos de

plasticidade sináptica à curto prazo, depressão e facilitação por pulsos pareados. O controle

foi realizado com o veículo de diluição DMSO a 0,05%.

Nossos resultados mostram uma diminuição na amplitude dos EPPs antes da tetania de

3,90,6 mV (n=22) para 1,90,2 mV (n=18), p=0,002 (FIG. 35A). Também verificamos uma

diminuição da depressão final de 884% (n=22) para 726% (n=18), p=0,02 (FIG. 35E) e no

tempo de sua instalação de 1,50,2 s (n=16) para 0,90,1 s (n=23), p=0,004. Com relação à

recuperação evidenciamos um aumento na recuperação final de 942% (n=22) para

1197% (n=17), p=0,0002 (FIG. 35F) e uma diminuição no tempo de sua instalação de

25,7±2,0 s (n=17) para 17,6±1,9 s (n=15), p=0,006.

A análise da facilitação por pulsos pareados revelou uma diminuição na facilitação quando o

intervalo entre os pulsos foi de 5-30 ms (FIG. 36 e tabela IX).

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

Controle

0,2 Hz 20 Hz

0 100 200 300 4000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6 0,2 Hz

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

U-73122

0,2 Hz 20 Hz

Controle U73122 0

20

40

60

80

100

(n=18)

% D

ep

res

sã

o f

ina

l

*

(n=22)

Controle U73122 0

1

2

3

4

5

(n=18)

EP

P (

mV

)

**

(n=22)

Controle U73122 0

20

40

60

80

100

120

140

(n=17)(n=22)

% R

ec

up

era

çã

o f

ina

l ***

Controle U73122 0

5

10

15

20

25

30

(n=17)

% P

ote

nc

iaç

ão

(n=19)

A B C

E F

D

G

100 110 120 130 1400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

EP

P A

mp

. (n

orm

ali

za

do

)

Tempo (s)

U-73122

Controle

20 Hz

FIGURA 35 - Efeito do U-73122 (5 µM) no tamanho dos EPPs, na Depressão, Recuperação e Potenciação. As barras e os símbolos representam a média ± EPM,*p<0,05,

**p<0,01 e ***p<0,001. Nas figuras B, C e D estão especificadas as frequências de estimulação.

0 10 20 30 40 50 600,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

**

*

*

***

Fa

cil

ita

çã

o

(EP

P2

- E

PP

1)/E

PP

1

Intervalos entre os pulsos (ms)


5 M U-73122 (n = 17 a 18)**

FIGURA 36 – Efeito do bloqueio da fosfolipase C na facilitação por pulsos pareados. Os pontos

representam a média ± EPM, *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

TABELA IX – Facilitação por pulsos pareados – Controle x U-73122


Controle

(n = 9 a 10)

5 µM U-73122

(n = 17 a 18)

p

5 1,06 0,04 0,76 0,05 ** 0,001

10 0,92 0,04 0,74 0,04 * 0,02

15 0,87 0,01 0,65 0,03 *** 0,0002

20 0,68 0,02 0,56 0,03 * 0,02

30 0,53 0,02 0,38 0,03 ** 0,004

40 0,31 0,02 0,28 0,02 0,44

50 0,22 0,02 0,21 0,02 0,79

60 0,16 0,02 0,18 0,01 0,45

V. DISCUSSÃO

5.1. Análise da liberação de neurotransmissores na junção neuromuscular

A presença de receptores nicotínicos na região pós-sináptica da junção neuromuscular torna

esta região um detector sensível ao neurotransmissor acetilcolina. Portanto, a liberação de

acetilcolina é facilmente detectada por registros intracelulares na fibra muscular (DEL

CASTILLO & KATZ, 1957). Assim, o registro da liberação espontânea e evocada na junção

neuromuscular permite o estudo da liberação de neurotransmissores.

A liberação de acetilcolina na junção neuromuscular pode ocorrer de duas formas:

espontânea ou evocada por um estímulo nervoso. Registros eletrofisiológicos possibilitam a

medição de tais formas de liberação através de técnicas que utilizam eletrodos intra e

extracelulares (FATT & KATZ, 1951, 1952).

O registro eletrofisiológico dos potenciais sinápticos evocados requer a adoção de medidas

para bloquear a contração muscular. Como tínhamos o intuito de estudar os mecanismos de

depressão e facilitação por pulsos pareados em condições fisiológicas, descartamos a

possibilidade da utilização de baixa concentração de cálcio e alta concentração de

magnésio. Outras alternativas para a realização do bloqueio da contração muscular são a

fibra cortada ou cut fiber, a utilização de formamida ou curare. O método de cut fiber

consiste na dilaceração das fibras musculares com um estilete de forma a bloquear a

geração e a condução do potencial de ação na fibra muscular. As propriedades elétricas da

membrana da fibra muscular são alteradas e verificadas por uma grande despolarização do

potencial de membrana (BARSTAD, 1962; BARSTAD & LILLEHEIL, 1968; DODSON &

FORSYTHE, 2004; SABATINI & REGEHR, 1999). A utilização da formamida consiste na

destruição dos túbulos T da membrana da fibra muscular durante a mudança da preparação

nervo-músculo de uma solução hipertônica de formamida para uma solução isosmótica

normal. Este tratamento também altera as propriedades elétricas da membrana da fibra

muscular e como consequência verifica-se também uma grande despolarização do potencial

de membrana (DODSON & FORSYTHE, 2004; ESCALONA DE MOTTA et al., 1982a, b;

HERRERA, 1984; SABATINI & REGEHR, 1999).

Considerando que o curare não despolariza a membrana da fibra muscular, em nosso

estudo nós o utilizamos para realizar o bloqueio da contração muscular. Esta prática tem a

vantagem de produzir menores potenciais sinápticos evocados, o que minimiza o problema

da correção de somação não linear (MARTIN, 1955). O curare, além do efeito pós-sináptico

de bloqueio do receptor nicotínico, também pode apresentar efeitos pré-sinápticos, como a

interferência no processo de liberação de transmissores em situações de alta frequência de

estimulação (GIBB & MARSHALL, 1984; GLAVINOVÍC, 1979; MAGLEBY et al., 1981). No

entanto, mesmo podendo interferir no processo de liberação de neurotransmissores

verificamos que nosso protocolo para o estudo da depressão sináptica era adequado, pois

em uma situação de estimulação de alta frequência evidenciamos que a depressão

apresentava origem pré-sináptica e relacionada a uma alteração na concentração de cálcio

intracelular. Com relação à facilitação por pulsos pareados existem evidências de que as

preparações tratadas com curare apresentam uma maior facilitação com menores intervalos

entre os pulsos (MATZNER et al., 1988), entretanto, nós estudamos a facilitação nas

condições controles e experimentais nas mesmas concentrações de curare. Nós

observamos um efeito de diminuição dos EPPs com o tempo, mesmo em baixas frequências

de estimulação nervosa (0,2 Hz), e este efeito se estabilizava por volta do terceiro pulso. No

intuito de impedir a interferência de tal efeito em nossas medições, nós analisamos somente

os 10 últimos pulsos dos 35 pulsos aplicados ao terminal nervoso. Além disso, a facilitação

por pulsos pareados encontrada em nosso estudo apresenta um decaimento de natureza

exponencial também encontrado em outros estudos (ATLURI & REGEHR, 1996; MAGLEBY

& ZENGEL, 1982) e uma maior facilitação à menores intervalos entre os pulsos

(MUKHAMEDYAROV, et al., 2006, 2009).

Todos os experimentos, controles e experimentais, foram realizados nas mesmas condições

experimentais. Além disso, o curare continua a ser uma ferramenta muito utilizada para o

bloqueio da contração muscular em diversos estudos eletrofisiológicos (BENNETT et al.,

2007; HACHISUKA, et al., 2007; KUBOTA et al., 2005). Portanto nossas condições

experimentais estavam adequadas para justificar a metodologia de análise empregada.

5.2. Plasticidade sináptica

Inicialmente nosso objetivo consistia na análise da depressão final e da facilitação por

pulsos pareados. No entanto, no decorrer do estudo e das análises verificamos a

possibilidade do estudo de outros parâmetros, como a recuperação final e a potenciação.

Estes parâmetros estão relacionados aos fenômenos de plasticidade estudados e

contribuem para o entendimento de tais fenômenos.

Os mecanismos envolvidos na transmissão sináptica no sistema nervoso periférico são

relevantes para a compreensão de como os circuitos neurais no SNC são continuamente

alterados (PERSONIUS & BALICE-GORDON, 2000). Informações provenientes de outros

tecidos e sistemas esclarecem sobre o papel da liberação de cálcio intracelular nos

neurônios. Na JNM a plasticidade sináptica à curto prazo contribui para o aumento da

margem de segurança que está relacionada ao controle de movimento (MUKAMEDYAROV

et al., 2009; WOOD & SLATER, 1997, 2001).

5.2.1. Depressão sináptica

A estimulação nervosa repetida em situações de concentração normal de cálcio pode

ocasionar a diminuição dos potenciais pós-sinápticos, sendo comumente denominada de

depressão sináptica. O mecanismo de depressão pode estar relacionado à diminuição da

liberação pré-sináptica de transmissores e/ou à diminuição da sensibilidade dos receptores

pós-sinápticos ao transmissor. Na JNM de rã uma diminuição na liberação de

neurotransmissores está envolvida na depressão sináptica (BETZ, 1970; DEL CASTILLO &

KATZ, 1954b; VAN DER KLOOT & MOLGÓ, 1994; WU & BETZ, 1998; ZUCKER, 1989) e a

sensibilidade dos receptores pós-sinápticos medida através da amplitude dos MEPPs não

está alterada (DEL CASTILLO & KATZ, 1954b; ZENGEL & SOSA, 1994). A diminuição na

liberação de transmissores pode ser causada pela depleção do pool de vesículas

prontamente liberáveis, ou por uma diminuição na probabilidade de liberação. Em alguns

casos, a intensidade da depressão pode ser diminuída com a redução da quantidade de

transmissores liberados, como ocorre nas situações de baixo cálcio. Este fato sugere que

durante a depressão ocorre a depleção do pool de vesículas prontamente liberáveis

(ZUCKER, 1989). A diminuição na probabilidade de liberação pode ser causada por uma

diminuição no influxo pré-sináptico de cálcio seguido de um potencial de ação ou uma

modulação direta da maquinaria de cálcio intracelular (BETZ, 1970; OTSUKA et al., 1962).

Takeuchi e Takeuchi (1962) mostraram que o potencial de ação pré-sináptico na JNM de

lagostina não está alterado durante a depressão. Portanto, o mecanismo da depressão

parece não estar relacionado às alterações no potencial de ação, o que exclui a

possibilidade de um influxo reduzido de cálcio ser devido à variações no potencial de ação

(BETZ, 1970). Entretanto, pode ser que o influxo de cálcio seja diminuído durante a

depressão por bloqueio dos canais de cálcio durante este processo. Existem também relatos

de diminuição da liberação de neurotransmissores por ativação de receptores nicotínicos

pré-sinápticos e bloqueio de canais para cálcio (VAN DER KLOOT et al., 1997) e este

mecanismo pode estar ativado durante a depressão.

Verificamos que as preparações tratadas com o quelante de cálcio intracelular, BAPTA-AM,

apresentaram EPPs menores. Este resultado sugere uma menor liberação de

neurotransmissores em uma situação de menor concentração intracelular de cálcio. Nossos

resultados evidenciaram uma menor depressão nestas preparações, o que sugere que o

aumento na concentração intracelular de cálcio está relacionado à depleção de vesículas

sinápticas e à depressão sináptica. Nosso resultado sugere que o mecanismo da depressão

sináptica está relacionado a um aumento na concentração intracelular de cálcio rápido e

localizado próximo dos canais de cálcio presentes no terminal pré-sináptico. Esta hipótese é

corroborada por estudos anteriores que verificaram que a micro injeção de EGTA, um

quelante mais lento de cálcio, em preparações nervo músculo não apresentaram alteração

na depressão sináptica (SWANDULLA et al., 1991).

O estudo do efeito do BAPTA-AM sobre a depressão também nos permitiu verificar que a

recuperação da depressão e a potenciação pós-tetânica também são fenômenos sensíveis

às variações da concentração intracelular de cálcio. Na situação de menor concentração

intracelular de cálcio verificamos que tanto a recuperação como a potenciação foram

maiores. A recuperação e a potenciação são fenômenos correlacionados e mais facilmente

visualizados em situações de baixa concentração de cálcio. Depressão e potenciação

apresentam o mesmo curso temporal (KALKSTEIN & MAGLEBY, 2004; MAGLEBY &

ZENGEL, 1982), mas em situações de baixa concentração de cálcio a potenciação torna-se

mais evidente. Verificamos também que a recuperação ocorreu mais rapidamente. Portanto,

tanto a intensidade, quanto a velocidade da recuperação dependem da concentração do

cálcio intracelular.

Assim, nossos resultados demonstram que a intensidade dos fenômenos de depressão,

recuperação e potenciação são sensíveis as variações da concentração de cálcio

intracelular.

Nossos resultados demonstram que nosso protocolo de depressão é adequado para o

estudo deste fenômeno de plasticidade sináptica, uma vez que ele reflete uma alteração

pré-sináptica, ou seja, uma alteração na concentração intracelular de cálcio e consequente

alteração na liberação de neurotransmissores.

5.2.2. Facilitação por pulsos pareados

Com relação à facilitação por pulsos pareados já foi demonstrado que este fenômeno de

plasticidade sináptica à curto prazo também é sensível às variações na concentração

intracelular de cálcio (MUKHAMEDYAROV et al., 2009; TANABE & KIJIMA, 1992; VAN DER

KOOT & MOLGÓ, 1993). Apesar de a facilitação ser um dos fenômenos de plasticidade

mais estudados e frequentemente relacionada ao cálcio residual, os mecanismos envolvidos

neste processo não estão completamente esclarecidos. A hipótese do cálcio residual propõe

que parte do cálcio que entra no terminal após o primeiro pulso é depurado lentamente,

portanto a entrada de cálcio após o segundo potencial de ação é adicionada ao cálcio

residual já presente, aumentando a liberação de neurotransmissores (BITTNER & SCHATZ,

1981; DODGE & RAHAMIMOFF, 1967; STOCKBRIDGE & HINES, 1982). A liberação de

neurotransmissores requer um aumento na concentração de cálcio de cerca de 50-200 µM

(ZEFIROV & CHERANOV, 2000). Llinás et al. (1992) demonstraram que a concentração de

cálcio intracelular nos microdomínios, onde ocorre a liberação de neurotransmissores, é de

aproximadamente 200-300 µM. No entanto, a concentração residual de cálcio no terminal

pré-sináptico, mesmo após uma atividade rítmica de alta frequência e prolongada não

ultrapassa mais que 3-5 µM (ANGLESON & BETZ, 2001). Portanto, a hipótese de cálcio

residual não pode ser a única responsável por tal processo. Até o momento não existem

dados concretos sobre a natureza específica da facilitação. Provavelmente, mecanismos

distintos com diferentes cinéticas e importância podem estar relacionados.

Em nosso estudo, além de quantificarmos através dos registros eletrofisiológicos a

importância dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular em uma mesma

preparação e verificarmos o papel dos receptores de IP3 nos fenômenos de plasticidade

sináptica à curto prazo, depressão e facilitação por pulsos pareados, também buscamos

elucidar os mecanismos envolvidos nestes fenômenos de plasticidade.


5.3. Efeito dos diferentes mecanismos de depuração do cálcio intracelular sobre a

depressão e a facilitação por pulsos pareados

Tendo em vista nossos resultados de diminuição da intensidade da depressão em uma

situação de menor concentração de cálcio intracelular ao incubarmos as preparações com o

BAPTA-AM, nós utilizamos a variação na intensidade de depressão como indicativo da

concentração de cálcio nos microdomínios de liberação de neurotransmissores. Desta

forma, avaliamos a contribuição dos diferentes sistemas depuradores de cálcio durante a

depressão. Nós também verificamos a participação destes sistemas durante estimulações

menos intensas capazes de produzir facilitação. Os primeiros experimentos objetivaram

verificar a contribuição das Ca+2-ATPases do RE (SERCA) e da membrana plasmática

(PMCA). As Ca+2-ATPases pertencem a família de ATPases do tipo P, caracterizadas pela

conservação temporária da energia do ATP na forma de uma enzima fosforilada

intermediária (PEDERSEN & CARAFOLI, 1987). As Ca+2-ATPases apresentam alta

afinidade ao cálcio, mas o transporte é realizado mais lentamente em comparação aos

trocadores Na+/Ca+2 (CARAFOLI, 1991; DIPOLO & BEAUGE, 1983; LEHOSTSKY, 1995).

A contribuição da SERCA foi verificada através da utilização da tapsigargina, um inibidor

não competitivo desta classe de enzima (ROGERS, et al., 1995). Nas células não

musculares a isoforma mais encontrada é a do tipo 2b e 3 (BRINI & CARAFOLI, 2009;

CARAFOLI & BRINI, 2000). A tapsigargina tem a capacidade de prender a bomba no estado

inativo de forma irreversível, sendo a inibição maior em solução livre de cálcio e na presença

de EGTA. Nesta situação o cálcio não pode ser recaptado para o RE, permanecendo por

mais tempo no citoplasma (SAGARA & INESI, 1991). Após o tratamento da preparação

nervo-músculo com tapsigargina verificamos um aumento na amplitude dos EPPs. Este

resultado sugere uma maior liberação de neurotransmissores na situação de maior

concentração de cálcio intracelular. Nossos resultados também evidenciam uma maior

depressão, condizente com a depleção das vesículas sinápticas devido à maior

concentração intracelular de cálcio. A maior recuperação final evidenciada pode ser

justificada por uma liberação lenta do cálcio pela mitocôndria após o término do estímulo

tetânico (TANG & ZUCKER, 1997; VERSTREKEN, 2005). Não verificamos efeito na

potenciação, provavelmente, pelo fato deste fenômeno ser mais facilmente visualizado em

situações de menor concentração de cálcio, no entanto, recuperação e potenciação são

fenômenos correlacionados (KALKSTEIN & MAGLEBY, 2004; MAGLEBY & ZENGEL,

1982).

Com relação à facilitação por pulsos pareados, verificamos uma maior facilitação quando o

intervalo entre os pulsos foi de 5 a 15 ms. Este resultado evidencia a importância deste

mecanismo de depuração de cálcio intracelular no fenômeno de facilitação e indica a

possível localização do RE próximo das zonas ativas, como já demonstrado

morfologicamente por Westrum & Gray (1986). O efeito significativo somente nos menores

intervalos entre os pulsos sugere a participação da SERCA na primeira fase da facilitação,

onde os mecanismos envolvidos encontram-se próximos dos locais de liberação de

neurotransmissores (MUKHAMEDYAROV et al., 2009). Além disto, este resultado sugere

que a SERCA é um mecanismo de depuração rápido quando ocorrem variações na

concentração intracelular de cálcio.

O segundo mecanismo de depuração do cálcio intracelular estudado foi a Ca+2-ATPase da

membrana plasmática (PMCA). No tecido nervoso as isoformas do tipo 1, 3 e 4 são as mais

encontradas (BRINI & CARAFOLI, 2009). Diferentemente da SERCA, não existe um inibidor

específico da PMCA como a tapsigargina é para a SERCA. No entanto, a CEDA é a

ferramenta farmacológica mais frequentemente utilizada e considerada mais adequada para

o bloqueio (BASSANI, et al., 1995; CHOI & EISNER, 1999; GATTO et al., 1995).

Nossos resultados não evidenciaram nenhum efeito sobre os parâmetros analisados na

depressão e nem na facilitação por pulsos pareados, o que sugere que a PMCA como

mecanismo de depuração do cálcio intracelular não apresenta uma importância significativa

nesta preparação. De forma contrária, Jensen et al. (2007) verificaram que o bloqueio da

PMCA com CEDA aumentou a frequência das correntes excitatórias pós-sinápticas e a

facilitação por pulsos pareados na região hipocampal CA3 de ratos. Neste mesmo trabalho

também foi realizado o bloqueio da SERCA com ácido ciclopiazônico (CPA) e nenhum efeito

foi encontrado. Outros estudos na JNM de rã (BENNET, et al., 2007; SUZUKI, et al., 2002) e

de lagostina (LIN, et al., 2005) também não verificaram uma contribuição importante da

PMCA no sequestro de cálcio citoplasmático. Portanto, diferentes preparações podem

apresentar mecanismos distintos para o controle da concentração intracelular de cálcio.

Outra organela importante para a homeostase do cálcio intracelular é a mitocôndria. A

mitocôndria apresenta em sua membrana dois sistemas de transporte que contribuem para

o controle da concentração intracelular de cálcio. O trocador Na+/Ca+2 (NCXm) e o uniporter

mitocondriais (MCU) (CARAFOLI, 1987). O NCXm opera de forma eletroneutra, mas pode

operar em alguns casos eletrogenicamente na direção do efluxo de Ca+2, ou seja, trocando

mais de dois íons Na+ para cada íon Ca+2 (CROMPTON et al., 1976). Em situações de

grande aumento da concentração intracelular de cálcio o NCXm pode atuar de modo reverso

(GRIFFITHS, 1999; SMETS et al., 2004). Portanto, resolvemos também investigar o papel

deste trocador no sequestro do cálcio intracelular.

Um dos fatores limitantes para o esclarecimento do papel do NCXm na fisiologia celular é a

ausência de informação sobre sua estrutura molecular. Nenhum gene do NCXm foi

encontrado no genoma mitocondrial (ANDERSON et al., 1981; BARRELL et al., 1980), o que

sugere que o NCXm é codificado por um gene nuclear, transferido para o citoplasma e

posteriomente para a mitocôndria. O mesmo acontece para o uniporter mitocondrial.

Utilizamos o bloqueador CGP37157 (COX et al., 1993) e verificamos que a intensidade da

depressão é maior e sua instalação é mais lenta. Este resultado sugere a atuação do NCXm

como mecanismo depurador do cálcio citoplasmático em situações de aumento de sua

concentração intracelular. Entretanto, sua cinética é diferenciada, pois a instalação da

depressão é mais lenta, o que indica que este mecanismo de depuração pode ser utilizado

mais tardiamente durante a depressão. Sugerimos que a SERCA seja o principal

mecanismo de depuração pela maior intensidade de depressão apresentada e instalação

mais rápida. No entanto, devemos considerar o fato do CGP também ativar a liberação de

cálcio (HERNÁNDEZ-SANMIGUEL et al., 2006) e reduzir o repreenchimento do RE

(ARNAUDEAU et al., 2001; MALLI et al., 2005). Portanto, a maior depressão final observada

pode estar relacionada à liberação de cálcio pelo RE e não à inibição do trocador NCXm ao

atuar de forma reversa e como depurador de cálcio intracelular.

O bloqueio do NCXm também apresentou efeitos sobre a recuperação e a potenciação pós-

tetânica. Verificamos uma recuperação mais lenta e uma menor potenciação, resultado este

mais condizente com a função do trocador. O bloqueio do trocador impede a extrusão de

cálcio pela mitocôndria após o estimulo tetânico, o que acaba por influenciar a recuperação

e a potenciação pós-tetânica. Nossos resultados assemelham-se com resultados de

trabalhos anteriores em outras preparações que demonstraram que a mitocôndria é capaz

de sequestrar o cálcio que entra no terminal nervoso durante a estimulação repetida numa

frequência que pode exceder 10-20 Hz (GARCÍA-CHACON et al., 2006). O sequestro de

cálcio pela mitocôndria contribui para a liberação de neurotransmissores, de forma a

minimizar a depleção de vesículas sinápticas após a tetania (DAVID & BARRETT, 2003).

Além disso, Tong (2007) verificou na JNM de drosófila um aumento significativo na

densidade de mitocôndrias nas sinapses estimuladas tetanicamente, enquanto que nas

sinapses não estimuladas, a densidade desta organela não foi alterada. Este rearranjo é

considerado essencial para a potenciação pós-tetânica.

No que se refere à facilitação por pulsos pareados, não verificamos nenhum efeito. Portanto,

sugere-se que o NCXm não atua como um mecanismo de depuração neste fenômeno de

plasticidade à curto prazo.

Outro sistema de transporte de cálcio presente na membrana mitocondrial é o uniporter. O

MCU consiste em um canal iônico altamente seletivo presente na membrana interna da

mitocôndria que permite a recaptação do cálcio citoplasmático para o interior desta

organela. O cálcio atravessa a membrana mitocondrial interna graças ao gradiente de força

representado pelo potencial transmembrana negativo (RIZZUTO et al., 2000, 2004). O

Ru360 foi utilizado em nosso estudo para verificar a participação do MCU como mecanismo

depurador do cálcio intracelular na depressão e facilitação por pulsos pareados (MATLIB et

al., 1998; ZAZUETA et al., 1999). Verificamos que as preparações nervo-músculo tratadas

com o Ru360 apresentaram uma menor intensidade de depressão. Hernandez-Guijo et al.,

(2001) demonstraram em células cromafins que o bloqueio da recaptação de cálcio pela

mitocôndria aumenta a inibição das correntes de cálcio dependentes de voltagem. Já foi

demonstrado que o Ru360 produz uma redução nos transientes de cálcio induzidos por

estimulação na JNM de lagarto. Este efeito decorre da redução da entrada de cálcio pela

inibição dos canais de cálcio presentes na membrana plasmática, principalmente os do tipo

N (DAVID et al., 1997; 1999). Portanto, nossa observação mostrando que houve uma

depressão de menor intensidade sugere que o Ru360 tenha bloqueado os canais de cálcio

voltagem-dependentes. A entrada reduzida de cálcio leva a uma menor liberação de

neurotransmissores e consequentemente uma depressão de menor intensidade como

verificamos. A análise dos demais parâmetros da depressão e a análise da facilitação por

pulsos pareados não apresentaram nenhuma diferença, o que sugere que este mecanismo

de depuração do cálcio intracelular não deve desempenhar um papel importante nestes

fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo na junção neuromuscular. No entanto, o

efeito do Ru360 sobre os canais de cálcio pode ter comprometido a análise do papel do

MCU.

A membrana plasmática também apresenta um trocador Na+/Ca+2 capaz de extrudar o

cálcio. Este sistema de transporte pertence a uma família de proteínas que transporta três

íons sódio para cada íon cálcio bidirecionalmente através da membrana plasmática

(CARAFOLI et al., 2001). O transporte é considerado eletrogênico (LAGNADO &

MCNAUGHTON, 1990). O gradiente eletrogênico para o transporte realizado pelo trocador é

o gradiente de concentração do sódio, do cálcio e o potencial de membrana (ANNUNZIATO

et al., 2004; HINATA & KIMURA, 2004). O tecido nervoso apresenta praticamente todas as

isoformas deste trocador (LI et al., 2000; THURNEYSEN et al., 2002).

Na ausência de um inibidor específico do NCX da membrana plasmática, realizamos o

bloqueio deste através da substituição da solução de Ringer normal pela solução de Ringer

lítio. Na ausência de sódio no meio extracelular o cálcio não pode ser extrudado pelo

trocador, permanecendo por mais tempo no citoplasma (HERMONI et al., 1987).

Verificamos que as preparações incubadas com a solução de Ringer lítio apresentaram

EPPs menores, maior depressão final, menor potenciação e menor facilitação quando o

intervalo entre os pulsos foi de 5 a 50 ms. Nossos resultados podem refletir uma

contribuição deste mecanismo de depuração na depressão e facilitação por pulsos

pareados, no entanto alguns aspectos devem ser esclarecidos antes de sugerirmos uma

participação. Caso o trocador atue realmente como um mecanismo de depuração nesta

preparação, seu bloqueio desencadearia um aumento na concentração intracelular de cálcio

e possíveis alterações nos fenômenos estudados. Estas alterações poderiam refletir um

aumento de intensidade da depressão e da facilitação por pulsos pareados. No entanto, os

efeitos do lítio sobre o conteúdo quântico e a liberação espontânea encontrados na literatura

são contraditórios. Crawford (1975) e Brainsteanu & Volle (1975) verificaram um aumento do

conteúdo quântico e da frequência dos MEPPs, enquanto que Benoit et al., (1973) e

Onodera & Yamakawa (1966) evidenciaram uma diminuição do tamanho e do conteúdo

quântico. Nossos resultados assemelham-se mais ao efeito inibitório do lítio na liberação de

neurotransmissores. Assim, a substituição do Ringer normal pelo Ringer lítio não foi uma

ferramenta adequada para bloquearmos o NCX da membrana plasmática. EPPs com

menores amplitudes, menor potenciação e facilitação por pulsos pareados são resultados

que podem refletir uma menor liberação de neurotransmissores. Alguns trabalhos

evidenciam que o lítio pode diminuir a velocidade de condução do potencial de ação e

reduzir a excitabilidade do terminal nervoso, bloqueando a neurotransmissão (ORTIZ &

JUNGE, 1978). Além disso, a permeabilidade dos receptores nicotínicos ao lítio é reduzida

quando comparada ao sódio (WATANABE & NARAHASHI, 1979). Estes efeitos podem

justificar os resultados encontrados, inclusive a maior depressão. Nesta situação a

depressão pode não estar relacionada à depleção de vesículas sinápticas decorrente de um

aumento na concentração intracelular de cálcio, mas sim a um bloqueio da

neurotransmissão (KELLY, 1968) ou a uma diminuição da sensibilidade do canal da placa

motora na presença no lítio (WATANABE & NARAHASHI, 1979).

Portanto, dentre os mecanismos de depuração estudados verificamos que somente a

SERCA apresenta uma contribuição nos fenômenos de depressão e facilitação por pulsos

pareados e talvez o NCXm na depressão. A ausência de efeito na depressão e na facilitação

por pulsos pareados quando realizamos o bloqueio da PMCA e do uniporter mitocondrial

sugere que estes mecanismos não apresentam importância significativa na depuração de

cálcio intracelular na plasticidade sináptica à curto prazo na JNM.

O bloqueio do NCX da membrana plasmática através da substituição do Ringer normal pelo

Ringer lítio não foi uma ferramenta adequada, mas podemos considerar que a presença de

íons sódio no meio extracelular é essencial para a neurotransmissão (SABATINI &

REGEHR, 1999). Apesar de não podermos verificar adequadamente o papel do NCX da

membrana plasmática como mecanismo de depuração do cálcio intracelular na depressão e

na facilitação por pulsos pareados, dados da literatura sugerem que este trocador não é o

principal participante da regulação da liberação de neurotransmissores dependente de

cálcio. Os NCX da membrana plasmática encontram-se concentrados no terminal nervoso,

mas não estão presentes nas zonas ativas onde as vesículas sinápticas estão posicionadas

e os canais de cálcio estão localizados (JUHASOVA et al., 2000; LUTHER et al., 1992).

Nossos resultados sugerem uma importante contribuição da mitocôndria no fenômeno de

potenciação como já demonstrado em estudos anteriores (DAVID & BARRETT, 2003;

GARCÍA-CHACON et al., 2006; TONG, 2007). Ao bloquearmos a SERCA verificamos uma

maior recuperação final. A recuperação e a potenciação são fenômenos correlacionados e

como já mencionados podem estar relacionados com a liberação lenta de cálcio pela

mitocôndria. Quando realizamos o bloqueio do NCXm verificamos uma menor potenciação e

uma recuperação mais lenta. Estes resultados confirmam a importância da mitocôndria na

potenciação pós-tetânica.

Podemos fazer uma correlação dos nossos resultados com os resultados obtidos por

Bennett et al., (2007). Neste trabalho foi verificado que diferentes mecanismos de depuração

do cálcio intracelular apresentam diferentes contribuições nos fenômenos de plasticidade

sináptica. A facilitação a qual o autor se refere consiste no aumento da concentração

intracelular de cálcio seguida de uma estimulação de alta frequência e curta duração. No

entanto, a mensuração da variação da concentração intracelular de cálcio não é uma

medida direta de alteração nos fenômenos de plasticidade como o registro eletrofisiológico

realizado em nosso trabalho. Também foi verificada uma contribuição importante do RE e da

mitocôndria como mecanismos de depuração. Com relação à PMCA, foi verificada uma

pequena contribuição deste mecanismo no sequestro de cálcio citoplasmático. Para verificar

a contribuição da mitocôndria foi utilizado o CCCP, um desacoplador metabólico da

mitocôndria que dissipa o gradiente de prótons na membrana mitocondrial interna, liberando

cálcio para o citoplasma (PENG, 1998). No entanto, esta ferramenta não é específica para

nenhum transportador ou trocador presente na mitocôndria. Portanto, nosso trabalho

mostra-se mais adequado para o estudo da participação de diferentes mecanismos de

depuração do cálcio intracelular em fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo, por

utilizar o registro eletrofisiológico e bloqueadores direcionados.

O efeito predominante do bloqueio da SERCA na depressão e facilitação por pulsos

pareados sugere que este mecanismo de depuração apresenta maior importância. O RE

parece estar mais envolvido no ajuste fino da concentração citosólica de cálcio. Já a

mitocôndria apresenta um papel secundário nestes fenômenos. A recaptação de cálcio pela

mitocôndria é de baixa afinidade, apesar de sua grande capacidade de estocagem deste íon

(VERCESI et al., 1978). A afinidade da mitocôndria ao cálcio é insuficiente para que esta

apresente um papel importante na regulação do cálcio intracelular quando a concentração

intracelular de cálcio é sub-µM (CROMPTON et al., 1976). O RE atua como um estoque

imediato de cálcio, enquanto a mitocôndria parece estar mais envolvida na potenciação pós-

tetânica.

5.4. Efeito da brevetoxina na liberação espontânea

Neurotoxinas são ferramentas importantes para o estudo da fisiologia das sinapses.

Brevetoxinas são poliéteres cíclicos lipossolúveis produzidos pelos dinoflagelados

Ptychodiscus brevis (BADEN, 1989). Esta toxina apresenta efeitos nas fibras nervosas

mielinizadas e nas junções neuromusculares de vertebrados. O alvo molecular desta toxina

é a quinta alça transmembrânica do canal de sódio, uma proteína essencial para a

excitabilidade celular (GAWLEY et al., 1992; MATTEI et al., 1999; POLI et al., 1986). A

PbTx-3 em concentrações nanomolares aumenta a permeabilidade ao sódio em células

excitáveis, e consequentemente afeta vários mecanismos sódio-dependentes nas células

nervosas. Esta ação é atribuída a uma modificação dos canais de sódio, que permanecem

permanentemente abertos, inclusive em potenciais de repouso da membrana, ao invés de

permanecerem no estado fechado. Como consequência, as brevetoxinas causam uma

despolarização do potencial de membrana, e consequentemente um aumento da liberação

espontânea na JNM (ATCHISON et al., 1986).

A PbTx-3 foi utilizada para identificarmos indiretamente a presença do receptor de IP3 na

junção neuromuscular, visto que o efeito da PbTx-3 de aumento da concentração de IP3 e

aumento da liberação de cálcio intracelular via IP3R em outras preparações já é conhecido

(LIBERONA et al., 2008).

A concentração utilizada de PbTx-3 foi 50 nM, pois estudos anteriores demonstraram que

esta concentração permite o monitoramento do potencial de repouso, apesar da

despolarização da membrana das fibras musculares de cerca de 8 - 18 mV (MEUNIER,

1997). Nossos resultados confirmam que a entrada de sódio pelos canais de sódio sensíveis

à TTX está envolvida no aumento da liberação espontânea produzida pela PbTx-3

(MEUNIER, 1997).

No intuito de esclarecer se o mecanismo de ação da PbTx-3 envolve a liberação de cálcio

de estoques sensíveis à tapsigargina utilizamos a tapsigargina. A tapsigargina produziu um

aumento na frequência dos MEPPs, o que sugere que o bloqueio da Ca+2-ATPase é capaz

de aumentar a concentração citosólica de cálcio. Este efeito está relacionado ao aumento

dos EPPs na presença de tapsigargina já demonstrado por Castonguay e Robitaille (2001).

A tapsigargina pode induzir o aumento da concentração citosólica de cálcio, que ocorre pela

liberação de cálcio dos estoques sensíveis à IP3 sem a hidrólise de fosfolipídios de inositol

(JACKSON et al., 1988). O aumento da frequência dos MEPPs quando realizamos a

incubação da preparação com PbTx-3 e tapsigargina foi menor do que na ausência de

tapsigargina. Portanto, a PbTx-3 aumenta a liberação espontânea pela liberação de cálcio

de estoques intracelulares sensíveis à tapsigargina.

Estudos anteriores demonstraram que o mecanismo de ação da PbTx-3 não envolve a

liberação de cálcio da mitocôndria ou dos receptores de rianodina (LIBERONA et al., 2008).

O aumento na frequência dos MEPPs pela PbTx-3 não é bloqueado por agentes

farmacológicos conhecidos por impedir a liberação de cálcio de estoques intracelulares,

como o TMB-8, heparina e dantrolene (MEUNIER, 1997). Entretanto, a utilização de alguns

agentes, como a heparina, pode não ser a mais adequada. A heparina bloqueia os IP3Rs,

mas apresenta uma lenta difusão na célula (NILSSON et al., 1988; WARRIER, 2005), além

de apresentar outros efeitos como o desacoplamento de proteínas G e a ativação de

receptores de rianodina (BEZPROZVANNY, 1993; DASSO & TAYLOR, 1991; EHRLICH et

al., 1994). Portanto, para investigar se o mecanismo de ação da PbTx-3 está relacionado à

ativação dos IP3Rs é necessária a utilização de agentes farmacológicos mais específicos.

Nossos resultados demonstram que o 2-APB e o U-73122 bloqueiam o efeito da PbTx-3 de

aumento da liberação espontânea. Apesar do 2-APB também poder inibir a Ca+2-ATPase do

RE e de bloquear a entrada de cálcio operada por estoques, utilizamos uma concentração

que não apresentou efeito na frequência e na amplitude dos MEPPs (dado não mostrado)

(BOOTMAN et al., 2002). Esta mesma concentração foi utilizada nos experimentos para

estudo da plasticidade sináptica à curto prazo. Portanto, concluímos que a PbTx-3 aumenta

a frequencia dos MEPPs pela ativação da fosfolipase C (PLC) e dos IP3Rs.

A ativação da PLC e a consequente ativação dos IP3Rs pode estar relacionada à vários

mecanismos. O grande influxo de sódio pode ativar proteínas G, as vias de sinalização da

PLC e do fosfatidil inositol 3-quinase (ELTIT et al., 2004, 2006). Gusovsky e Daly (1988)

sugere que o aumento da concentração intracelular de sódio pode ativar diretamente a PLC.

A ativação da PLC ocasiona a formação de segundos mensageiros como o diacilglicerol

(DAG) e o IP3. O IP3 é capaz de desencadear a liberação de cálcio de estoques

intracelulares, mais especificamente do RE. O DAG juntamente com o cálcio estimula a

proteína quinase C (PKC) e esta está envolvida na fosforilação de componentes do

complexo SNARE, possibilitanto o acesso das vesículas aos locais de liberação na

membrana plasmática (CATTERALL, 1999; MORGAN et al., 2005; VAUGHAN et al., 1998).

A PLC também é capaz de modular a liberação de neurotransmissores pela fosforilação de

substratos de proteínas envolvidas no recrutamento de vesículas sinápticas e no processo

de exocitose (BROWN & SIHRA, 2008; GILMAN, 1987).

Portanto, a entrada de sódio e ativação de cascatas intracelulares envolvidas na liberação

de neurotransmissores proporcionam o aumento da liberação espontânea. Nossos

resultados, além de auxiliarem na elucidação do mecanismo de ação da PbTx-3, sugerem a

presença do IP3R e da PLC e o importante papel destes na modulação da liberação de

neurotransmissores na JNM.

5.5. Efeito dos receptores de rianodina e de IP3 sobre a depressão e a facilitação por

pulsos pareados

O esclarecimento do papel do IP3R na plasticidade sináptica à curto prazo na JNM é um dos

objetivos de nosso trabalho, no entanto, também verificamos o papel do RyR no intuito de

realizarmos uma comparação destes dois canais liberadores de cálcio presentes na mesma

organela.

No terminal pré-sináptico da JNM de rã a principal isoforma encontrada do RyR é a do tipo 3

(KUBOTA et al., 2005). Com o bloqueio dos RyRs verificamos uma depressão menor e de

instalação mais lenta. Com relação à facilitação por pulsos pareados evidenciamos uma

menor facilitação quando o intervalo entre os pulsos foi de 5-15 ms. Portanto, nossos

resultados sugerem uma importante contribuição do cálcio liberado pelos receptores de

rianodina nestes fenômenos de plasticidade sináptica à curto prazo.

Narita et al., (1998, 2000) demonstraram que o mecanismo de CICR na JNM de rã necessita

da entrada de cálcio através da estimulação tetânica. Os RyRs localizam-se próximos dos

canais de cálcio presentes no terminal pré-sináptico e amplificam a exocitose evocada por

impulsos e a plasticidade sináptica (KUBOTA et al., 2005; NARITA et al., 2000).

Posteriormente, este mesmo grupo de pesquisadores demonstrou que a CICR ocorre em

resposta à entrada de cálcio, na ausência de estimulação tetânica (KUBOTA et al., 2005).

Em nosso protocolo de estimulação tetânica verificamos depressão sináptica em contraste

com os resultados encontrados por Narita et al., (1998, 2000) que observaram potenciação.

Narita et al., (1998) não observaram alteração na facilitação após a estimulação tetânica de

curta duração, porém, a aumentação e a potenciação aumentaram após a estimulação

tetânica de longa duração. Realizamos nosso estudo em condições de conteúdo quântico

normal (1,8 mM Ca+2). Nestas condições a depressão é observada imediatamente após a

estimulação tetânica, ao invés de pronunciada aumentação e potenciação, comumente

encontradas em situações de baixo cálcio (KALKSTEIN & MAGLEBY, 2004). Além disso, a

facilitação referida no trabalho de Narita et al. (1998, 2000), não é a facilitação por pulsos

pareados que estudamos, e sim o aumento da amplitude dos EPPs. Neste caso, para uma

melhor comparação de efeito na facilitação a amplitude dos MEPPs também deve ser

considerada.

Nosso resultado de menor facilitação por pulsos pareados quando o intervalo entre os

pulsos foi de 5-15 ms está de acordo com o rápido aumento na concentração intracelular de

cálcio observada após o disparo do potencial de ação (LLINÁS et al., 1995a, b), com a

localização dos RyRs próxima dos canais de cálcio no terminal pré-sináptico (KUBOTA et

al., 2005; NARITA et al., 2000) e com a ocorrência da CICR mesmo na ausência de

estimulação tetânica (KUBOTA et al., 2005).

As três isoformas dos IP3Rs são expressas na maioria dos tipo celulares, o que sugere a

importância deste receptor em vários processos fisiológicos (DE SMEDT et al., 1997;

FUJINO et al., 1995, TAYLOR et al., 1999). No tecido nervoso a isoforma mais comumente

encontrada é a do tipo 1 (FURUICHI et al., 1993; NAKAGAWA et al., 1991), entretanto, não

se sabe qual isoforma é expressa no terminal pré-sináptico das junções neuromusculares.

A sinalização do cálcio intracelular mediada pelos IP3Rs é importante para a

neurotransmissão e a plasticidade sináptica, visto que a formação de IP3 pode ocorrer

seguida a ativação de receptores presentes na membrana plasmática por

neurotransmissores (COHEN et al., 1998; NISHIZAKI & MORI, 1998; POWER & SAH,

2002). A liberação de cálcio dependente do IP3 (ICICR, do inglês IP3-dependent calcium-

induced calcium release) é um mecanismo comumente encontrado nos neurônios piramidais

do hipocampo, no neocórtex e nas células de Purkinje do córtex cerebelar

(BEZPROZVANNY et al., 1991; FINCH & AUGUSTINE, 1998; NAKAMURA et al., 2000;

TAKECHI et al., 1998). As preparações tratadas com 2-APB apresentaram uma depressão

menor e de instalação mais lenta. Estes dados sugerem que os IP3Rs são ativados durante

estimulação intensa. No entanto, não verificamos nenhum efeito na facilitação por pulsos

pareados. Nossos resultados sugerem a participação dos IP3Rs somente na depressão

sináptica, sendo esta a primeira evidência da participação dos IP3Rs na plasticidade

sináptica à curto prazo na JNM.

Como a PLC está envolvida na formação do IP3, também verificamos seu envolvimento na

depressão sináptica e na facilitação por pulsos pareados. Verificamos que as preparações

tratadas com o inibidor da PLC, U-73122, apresentaram EPPs menores. Este resultado

sugere uma menor liberação de neurotransmissores em uma situação de menor

concentração intracelular de cálcio. Verificamos também uma depressão menor e de

instalação mais rápida. Com relação à recuperação evidenciamos que esta foi maior e mais

rápida. Portanto, sugerimos que a ativação da fosfolipase C é importante para este

fenômeno de plasticidade sináptica à curto prazo. Nossos resultados sugerem que o

provável efeito estimulatório nos IP3Rs durante estimulação prolongada seja mediado pela

fosfolipase C. Este efeito pode ser devido ao aumento na concentração intracelular de sódio

(ELTIT et al., 2004, 2006, GUSOVSKY & DALY, 1988).

Com relação à facilitação por pulsos pareados verificamos uma menor facilitação quando o

intervalo entre os pulsos foi de 5-30 ms, o que sugere também uma importante contribuição

da ativação da fosfolipase C neste fenômeno de plasticidade sináptica à curto prazo.

Entretanto, como nós não observamos alteração na facilitação por pulso pareados por

bloqueio de IP3Rs, o efeito da fosfolipase C na facilitação não deve ser por ativação destes

receptores. Outros alvos da fosfolipase C devem ser investigados.

Nossos resultados evidenciam uma importante contribuição dos IP3Rs e da PLC na

plasticidade sináptica à curto prazo na JNM. Durante a estimulação de alta frequencia do

protocolo de depressão também ocorre uma grande entrada de íons sódio juntamente com o

cálcio. Somente alguns aspectos foram considerados sobre o envolvimento da via de

sinalização do IP3 na neurotransmissão quando discutimos o efeito da PbTx-3 na liberação

espontânea. O diacilglicerol, formado pela ativação da fosfolipase C, juntamente com o

cálcio estimula a proteína quinase C (PKC). A PKC é capaz de modular canais de cálcio

sensíveis à voltagem e consequentemente alterar o influxo pré-sináptico de cálcio

(CATTERALL, 1999; VAUGHAN et al., 1998). A ativação da cascata de sinalização

intracelular do IP3 pode ocorrer com a ativação de diferentes receptores presentes na

membrana celular. Nas células piramidais do hipocampo, a liberação de cálcio de estoques

sensíveis à IP3 e o aumento da potenciação de longo prazo (LTP, do inglês long term

potentiation) são desencadeadas pela ativação de receptores glutamatérgicos, que muito

provavelmente atuam via cascatas intracelulares similares às ativadas por receptores

muscarínicos (COHEN et al., 1998). A ativação de receptores purinérgicos e adrenérgicos

também estão relacionadas com a produção de IP3 (NISHIZAKI & MORI, 1998).

A produção de IP3 induzida pela ativação dos receptores muscarínicos é um dos principais

mecanismos de liberação de cálcio do RE nos neurônios piramidais (POWER & SAH, 2002).

Na sinapse colinérgica da JNM de rã receptores muscarínicos regulam a liberação de ACh.

Dois subtipos de receptores estão envolvidos neste processo. O subtipo 1 (M1) regula o

aumento da liberação de ACh, enquanto que o subtipo 2 (M2) está envolvido na inibição da

liberação (REN & HARTY, 1994; SLUTSKY et al., 1999; VANNUCCHI & PEPEU,1995). O

receptor muscarínico M1 está acoplado à PLC e via proteína G heteromérica (Gq/11)

hidrolisa fosfolipídeos de membrana, produzindo IP3 e DAG (BARDO et al., 2006; ROSE &

KONNERTH, 2001). Portanto, a ativação do receptor muscarínico pré-sináptico na JNM pela

maior quantidade de ACh liberada durante a facilitação por pulsos pareados e a depressão

pode ativar a via de sinalização da PLC, produzir IP3 e DAG e proporcionar modificações na

eficácia sináptica.

Outra alternativa para a ativação da PLC consiste na fosforilação e ativação desta proteína

por proteínas quinases dependentes do cálcio ativadas durante a estimulação tetânica

(KOYANO et al., 1985).

Além dos efeitos da ativação dos RyRs e dos IP3Rs por seus agonistas específicos,

evidências recentes sugerem que o IP3 pode mobilizar cálcio via RyRs e provavelmente de

forma mais eficiente (LOUVET & COLLIN, 2005).

Portanto, verificamos uma importante contribuição dos IP3Rs e da PLC em fenômenos de

plasticidade sináptica à curto prazo. A PLC parece apresentar efeitos variados, pois

verificamos efeito tanto na depressão sináptica quanto na facilitação por pulsos pareados,

muito provavelmente por sua ativação estar relacionada à formação e ativação de outros

componentes, como a PKC e o DAG, também envolvidos na sinalização de cálcio

intracelular.

VI. CONCLUSÃO

Nosso estudo demonstra que a Ca+2-ATPase presente no RE apresenta um importante

papel na depuração do cálcio intracelular na plasticidade sináptica à curto prazo na JNM.

Estudos anteriores já haviam demonstrado tal importância (BENNETT et al., 2007), no

entanto, em nosso estudo realizamos a mensuração da eficácia sináptica através do registro

eletrofisiológico, que é considerado adequado na detecção de alterações quantitativas e

qualitativas da função sináptica. Além disso, o efeito da tapsigargina na facilitação por

pulsos pareados é novo e contribuiu para confirmar o papel primordial da facilitação no

mecanismo de depuração do cálcio intracelular e da presença do RE próximo dos locais de

liberação de neurotransmissores.

Nossos resultados confirmam evidências de estudos anteriores do papel da mitocôndria no

fenômeno de potenciação pós-tetânica (DAVID & BARRETT, 2003). Também sugerimos a

provável importância da mitocôndria no fenômeno de depressão sináptica.

Com relação aos IP3Rs demonstramos indiretamente a presença destes receptores no

terminal pré-sináptico da JNM e sua importância na modulação da liberação de

neurotransmissores através da utilização de um bloqueador para este receptor e para a

enzima PLC envolvida na sua sinalização nos fenômeno de depressão e facilitação por

pulsos pareados. Além disso, estudamos o mecanismo de ação da brevetoxina-3. Nossos

resultados são a primeira evidência da importância do IP3R em fenômenos de plasticidade

sináptica à curto prazo na JNM. Portanto, podemos considerar que os terminais pré-

sinápticos não possuem somente estoques intracelulares de cálcio sensíveis ao IP3, mas

também toda a maquinaria necessária, como receptores metabotrópicos e a enzima

fosfolipase C, para gerar o IP3.

Também evidenciamos que os mecanismos da depressão sináptica e da facilitação por

pulsos pareados estão relacionados à liberação de cálcio de estoques intracelulares

sensíveis ao IP3 e a ativação da fosfolipase C.

Por fim, sugerimos que estes resultados possam contribuir, pelo menos em parte, para um

maior entendimento da plasticidade sináptica na JNM. Além disso, estes resultados podem

ajudar no esclarecimento da plasticidade sináptica de outros sistemas colinérgicos, como no

sistema nervoso central.

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO I – Protocolos experimentais

1) Protocolo do efeito do BAPTA-AM na Depressão.

Ringer 0 mM Ca+2 + 1,8 mM Mg+2

+ 100 M BAPTA-AM / 0,05% DMSO

Ringer 1,8 mM Ca+2

+ 6 M curare

Registro da Depressão

120 minutos

30 minutos

2) Protocolo de bloqueio da Ca+2-ATPase do retículo endoplasmático.

Ringer 0 mM Ca+2 + 2,5 mM

EGTA

+ 2 M Tapsigargina / 0,028%

etanol

Ringer 1,8 mM Ca+2

+ 2 M Tapsigargina / 0,028% etanol + 6 M curare

Registro da Depressão e

da Facilitação por pulsos

pareados

30 minutos

30 minutos

3) Protocolo de bloqueio da Ca+2-ATPase da membrana plasmática.

Ringer Normal

+ 20 M CEDA / 0,17% DMSO

Ringer Normal

+ 6 M curare



pareados

40 minutos

30 minutos

Lavagem

4) Protocolo de bloqueio do trocador Na+/Ca+2 pelo CGP 31157.

Ringer Normal

+ 50 M CGP / 0,05% DMSO

6 M curare



pareados

30 minutos

5) Protocolo de bloqueio do uniporter mitocondrial pelo Ru360.

Ringer Normal

+ 10 M Ru360 / Água deoxigenada

6 M curare



pareados

30 minutos

6) Protocolo de bloqueio do trocador Na+/Ca+2 pela substituição do Ringer normal pelo

Ringer Lítio.

Ringer Normal

6 M curare

Registro da Depressão e da Facilitação por pulsos pareados

30 minutos

Perfusão_Ringer Lítio

(20 min.) 6 M curare

Registro da Depressão e da Facilitação por pulsos pareados

20 minutos

Obs.: Resgistros foram realizados

na mesma fibra sem perda do

empalamento.

7) Protocolos dos experimentos realizados com PbTx-3.

Ringer 0 Ca+2 + 2,5 mM EGTA

Registro da fMEPPs

60 minutos

Adição de 50 nM PbTx-3 à

preparação

Registro da fMEPPs

60 minutos

Adição de TTX, Tapsigargina, 2-APB

ou U-73122

Registro da fMEPPs

30 minutos

Registro da fMEPPs

Ringer 0 Ca+2 + 2,5 mM EGTA

30 minutos

30 minutos

Adição de 50 nM PbTx-3

30 minutos

Registro da fMEPPs

A) B)

Obs.: Resgistros foram realizados

na mesma fibra sem perda do

empalamento.

8) Protocolo de bloqueio do receptor de rianodina pela rianodina.

Ringer Normal

+ 10 M Ry / 0,1% EtOH

6 M curare



pareados

30 minutos

9) Protocolo de bloqueio do receptor de IP3 pelo 2-APB.

Ringer Normal

+ 10 M 2-APB / 0,002% MeOH

6 M curare



pareados

30 minutos

10) Protocolo de bloqueio da fosfolipase C pelo U-73122.

Ringer Normal

+ 5 M U-73122 / 0,05% DMSO

6 M curare



pareados

30 minutos

ANEXO II – Artigos em processo de elaboração e submissão

1) Artigo em processo de submissão

Extracellular calcium-independent increase in quantal secretion induced by brevetoxin-3 is

related to IP3 receptor and phospholipase C.

Priscila E. Silveira1,2, Emmanuelle Girard1, Ligia A. Naves2 and Jordi Molgό1

1 CNRS, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard – FRC2118, Laboratoire de Neurobiologie

Cellulaire et Moléculaire – UPR9040, Gif sur Yvette, France.

2 Laboratório de Eletrofisiologia Celular, Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB-UFMG,

Belo Horizonte, MG, Brazil.

Revista pretendida: Toxicon.

2) Artigo em processo de elaboração

Synaptic plasticity at the neuromuscular junction: the role of IP3 and Ryanodine receptors.

Priscila E. Silveira 1,2, Christopher Kushmerick 1, Jordi Molgό 2 and Ligia A. Naves 1

1 Laboratório de Eletrofisiologia Celular, Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB-UFMG,

Belo Horizonte, MG, Brazil;

2 CNRS, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard – FRC2118, Laboratoire de Neurobiologie

Cellulaire et Moléculaire – UPR9040, Gif sur Yvette, France.

Revista pretendida: Neuroscience Letters ou Neuroreport.

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