olimpÍada argentina de biologia - oabplásmido recombinante se transfiere a una célula bacteriana...

OLIMPÍADA ARGENTINA DE BIOLOGIA

AUSPICIA Y FINANCIA EL MINISTERIO DE EDUCACIÓN, CIENCIA Y TECNOLOGÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS FÍSICO-QUÍMICAS Y NATURALES-

CUADERNILLO TEÓRICO

OAB

Editado por Olimpíada Argentina de Biología

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CONCEPTOS DE LAS CIENCIAS BIOLÓGICAS Sobre la base de los temarios teóricos y prácticos propuestos para la OAB, y

considerando la necesidad de lograr un abordaje del conocimiento actualizado es que

ponemos a su disposición esta guía orientadora, según la bibliografía disponible en

esta Olimpíada, la cual es consultada por los Comités académicos para lograr ideas

que permitan la elaboración de los exámenes de todas las instancias de esta

Olimpíada.

La ampliación de estos contenidos pueden realizarse en cualquier material que

Ud. disponga y que se encuentre acorde a lo aquí especificado.

En esta primera propuesta se presentan los tres tópicos de los temarios teóricos

(Biología Celular, Organismos y Etología, Ecología y Evolución), de los cuales se

seleccionaron algunos puntos en función de las dificultades observadas en ediciones

anteriores de la OAB, entre ellos Biotecnología, Sistemática de animales, Anatomía de

vegetales, Cladismo y conceptos incluidos en Etología. Asimismo se incorporaron

algunas destrezas básicas incluidas en los temarios prácticos de ambos niveles.

Compilación: Lic. y Prof. Analía Barbosa Secretaria Olimpíada Argentina de Biología


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Tópico: Biología Celular Ingeniería genética En 1970 comienza el desarrollo de la tecnología del DNA recombinante, llevando

a métodos de investigación novedosos.

Las técnicas de DNA recombinante se desarrollaron en un principio como

herramientas que permitirían a los científicos obtener una gran cantidad de copias de

cualquier segmento de DNA específico, de manera que éste pudiera estudiarse desde

el punto de vista bioquímico. Esto se realizó en un inicio introduciendo DNA ajeno en

células de microorganismos. En condiciones apropiadas, éste se duplica y transmite a

las células hijas cuando la original se divide. Así una secuencia de DNA específica

puede ser amplificada o clonada para producir millones de copias idénticas que pueden

aislarse en forma pura. En la actualidad son cada vez más importantes los métodos in

vitro.

La tecnología del DNA recombinante tiene varias aplicaciones, una de las que

más avanza es la ingeniería genética, que implica la modificación del DNA de un

organismo para producir nuevos genes con nuevas características. Su desarrollo se

debe al descubrimiento de las enzimas de restricción y de la transformación bacteriana

de los plásmidos. Las bacterias producen enzimas conocidas como de restricción, las

cuales cortan las moléculas de DNA sólo en lugares específicos.

La amplificación de un fragmento de DNA puede lograrse in vitro, con el uso de

polimerasas de DNA de bacterias termorresistentes e in vivo, introduciendo moléculas

de DNA recombinante (vector + inserto DNA) en bacterias u otros microorganismos

como las levaduras.

Las enzimas de restricción son “tijeras moleculares” cuya especificidad permite

realizar cortes del DNA de manera controlada. Existen varias enzimas conocidas, un

ejemplo es Bam HI que reconoce y corta una molécula de DNA en la secuencia de

bases 5´G/GATTCC-3´, otro es EcoRI, que corta la secuencia 5´-G/AATTC-3´.

Muchas de las enzimas empleadas para estudios de DNA recombinante cortan

secuencias polindrómicas, en las cuales una cadena se lee igual que su complemento

pero en sentido opuesto, por ejemplo para 5´-AAGCTT-3´ se lee, 3´-TTCGAA-5´.

Cuando la enzima corta, quedan extremos de cadenas sencillas complementarios a los


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que se denomina “pegajosos” por la posibilidad que poseen de unirse entre sí por

enlaces de hidrógeno. Además, el fragmento puede tratarse con una ligasa de DNA

para lograr una molécula recombinante estable.

En la figura se muestra el mecanismo de acción de una enzima de restricción.

Luego del aislamiento, los fragmento del DNA, deben ser incorporados a un

portador adecuado llamado vector para poder ser amplificado.

Vectores Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA

puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse (clonarse). Los vectores son,

esencialmente, moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula

de DNA debe tener unas determinadas características:

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que

transporta.

2. Debe contener varios sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una

vez en el vector. Estos sitios de restricción únicos permiten insertar segmentos de

DNA cortados con la misma enzima sin desmembrar el vector, situación que se

produciría si se utilizasen sitios de restricción presentes más de una vez en el


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vector.

3. Debe tener algún marcador de selección, (normalmente genes de resistencia a

antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tenga) para poder

distinguir las células huésped que transportan al vector, de las que no las contienen.

4. El vector debería poder extraerse fácilmente de la célula huésped.

Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los

bacteriófagos y los cósmidos.

Los plásmidos Un plásmido es una molécula circular separada del DNA bacteriano y mucho

más pequeña que éste pero con la capacidad de duplicarse dentro de la célula

bacteriana y de brindarles facultades para desarrollarse en condiciones específicas en

las que no podrían hacerlo si no estuvieran transformadas.

Son moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural

que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en células

bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado de manera

que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a

antibióticos específicos.

El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se utilizó.

Figura. Mapa de restricción del plásmido pBR322, que muestra las localizaciones de los sitios

de las enzimas de restricción que cortan el plásmido por un solo sitio. Estos sitios pueden

utilizarse para insertar los fragmentos de DNA a clonar. También se muestran las

localizaciones de los genes de resistencia a antibióticos.

ori


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Este plásmido tienen un origen de replicación (ori), dos genes de selección

(resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restricción

únicos. Dentro del gen de resistencia a tetraciclina hay sitios de restricción únicos para

las enzimas BamHI, SpbI, SalI, XmaIII y NruI, y dentro del gen de resistencia a

ampicilina hay sitios de restricción únicos para las enzimas RruI, PvuI, y PstI. Si se

introduce un pBR322 en una célula bacteriana sin plásmidos y sensible a antibióticos,

la célula se convertirá en resistente a la tetraciclina y a la ampicilina. Si se inserta un

fragmento de DNA en los sitios de restricción RruI, PvuI, o PstI, se inactivará el gen de

resistencia a ampicilina, pero el gen de resistencia a tetraciclina seguirá activo. Si este

plásmido recombinante se transfiere a una célula bacteriana que no contenga

plásmidos, las células que contengan el plásmido recombinante podrán identificarse, ya

que serán resistentes a tetraciclina y sensibles a ampicilina.

Figura. El plásmido pUC18 ofrece varias ventajas como vector de clonación. Debido a su

pequeño tamaño, puede aceptar fragmentos de DNA relativamente grandes; se replica hasta

un alto número de copias y tiene un gran número de sitios de restricción en el sitio de clonación

múltiple, localizado dentro del gen lacZ. Las bacterias que contienen pUC18 producen colonias

de color azul si crecen en un medio que contenga X-gal. El DNA insertado en el sitio de

clonación múltiple interrumpe el gen lacZ, resultando en colonias blancas, lo que permite la

identificación directa de las colonias que tienen insertos de DNA clonados.

ori


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Los bacteriófagos lambda y M13 Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de DNA

recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y se

conoce toda la secuencia nucleotídica de su genoma. El tercio central de su

cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exógeno sin afectar la

capacidad del fago para infectar células y formar calvas. Se han desarrollado más de

100 vectores basados en el fago lambda, eliminado diversas porciones del grupo

génico central. Para clonar utilizando el vector lambda, se corta el DNA del fago con

una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un

brazo derecho y una región central. Se aislan los brazos y se ligan (utilizando la DNA

ligasa) a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma

enzima de restricción (en este ejemplo EcoRI).

Las moléculas recombinantes resultantes pueden introducirse en células

huésped bacterianas de dos maneras: Por transformación. Una vez en las células

huésped, se replican generando fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto

de DNA. Por infección , se mezcla el DNA de lambda que contiene el inserto con los

componentes proteicos del fago (cabezas y colas); de esta mezcla se forman partículas

fágicas infectivas (empaquetamiento “in vitro”). Los fagos pueden amplificarse

haciéndose crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formarán calvas, o

bien infectando células en un medio líquido y recogiendo las células lisadas.

Figura. Pasos en la clonación utilizando el fago lambda como vector. Se extrae el DNA de una preparación de fago lambda y se elimina el grupo central de genes por tratamiento con una enzima de restricción. El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos del cromosoma de lambda. Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las proteínas del fago para formar un virus recombinante. Este virus puede infectar células bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de DNA.


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Los cósmidos y los vectores transbordadores

Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma

del fago lambda y de DNA plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia cos del

fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su

cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación (ori) y de genes de

resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los

contienen. El DNA de los cósmidos que contienen insertos de DNA se empaqueta en la

cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas.

Una vez que el cósmido entra en la célula huésped se replica como un

plásmido. Puesto que la mayoría del genoma lambda se ha delecionado, los cósmidos

pueden transportar insertos de DNA mucho más grandes que los que lambda puede

llevar. Los cósmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado; los vectores

fágicos pueden acomodar insertos de DNA de unas 15 kb, y los plásmidos

generalmente están limitados a insertos de 5- 10 kb.

Existen otros vectores híbridos, construidos con orígenes de replicación

provenientes de distintas fuentes (por ejemplo, plásmidos y virus animales como

SV40), que pueden replicarse en más de un tipo de célula huésped. Generalmente,

estos vectores transbordadores contienen marcadores genéticos que permiten su

selección en los dos sistemas huésped, y pueden utilizarse para transportar insertos de

DNA entre E. coli y otras células huésped como levadura y viceversa.

A menudo, estos vectores se emplean para investigar la expresión génica.


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Para cartografiar y analizar genomas eucarióticos complejos, se desarrolló un

vector multiuso llamado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de

bacterias. Éste es un plásmido que se replica independientemente y está implicado en

la transferencia de información genética en la conjugación bacteriana. Como los

factores F pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1 Mb, se

diseñaron para que funcionen como vectores de DNA eucariótico. Los vectores BAC

tienen los genes de replicación y de número de copia del factor F, e incorporan un

marcador de resistencia a un antibiótico y sitios de restricción para insertar el DNA

exógeno a clonar. Además, el sitio de clonación está flanqueado por regiones

promotoras que pueden utilizarse para generar moléculas de RNA y expresar así el gen

clonado, o para utilizarlas como sonda para paseo cromosómico, y para secuenciar el

DNA del inserto clonado.

Figura. El cósmido pJB8 contiene un origen de

replicación bacteriano (ori), un solo sitio cos

(cos), un gen de resistencia a ampicilina (amp)

para seleccionar las colonias que han

incorporado el cósmido, y una región que

contiene cuatro sitios de restricción para la

clonación (BamHI, EcoRI, Clal y Hind III). Las

cubiertas víricas que contienen un cósmido

pueden utilizarse para infectar células huésped

adecuadas, y el vector que transporta el inserto

de DNA se transferirá a la célula huésped por

infección. Una vez dentro, la secuencia ori

permite que el cósmido se replique como un

plásmido bacteriano.


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Figura. Resumen de los pasos seguidos en la clonación de un vector plasmídico. Los vectores plasmídicos se aíslan y

se cortan con una enzima de restricción. El DNA a clonar se corta con la misma enzima de restricción, produciendo

una colección de fragmentos. Estos fragmentos se reparten entre los vectores y se transfieren a huéspedes

bacterianos para su replicación. Las células bacterianas que contienen plásmidos pueden identificarse por crecimiento

en un medio selectivo, y pueden aislarse. El DNA clonado puede recuperarse del huésped bacteriano para nuevos

análisis.


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Clonación de DNA en E. coli

Para replicar el DNA clonado se pueden utilizar distintos tipos de células

huésped. Uno de los huéspedes más utilizados es la cepa de laboratorio K12 de E. coli.

Ésta y otras cepas de E. coli se utilizan como huéspedes ya que están bien

caracterizadas genéticamente y pueden aceptar un amplio espectro de vectores,

incluyendo los plásmidos, los fagos y los cósmidos.

Para crear moléculas de DNA recombinante se precisan varios pasos. Si se utiliza

un plásmido como vector, el procedimiento es el siguiente:

1. El DNA que se va a clonar se aísla y se trata con una enzima de restricción para

crear fragmentos que acaben en secuencias específicas.

2. Estos fragmentos se ligan a moléculas de plásmido que han sido cortadas con la

misma enzima de restricción, obteniéndose un vector recombinante.

3. El vector recombinante se transfiere a células huésped bacterianas,

generalmente por transformación, un proceso en el que las moléculas de DNA

atraviesan la membrana de la célula huésped transfiriéndose a su interior.

4. La célula huésped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formará

colonias. Puesto que las células de cada una de las colonias provienen de una

sola célula inicial, todas las células de la colonia, y los plásmidos que contienen,

son genéticamente idénticas, o clones. Se rastrean las colonias para identificar

las que han incorporado el plásmido recombinante.

Se utilizan varios métodos para seleccionar las colonias que contienen

plásmidos con el inserto de DNA. Este proceso se denomina rastreo (o cribado). Para

vectores como pBR322, el rastreo es un proceso que consiste en dos etapas. Por

ejemplo, si el DNA que se desea clonar se inserta dentro del gen de resistencia a

tetraciclina, este gen se inactivará. Después de transformar células huéspedes con el

plásmido recombinante, éstas se hacen crecer en placas de cultivo que contienen el

antibiótico ampicilina. Todas las células que hayan incorporado un plásmido (con o sin

inserto) crecerán y formarán colonias, mientras que las células que no lo hayan

incorporado morirán ya que son sensibles a la ampicilina.

En el segundo paso, se identifican las colonias que contiene plásmidos con el

inserto de DNA. En este paso, se transfieren las colonias de la placa que


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contiene ampicilina a una placa que contiene tetraciclina, debido a que el inserto ha

inactivado el gen de resistencia a tetraciclina. Entonces, el patrón de colonias de la

placa con tetraciclina se compara con el de la placa con ampicilina, y se identifica las

colonias de la placa con ampicilina que no han crecido en la placa con tetraciclina. Las

células de estas colonias contienen vectores con el inserto de DNA, y se transfieren a

un medio de crecimiento para nuevos análisis.

Figura. Selección de colonias que contienen un vector plasmídico que tiene dos genes de

resistencia a antibióticos, uno para tetraciclina y otro para ampicilina. En este experimento,

la presencia del inserto de DNA en el plásmido inactivará el gen de resistencia de

tetraciclina.

Otros vectores, como pUC18, tienen construcciones que producen colonias

azules cuando están en células bacterianas sembradas en un medio que contiene una

sustancia denominada X-gal. Los sitios de restricción del sitio de clonación múltiple de

pUC18 están dentro del gen lac, el gen responsable de la capacidad de formar colonias

azules, y la inserción de DNA en el sitio de clonación múltiple interrumpe esta

capacidad. Como se ha expuesto anteriormente, los plásmidos que contienen los

segmentos de DNA insertados producen colonias blancas, mientras que los que no

tienen insertos producen colonias azules.

De igual modo, los fagos que contengan DNA exógeno también pueden

utilizarse para infectar células huésped de E. coli, y cuando se siembran en un medio

sólido, cada una de las calvas resultantes representa los descendientes clonados de


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un solo fago inicial. Los cósmidos infectan a las células bacterianas como los fagos,

pero luego se replican como los plásmidos dentro de la célula huésped. Las células que

contiene cósmidos con DNA clonado pueden identificarse y recuperarse de la misma

manera que los plásmidos.

Clonación en huéspedes eucarióticos Hemos descripto la utilización de E. coli como huésped para la clonación.

También pueden utilizarse otras especies de bacterias como huéspedes, como B.

subtilis y Streptomyces. Estos sistemas huésped bacterianos y sus vectores son

parecidos a los descriptos para E. coli. Sin embargo, para estudiar la expresión y

regulación de los genes eucarióticos, a menudo es conveniente e incluso necesario

utilizar huéspedes eucarióticos. En esta sección describiremos sistemas de clonación

que utilizan células eucarióticas como huéspedes.

Vectores de levadura

Aunque la levadura es un organismo eucariótico, puede manipularse y crecer de

manera parecida a las células bacterianas. Además, la genética de las levaduras se ha

investigado exhaustivamente, lo que ha proporcionado un gran catálogo de mutaciones

y unos mapas genéticos altamente detallados de sus cromosomas. En levadura hay un

plásmido de origen natural, denominado plásmido 2 micras (o plásmido 2 µ), que se

ha utilizado para construir varios vectores de clonación para levadura. Combinando

secuencias de plásmidos bacterianos con plásmidos 2 micras, se pueden producir

vectores con muchas propiedades útiles.

Construcción de bibliotecas de DNA Puesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeño, deben

construirse muchos clones diferentes para incluir todas las pequeñas porciones del

genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas las secuencias genómicas de

un solo individuo se denomina biblioteca. Las bibliotecas clonadas pueden provenir del

genoma completo de un individuo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto de

genes transcripcionalmente activos en un único tipo celular.


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Bibliotecas genómicas Las bibliotecas genómicas (o genotecas) suelen construirse utilizando vectores

fágicos, que pueden contener grandes fragmentos cromosómicos. Para preparar una

biblioteca en el fago lambda, se corta el DNA de lambda con una enzima de restricción

para eliminar el grupo génico central. El DNA genómico que se desea clonar se corta

con la misma enzima, y se purifican los fragmentos cortados de tamaño óptimo para el

empaquetamiento (de 15 a 17kb) mediante electroforesis en gel o por centrifugación.

Estos fragmentos de DNA se ligan con los brazos del cromosoma de lambda para

formar la biblioteca.

En una biblioteca genómica están representados todos los genes de un

organismo. La biblioteca es un medio para recuperar cualquier gen del genoma del

organismo, pudiéndose estudiar con detalle junto con sus secuencias reguladoras

adyacentes. Teóricamente, una biblioteca genómica contiene al menos una copia de

todas las secuencias representadas en el genoma. Sin embargo, cada molécula de

vector puede contener sólo relativamente pocas kilobases de DNA insertado, por lo que

una de las primeras tareas al preparar una biblioteca genómica es seleccionar el vector

más adecuado para contener el genoma completo en el menor número posible de

clones. El número de clones necesarios para contener todas las secuencias de un

genoma depende del tamaño medio de los insertos clonados y del tamaño del genoma

a clonar. Este número puede calcularse con la siguiente fórmula:

N= ln (1-P)

ln (1- ƒ)

Donde N es el número de clones necesarios, P es la probabilidad de recuperar

una secuencia determinada, y ƒ representa la fracción del genoma presente en cada

clon.

Si deseamos preparar una biblioteca del genoma humano utilizando como

vector el fago lambda. El genoma humano tiene 3,0 x 106 kb; si el tamaño medio de los

insertos clonados en el vector es 17 kb, y queremos tener una probabilidad del 99 %

(P=0,99) de que cualquier gen humano esté representado al menos en una copia,

precisaremos una biblioteca de unos 8,1x 105 fagos (donde f= 1,7 x104/3,0 x 109). Si

hubiésemos seleccionado a pBR322 como vector, con una tamaño medio de insertos

de 5 kb, la biblioteca necesitaría contener varios millones de clones.


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Bibliotecas de cDNA

Se puede construir una biblioteca que represente los genes que se están

transcribiendo en una célula eucariótica en un momento dado, utilizando el mRNA

aislado de esa célula. Casi todas las moléculas de mRNA eucariótico tiene una cola de

poli-A en su extremo 3’. Primero, se hibrida la población de moléculas de mRNA que

tienen colas de poli-A 3’ con oligo-dT (DNA corto de cadena sencilla formado sólo por

dexositimidina). La secuencia de oligo-dT híbrida con la cola de poli –A, y sirve de

cebador para la síntesis de una cadena complementaria de DNA utilizando la enzima

retrotranscriptasa (transcriptasa inversa). Esta enzima es una DNA polimerasa

dependiente de RNA que copia un molde de RNA de cadena sencilla en un DNA de

cadena sencilla. El resultado es un dúplex RNA-DNA de doble cadena. La cadena de

RNA se elimina y la cadena sencilla de DNA se utiliza como molde para sintetizar la

cadena complementaria de DNA, utilizando la DNA polimerasa I. El extremo 3’ de la

cadena sencilla de DNA se dobla sobre sí mismo formando una horquilla (un lazo), por

lo que puede servir de cebador para sintetizar la segunda cadena. El resultado es un

DNA dúplex con las cadenas unidas por un extremo. La horquilla puede abrirse,

obteniéndose una molécula de DNA de doble cadena (denominada DNA complementario o cDNA), cuya secuencia nucleotídica deriva de una molécula de

RNA.

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Si se añade un trozo corto de DNA con sitios de restricción en cada uno de sus

extremos, el cDNA puede clonarse. Este sitio de clonación puede cortarse con la

enzima de restricción adecuada, produciendo extremos pegajosos, lo que permite que

el cDNA se inserte en el sitio de restricción de un vector plasmídico o fágico.

Una biblioteca de cDNA es diferente de una biblioteca genómica ya que

representa sólo un subconjunto de todos los genes del genoma. Otra diferencia es que

las bibliotecas de cDNA no contienen las secuencias promotoras adyacentes al gen, ni

tampoco contienen las secuencias intercaladas o intrones, ya que éstos han sido

eliminados del pre-mRNA durante la reacción de corte y empalme y no se encuentran

en el mRNA maduro.

Las bibliotecas de cDNA utilizan mRNA como punto de partida, de manera que

sólo representan a las secuencias que se están expresando en un tipo celular, en un

tejido, o en un estadio concreto del desarrollo embrionario. La decisión de construir una

biblioteca genómica o de cDNA depende del problema planteado. Si se está interesado

en un gen particular, podría ser más fácil preparar una biblioteca de cDNA del tejido en

el que se expresa dicho gen. Por ejemplo, los glóbulos rojos producen grandes

cantidades de hemoglobina, y la mayoría del mRNA de estas células es mRNA de la

β-globina. Una biblioteca de cDNA preparada utilizando mRNA aislado de glóbulos

rojos permite aislar con facilidad un gen de la globina. Si se interesaran las secuencias

reguladoras adyacentes al gen de la globina, se necesitaría construir una biblioteca

genómica, ya que estas secuencias reguladoras no se encuentran en el mRNA de la

globina, y por lo tanto no estarían representadas en la biblioteca de cDNA.

Identificación de secuencias clonadas específicas Una biblioteca genómica puede contener varios cientos de miles de clones. El

problema ahora es identificar y seleccionar sólo el clon o clones que contienen el gen

que nos interesa, y determinar si un clon contiene todo el gen o sólo una parte de él.

Hay varias maneras de hacerlo, y la elección depende de las circunstancias y de la

información disponible. Los métodos que se describen a continuación utilizan diversos

enfoques para encontrar una secuencia específica de DNA en una biblioteca.


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Sondas para rastrear clones específicos

Muchos de los protocolos utilizan una sonda para rastrear la biblioteca e

identificar el clon que contiene el gen de interés. A menudo, las sondas son

polinucleótidos radioactivos que contienen una secuencia de bases complementaria a

todo o parte del gen de interés. Otros métodos utilizan sondas que dependen de

reacciones químicas o colorimétricas para indicar la localización de un clon específico.

Las sondas pueden provenir de distintas fuentes; genes relacionados aislados de otras

especies pueden servir de sonda si la secuencia se ha conservado suficientemente.

Por ejemplo, se aislaron copias extracromosómicas de genes ribosómicos de la rana

Xenopus laevis por centrifugación, se cortaron con enzimas de restricción, y se

clonaron en vectores plasmídicos. Como las secuencias de los genes ribosómicos se

han conservado enormemente durante la evolución de los eucariotas, estos genes

clonados de Xenopus se marcaron con radioisótopos y se utilizaron como sonda para

aislar los genes ribosómicos humanos de una biblioteca genómica.

Si el gen que se quiere seleccionar de la biblioteca es transcripcionalmente

activo en determinados tipos celulares, se puede utilizar una sonda de cDNA para

encontrarlo. Esta técnica es especialmente útil cuando puede obtenerse el mRNA

purificado o enriquecido. Se sabe que el mRNA de la $-globina es el RNA mensajero

predominante en determinados estadios del desarrollo de los glóbulos rojos. Para hacer

una sonda, se aísla el mRNA de estas células, se purifica, y se copia con la

retrotranscriptasa en una molécula de cDNA. Este cDNA puede utilizarse como sonda

para recuperar el gen de la $-globina de una biblioteca genómica, incluyendo los

intrones y las regiones de control adyacentes.

Métodos de análisis de las secuencias clonadas La identificación y recuperación de secuencias de DNA clonadas especificas es

una herramienta poderosa para analizar la estructura y la función de los genes. Las

técnicas que se describen a continuación se utilizan para responder a preguntas

experimentales de la organización y de la expresión de las secuencias clonadas.


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Cartografía de restricción

Un mapa de restricción es la recopilación del número, del orden y de la

distancia entre los sitios de corte de enzimas de restricción en un segmento clonado de

DNA. Las unidades de mapa se expresan en pares de bases (pb) o, para largas

distancias, en pares de kilobases (kb). Los mapas de restricción proporcionan

información que puede utilizarse para subclonar fragmentos de un gen, o bien para

comparar la organización de un gen y de su cDNA con el fin de identificar los exones y

los intrones en la copia genómica del gen.

Los fragmentos generados tras cortar el DNA con enzimas de restricción pueden

separarse mediante electroforesis en gel, método que separa los fragmentos por su

tamaño, y en el que los fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente. Los

fragmentos aparecen como una serie de bandas que pueden visualizarse tiñendo el

DNA con bromuro de etidio e iluminándolo con luz ultravioleta (siguiente figura). El

tamaño de los fragmentos individuales puede determinarse corriendo un conjunto de

fragmentos marcadores de tamaño conocido en otro carril del mismo gel.

Figura. Gel de agarosa que contiene fragmentos separados de DNA, teñidos con un colorante

(bromuro de etidio) y visualizados mediante iluminación ultravioleta.

La siguiente figura muestra los pasos que deben seguirse para construir el

mapa de restricción de un segmento de DNA clonado que contiene sitios de corte para

dos enzimas de restricción. Para construir el mapa, empecemos con una segmento de

DNA clonado de 7 kb de longitud. Tres muestras del DNA clonado se digieren con

enzimas de restricción: una con HindIII; otra con SalI; y la última con las dos


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enzimas nombradas. Los fragmentos generados por la digestión con las enzimas de

restricción se separan por electroforesis. El tamaño de estos fragmentos se estima por

comparación con un conjunto de patrones de tamaño separados electroforéticamente

en carriles adyacentes del mismo gel. Para construir el mapa, se analizan los

fragmentos generados con las enzimas de restricción.

1. Cuando el DNA se corta con HindIII, se producen dos fragmentos, uno de 0,8 kb

y otro de 6,2 kb, indicando que sólo hay un sitio de restricción para esta enzima (y que

está localizado a 0,8 kb de uno de los extremos).

2. Cuando el DNA se corta con SalI, se producen dos fragmentos, uno de 1,2 kb y

otro de 5,8 kb, lo que significa que hay un único sitio de restricción localizado a 1,2 kb

de uno de los extremos.

En conjunto, estos resultados muestran que hay un sitio de restricción para cada

enzima, pero se desconoce la relación existente entre estos dos sitios. Con esta

información, hay dos mapas posibles. En un modelo, el sitio HindIII está a 0,8 kb de

uno de los extremos (modelo I), y el sitio SalI está a 1,2 kb del mismo extremo. En el

modelo alternativo (modelo 2), el sitio HindIII está localizado a 0,8 kb de un extremo, y

el sitio SalI está localizado a 1,2 kb del otro extremo.

El modelo correcto puede determinarse si se consideran los resultados de la

digestión de ambas enzimas, HindIII y SalI. El modelo 1 predice que la digestión con

ambas enzimas generará tres fragmentos de 0,4, 0,8 y 6,2 kb; ambas enzimas

generarán tres fragmentos de 0,8, 1,2 y 5 kb. El patrón real de fragmentos observado

después de la digestión con ambas enzimas indica que el modelo correcto es el modelo

1 de la Figura.

En la mayoría de los casos, la cartografía de restricción es más compleja e

implica un mayor número de enzimas y un mayor número de sitios para cada enzima.

Los mapas de restricción proporcionan una manera importante de caracterizar un

segmento de DNA, y pueden construirse sin tener ninguna información de la capacidad

codificadora ni de la función del DNA cartografiado. Junto con otras técnicas, el

cartografiado de restricción puede utilizarse para definir los extremos de un gen, y

proporciona una manera de diseccionar la organización molecular de un gen y de sus

regiones flanqueantes. El cartografiado también puede servir de punto de partida para

analizar un gen intacto de segmentos clonados de DNA, y proporciona una


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manera de localizar sitios de mutación en los genes.

Los mapas de restricción también pueden utilizarse para refinar los mapas

génicos. En la mayoría de los casos, la exactitud de los mapas construidos por análisis

genéticos se basa tanto en la frecuencia de recombinación entre marcadores genéticos

como en el número de marcadores genéticos utilizados en la construcción del mapa. Si

hay una gran distancia entre los marcadores y/o variación en la frecuencia de

recombinación, el mapa genético puede no corresponder al mapa físico de esa región

cromosómica. Por ejemplo, el genoma humano es grande (3,2 x 109 pb), y el número

de genes cartografiados es pequeño (unos pocos millares), lo que significa que cada

unidad del mapa está compuesta por millones de pares de bases de DNA. El resultado

es una correlación baja entre los mapas genético y físico de los cromosomas. Los sitios

de corte de las enzimas de restricción pueden utilizarse como marcadores genéticos,

reduciendo así la distancia entre los distintos sitos del mapa, incrementando la fidelidad

de los mapas, y proporcionando puntos de referencia para la correlación de los mapas

genético y físico.

Los sitos de restricción han desempeñado una función importante en la

cartografía de genes en cromosomas humanos específicos y en regiones definidas de

cromosomas concretos. Además, si un sitio de restricción está cerca de un gen

mutante, puede utilizarse como marcador de diagnóstico. Estos sitios son conocidos

como polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción o RFLP. Su utilización ha

demostrado ser especialmente útil, ya que los genes mutantes que provocan muchas

enfermedades genéticas humanas están muy poco caracterizados a nivel molecular, y

los sitios de restricción cercanos se han utilizado con éxito en la detección de los

individuos afectados y de los heterocigotas con riesgo de tener hijos afectados.


20

Transferencia de Southern y Northern

Los insertos de DNA clonados en vectores pueden utilizarse en experimentos

de hibridación para caracterizar la identidad de genes específicos, para localizar

regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias clonadas y

para investigar la organización molecular de las secuencias genómicas.

Edward Southern desarrolló la utilización de segmentos de DNA clonado,

separados por electroforesis, transferidos a filtros, y rastreado con sondas.

Figura. Construcción de un mapa de restricción.


21

Conocido como transferencia de Southern (Southern blot), este

procedimiento tiene muchas aplicaciones. En la transferencia de Southern, el DNA

clonado se corta en fragmentos con una o más enzimas de restricción, y estos

fragmentos se separan por electroforesis en gel (Figura 20). El DNA se desnaturaliza

dentro del gel en fragmentos de cadena sencilla, y éstos se transfieren a un filtro de un

material, normalmente nitrocelulosa o un derivado de nylon, que une el DNA. La

transferencia se hace colocando la hoja de la membrana encima del gel, y provocando

que el tampón pase por el gel y por la hoja de nitrocelulosa o de nailon por capilaridad.

El tampón pasa por el gel y por la membrana, arrastrando al DNA fuera del gel e

inmovilizándolo en la membrana.

En la práctica, esto se hace poniendo el gel con el DNA desnaturalizado sobre

una gruesa esponja que actúa de mecha. La esponja está parcialmente sumergida en

una cubeta con tampón. Se pone una membrana encima del gel, y se cubre con hojas

de papel secante o absorbente y un peso. La acción capilar arrastra el tampón de la

cubeta a través de la esponja, del gel, de la membrana, y del montón de papel secante.

Al pasar el tampón por el gel, los fragmentos de DNA se transfieren a la membrana, a

la que se unen. Después de la transferencia, el DNA de cadena sencilla se fija a la

membrana calentándola a 80 ºC o exponiéndola a la luz ultravioleta para que se hagan

uniones entre los fragmentos y la membrana.

Entonces, los fragmentos de DNA del filtro se hibridan con una sonda. Sólo

formarán híbridos los fragmentos de DNA de cadena sencilla presentes en la

membrana que sean complementarios a la secuencia nucleotídica de la sonda. Se lava

la sonda no unida, y se visualizan los fragmentos hibridados. Si se utiliza una sonda

radioactiva, la posición de la sonda se determina por autorradiografía, utilizando

película fotográfica.

Además de para caracterizar DNA clonado, la transferencia de Southern se

utiliza para muchos otros fines, como la cartografía de sitios de restricción en un gen o

cerca de él, la identificación de fragmentos de DNA que contienen un gen determinado

de entre una mezcla de muchos fragmentos, y la identificación de genes relacionados

en diferentes especies. La transferencia de Southern también se utiliza para detectar

reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genéticas

humanas y cánceres.


22

Figura. Transferencia de Southern.

Existe una técnica de transferencia relacionada que puede utilizarse para

determinar si un gen clonado es transcripcionalmente activo en un tipo celular o en un

tejido dado. Esta técnica detecta la presencia de RNA que sea


23

complementario al segmento de DNA clonado. Esto se lleva a cabo extrayendo RNA de

uno o varios tipos celulares o tejidos. Se fracciona el RNA por electroforesis en gel, y el

patrón de bandas se transfiere a una membrana que une el RNA como en la

transferencia de Southern. El filtro se hibrida con una sonda de DNA de cadena

sencilla, proveniente de DNA genómico clonado o de cDNA. Si hay RNA

complementario a la sonda de DNA, éste se detectará por autorradiografía como una

banda en la película fotográfica. Como el protocolo original que utiliza DNA unido a un

filtro se conoce como transferencia de Southern, el protocolo que utiliza RNA unido al

filtro se denominó transferencia Northern.

La transferencia Northern proporciona información de la presencia de un

transcripto de RNA complementario de un gen clonado en una célula o en un tejido

determinado, y se utiliza para examinar patrones de expresión génica en tejidos

embrionarios y adultos. La transferencia Northern también puede utilizarse para

detectar cortes y empalmes alternativos del mRNA, y para detectar múltiples tipos de

transcriptos provenientes de un solo gen. La transferencia Northern también

proporciona otras informaciones de los mRNA transcriptos. Si se corre un RNA

marcador en un carril adyacente, se puede calcular el tamaño del mRNA de un gen de

interés. Además, la cantidad de RNA transcripto presente en una célula o en un tejido

está relacionado con la densidad de la banda de RNA del film de autorradiografía. Se

puede cuantificar la cantidad de RNA midiendo la densidad de la banda, lo que

proporciona una medida relativa de la actividad transcripcional. De esta manera, la

transferencia Northern puede utilizarse para caracterizar y cuantificar la actividad

transcripcional de un gen determinado en distintas células, tejidos, u organismos.

Secuenciación de DNA

En cierto sentido, la caracterización definitiva de un segmento de DNA clonado

es la determinación de su secuencia de nucleótidos. La capacidad de secuenciar DNA

clonado ha permitido grandes avances en el conocimiento de la estructura génica y de

los mecanismos de regulación. Aunque desde la década de los 40 hay técnicas que

permiten determinar la composición de bases del DNA, fue en la década de los 60

cuando se desarrollaron los métodos para determinar la secuencia de los nucleótidos.

En 1965, Robert Holley determinó la secuencia de una molécula de tRNA que contenía

74 nucleótidos. Se necesitó un año de esfuerzo para realizar este trabajo. En la


24

década de los 70 se desarrollaron métodos más eficientes de secuenciación y,

actualmente, en un laboratorio de biología molecular, es posible secuenciar más de mil

bases en una semana. En un futuro cercano, con la automatización de este proceso, se

podrán secuenciar miles de bases en un solo día.

Un método de secuenciación de DNA diseñado por Alan Maxam y Walter

Gilbert utiliza productos químicos para cortar el DNA. Este método se utilizó para

determinar la secuencia de bases de los 4.362 nucleótidos del plásmido pBR322. El

segundo método, que es el que generalmente se utiliza, lo desarrollaron Frederick

Sanger y sus colaboradores. El método de Sanger se basa en la elongación 5’ – 3’ de

las moléculas de DNA por la DNA polimerasa. Ambas estrategias generan un conjunto

de moléculas de DNA de cadena sencilla de diferentes longitudes. Para determinar la

secuencia de los nucleótidos en un segmento de DNA, ambos métodos utilizan una

serie de cuatro reacciones, realizadas en tubos separados. Estas secuencias, cuya

diferencia en tamaño es de un solo nucleótido, se separan por electroforesis en gel en

cuatro carriles adyacentes. El resultado es una serie de bandas que forman un patrón

parecido a una escalera. La secuencia puede leerse directamente del patrón de bandas

de los cuatro carriles. Los secuenciadores automáticos de DNA utilizan colorantes

fluorescentes en vez de sondas radioactivas. Se utilizan cuatro colorantes, produciendo

un patrón de picos de colores que, al leerlos, proporcionan la secuencia de DNA.

La secuenciación de DNA proporciona información de la organización de los

genes y de los sucesos mutacionales que alteran a los genes y a los productos

génicos, confirmando la conclusión de que los genes y las proteínas son moléculas

colineares. La secuenciación también se ha utilizado para examinar la organización de

las regiones reguladoras que flanquean los genes procarióticos y eucarióticos, y para

deducir la secuencia de aminoácidos de las proteínas. El gen de la fibrosis quística

(CF), una enfermedad genética humana autosómica recesiva, se identificó clonando y

secuenciando el DNA de una región del brazo largo del cromosoma 7. Como no se

conocía el producto proteico de este gen, se utilizó la secuencia de DNA para identificar

una región codificadora. Se utilizó la secuencia de DNA de esta región para generar

una probable secuencia de 1.480 aminoácidos. Esta secuencia se utilizó para buscar

secuencias aminoacídicas de proteínas conocidas en las bases de datos, lo que

permitió inferir que la proteína CF tiene características similares a las proteínas de

membrana que desempeñan una función en el transporte de iones. Nuevos


25

experimentos confirmaron que el producto del locus de la fibrosis quística es una

proteína de membrana que regula el transporte de iones cloro por la membrana

plasmática. En la mayoría de casos de CF, el gen mutante tiene una secuencia de DNA

alterada que causa la producción de una proteína defectuosa.

Además de identificar los defectos del DNA que causan los fenotipos mutantes,

la secuenciación de DNA también se utiliza para examinar la organización de un gen (el

número de intrones y de exones, y sus límites), para proporcionar información de la

naturaleza y de la función de las proteínas codificadas por los genes, como el tamaño,

el número y tipo de dominios (región transmembrana, de unión al DNA) y de la relación

con proteínas similares y con proteínas de otros organismos.

Figura. La secuenciación del DNA se ha automatizado con la utilización de colorantes

fluorescentes, uno para cada base; las bases se leen en orden de izquierda a derecha.

Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR)

Las técnicas de DNA recombinante se desarrollaron a principios de la década de

los 70, y en los años posteriores revolucionaron la manera en que los genetistas y los

biólogos moleculares dirigían sus investigaciones. En 1986, se desarrolló una nueva

técnica denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha ampliado

enormemente el poder de la investigación del DNA recombinante. Incluso ha

reemplazado algunos de los métodos anteriores. El análisis de PCR ha encontrado

aplicaciones en una amplio abanico de disciplinas, entre las que se encuentran la

biología molecular, la genética humana, la evolución e incluso la medicina forense.


26

Uno de los prerrequisitos para muchas técnicas de DNA recombinante es la

disponibilidad de grandes cantidades de un segmento específico de DNA. Estos se

obtenían a menudo después de un trabajo intensivo y tedioso de clonación y

reclonación. La PCR permite la amplificación directa de segmentos de DNA específicos

sin clonación, y puede utilizarse en fragmentos de DNA que estén presentes,

inicialmente, en cantidades infinitesimalmente pequeñas. El método de PCR se basa

en la amplificación de un segmento de DNA utilizando DNA polimerasa y cebadores,

oligonucleótidos que hibridan con la cadena complementaria a la secuencia a

amplificar. Hay tres pasos fundamentales en la reacción de PCR, y la cantidad de DNA

amplificado producido sólo está limitado, en teoría, por el número de veces que se

repiten estos pasos.

1. El DNA que se requiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas. Este

DNA no necesita estar ni purificado ni clonado, y puede provenir de distintas fuentes,

incluyendo DNA genómico, muestras forenses como sangre seca o semen, muestras

almacenadas en registros médicos, pelos, restos momificados, y fósiles. El DNA de

doble cadena se desnaturaliza por calor (a unos 90º C) hasta que se disocia en

cadenas sencillas, normalmente unos 5 minutos.

2. Los cebadores hibridan al DNA de cadena sencilla. Estos cebadores son

oligonucleótidos sintéticos que hibridan con las secuencias flanqueantes del segmento

a amplificar. Generalmente se utilizan dos cebadores diferentes. Cada uno de ellos

tiene la secuencia complementaria a una de las dos cadenas del DNA. Los cebadores

se alinean con sus extremos 3’ encarados ya que hibridan a cadenas opuestas, como

se observa en la figura 22. La utilización de cebadores sintéticos significa que se debe

tener alguna información de la secuencia de DNA a amplificar.

3. A la mezcla de reacción se le añade una DNA polimerasa resistente al calor, la

polimerasa Taq. La polimerasa extiende los cebadores en dirección 5’ – 3’, utilizando

como molde al DNA cadena sencilla unido al cebador. El producto es una molécula de

DNA de doble cadena con los cebadores incorporados en el producto final.

Cada grupo de tres pasos se denomina ciclo. Generalmente, cada paso


27

del ciclo se realiza a una temperatura diferente. El ciclo puede repetirse llevando a

cabo otra vez todos los pasos. Empezando con una molécula de DNA, el primer ciclo

produce dos moléculas de DNA, dos ciclos producen cuatro, tres ciclos producen ocho,

etc. Veinticinco ciclos amplifican varios millones de veces el DNA en cuestión. El

proceso es automático y se utiliza una máquina denominada termociclador, que puede

programarse para realizar un número predeterminado de ciclos, produciendo grandes

cantidades de segmentos de DNA amplificado en unas pocas horas.

La PCR es ampliamente utilizada en laboratorios de investigación y tiene

muchas aplicaciones en campos entre los que se incluyen las enfermedades

infecciosas, la arqueología, el control de alimentos, la genética humana, la terapia del

cáncer y la evolución molecular, entre otros. En aplicaciones clínicas, la PCR se utiliza

para identificar los agentes infecciosos como el bacilo de la tuberculosis y otras

bacterias, el HIV y otros virus. La PCR tiene la ventaja de ser rápida y menos laboriosa

que las técnicas de clonación convencionales, y ha reemplazado a la utilización de

sondas clonadas en campos como el diagnóstico prenatal. Aunque el desarrollo de la

técnica de PCR representa un adelanto importante, también tiene sus limitaciones.

Puesto que la PCR amplifica secuencias de DNA, incluso la más pequeña

contaminación del material inicial con DNA de otras fuentes puede provocar

dificultades. Células desprendidas de la piel de uno de los empleados del laboratorio

mientras se realizaba la PCR pueden contaminar las muestras recogidas del escenario

del crimen, dificultando la obtención de datos fiables. La PCR debe realizarse siempre

con controles adecuados.


28

ESTRATEGIAS BÁSICAS PARA EL CLONADO MOLECULAR

El clonado de ADN basado en células se usa para amplificar ADN con el objeto de

poder caracterizarlo físicamente y llevar a cabo estudios funcionales de los genes, de

grupos de genes o de otras secuencias de ADN de interés.

Fig. Esquema de clonado molecular en plásmido. Ejercicio 1 La figura de arriba sintetiza los distintos pasos a seguir en un experimento de clonado básico. Analiza el esquema y describe cada uno de ellos.

HERRAMIENTAS BÁSICAS PARA EL CLONADO 1. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN.

Las endonucleasas de restricción reciben el nombre según la bacteria a partir de

la cual se han aislado. A continuación, a modo de ejemplo, se muestra una tabla con

los sitios de reconocimiento y corte de varias enzimas de restricción tipo II.


29

Enzima Organismo fuente Sitio de restricción EcoRI Sau3AI HindII HaeIII BamHI MsoI NotI

Escherichia coli Satphylococcus aureus Haemophilus influenzae H. aegiptus Bacillus amyloliquefaciens Moraxela bovis Nococardia otitdis-caviarum

I 5’ -G-A-A-T-T-C- -C-T-T-A-A-G- 5’ I I 5’ -N-G-A-T-C-N- -N-C-T-A-G-N- 5’ I I 5’ -G-T-Py-Pu-A-C- -C-A-Pu-Py-T-G- 5’ I I 5’ -G-G-C-C- -C-C-G-G- 5’ I I 5’ -G-G-A-T-C-C- -C-C-T-A-G-G- 5’ I I 5’ -N-G-A-T-C-N- -N-C-T-A-G-N- 5’ I I 5’ -G-C-G-G-C-C-G-C- -C-G-C-C-G-G-C-G- 5’ I

Ejercicio 2 a)¿ Qué son las endonucleasas de restricción?

b) ¿Qué características poseen los sitios de reconocimiento de las enzimas de

restricción?

c) ¿Qué tipos de corte pueden producir y qué nombres reciben las terminaciones

formadas?

d) Además de ser útiles como “ tijeras moleculares” ¿qué otro uso se les da a las

endonucleasas de restricción?

2. VECTORES DE CLONADO

Existen vectores naturales tales como plásmidos o bacteriófagos que han sido

modificados artificialmente para poder ser utilizados en el clonado. Otros han sido


30

construidos por el hombre como los cósmidos, cromosomas artificiales de levadura

(YACs) y los cromosomas artificiales de mamíferos (MACs). Los vectores empleados

más frecuentemente comparten las siguientes propiedades:

1. Molécula pequeña, bien caracterizada.

2. Origen de replicación en la molécula que permita su propia reproducción así como

también la del fragmento insertado.

3. Fácil recuperación de la molécula híbrida.

Ejercicio 3 a) ¿Qué son los plásmidos y qué características naturales poseen?

b) Los plásmidos naturales han sido modificados para hacerlos más adecuados como

vectores de clonado. Observa la estructura del pBR322 y deduce qué condiciones debe

reunir un plásmido para que sirva como vector.

EcoR I Hind III Origen de BamH I replicación Sph I 562 (ORI) Tetr Sal I 651 BstZ I 939 Ampr Pst I Pvu I Sca I

Fig.2 Esquema del plásmido vector pBR322 c) Volvamos nuevamente a la figura donde se muestra el clonado en plásmidos y

supone que el vector usado fue el pBR322. Las moléculas de pBR322 circular

purificadas deben ser cortadas con una enzima de restricción para insertar un

fragmento de ADN extraño ¿Qué enzima usarías y por qué?.

d) ¿Con qué enzima cortarías el ADN fuente? ¿ Por qué?

e) ¿Cómo ligarías los pBR322s con los fragmentos del ADN fuente? ¿Cómo evitarías

que los plásmidos recircularicen sin incorporar un inserto?


31

f) ¿Cómo se origina la molécula quimera cuando el ADN de interés es cortado con una

enzima diferente a la empleada para cortar el plásmido?

g) ¿Qué tamaño máximo de fragmentos puede ser clonado en plásmidos?

h) ¿Cómo se introducen las moléculas recombinantes en las bacterias hospedadoras?

i) ¿Cómo identificarías las colonias de bacterias que han incorporado los plásmidos con

inserto?

j)¿Qué es una biblioteca genómica o genoteca? ¿Cómo se construye? Bacteriófagos: usaremos como ejemplo el Fago lambda por ser uno de los más conocidos. Brazo izquierdo Región no esencial Brazo derecho Cabeza ciclo lisogénico A B E Z J att xis N cro P S cos W D F int red cl O Q R cos Cola inmunidad lisis 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Figura. Mapa sintetizado del cromosoma lineal del bacteriófago lambda mostrando la

posición de algunos genes.

Ejercicio 4

a) ¿Qué son los sitios cos?

b) ¿Qué regiones del lambda pueden ser reemplazadas por ADN exógeno sin afectar

su capacidad de infectar bacterias?

c) ¿Cuál es el tamaño máximo de fragmentos que pueden ser insertados en el fago

lambda? ¿por qué?

d) ¿Qué ventajas ofrece clonar usando como vector un bacteriófago en lugar de un

plásmido?

Ejercicio 5


32

a) ¿Qué son los cósmidos?

b) Analiza las ventajas del clonado en cósmidos en relación con el clonado en los dos

vectores anteriores.

VECTORES DE EXPRESIÓN El objetivo primario del clonado de genes para aplicaciones biotecnológicas es la

expresión del gen clonado en el hospedador seleccionado. Pero, la inserción de un gen

en un vector no necesariamente asegura que será expresado con éxito. La producción

de una proteína a partir de un gen requiere que el mismo sea transcripto

adecuadamente y que su mRNA sea traducido. En respuesta a esta necesidad se han

creado varios vectores de expresión especializados como el que se muestra a

continuación. Nco I ros Pst I Hind III ptac T 1 Ampr T2 ori Figura. Esquema del vector de expresión pKK233-2. Ampr = gen de resistencia a la

amicilina.

ptac = promotor del operon lac. rbs = sitio de unión a los ribosomas . Noc I, Pst I y Hind

III = sitios de cortes para esas endonucleasas de restricción. T1 y T2 = secuencias

terminadoras de la transcripción.Ori 0 origen de replicación. La flecha indica la

dirección de la transcripción.

Ejercicio 6 Compara al pKK233-2 con el pBR322 ¿Qué similitudes y qué diferencias

observas?


33

TÉCNICAS DE RASTREO (SCREENING) POR HIBRIDACIÓN DEL ADN. Una vez construida la biblioteca genómica, se puede localizar dentro de ella un

gen o bien algún segmento de ADN de interés. Se han diseñado numerosas técnicas

de sondeo: Hibridización Southern, hibridización Northern, hibridización Western entre

otras.

Ejercicio 7

a) ¿Qué es una sonda, qué tipos de sondas existen y para qué sirven?

b) Describe brevemente cada una de las técnicas de sondeo mencionadas arriba.

ADN COMPLEMENTARIO

Ejercicio 8

a) ¿A qué se denomina cADN o ADN copia y cómo se obtiene?

b) ¿Cómo se construye una biblioteca de cADN?

CLONADO POR PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

El PCR es un procedimiento efectivo para obtener grandes cantidades de una

secuencia específica de ADN in vitro. Se puede obtener una amplificación de hasta

más de un millón de veces. Para que el PCR ocurra se necesita:

• Dos cebadores o primers (repasar transcripción del ADN) complementarios a

regiones sobre cadenas opuestas del ADN a ambos lados de la secuencia a

amplificar.

• Una ADN polimerasa termoestable que soporte temperaturas de 95ºC o más (Taq,

ADN polimerasa de Thermus aquaticus).

• Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato.


34

Esta técnica consiste en alrededor de unos 30 ciclos de replicación del ADN. Cada ciclo

contiene 3 etapas:

1. Desnaturalización: 95ºC

2. Renaturalización: ~55ºC

3. Síntesis: ~75ºC

Ventajas del clonado por PCR.

• Rapidez: Una reacción típica de 30 ciclos de 3 a 5 min cada uno. El tiempo requerido

para el clonado en células es de semanas o meses.

• Sensibilidad de la reacción: Es posible amplificar secuencias a partir de diminutas

cantidades de ADN, aún de una única célula.

• No es necesario que el ADN esté muy purificado: Permite amplificar secuencias

específicas de material en el que el ADN está muy degradado o embebido en un

medio que hace problemático su aislamiento.

Ejercicio 9 a) Esquematiza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hasta el cuarto ciclo.

BIBLIOGRAFÍA: GRIFFITHS, A. Genética. Ed. McGraw Hill Interamericana. 5ta edición. KLUG, W y M. CUMINGS. 1999. Conceptos de Genética. Ed. Prentice Hall. 5ta. ed. TAMARÍN, R. 1996. Principios de Genética. Edit. Reverté


35

Tópico: Organismos

La diversidad biológica actual ha sido dividida en tres dominios basado

principalmente en la evidencia molecular, dado que los organismos que pertenecen a

un dominio particular han ido evolucionando separadamente de los hallados en los

otros dominios durante más de 1.000 millones de años; por esto constituyen las

divisiones más profundas en la historia de la vida evolutiva hasta ahora conocida.

LOS CARACTERES QUE DEFINEN A LOS TRES DOMINIOS SON:

Bacteria Organismos: Termotogales, flavobacterias, cianobacterias, bacterias púrpuras,

bacterias gram-positivas, bacterias verdes no-sulfurosas.

Características: Células procarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente

por diésteres de diacil-glicerol. El RNA ribosomal de la subunidad pequeña de los

ribosomas (16S-rRNA) es del tipo eubacteriano, es decir, posee un bucle entre las

posiciones 500-545.

Dominio Archaea Organismos: Pyrodictium, Thermoprocteous, termococales, metanococales,

metanobacterias, metanomicrobiales, halófilos extremos.

Características: Células procarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente

por diéteres de glicerol isoprenoides o tetraéteres de diglicerol. El RNA ribosomal de la

subunidad pequeña de los ribosomas (I6S-rRNA) es del tipo arqueobacteriano, es

decir, tiene una estructura única entre las posiciones 180-197 ó 405-498.

Dominio Eukarya Organismos: Animales, protozoos ciliados, protozoos flagelados, plantas, hongos,

diplomonas, algas rojas, euglenoides, microsporidias.

Características: Células eucarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente

por diésteres de acil-glicerol. El RNA ribosomal de la subunidad pequeña de los

ribosomas (18S-rRNA) es del tipo eucariota, es decir, posee una estructura única entre

las posiciones 585-655.


36

Cuadro de los tres dominios Dominios Característica Bacteria Archae Eukarya

Núcleo rodeado por membranas ausente ausente Presente

Organelas rodadas por membrana ausente ausente presente

Peptidoglucanos en la pared celular presente ausente ausente

Lípidos de membrana Enlazado por éster

no ramificado

Enlazado por

éter ramificado

Enlazado por éster

no ramificado

ribosomas 70S 70S 80S

Iniciador del tRNA Formilmetionina Metionina Metionina

Operones Sí Sí No

Plásmidos Sí Sí Raros

RNA polimerasas uno varios Tres

Sensibles a cloranfenicol y a la

estreptomicina

Si No No

Ribosomas sensibles a la toxina

diftérica

No Sí Sí

Algunos son metanógenos No Sí No

Algunos fijan nitrógeno Sí Sí No

Algunos conducen una fotosíntesis

basada en la clorofila

Sí No Sí

(P(

(Purves, el al. 2003)


37

Figura. La estructura filogenética más profunda de la diversidad biológica obtenida por Carl

Woese a partir de la secuenciación de rRNA.

Figura. La naturaleza jerárquica de la clasificación biológica consiste en la formación de

grupos dentro de grupos. El mayor es el Dominio, en el cual se incluye al Reino (Curtis, 2000)


38

Los tres dominios Archaebacteria , Bacteria y Eukarya, incluyen a los seis Reinos tal

como se muestra:

Dominio Archebacteria: Reino Archaebacteria.

Dominio Bacteria: Reino Bacteria (Eubacteria)

Dominio Eukarya: Reinos: Protista, Fungi, Plantae, Animalia.

LOS CARACTERES GENERALES QUE DEFINEN A CADA REINO, SON:

Reino Características

Archaeo-

bacteria

Se caracterizan por la ausencia de peptidoglucano en las paredes

celulares y la presencia de lípidos de composición distintiva en las

membranas celulares que no se encuentra en ninguna otra bacteria. La

mayoría vive en lugares calurosos y ácidos

Eubacteria o

Bacteria

Células de vida libre; diferenciación celular incipiente en algunos

grupos. Incluye a todas las bacterias.

Protista o

Protoctista

Células eucariotas. Flagelo de estructura 9+2 en algún momento de su

ciclo de vida. La distinción entre unicelularidad y multicelularidad es

irrelevante. Es un grupo definido por exclusión, es decir, no son

animales, ni plantas, ni hongos ni procariotas. Contiene

aproximadamente 27 phyla incluyendo a protozoos y algas como los

organismos más comunes.


39

Fungi

(Hongos)

Células eucariotas. Formación de esporas y ausencia de flagelos

(amastigotas). Las esporas haploides germinan generando hifas que

por un proceso de septación más o menos incompleto da lugar a la

formación de células. El citoplasma puede fluir en mayor o menor grado

a través de la hifa. Al conjunto de hifas se le llama micelio y constituye

la estructura visible de la mayor parte de los hongos. Las hifas

adyacentes pueden compartir núcleos por conjugación dando lugar a

una célula heterocariótica cuyos núcleos se dividen por mitosis y

originan una hifa dicariótica. En la reproducción sexual, ambos núcleos

se fusionan y forman una célula cigótica diploide que se dividirá por

meiosis y formará las nuevas esporas haploides.

Plantae

(Plantas)

Organismos multicelulares eucariotas desarrollados a partir de un

embrión que no produce una blástula. Las células eucariotas de la

mayor parte de las plantas poseen plástidos fotosintéticos, sin

embargo, ésta no es una característica exclusiva ni general de las

plantas. A diferencia de los animales -cuyas células son en su mayoría

diploides- y fungi -cuyas células son haploides o dicarióticas- las

plantas alternan de manera ordenada un estadio haploide o de

gametofito -donde se producen gametas por mitosis- y otro diploide o

de esporofito -donde se producen gametas por meiosis.

En las plantas con flores, el esporofito domina el ciclo de vida y el

gametofito, en lugar de producir una nueva planta independiente, se

reduce a unas pocas células dentro de la flor del esporofito. Del mismo

modo, en los helechos, el esporoflto es la forma que domina el ciclo de

vida y el gametoflto, a pesar de tener una fase de vida libre, no es

visible a simple vista.


40

Animalia

(Animales)

Organismos multicelulares eucariotas desarrollados a partir de un

embrión que pasa por un estadio de blástula. Aunque la

multicelularidad ha surgido independientemente en todos los reinos, en

los animales es característica ya que las células están unidas por

complejas estructuras como los desmosomas uniones denominadas

“gap" y septadas. A diferencia de las plantas, en los animales la

meiosis es gamética, es decir, a la reducción cromosómica le sigue

inmediatamente la formación de gametas sin posibilidad de originar

individuos haploides como el gametofito.

Ejercicio 1

Ubicar en las categorías taxonómicas especificadas (Dominio y Reino) a: Trifolium

repens (alfalfa), Tripanosoma cruzi (agente causante de Mal de Chagas), Dipilidium

caninum (gusano parásito de perros), Ascaris lumbricoides (gusano parásito de

vertebrados), Amynthas hawayanus (lombriz de tierra), Azolla sp (planta flotante), Zea

mays (maíz).

Bibliografía:

CURTIS, H. y N. BARNES. 2000. Biología. Ed. Med. Panamericana. 6ta. Ed. PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia

de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.


41

¿Cómo iniciar el estudio de un animal?

Existen distintos arquetipos que subyacen a la biodiversidad de formas animales con

aspectos estructurales comunes que son compartidos por ellos.

Los principales atributos que definen la arquitectura corporal (plan corporal) son: la

multiceluridad, la simetría, el diseño del tubo digestivo, la cavidad corporal (celoma), el

desarrollo embrionario y la metamería.

A continuación se presenta un esquema de conceptos que muestra los mencionados

atributos y la forma en que unos se relacionan con los otros. Para interpretarlo

adecuadamente se aconseja utilizar el glosario que se presenta debajo.


42

según la relación de las células que lo componen

Según la simetría y número de capas tisulares

Según su desarrollo embrionario

Según la disposición del tubo digestivo

Según la presencia o ausencia de cavidad corporal

Según el modo de formación del celoma

Según la metamería

* *1Equinodermata: es considerado por su

bilateralidad en estadíos larvales.

Animal

Metazoos (mesozoos y Parazoos) (Porifera)

Eumetazoos

Radial-diploblástico (Cnidaria) Bilateral –

Triploblástico

En saco ciego De tubo en tubo

Acelomados (Platyhelminthes) Pseudocelomados

(Nematoda)

Celomados

Esquizocelomados (Annelida, Mollusca, Arthropoda)

Enterocelomados (Equinodermata*1,

Chordata)

Protostomados (Platyhelminthes, Nematoda,

Mollusca, Annelida Arthropoda)

Deuterostomados (Equinodermata,

Chordata)

Sin metamería Mollusca

Con metamería

Homómera (Annelida)

Heterónoma (Arthropoda)


43

Glosario Metazoos (mesozoos y parazoos): Animales multicelulares con capas celulares no

homólogas a las de los blastodermos de los eumetazoos. Presentan un mayor nivel

de organización que el que se encuentra en las colonias de protozoos, no obstante se

considera que poseen un grado celular de organización, en el cual la organización

celular es una agregación de células funcionalmente diferenciadas, con división de

trabajo, pero con escasa tendencia a organizarse como tejido.

Eumetazoos: Animales multicelulares con una organización estructural, en la cual

combinan sus células en unidades mayores, aquí una célula es una parte especializada

del conjunto del organismo que es incapaz de vivir por sí sola. Existe un grado de organización celular-tisular, en el cual las células similares se agregan según

patrones definidos, de lo cual surgen los tejidos.

Simetría: Es el equilibrio de las proporciones, o correspondencia en tamaño y forma de

las partes o estructuras situadas en lados opuestos de un plano (plano de simetría)

Simetría radial: Cuando el organismo puede quedar dividido en mitades semejantes

por más de dos planos que contengan un eje longitudinal (plano de simetría).

Simetría bilateral: Cuando el organismo puede ser dividido en dos mitades

especulares (derecha e izquierda) en un solo plano sagital.

Diploblástico: disposición básica de tejidos embrionarios con dos capas tisulares,

endodermo y ectodermo. Triploblástico: disposición básica de tejidos embrionarios con tres capas tisulares,

endodermo, mesodermo y ectodermo. Sistema digestivo en saco ciego: Existe una abertura que funciona como boca y ano

que se abre a un saco ciego.


44

Sistema digestivo de tubo en tubo: Tubo unidireccional, con dos aberturas, boca y

ano.

Celoma: Cavidad llena de fluido que rodea al tubo digestivo, proporcionando un diseño

del tipo “tubo dentro de un tubo”, lo que permite una flexibilidad mucho mayor de la

cavidad interna. También supone la disponibilidad de espacio para los órganos

viscerales y permite un mayor tamaño y complejidad al dejar mayor superficie expuesta

para intercambios celulares. Funciona adicionalmente como un esqueleto hidrostático

en ciertos casos, especialmente en muchos gusanos contribuyendo a actividades como

traslación y excavación.

Acelomado: No existe cavidad corporal alrededor del tubo digestivo. El espacio entre

la epidermis (ectodérmica) y el tubo digestivo (Endodérmico) está completamente

ocupado por una masa esponjosa de células denominada parénquima (mesodermo).

Pseudocelomado: Existe una cavidad corporal alrededor del tubo digestivo limitada

por blastocele persistente que deriva del blastocele embrionario, por ello se denomina a

esta cavidad pseudoceloma o pseudocele.

Celomado: Hay una verdadera cavidad desarrollada dentro del mesodermo tapizada

por peritoneo mesodérmico.

44


45

Metamería (segmentación): la repetición seriada de unidades corporales a lo largo del

eje longitudinal de un organismo. Cada una de esas unidades se denomina segmento o

metámero. Esta disposición afecta a estructuras externas e internas de varios sistemas.

La segmentación del cuerpo (metamería) se llama verdadera o mesodérmica,

cuando existen tabiques internos que separan las secciones sucesivas del animal. Se

opone a la llamada segmentación superficial o aparente, que se observa en algunos

gusanos – Acantocéfalos, aschelmintos – y dónde sólo la cutícula o la pared corporal,

incluso la musculatura, presenta las divisiones sucesivas a lo largo del eje longitudinal,

pero faltan los tabiques y no hay repetición de órganos internos. También se observa el

pseudomatamerismo – Platelmintos, Nenertinos – cuando en el cuerpo existe una

tendencia a la repetición de las partes y de los órganos (por ejemplo, las gónadas), sin

que estos sean separados por tabiques. (Novikoff, M. M. 1976.)

Se conoce como Metámero cada uno de los segmentos que se repiten en

ciertos grupos de animales, celomados de simetría bilateral (Bilateria). La metamerización es una de las principales modificaciones del celoma. Cada

metámero tienen cavidades celómicas separadas de las de otros metámeros por

tabiques, y las estructuras internas (ganglios nerviosos, nefridios, gónadas, etc.) y

externas (patas, branquias, etc.) están repetidas en cada metámero.

Metamería Homómera: Los segmentos son semejantes entre sí.

Metamería Heterónoma: Los segmentos se fusionan entre sí en grupos funcionales

llamados tagmas para funciones especiales.

Esquizocelomado: El celoma surge de la división de bandas mesodérmicas originadas

a partir de células de la región del blastoporo (abertura al exterior del tubo digestivo

primitivo) , las cuales proliferan y se ahuecan para formar la cavidad celómica.

Enterocelomado: El celoma se origina por invaginaciones del tubo digestivo primitivo

que se independiza de éste y aumentan de tamaño para formar la cavidad celómica.


46

Protostomado: El blastoporo origina la boca, en tanto que el ano se forma

secundariamente.

Deuterostomado: El blastoporo origina el ano, en tanto que la boca se forma

secundariamente.


47

Tagmosis: metamerización heterónoma en tagmas que presentan los Arthropodos

para funciones especializadas.

La asociación de tagmas y la presencia de apéndices especializados permite la

distinción exomorfológica entre las Clases de Artrópodos, estas características se

muestran en el siguiente cuadro.


48

Clase Antenas Patas Partes bucales

Tagmosis Ejemplos

Crustacea 2 pares N pares y

birrámeas

Madíbulas

1 maxila

2 maxila

Cefalotórax

Abdomen

Insecta 1 par 3 pares y

unirrámeas

Madíbulas

1 maxila

2 maxila

(labium)

Cabeza

Tórax

Abdomen

Myriapoda 1 par N pares y

unirrámeas

Mandíbulas

1 maxila

Variable

Cabeza

Tronco

Chelicerata Ausentes 4 pares y

unirrámeos

Quelíceros

pedipalpos

Cefalotórax

(prosoma)

Abdomen

(opistosoma)

Ejercicio 2 * Considerando los conceptos expuestos, realizar un cuadro comparativo entre los

Phyla más conocidos.

* Elige al menos dos animales mencionados en el ejercicio 1 y descríbelos

considerando todos los aspectos mencionados en este apartado.

Ejercicio 3 * Busca un dibujo de pata birrámea y unirrámea, identifica sus partes y explica a qué se

debe el nombre e hipotetiza cuál será la importancia adaptativa de cada tipo.

* Completa el cuadro dado arriba mencionando dos ejemplos de cada una de las

Clases.

Bibliografía consultada:


49

BARNES, R. D. 1989. Zoología de los Invertebrados. Ed. Mc Graw Hill Interamericana 5ta.

ed.

CURTIS, H. y S. BARNES 2000. Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. HICKMAN, C., L. ROBERTS y A. PARSON. 2002. Principios integrales de Zoología.

Ed. Mc Graw Hill Interamericana 11ma. ed.

PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia

de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. SOLOMON, E. P; L. R. BERG y D. W. MARTIN, 1999. Biología. Ed. Mc Graw Hill

Interamericana 5ta. ed.


50

El estudio de los vegetales, como cualquier ser vivo, implica abordarlo desde

diferentes perspectivas, entre ellas su morfología externa.

ADAPTACIONES DEL CORMO

No siempre el cuerpo de las plantas superiores sigue, el modelo estructural básico (raíz,

tallo y hoja). Además de la variabilidad en el aspecto externo, que es causada por diferentes

modos de ramificación y simetría, la multitud de formas de los órganos vegetativos aumenta por

modificaciones morfológicas. Estas modificaciones o adaptaciones están generalmente

relacionadas con el ambiente en el que se desarrolla la planta, algunas son la acumulación de

reservas y la existencia de mecanismos de multiplicación vegetativa.

Este texto hace referencia a las adaptaciones del cormo no relacionadas y relacionadas

con la acumulación de reservas.

A- Adaptaciones independientes de la acumulación de reservas

1- Hoja

a- Espinas foliares: son modificaciones agudas, muy ricas en tejidos de sostén y como

consecuencia, rígidas; pueden ser ramificadas o sencillas. Este tipo de adaptación está difundida

en vegetales típicos de zonas áridas, pero aparece también, como defensa contra herbívoros, en

algunos vegetales no xeromorfos de otras regiones climáticas y en ciertas plantas trepadoras.

Las espinas foliares se producen por transformación de hojas o de partes de éstas (fig. 1).

En Berberis sp, por ejemplo, son parte de la lámina foliar, que además presenta estípulas

modificadas. Éstas se desarrollan también en Acacia, Robinia y Prosopis (algarrobo). Figura 1: Estípulas transformadas en espinas de Robinia pseudoacia.


51

b- Zarcillos foliares: son órganos filamentosos, simples o ramificados, haptotrópicos que

la planta utiliza exclusivamente para trepar. Tienen origen por transformación del limbo foliar o

de otra parte de la hoja. Ejemplos: zapallo (Cucurbita pepo) los zarcillos foliares resultan de

hojas reducidas a la nervadura media, arveja (Pisum sativum) los últimos folíolos de la hoja

pueden transformarse en zarcillos ramificados (fig. 2); en Lathyrus aphaca (Leguminosa) el

limbo se ha transformado en un zarcillo simple y su función originaria, es decir, la asimilación

de C2O, es desempeñada por dos grandes estípulas. Figura 2: Zarcillos foliares en una hoja pinnada de Pisum sativum; con desarrollo de una rama lateral florífera.

c- Filodios: se le da este nombre a un pecíolo dilatado y lámina que sustituye a la lámina

de la hoja, por lo general totalmente abortada. Se presenta en algunas especies de género Acacia

(fig. 3). Figura 3: Filodios de Acacia heterophylla; transiciones de las hojas pinnadas (abajo) a los filodios (arriba).


52

2- Tallo a- Espinas caulinares: aparecen como toda rama lateral en la axila de las hojas. Pueden

ser simples o ramificadas, generalmente presentan una foliación reducida, aunque en algunos

casos producen hojas normales con yemas en las axilas. Ejemplo: Crataegus (fig. 4) y Prunus

spinosa. Figura 4: Espina de Crataegus sp.

b- Zarcillos caulinares: son semejantes en forma y función a los zarcillos foliares, difieren

en su origen. Se originan de una yema axilar, del mismo modo que las ramas laterales normales. Figura 5: Zarcillo caulinar de Passiflora sp.

c- Braquiblastos: en las plantas superiores la intensidad de crecimiento de las ramas

laterales puede ser muy variada; en unos casos se desarrollan ramas con entrenudos largos, son

los macroblastos, y otras dan lugar a braquiblastos, ramas cortas y con aspecto de roseta (fig. 6).

Los braquiblastos tienen, con frecuencia, una vida limitada, suelen ser simples o

escasamente ramificados. En algunas plantas leñosas las hojas normales, al menos en estado

adulto, se forman únicamente en los braquiblastos por Ejemplo: Prunus cerasus (guindo), Malus

y Ginkgo.


53

Figura 6: Macro y braquiblastos de Pinus sp

d- Cladodios y Filóclados. Cladodios: son ramas de forma comprimida o hasta laminar,

generalmente con hojas rudimentarias, color verde, en la que se realiza, por lo tanto la función

fotosintética.

A pesar de su semejanza con los nomófilos, con quienes coinciden funcionalmente,

difieren de ellos por el origen y por tener crecimiento ilimitado. Es frecuente su desarrollo en

plantas de lugares secos, por ejemplo Cactáceas, en las que además se acumula agua (figs. 7 a y

b).

Figura 7: Opuntia sp tallos aplanados con ramas laterales (aréolas), las hojas de dichas ramas se han transformado

en espinas. Derivación de una forma suculenta (a la derecha) a partir de una forma cactácea con hojas (a la

izquierda)

Si las ramas laminares fotosintetizantes son braquiblastos y presentan por ello aspecto

muy semejante al de las hojas, reciben el nombre de filóclados. Ejemplo :Ruscus sp (fig. 8).


54

Figura 8: Rama de Ruscus aculeatus mostrando filóclados con aspecto de hoja, sobre las que aparecen las flores.

e- Estolones: ramas laterales, más o menos delgadas, a menudo muy largas que nacen de

las base de algunos tallos. Los estolones pueden desarrollarse arrastrándose por la superficie de

la tierra y constituyen estolones epígeos, por ejemplo el fresal (fig. 9); o bien pueden hacerlo por

debajo del suelo formando estolones subterráneos, por ejemplo la menta. Figura 9: Formación de un estolón de fresa (Fragaria sp).

3– Raíz a- Espinas radicales: entre las Monocotiledóneas, por ej. algunas palmeras

(Acanthorrhiza) producen espinas radicales en la base del tallo, originadas por transformaciones

de las raíces adventicias.

b- Raíces contráctiles: son raíces embrionarias o adventicias encargadas de enterrar más

profundamente la planta o de favorecer su dispersión. Cumplen su función por medio de

contracciones que se observan como estrías en la superficie.


55

Se desarrollan preferentemente en las especies con tubérculos, bulbos o rizomas (fig.10). Figura 10: Raíces contráctiles de Arum maculatum. Hundimiento progresivo del tubérculo por contracción de la raíz:

I germinación, II principio del segundo año, III finales de dicho año, IV planta adulta, tubérculo a 10 cm por debajo

del suelo.

B- Adaptaciones relacionadas con la acumulación de reservas

1- Hoja Bulbos: brote subterráneo con los catáfilos o las bases foliares convertidos en órganos

reservantes.

En un bulbo de cebolla (Allium cepa) en corte longitudinal se distingue el tallo en forma

de disco con entrenudos breves, en su extremo se ubica la yema terminal de donde brota el

vástago epígeo con la inflorescencia. Las hojas cercanas al ápice tienen vaina engrosada y lámina

fotosintetizante normal. Las ubicadas en la parte media han perdido la lámina, y se reducen a la

vaina gruesa. Las más externas son muy delgadas, y constituyen las vainas foliares de hojas

viejas que han muerto después de la reabsorción de sus sustancias de reserva.

En otros casos, el bulbo está constituido por catáfilos escamosos y reservantes que se

disponen de manera imbricada, a este tipo se lo llama escamoso, por ejemplo la azucena.

En las plantas con bulbo, éste permanece latente en la estación desfavorable; al finalizar


56

este período se reactiva la yema, produciendo hojas y flores a expensas de las reservas

almacenadas en él.

En las axilas de las hojas se producen yemas, cuyas hojas también acumulan reservas en

la base formando nuevos bulbos; éstos al independizarse y formar raíces adventicias contribuyen

a la multiplicación vegetativa de la planta.

2- Tallo a- Rizoma: tallo subterráneo reservante, con crecimiento horizontal; como vive fuera de

la zona de la luz, carece de nomófilos u hojas propiamente dichas capaces de asimilar o

transpirar; en su lugar hay catáfilos, la mayoría de las veces en forma de escamas membranosas.

Posee yemas y produce vástagos folíferos y floríferos; también raíces adventicias. Podría

confundirse con una raíz, difiere de ella por sus catáfilos y yemas, por no tener caliptra y

principalmente por su anatomía.

Durante el período del año desfavorable a la vegetación, en los países con inviernos fríos

o con estaciones excesivamente secas, el rizoma defiende a la planta contra los rigores del

ambiente.

Figura 11: Rizoma: a, yema que dará el brote epígeo el año siguiente; b, c, d y e, cicatrices de los brotes de los años

anteriores.


57

Figura 12: Esquema de una planta rizomatosa; a, b, c las ramas floríferas que se han formado como ramas laterales,

en tres años consecutivos, el eje principal continua el crecimiento monopódico.

b- Tubérculos caulinares: son tallos subterráneos, engrosados en mayor o menor grado y

con función de reserva. Al igual que los rizomas, presentan escamas catafílicas membranosas

fugaces, o sus cicatrices. Se distinguen de dichos rizomas por su considerable grosor y por su

crecimiento limitado. El ejemplo mejor conocido es el de la papa (Solanum tuberosum). Los

tubérculos de la papa se originan en el extremo de ramas laterales subterráneas plagiótropas

(estolones), éstas nacen en las axilas de las hojas inferiores del tallo. Se produce el

engrosamiento de los entrenudos terminales, se almacenan sustancias de reserva y estos

tubérculos nuevos viven para multiplicar la planta madre. Las oquedades que se advierten

distribuidas de un modo regular en todos los tubérculos, alojan yemas axilares (ojos). La planta

madre muere luego de haber producido el desarrollo de los tubérculos.

Los tubérculos caulinares pueden originarse también por fuerte engrosamiento primario o

secundario del hipocótilo. Tubérculos puramente hipocotíleos se desarrollan, por ejemplo en

algunas plantas bienales como el rabanito (Raphanus sativus var. sativus) o la remolacha roja

(Beta vulgaris var. conditiva); en el caso de la remolacha forrajera algo de las reservas se

acumulan en la raíz (fig. 13). Un típico tubérculo caulinar, formado exclusivamente por

segmentos elevados, foliosos, del tallo, es el del calinabo (Brassica oleracia var. gongyloides).

Tanto el rabanito como la remolacha emplean las reservas acumuladas para la producción

de flores y semillas.


58

Figura 13: Beta spp, remolacha, a: azucarera, b: forrajera, c: roja

3– Raíz a- Tubérculos radicales: los producen algunas plantas herbáceas bianuales y perennes.

Con frecuencia se asemejan a los tubérculos caulinares, pero se diferencian de ellos por la falta

de hojas y yemas axilares y por su estructura anatómica. Se desarrolla por transformación de

raíces adventicias que detienen su crecimiento en longitud y no desarrollan raíces laterales.

Todos los tubérculos radicales realizan la función de almacenamiento en el parénquima cortical,

que está muy engrosado a consecuencia de procesos de crecimiento primario. Ejemplos: dalia

(Dahlia sp) (fig. 14) y batata (Ipomea batata).

a b c


59

Figura 14: Tubérculos radicales de una dalia.

b- Raíces napiformes: son raíces principales engrosadas total o al menos parcialmente; se

encuentran en las Dicotiledóneas alorrizas. Como la mayoría de las veces, intervienen también

partes variables del hipocótilo y epicótilo, estos órganos resultan morfológicamente

heterogéneos, y a pesar de su semejanza externa, pueden presentar considerables diferencias en

la estructura anatómica.

Ejemplo de ello es la zanahoria (Daucus carota) y la remolacha azucarera, donde además

de la raíz, el hipocótilo participa e la acumulación de reservas.

GLOSARIO

Epígeo: Hábito de crecimiento de los órganos de un vegetal. Que se produce sobre la

superficie de la tierra ya sea de porte aéreo o rastrero.

Estípulas: Estructuras membranosas o foliosas que se suelen desarrollar en la base de las

hojas ubicándose a ambos lados del peciolo.

Haptotrópico: perteneciente o relativo al haptotropismo.

Haptotropismo: conjunto de fenómenos relativos a los movimientos de orientación que

realizan determinados órganos vegetales estimulados por el contacto unilateral.

Hipocótilo: Primer entrenudo, ubicado entre el cuello de la raíz y el nudo cotiledonar. Su

grado de desarrollo varia con las especies.

Imbricada: Superpuesta de manera escalonada llegando a cubrirse los bordes laterales Limbo foliar= Lámina foliar

Monopólico: Sistema de ramificación de las plantas superiores, cuyas ramas se originan

a partir de yemas axilares, y que se caracteriza porque la yema terminal de los tallo y ramas es


60

de larga duración. Las ramas más viejas (más largas) están más alejadas de estas yemas

terminales.

Nomófilo: Hoja normal cuya función principal es fotosíntesis y regulación de la

transpiración.

Plagiótropa/po: la planta o el órgano que, como consecuencia de la acción unilateral de

un estímulo, se coloca en posición oblicua o transversal con respecto a la dirección del mismo.

En un pino, cedro o abeto, el tronco es ortótropo pero las ramas son plagiótropas.

Ortotrópo: en los fenómenos trópicos, la planta o el órgano que, como consecuencia de la

acción de un estímulo unilateral, se orientan en la misma dirección del estímulo. En el

geotropismo, por Ejemplo: la raíz y el tallo de la mayoría de las plantas son órganos ortótropos,

porque la dirección de la vertical del punto en que crece.

Simpódico Sistema de ramificación de las plantas superiores , cuyas ramas se originan a

partir de yemas axilares, y que se caracteriza porque la yema terminal de los tallo y ramas es de

vida corta transformandose tempranamente en flor.

Xeromorfo: aplícase a los vegetales que por su morfología externa o por su estructura

están adaptados a la sequedad; como los xerófitos.


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Ejercicio 1

Analiza la exomorfología de los siguientes vegetales, para cada uno, nombra los órganos

marcados con flechas. Menciona el órgano modificado, nombre de la modificación y su función.

Sorghum halepensis L. Pers. (sorgo de halepo)

Allium cepa L. (cebolla) en corte longitudinal


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Solanum tuberosum L. (papa)


63

Flor e inflorescencias en Gramíneas Las Gramíneas= Poaceas son una de las familias dentro de las Liliopsidas=

Monocotiledóneas más importante dentro del Reino Plantae. Cobran esta importancia ya que incluyen una gran cantidad de géneros de gran valor e importancia económica, como los pastos que constituyen la base de la alimentación del ganado (Bromus, Poa, Panicum, Eragrostis, etc.) y los cereales que alimentan a la humanidad (Zea, Oryza Triticum, Avena, etc), además hay plantas sacaríferas, como la caña de azúcar (Saccharum), industriales (Arundo, Saccharum, etc), ornamentales (Lolium, Cynodon) oleaginosas, medicinales, aromáticas etc. Si analizamos la exomorfología y la anatomía del cuerpo de las plantas de las diferentes especies que están incluidas en esta familia nos encontraremos que en general todas responden a un plan básico de organización con características comunes, (con excepciones), que nos permiten identificarlas, aunque no podemos desconocer que en ellas existe una prodigiosa diversidad de delicadas e interesantes estructuras.

Es así como el análisis de raíces, tallos, hojas, flores y frutos, entre otros, nos pueden indicar la pertenencia de un vegetal a esta familia.

Este texto trata sobre el estudio de la flor e inflorescencias. Para poder arribar a su estudio se deben recordar algunos conceptos básicos.

¿Qué se entiende por inflorescencia? Son inflorescencias aquellos sistemas de ramas que están destinados a la formación de

flores y se hallan metamorfoseados (modificados) en relación a su especialización.

¿Qué Elementos constituyen una inflorescencia? Una inflorescencia consta de: un eje principal, el raquis con hipsófilos llamados brácteas.

En la axila de cada bráctea nacen flores sostenidas o no por un pedicelo, o bien ramificaciones con flores que constituyen inflorescencias parciales. Toda la inflorescencia está sostenida por un pedúndulo.

¿Cómo se clasifican las inflorescencias? A- Inflorescencias simples y complejas

En las inflorescencias simples cada rama lateral del eje principal forma una sola flor.

En las inflorescencias complejas, el eje principal produce inflorescencias parciales provistas de un mayor o menor número de flores.

B- Inflorescencias cerradas y abiertas

En las inflorescencias cerradas tanto el eje principal, como el de las inflorescencias


64

parciales acaban en flores terminales. Estas flores se reconocen claramente porque se abren antes

que las flores laterales inmediatas.

En las inflorescencias abiertas, en cambio, el eje principal y sus ramas laterales de primer orden detienen su crecimiento después de un cierto tiempo, pero no concluyen en una flor terminal; en otras palabras quedan teóricamente abiertos.

C- Inflorescencias racemosas y cimosas

Las inflorescencias racemosas son abiertas, y las cimosas son cerradas.

flor e Inflorescencia de gramineas Previo al análisis de las inflorescencias, identificaremos como está constituida la flor. En las Gramíneas la flor puede considerarse como una forma extremadamente reducida del tipo

básico de una Monocotiledónea adaptada a la anemofilia (fig. 1).

Figura 1: Flor de Gramínea.

Consta de los verticilos fértiles y de un perianto rudimentario, las glumélulas. En general

son perfectas, (es decir presentan androceo y gineceo), en el arroz por ejemplo tienen androceo

con seis estambres y un gineceo, pero en diversos géneros son imperfectas, (es decir que

presentan un androceo o un gineceo), en el maíz por ejemplo en la misma planta se encuentran

flores estaminadas y carpeladas.

El perianto está constituido por las lodículas o glumélulas. Son dos pequeñas

formaciones, membranosas dispuestas a los lados del ovario.

Cada flor está protegida por un par de glumelas (brácteas estériles) que constituyen la

casilla o Antecio floral.


65

Inflorescencia

Salvo muy raras excepciones, las inflorescencias de las Gramíneas son compuestas. La

inflorescencia parcial o elemental es la espiguilla y las totales son panojas o espigas de espiguillas. Espiguilla o Espícula (= espiguita, fig. 2)

Figura 2: Espiguilla (inflorescencia elemental).

La espiguilla representa la inflorescencia parcial o elemental de las Gramíneas (fig. 2);

consta de un pequeño eje, la raquilla, de longitud variable, que soporta las flores. La totalidad de

la espiguilla está protegida por dos brácteas estériles denominadas glumas, cada flor de la

espiguilla se encuentra protegida por las glumelas.

El número de flores de cada espiguilla es variable según los diversos grupos; se

distinguen:

• Espiguillas plurifloras: poseen dos o más flores (Avena, Bromus).

• Espiguillas unifloras: constan de una sola flor ( arroz, maíz);.

Las inflorescencias compuestas responden a dos tipos principales:

A- Panoja: cada espiguilla está sostenida por un pedicelo de longitud variable, originando varias

formas diferentes (fig 3).


66

Figura 3: Panoja laxa (A) y densa (B).

• Panoja laxa: las ramas y pedicelos son alargados y las espiguillas un tanto separadas

entre sí (ej. Avena byzantina, Poa annua, oriza sativa).

• Panoja densa: las ramificaciones y pedicelos son cortos y las espiguillas están

apretadas junto al raquis principal (ej. Phleum, Alopecurus).

B- Espiga compuesta: las espiguillas están sostenidas sobre el raquis o sostenidas por un brevísismo pedicelo (fig 4).

Existen tres tipos: • Espigas unilaterales: las espiguillas están dispuestas en dos o más rangos hacia un

solo lado del raquis. Es posible distinguir las que tienen raquis articulado y las que

tienen raquis continuo y tenaz (ej. Cloris).

• Espigas dísticas: las espiguillas están ordenadas en dos series opuestas y alternas a lo

largo del raquis articulado (ej. Triticum).

• Espigas cilíndricas: las espiguillas se disponen en varios rangos sobre el raquis,

generalmente ensanchado (ej. Zea).


67

Figura 4: Espiga unilateral (A), dísticas (B y C) y cilíndrica (D).

Ejercicio (pregunta extraída del cuadernillo de entrenamientos correspondiente a la XII OAB) La diversidad de disposición de las flores sobre las ramas de las plantas o la extremidad del tallo (inflorescencia) es enorme. Los esquemas de abajo representan algunas de ellas. Señala si las mismas son inflorescencias simples o complejas y busca un ejemplo para cada una.


68

Bibliografía consultada: PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. STRARBURGER, E.; F. NOLL; H. SCHENCK y A. SCHIMPER. 1994. Tratado de Botánica. Ed. Omega. 8va. ed.


69

Tópico: Etología, Ecología y Evolución Teorías taxonómicas

Una teoría taxonómica establece los principios que rigen el recocimiento y la

jerarquización de grupos taxonómicos. Actualmente hay dos corrientes más populares,

la taxonomía evolutiva tradicional y la sistemática filogenética (cladismo), ambas

difieren en el modo de utilización de los principios evolutivos.

La relación entre los grupos taxonómicos puede ser de tres formas:

monofiletismo, parafiletismo y polifiletismo. En el primer caso un grupo monofilético (A) contiene al antecesor común más reciente de todos los miembros del grupo y a sus

descendientes.

Un grupo parafilético (B) contiene al antecesor común más reciente pero no a los

descendientes. Y un grupo polifilético (C) no contiene al antecesor común más

reciente, lo que implica más de un origen filogenético del grupo.

Sistemática filogenética cladística

Los sistemáticos usan el llamado método cladístico para encontrar relaciones evolutivas. Los organismos son descriptos primero en términos de caracteres

específicos, un carácter ancestral, es aquel que se encuentra presente en el

antecesor común, en tanto que las formas del carácter que evolucionaron más tarde

son los estados derivados. La presencia de los mismos en las especies indica que


70

pueden existir relaciones entre ellas; sin embargo las similitudes compartidas podrían

ser el resultado de una evolución convergente y llevar a conclusiones erróneas al

intentar reconstruir las relaciones evolutivas del grupo estudiado.

Sólo las similitudes que son debidas a una descendencia común pueden ser

verdaderos indicadores de relaciones, porque podrían ser el resultado de descender de

un ancestro, pero por sí solas no dicen nada sobre los patrones de ramificación

evolutiva a partir de este ancestro.

Para distinguir los caracteres primitivos de los que han evolucionado

recientemente, el análisis cladista usa el concepto de comparación de grupos externos.

Un grupo externo es aquel conjunto de organismos que se encuentra relacionado al

estudiado, pero no incluido en el mismo. Con esto se puede deducir que cualquier

estado de un carácter que se encuentre tanto en el grupo en estudio como en el

externo, es un carácter ancestral en tanto que los estados del carácter que no

aparezcan en el grupo externo serán derivados.

Los organismos que comparten estados derivados de un carácter constituyen

subconjuntos internos del grupo denominados clados (klados= rama). Así un carácter

derivado, compartido por los miembros del clado es una sinapomorfía, en tanto que si

es sólo de uno de estos miembros se denomina autopomorfía. De la asociación jerárquica de clados, en la cual algunos quedarán incluidos en

otros surgen esquemas ramificados denominados cladogramas. El mejor cladograma

es aquel en el cual el patrón de ramas refleja más claramente la distribución de

caracteres entre los organismos y el menor número de cambios independientes.


71

anfioxo carpa lagarto caballo mono

- pelo, glándulas mamarias

- cuatro patas, huevo amniota

- vértebras, mandíbulas

Figura: Se presenta un cladograma en el cual, el anfioxo es el grupo externo, y el

grupo en estudio comprende cuatro vertebrados (carpa, lagarto, caballo y mono). Para

generar este cladograma se han utilizado cuatro caracteres que varían entre los

vertebrados: la presencia o ausencia de cuatro extremidades, huevos amnióticos, pelo

y glándulas mamarias. Para todos estos caracteres, la ausencia es el estado ancestral

porque es la condición que aparece en el grupo externo (anfioxo); por lo tanto la

presencia es el estado derivado.

La posesión de cuatro extremidades y de huevos amniotas permiten que el

lagarto, el caballo y el mono (recuadro) formen un clado “pariente” de la carpa. Este

clado se subdivide posteriormente por la presencia de pelo y de glándulas mamarias,

que reúnen al caballo y mono (óvalo) frente al lagarto.

Por comparación con animales más alejados se conoce que la presencia de

vértebras y mandíbulas constituyen sinapomorfías de los vertebrados; así el anfioxo

que carece de tales caracteres queda fuera del clado de los vertebrados (recuadro

punteado) y puede ser usado como grupo externo. (Hickman et al, 2002)


72

Ejercicio 3

* Analizando el cladograma descripto anteriormente, identificar las sinapomorfías

correspondientes a cada clado.

* ¿Cuántos clados hay en el ejemplo?

* Mencionar alguna autopomorfía para el grupo de mono y de caballo.

* ¿La carpa, lagarto, mono y caballo formarán un grupo mono, para ó polifilético?

Justificar la respuesta.

Ecología del comportamiento

La ecología del comportamiento se ocupa de analizar cómo los animales toman

“decisiones “ que influyen sobre su supervivencia y su éxito reproductivo.

Los animales deciden dónde llevar adelante sus actividades y cómo seleccionar

los recursos que necesitan (alimento, agua, protección, sitios de nidificación). Los

animales también responden a los predadores y competidores y deciden cómo

interactuar con otros miembros de su propia especie. Las elecciones individuales son

fundacionales de gran parte de la ecología porque los cambios en densidades y

distribuciones de las poblaciones son el resultado acumulativo de las decisiones de

innumerable individuos. Es decir que a lo largo de muchas generaciones la selección

natural ha moldeado el comportamiento de manera acorde con los costos y beneficios.

El costo del comportamiento posee tres componentes. El energético, que resulta

de la diferencia entre la energía que el animal hubiera invertido en descanso y la

invertida en realizar este comportamiento. El costo del riesgo, que corresponde al

incremento en la probabilidad de ser dañado o muerto por haber ese comportamiento,

comparado con el descanso. Y el costo de oportunidad de un comportamiento es la

suma de los beneficios que el animal pierde por no haber realizado otros

comportamiento durante el mismo intervalo de tiempo. Estos costos miden la eficacia

involucrada en realizar comportamientos diferentes durante cantidades de tiempo

diferentes.

Un ejemplo del estudio de estos costos es el que sigue: Se observó que durante

la estación reproductiva (abril- marzo), los machos de una lagartija mantienen territorios

de los cuales excluyen a los machos de la misma especie. Se evaluó el costo de este


73

comportamiento estimulando el comportamiento territorial tres meses antes de la

estación reproductiva (enero-febrero), cuando este comportamiento es poco visible.

Para lograrlo insertaron pequeñas cápsulas que contenían testosterona debajo de la

piel. Los machos control también fueron capturados y liberados sin recibir el implante.

Al observarlos se detectó que los machos implantados patrullaban más sus

territorios, realizando más despliegues de amenazas que los control, quienes ocupaban

más tiempo en alimentarse. Por lo tanto los primeros que capturaban menos insectos,

acumulaban menos energía y murieron en mayor número en los meses siguientes.

Esto demostró que quienes presentan un comportamiento territorial en el verano

mueren en mayor porcentaje que quienes no lo presentan y que este comportamiento

aparece cuando la hembra es receptiva para lograr el mayor éxito reproductivo, siendo

este beneficio mayor que los costos que demanda este comportamiento. (Purves et al,

2003)

Ejercicio 4

* Analizando el ejemplo antes expuesto, indicar, en qué parte del párrafo se refleja el

costo energético, el costo de oportunidad y el costo de riesgo considerados en el

comportamiento territorial.

Correlación temporal del comportamiento: Ritmos biológicos

Entre las causas próximas del comportamiento están aquellos que determinan

su organización a través del tiempo. Los estudios sobre esta correlación temporal

permitieron descubrir los mecanismos encefálicos y hasta el nivel molecular que

permiten a los animales organizar su comportamiento en el tiempo.

Dentro de los ritmos biológicos se conocen a los diarios, mensuales y anuales.

En muchos animales, incluyendo al hombre los períodos de actividad y sueño,

alimentación e ingestión de agua, fluctuación de la temperatura corporal y secreción de

algunas hormonas tienen ciclos que parecen seguir un ritmo interno. Estas actividades

rítmicas diarias son ritmos circadianos que significa “aproximadamente un día”. Esto

sugiere que los animales poseen relojes biológicos ajustados o reprogramados con

precisión por indicios ambientales.


74

Parece ser que el comportamiento de muchos animales o las actividades de una

planta está organizado en torno a ritmos circadianos, así existen animales diurnos

como las abejas, crepusculares como los mosquitos, y nocturnos como los

murciélagos; éstos presentan su máxima actividad en esos momentos del día

Algunos ciclos biológicos reflejan el ciclo lunar, esto es notable en los

organismos marinos que se sincronizan con los cambios en las mareas y las fases de

la luna. Por ejemplo una combinación de ciclos de marea, lunares y anuales rige el

comportamiento reproductivo del “gronio”, un pequeño pez del Pacífico. Éste forma

grandes cardúmenes de abril a junio, durante tres o cuatro noches en que se presentan

las mareas más altas del año. En el punto más alto de la marea los peces salen del

mar, depositan óvulos y espermatozoides en la arena de la playa y regresan al mar con

la siguiente ola. Cuando la siguiente marea alta llega a esa porción de la playa, unos 15

días después, los pececillos han hecho eclosión en la arena y están listos para ir al

mar. Este ejemplo reafirma la idea que en condiciones normales, los procesos

metabólicos de un organismo y su comportamiento están sincronizados con los

cambios cíclicos del ambiente externo, de modo que su comportamiento puede

anticipar esos cambios regulares.

Al parecer muchos ritmos biológicos son regulados por mecanismos de

cronometraje internos que actúan como relojes biológicos. Los datos disponibles hacen

pensar que casi ningún organismo tiene un solo reloj biológico, sino que la interacción

de varios procesos bioquímicos podrían encargarse de regir los ritmos fisiológicos y

conductuales.

Migraciones: Proceso en el que interactúan los ritmos biológicos, la fisiología y el ambiente.

La migración es el desplazamiento periódico a larga distancia y es una

adaptación al cambio ambiental.

La pregunta que surge en primera instancia es ¿Por qué migran los animales? Al

parecer las causas últimas de la migración tiene que ver con las ventajas de

desplazarse de una zona cuya estación se torna menos hospitalaria a una región más

propicia para la reproducción o supervivencia.

Algunos animales migran al madurar, en otros, determinados indicios


75

ambientales activan reacciones fisiológicas que inducen la migración. En las aves

migratorias, pro ejemplo, la glándula pineal percibe cambios en la duración del día

entonces libera hormonas que provocan un comportamiento inquieto característico, el

ave muestra una creciente disposición a volar, haciéndolo por períodos cada vez más

largos.

Al analizar este comportamiento deben considerarse los siguientes aspectos:

*orientación direccional: se refiere al viaje en una dirección específica.

*sentido de orientación: se refiere a dirigirse a un destino en línea recta.

*Navegación: Proceso que implica integrar información de distancia y tiempo y

dirección para arribar al destino específico. Es decir que deben tener el sentido de la

orientación como el cartográfico (“conciencia” de la ubicación).

Los sentidos de orientación que usan los animales son variados, en muchos casos es

el sol, también pueden ser los olores, el campo magnético terrestre o las

constelaciones.

El comportamiento de pastoreo eficiente contribuye a la supervivencia

El comportamiento de alimentación o pastoreo consiste en localizar y seleccionar

el alimento, además de colectarlo y capturarlo. Algunos ecólogos conductuales

estudian los costos y beneficios de la búsqueda y selección de determinados tipos de

alimentos, así como mecanismos empleados para localizar a las presas. Por ejemplo

han surgido, por evolución muchas estrategias de camuflaje que hacen a las presas

difíciles de detectar. Se piensa que conforme los predadores experimentan éxito

repetido en al localización de una presa específica, desarrollan una imagen de

búsqueda, es decir un conjunto de indicios que ayudan a identificar presas ocultas.

Cuando un organismo obtiene la mayor eficiencia en buscar y lograr un alimento se

habla de pastoreo óptimo dado que cuando se maximiza la energía obtenida por unidad

de tiempo de pastoreo, se maximiza el éxito reproductivo.

El pastoreo es afectado por factores como la abundancia o escasez del alimento

y la presencia de predadores. Esto se evidencia porque en ambientes con abundancia

de alimento el organismo puede ser selectivo y la estrategia óptima sería invertir tiempo

en encontrar la mejor presa, en tanto que en ambientes pobres, donde este tiempo


76

sería mayor, la estrategia óptima sería seleccionar una mayor variedad de alimentos.

Los animales pueden aprenden a pastorear de manera eficiente a través de

condicionamiento operante, esto es ensayando al azar diversas estrategias y

seleccionando la que conlleva las mayores recompensas.

El riesgo de los predadores influye sobre la estrategia de pastoreo, de tal

manera que en oportunidades extremas la presión selectiva parece ser más fuerte

sobre el cuidado de la prole cachorros y la defensa de un territorio contra organismos

extraños que hacia el pastoreo óptimo

Ejemplo de la influencia de los factores mencionado son los leones, los cuales

pastorean en manadas (unidades sociales en las que suele haber algunas hembras,

cachorros y machos no emparentados) y utilizan diferentes estrategias según la

situación: En caso de abundancia de alimento cazan en grupos pequeños, grandes o

solos; pero cuando es escaso lo hacen en grupos lo más grandes posibles,

disminuyendo la ganancia de energía por el alimento obtenido, pero protegiendo a sus

cachorros de predadores y competidores. (Solomon et al, 1999)

Ejercicio 5

Analiza la situación problemática presentada en el cuadernillo de entrenamiento XIII

OAB, edición 2005, ejercicio Nº 145.


CURTIS, H. y S. BARNES 2000. Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. HICKMAN, C., L. ROBERTS y A. PARSON. 2002. Principios integrales de Zoología.


NOVIKOFF, M. M. 1976. Fundamentos de la morfología comparada de los

invertebrados. Editorial Universitaria de Buenos Aires)

PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia

de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. RICKLEFF, R.E. 1998. Invitación a la Ecología. Ed. Médica Panamericana. 4ta. ed. SOLOMON, E. P; L. R. BERG y D. W. MARTIN, 1999. Biología. Ed. Mc Graw Hill



77

ALGUNAS DESTREZAS PRÁCTICAS


78

MÉTODOS BIOLÓGICOS

*PREPARACIÓN PARA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

ACTIVIDAD: OBSERVACIÓN DE COLONIAS DE BACTERIAS.

Introducción

Las bacterias son organismos unicelulares de los Reinos Eubacteria y Archaeobacteria, en

general las que se observarán en un práctico de este tipo serán del primer Reino mencionado.

Crecen en medios sencillos con nutrientes básicos por lo cual es posible observar su desarrollo

en todos los ambientes conocidos.

Materiales: cápsulas de Petri- agar-agar o gelatina sin sabor- hansa- una papa- una cuchara de té-

azúcar- ½ litro de agua- tapón de goma- elermeyer grande o frasco de vidrio con tapa- embudo-

papel de filtro- trípode- mechero- varilla de vidrio- jarra metálica- trapo o manopla- diferentes

fuentes de bacterias (cultivo líquido- saliva, roce de manos, granos de tierra, agua estancada por

más de 5 días, etc.)- hansa- porta y cubreobjeto-microscopio.

Preparación del medio de cultivo sólido

1) Esterilización del material de vidrio

Todo el material de vidrio debe ser lavado con detergente, enjuagado muy bien y puesto a secar

en un horno a gas o microondas, envuelto en papel metalizado o plástico adherente

respectivamente y una vez frío se guarda en la heladera hasta el momento de ser utilizado.


79

2) Medio de cultivo nutritivo

Preparar en una jarra metálica un caldo, hirviendo de 20 a 30 minutos una papa en ½ litro de

agua, luego agregar una cucharada de azúcar y filtrar esta preparación en un elermeyer.

Nota: Si no se usa inmediatamente, se guarda en la heladera sellado con un tapón de goma. (con

esta cantidad se pueden preparar unas 7 cápsulas de Petri).

*Colocar nuevamente la preparación sobre el fuego, agregar una cucharada de agar-agar o

gelatina sin sabor y revolver suavemente con la varilla de vidrio para que se disuelva

completamente.

3) Preparación de las placas

*Antes de comenzar a trabajar se deben limpiar las mesadas con alcohol, se enciende el mechero

y se lo deja en el lugar de trabajo.

*Desenvolver las cápsulas y verter el caldo de cultivo hasta la mitad, tratando de levantar los

menos posible la tapa, tapar rápidamente y esperar a que solidifique.

Importante: Al preparar las placas se debe trabajar próximo al mechero para mantener las

condiciones de esterilidad. Si las placas no se usan de inmediato pueden guardarse en la

heladera.

4) Sembrado

*Antes de comenzar la siembra, también se deben limpiar las mesadas con alcohol, se debe

encender el mechero y dejarlo en el lugar de trabajo.

* En general se siembra con hansa, palillo o espátula de Drigalsky.

1- Esterilizar el hansa en el fuego (Fig. 1. 1), enfriarla sobre las paredes de la cápsula antes de

sembrar.

2- Tomar la muestra con el hansa y pasarla sobre el agar en zigzag con movimientos suaves (Fig.

1. 2 y Fig. 2).

Recomendación: Levantar la tapa de la cápsula lo menos posible para evitar contaminaciones y

trabajar siempre al lado del mechero.


80

Importante: El hansa puede prepararse con el tubo de un bolígrafo vacío y un alambre fino

doblado formando un rulo.

Fig. 1: esterilización (1) y sembrado (2)

3- Dejar las cápsulas bien tapadas a temperatura ambiente. Si se contara con una estufa a 36º C

se las coloca dentro para acelerar el crecimiento bacteriano. En cualquier caso, las cápsulas no

deben abrirse para evitar la contaminación por hongos.

5) Observación

1- Extraer con el hansa, una pequeña porción de una colonia bacteriana y colocarla en un

portaobjetos, luego agregarle una gota de agua taparlo con un cubreobjetos (ver fig. 3: montaje).

2- Para mejorar la visualización, puede teñirse con azul de metileno.

a) Se coloca sobre el portaobjetos una gota de agua.

b) Con un hansa estéril (pasando 2 ó 3 veces por el mechero) se toma una colonia de

Fig. 2: Sembrado

hansa

Espátula de Drigalsky palillo


81

bacterias de la placa y se pasa sobre una gota de agua tratando que la misma se extienda bien

sobre el portaobjetos.

c) Se coloca sobre el extendido unas gotas de azul de metileno, se deja descansar un minuto y

luego se enjuaga. Se repite esta operación y luego se coloca el cubreobjetos.

d) Se lleva al microscopio para su observación.

ACTIVIDAD: OBSERVACIÓN DE DIVERSIDAD DE PROTOZOOS AL

MICROSCOPIO.

Materiales: Cultivo de protozoos- portaobjetos- cubreobjetos- pipeta Pasteur- pinza- papel tisú.

Cultivo de Protozoos

Los protozoos son organismos unicelulares que pertenecen al Reino Protista, por lo tanto

son eucariotas. Según su rol ecológico algunos son heterótrofos y otros autótrofos.

Estos organismos se desarrollan en diferentes medios, uno de ellos, el acuático. Por esto

es posible observarlos en lugares con agua estancada de pocos días, por. ej. en floreros.

Si no se contara con esos medios, puede prepararse uno, colocando agua en un recipiente

al que se le agregan alguno de los siguientes materiales: pequeñas hojas secas, porciones de

tierra, granos de arroz o de trigo. Se los deja unos días (4 ó 5) y luego se observan al

microscopio.

Importante: No dejar más días porque estos organismos consumen el oxígeno del agua y mueren,

si se los dejara más días se debe mantener el cultivo, agregando un poco de agua potable o de

lluvia.

Montaje

1- Con una pipeta Pasteur se extrae agua del recipiente, buscando el fondo o rozando los palitos

u hojas que hubiera en el medio.

2- Se prepara un portaobjetos y se le coloca una gota del líquido extraído (a), luego se coloca el

cubreobjetos con la pinza o mano tratando que no quede burbujas de aire (b y c), ver fig. 3.


82

Fig. 3

3- Llevar al microscopio y observar, algunos de los ejemplares que pueden aparecer se muestran

en la fig. 4.

4- Si bien no se observarán como en las figuras, los movimientos permitirán determinar qué tipo

de estructura de movilidad presentan (pseudópodos, cilios, flagelos).

Fig. 4


83

*PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS PARA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

ACTIVIDAD: EXTRACCIÓN Y OBSERVACIÓN DE EPIDERMIS.

Materiales: hoja- hoja de bisturí o afeitar- pinza- portaobjetos- cubreobjetos- microscopio-papel

tisú.

Procedimiento

1- Se toma la hoja y se practica un pequeño corte que puede ser en forma de V en el órgano en

estudio, luego se toma uno de los bordes y se levante deslizándolo cuidadosamente y tratando de

separar la epidermis de los tejidos subepidérmicos (fig. 5). También puede cortarse como se

muestra en la fig. 6

2- El trozo obtenido se monta sobre un portaobjetos con unas gotas de agua, orientando la

cutícula hacia arriba para esto puede ayudarse con una pinza (Fig. 6.3).

3- Se coloca el cubreobjetos quedando el preparado listo para su observación (Fig. 6.4). Puede

secarse los bordes del cubre objetos con un papel tisú. (Fig. 6.5)

Fig. 5

Vaina de cebolla


84

Fig. 6

4- Observar al microscopio y realizar un dibujo detallado de un estoma y las diversas células de

la epidermis.

Importante: Generalmente se extrae epidermis de la cara abaxial de las hojas, en donde los

estomas son más abundantes.

Actividad: Observación de epidermis mediante la técnica de improntas

Materiales: hoja- esmalte transparente- portaobjetos- cubreobjetos- pinza- microscopio.

Procedimiento

1- Seleccionar una hoja pequeña y con buena coloración y estructura.

2- Colocar una capa de esmalte sobre uno de los lados de la hoja, extendiéndola rápidamente y

dejar secar por 2 minutos.

3-Con la pinza, comenzar a separar la capa de esmalte por uno de los extremos, debe hacerse con

cuidado para que no se rompa.

4-Colocar la capa extraídas sobre un portaobjetos y con su cubreobjetos marcar el campo de

visión.

5- Observar al microscopio y realizar un dibujo detallado de un estoma y las diversas células de

la epidermis.

Gota de agua


85

*TEÑIDOS

Colorantes usados para la observación de estructuras vegetales

La coloración de estructuras celulares está basada en la afinidad específica entre el colorante.

Los más usados son:

Yodo, ioduro de potasio (IIK): tiñe almidón de color azul violeta.

Hematoxilina: tiñe contenido celular y paredes primarias de amarillo.

Fast-Green: Tiñe paredes celulósicas de celeste.

Safranina: tiñe paredes secundarias lignificadas, cutinizadas o suberificadas en algunos casos

tiñe nucleolos (color rojo).

Sudán IV: tiñe grasas, cutina y suberina de color rojo.

* CORTE A MANO ALZADA

ACTIVIDAD: OBSERVACIÓN DE TEJIDOS AL FRESCO.

Materiales: hoja- raíz o tallo- hoja de bisturí o de afeitar- portaobjetos- cubreobjetos-

microscopio- pinza- pipeta Pasteur o gotero.

Introducción

Esta técnica implica realizar finos cortes al órgano a observar, de tal manera que sea

posible distinguir los tejidos constitutivos. Es una actividad que permite la observación en el

momento de trabajo, ya que no presentan ninguna técnica de fijación, por lo tanto es fácil de

realizar por los alumnos.

Pasos del corte

1- Seleccionar el órgano a cortar, tratando que se encuentre bien fresco y en buenas condiciones

de color y textura y que sea de un tamaño pequeño, fácil de manejar.

2- Con la hoja de bisturí o afeitar realizar los cortes en el sentido deseado, lo más delgados

posibles (cortes a mano alzada). Fig. 7)


86

Corte longitudinal: Es aquel que se realiza paralelo al eje longitudinal del órgano.

Fig. 7

3- Limpiar el porta y cubreobjeto con alcohol lavándolos con alcohol 70º y secarlos con una

gasa, evitando dejar pelusas en su superficie.

4- Colocar unas gotas de agua sobre el portaobjetos y montar el corte con la pinza.

5- Colocar el cubreobjetos en un ángulo de 45° para que no se formen burbujas de aire, apretar

suavemente con la pinza. (repasar Fig. 6)

6- Observar al microscopio.

Recomendación: Si se va a realizar una observación prolongada (más de 10 minutos), en lugar

de unas gotas de agua, es conveniente colocar unas gotas de glicerina diluida (1:1) en agua sobre

el portaobjeto, para evitar la desecación de la muestra.


87

*INDENTIFICACIÓN DE PHYLA Y CLASES DE ORGANISMOS

Actividad: Análisis de la biodiversidad de especies.

Introducción

Para esta actividad el docente deberá contar con ejemplares de invertebrados conservados

en alcohol etílico al 70%. Éste se prepara colocando 300 ml de agua por cada 1000 ml de

alcohol.

Entre los organismos se pueden recolectar bichos bolita, ciempiés, milpiés, arañas, lombrices,

pequeños caracoles, varios insectos como: langostas, escarabajos, cigarras, grillos, alguna larva

de mariposa u otro insecto, entre otros.

Luego deberá tomar una porción de tierra húmeda con hojarasca de peso conocido,

colocarla en un recipiente al que le irá agregando los ejemplares conociendo el tipo y número

que colocó.

Esto será presentado a los alumnos como muestra con un protocolo de trabajo en el que

se consignen los siguientes aspectos, una fundamentación sobre el concepto de biodiversidad y la

importancia de su conservación, un objetivo de trabajo claro, y los materiales y procedimientos.

El grupo de alumnos o cada uno deberá tomar el volumen de la muestra recibida, luego

con la ayuda de un cernidor o pinza buscará la presencia de organismos.

Al verificar que todos fueron extraídos es posible:

*determinar la diversidad considerando la variedad específica y la abundancia relativa.

*determinar la densidad de cada población explicando este concepto.

* Identificar a la especie dominante en ese volumen.

* identificar los phyla y clases representados según los organismos encontrados completando una

tabla como la que sigue.

Ejemplar Phyllum- Clase-Orden

Araña

Langosta

bicho bolita


88

*Construcción de una clave dicotómica sencilla

* Construir una clave dicotómica que permita la identificación de los ejemplares, considerando

diferentes características exomorfológicas como: apéndices, la tagmosis, presencia de alas, tipos

de alas, número de patas, tipo de aparato bucal, etc. Recordar que una clave dicotómica es una

herramienta de trabajo que siempre va considerando de a dos alternativas para una determinada

característica.

Una buena clave dicotómica debe tener las siguientes características:

-presenta características claramente identificables agrupadas de a pares que deben ser

mutuamente excluyentes.

- tiene estilo telegráfico en su redacción.

- las características son absolutas y no dependen de juicios (ej. oscuro/claro).

- las características usadas deben ser fácilmente observables.

- las características consideradas deben ser aplicadas a ambos sexos o edad del grupo.

-puede presentar ilustraciones de referencia sobre todo de características que presentan

confusión, también puede contar con un glosario que defina algunos conceptos o estructuras que

puedan resultar desconocidas.

Ejemplo 1:

1a-cuerpo dividido en cabeza, tórax y abdomen...........................2

1b-cuerpo no dividido en cabeza tórax y abdomen, sino cefalotórax y abdomen....................... 2

2a- un par de antenas presentes...........................................................Clase Insecta

2b- más de un par de antenas presentes………………….....................................................3

3a- dos pares de antenas………………………………………. Clase Crustacea

3b- sin antenas………………………………………………….Clase Arácnida


89

Ejemplo 2:

A. Fruto seco.

B. Fruto dehiscente.

C. La dehiscencia se produce por dos líneas de sutura (dorsal y

ventral).......................... Legumbre.

CC. La dehiscencia se produce por una sustura ventral........Folículo.

BB: Fruto indehiscente.

D. Fruto proveniente de un gineceo súpero.

DD. Fruto proveniente de un ovario ínfero.

*MONTAJE DE PEQUEÑOS ARTRÓPODOS Y DISECCIÓN

ACTIVIDAD: ESTUDIO EXOMORFOLÓGICO DE INSECTOS

Materiales: insectos con aparatos bucales diferentes conservados en alcohol 70°- pinza- aguja de

disección- cápsula de Petri o vidrio de reloj, gotero con agua o recipiente y pipeta Pasteur-

plancha de telgopor- plasticola transparente o cinta adhesiva.

Introducción

Los insectos conforman el grupo más numeroso y diverso entre los artrópodos, presentan

una gran diversidad tanto en forma como en tamaño. A nivel exomorfológico es posible

reconocer variaciones en el aparato bucal, tipo de alas, antenas y modificaciones en las patas.

1- Observación y análisis de un insecto

Con la ayuda de una figura (Fig. 8) como la siguiente se puede observar con una lupa la

exomorfología del insecto.


90

*Con la ayuda de las siguientes figuras puedes determinar las características que te permitirán

completar el cuadro dado debajo.

Fig. 9 Tipos de antenas

Ref: 1: filiforme, 2: filiforme modificada, 3: clavada, 4: moniliforme, 5: aserrada, 6: lamelada, 7:

pectinada.

Fig. 8

7


91

Fig. 10 tipos de alas.


92

Fig. 11 tipos de patas.

Ref: A: caminadora, el resto son modificaciones según el ambiente o por dimorfismo sexual.


93

Fig. 12 tipos de aparatos bucales

Recomendación: El cuadro puede ser completado colocando los códigos que identifican a cada

tipo de estructura (número o letra).

Cuadro de características.

Característica Muestra

Tipo de alas

Tipo de antenas

Tipo de aparato bucal

Tipo de patas


94

* Se extrae una pata y se la pega sobre el telgopor, se identifican sus partes con la ayuda de un

esquema como el siguiente. (Fig. 13)

2- Observación de aparato bucal masticador

Introducción

Si cuenta con lupa es posible tomar dos ejemplares de insectos para analizar los aparatos

bucales, separando e identificando cada una de las piezas que lo componen. El más fácilmente

visible es el aparato masticador que poseen las langostas, escarabajos o grillos.

En la cabeza de los insectos, además de las antenas encontramos tres pares de apéndices.

Éstos son los bucales, que conforman el aparato bucal, muy importante para la sistemática de

insectos y la comprensión de sus hábitos.

Los elementos más notables de la boca de un insecto son las mandíbulas, maxilas, y el labio. La

disposición y forma primaria de los mismos son las del aparato bucal masticador típico.

Estas piezas se observan modificadas según los hábitos alimentarios, así aparecen aparatos

bucales: cortador-chupador- chupador- picador-chupador, masticador- lamedor, etc.

Procedimiento

Se corta la cabeza y con la ayuda de una figura como la Fig. 9 se van separando los apéndices y

se van pegando uno a uno sobre el telgopor, con sus nombres.

Fig. 13


95

ACTIVIDAD: COMPARACIÓN ENTRE DIFERENTES CLASES DE ARTHROPODA

Luego del trabajo de observación del o los insectos (I), si se cuenta con otros

invertebrados artrópodos como: araña (A), escorpión (E), cangrejo (C), milpiés (M) u otro

representante de cada una de las Clases de Arthropoda, puede elaborarse un cuadro comparativo

con las siguientes características.

Característica I A E C M

Tagmosis

Segmentos que componen la tagmosis

Nº de patas

Nº de antenas

Nº de alas

Ubicación de las patas

Ubicación de las alas.

Fig. 9


96

MÉTODOS FÍSICOS Y QUÍMICOS

*Pruebas estándares de monosacáridos, polisacáridos

Actividad: Identificación de componentes en una sustancia.

Situación problemática: Un técnico preparó seis soluciones pero al finalizar olvidó rotularlas. Lo

que sabemos es que utilizó glucosa, almidón, y albúmina y que tres de las muestras son una

mezcla entre 2 ó 3 de los compuestos mencionados anteriormente. Utilizando los test

mencionados a continuación ¿te animas a ayudarnos a determinar que contiene cada muestra?

Muestra (M)

M1: Lugol(+) Fehling (-) Bradford (-) M4: Lugol(+) Fehling (+) Bradford (-)

M2: Lugol(-) Fehling (+) Bradford (-) M5: Lugol(+) Fehling (-) Bradford (+)

M3: Lugol(-) Fehling (-) Bradford (+) M6: Lugol(+) Fehling (-) Bradford (+)

Lo que se conoce de cada uno de los test es lo siguiente:

Reacción de Bradford:

Bajo condiciones apropiadas los grupos ácidos y básicos de las proteínas interactúan con grupos

disociados de colorantes orgánicos para formar precipitados coloreados. Este procedimiento es

muy útil para la determinación cuantitativa de proteínas y fue desarrollado por Marion Bradford.

El método emplea el colorante Azul brillante de Comassie G-250. La unión del colorante a la

proteína produce un cambio en la absorción máxima del colorante de 465 nm (forma roja) a 595

nm (forma azul). Por lo tanto el cambio de color de la solución de marrón-rojizo a azul indica

presencia de proteínas.

Reacción de Fehling: En medio alcalino y en presencia de azúcares reductores el calentamiento

produce decoloración de la solución azul del reactivo (que contiene Cu++) y la aparición de óxido

cuproso (Cu2O) de color rojo.


97

Test de Lugol para la determinación de Almidón:

El reactivo de Lugol cambia de un color marrón-amarillo a azul-negro en presencia de almidón,

pero no cambia de color en presencia de un disacárido o monosacárido.

Respuesta

M1: almidón. M4: almidón + glucosa.

M2: glucosa. M5: almidón + albúmina.

M3: albúmina. M6: almidón + glucosa+ albúmina.


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MÉTODOS ESTADÍSTICOS

TEST ESTADÍSTICO X2

En Biología es muy importante poder evaluar si los datos observados (Oi) se ajustan o no

a las frecuencias teóricas esperadas (Ei). Cuando asumimos que los datos se adecuarán a una

proporción dada, establecemos lo que se llama HIPOTESIS NULA (Ho). Se llama así debido a

que se asume que no hay diferencias reales entre Oi y E1, y en el caso de existir alguna pequeña

diferencia sería atribuida al azar. Una de las pruebas estadísticas más simples para valorar la Ho,

es el análisis de X2. Esta prueba tiene en cuenta las desviaciones observadas de cada componente

de una proporción esperada, así como el tamaño de la muestra y las reduce a un único valor

llamado estadístico o X2 calculado

(O1 - E1)2

X2 = ∑

Ei

Este valor de X2 se utiliza luego para estimar si la desviación observada se debe o no al azar. La

distribución de X2 es una función de la densidad de probabilidades. El estadístico puede tomar

valores entre 0 → ∝

La tabla de doble entrada que se te presenta a continuación representa los valores de X2

tabulados en función de los Grados de Libertad (GL) y de un valor de probabilidad α

G.L\ α 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1 0,05 0,01

1

0.02 0.15 0.46 1.17 2.71 3.84 9.21

2

0.21 0.71 1.39 2.41 4.60 5.99 9.21

3

0.58 1.42 2.37 3.66 6.25 7.82 11.34

4

01.06 2.20 3.36 4.88 7.88 9.49 13.28

Grados de libertad: se calculan como GL = n - 1, donde n es en este caso el número de clases

fenotípicas.

Valor de probabilidad : α es la probabilidad de rechazar una hipótesis nula siendo esta


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verdadera.

Uno de los aspectos más importantes del análisis de X2 es comprender lo que significa

realmente el valor α. Analicemos un ejemplo: ¿qué indica un α= 0, 26? Si se repitiera el

experimento muchas veces, en el 26% de las repeticiones esperaríamos una desviación por azar

igual o mayor que la observada en la prueba inicial. Por el contrario en el 74% de las

repeticiones mostrarían menor desviación por azar que la inicialmente observada. Esto

demuestra que una Ho nunca puede ser aceptada o rechazada de manera absoluta. Por ello se

debe fijar un límite que sirva de base para rechazar o no la Ho. Este límite es a menudo un valor

de α = 0.05. Esto significa que si el valor de X2 calculado no excede al valor de X2 tabulado,

hay 95% de probabilidad de aceptar la Ho sin equivocarse.

Ejemplo: X2 calculado = 4,45 GL =2 X2 tabulado = 5.99 α = 0.05 Conclusión: como el valor de X2 calculado es menor que el valor crítico tabulado, la Ho no

puede ser rechazada.


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LA DISTRIBUCIÓN T Y EL TEST T

La distribución t fue descrita por primera vez por Gosset usando una lapicera llamada “Student”

y por ello se llamo distribución de student. Esta distribución dice que la diferencia entre la media

(m) aritmética de la muestra (m) y la verdadera (µ) dividida por el error estándar de la media de

la muestra sigue la distribución t

mSumt −

=

El error estándar de la media de la muestra es referida como:

nSSm

2

=

Donde S es la desviación estándar y n el número de observaciones.

La forma de la distribución t depende de los grados de libertad (v)

1−= nV

La tabla t está dispuesta con los grados de libertad (v) abajo y las probabilidades a lo largo de la

tabla. Estas probabilidades corresponden a las áreas bajo la curva de la distribución t (figura en

parte derecha de la tabla). Observa que la tabla muestra sólo los valores absolutos de t; dado que

la curva es simétrica alrededor de 0. Nota que hay dos colas pintadas de negro que cada una

contribuye a la mitad del valor de α El valor de α es elegido dependiendo del nivel de

significancia que deseas; el valor t correspondiente es llamado valor crítico de t para α =0,05 y

V=5, encontramos t =2,571. La hipótesis nula (H0) es que la media de la muestra no es

significativamente diferente de la media verdadera. Si el valor absoluto del estadístico t

observado es menor que el crítico t la hipótesis nula no es rechazada.


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CURTIS, H. y S. BARNES. 2000. Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. DAVIES, R. G. 1991. Introducción a la Entomología. Ediciones Mundi-Prensa. HICKMAN, C., L. ROBERTS y A. PARSON. 2002. Principios integrales de Zoología.


MADIGAN, M. T.; J. M. MARTINKO and J. PARKER. 1998. Brock. Biología de los

microorganismos. Ed. Prentice Hall. 8va. ed.

MARSHALL, A. y W. WILLIAMS. 1980. Zoología Invertebrados. Ed. Reverté SA. PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La

ciencia

de la Biología. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed. SOLOMON, E. P; L. R. BERG y D. W. MARTIN, 1999. Biología. Ed. Mc Graw Hill


Apuntes elaborados por docentes de las Cátedras de:

MORFOLOGÍA VEGETAL

GENÉTICA

ZOOLOGÍA DE INVERTEBRADOS

BIOLOGÍA GENERAL

Departamento de Ciencias Naturales- Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y

Naturales- Universidad Nacional de Río Cuarto.

olimpÍada argentina de biologia - oabplásmido recombinante se transfiere a una célula bacteriana...

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