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1 ESTUDIO DE BACTERIOCINAS Y PLÁSMIDOS BACTERIOCINOGÉNICOS DE CEPAS DE Staphylococcus aureus DE ORIGEN CLÍNICO. I AISLAMIENTO DE CEPAS DE S. aureus, PRODUCTORAS DE ESTAFILOCOCINAS Y ANÁLISIS DEL PLÁSMIDO BACTERIOCINOGÉNICO Registro SIP de 2007/03/27 Dir. Alicia Espinosa Lara

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ESTUDIO DE BACTERIOCINAS Y PLÁSMIDOS BACTERIOCINOGÉNICOS DE CEPAS DE Staphylococcusaureus DE ORIGEN CLÍNICO. I AISLAMIENTO DE CEPAS DE S. aureus, PRODUCTORAS DE ESTAFILOCOCINAS Y

ANÁLISIS DEL PLÁSMIDO BACTERIOCINOGÉNICO

Registro SIP de 2007/03/27 Dir. Alicia Espinosa Lara

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RESUMENCon el objeto de establecer si las cepas de Staphylococcus aureus de origen clínico producen bacteriocinas y si éstas están codificadas en DNA plasmídico, se analizaron 25 cepas de Staphylococcus aureus del Instituto Nacional de Rehabilitación (I.N.R.) y 25 del Centro Médico “La Raza”. A las cepas se les practicaron las pruebas microbiológicas para la confirmación de género y especie, así también se les determinó la sensibilidad a 12 antimicrobianos, usando para ello, multidiscos comerciales, se encontró que todas ellas fueron resistentes a penicilina G y a ampicilina, mientras que mostraron sensibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol, tetraciclina y gentamicina; con respecto a los antibióticos del grupo de las cefalosporinas, sólo las cepas del C.M.R., presentaron resistencia.

La producción de bacteriocina se midió por la técnica de difusión en agar, más del 75% de las cepas estudiadas sintetizaron la proteína, aunque las cepas del C.M.R., presentaron un espectro de acción más amplio. Tomando en cuenta el número de cepas sensibles a cada bacteriocina y el tipo de acción de la misma, se estableció la existencia de 31 bacteriocinasdiferentes.

Para determinar si los marcadores para la producción de bacteriocinas son extracromosómicos, se determinó en primer lugar, el patrón plasmídico de las cepas productoras, encontrándose que las cepas del I.N.R., en su gran mayoría, presentan un solo plásmido, con una migración electroforética en geles de agarosa al 1.2% de aproximadamente 15 mm; sólo dos de estas cepas presentaron plásmidos adicionales. En el caso de las cepas del C.M.R., aproximadamente el 50% presentó un solo plásmido, con diferencias en su migración electroforética y el resto presentaron dos plásmidos.

A partir de los resultados anteriores, se seleccionaron ocho cepas, para establecer si la bacteriocina estaba codificada en el DNA plasmídico; las cepas se sometieron a un tratamiento con dodecil sulfato de sodio (SDS) para eliminar el plásmido, seleccionándose aquéllas que perdieron la resistencia a ampicilina; posteriormente, a las cepas curadas (Ams) se les determinó la producción de bacteriocinas, encontrándose que en la mayoría de los casos, sólo una de las clonas curadas (Ams) perdió también la producción de bacteriocina; el resto de las clonas curadas siguieron produciendo.

Finalmente, para comprobar que los plásmidos presentes en las diferentes cepas eran bacteriocionogénicos, se realizó el aislamiento del DNA plasmídico de las clonas curadas no productoras y productoras de bacteriocina y se determinó su presencia, mediante electroforesis en geles de agarosa; en los aislamientos de las clonas curadas no productoras, no se observó la banda correspondiente al plásmido presente en la cepa no curada y en las clonas curadas productoras de bacteriocina, se encontró una banda de DNA plasmídico, con una migración electroforética ligeramente mayor que el plásmido de la cepa no curada; estos resultados permitieron señalar que los plásmidos presentes en las cepas analizadas, llevan los marcadores que codifican para la bacteriocina y que la resistencia a los antibióticos, probablemente reside en un transposón que se segrega del plásmido mediante el tratamiento con SDS con mayor frecuencia que el plásmido que lo contiene; aspecto que no se había reportado en la literatura.

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INTRODUCCIÓN.

S. aureus es un microorganismo de interés médico que ocasiona problemas a nivel de piel y aparato respiratorio y su aislamiento es frecuente en nuestro país; por otro lado las infecciones intrahospitalarias por este género bacteriano han adquirido importancia a nivel nacional.

En estos microorganismos, se ha descrito en la literatura la existencia de DNA extracromosómico (plásmidos) en el que residen marcadores para la resistencia a antimicrobianos, producción de bacteriocinas y producción de toxinas.

Las bacteriocinas en general, son proteínas de tipo antibiótico que inhiben el desarrollo de bacterias de la misma especie, no poseedoras de los genes que codifican para la bacteriocina a la que son sensibles. En el caso de S. aureus se ha determinado que las bacteriocinas que producen, cuando menos aquéllas producidas por cepas que infectan piel, son activas no sólo contra cepas de la misma especie, sino también contra otras especies de diferentes géneros tanto de bacterias Gram (+) como Gram (-). Esta situación hace evidente la importancia que tienen estos productos para asegurar la prevalencia de S. aureus en diferentes hábitats. Por otro lado, las bacteriocinas también se han empleado como marcadores para la identificación de algunas bacterias causantes de problemas epidemiológicos, por ejemplo Pseudomonas y Klebsiella, además, existen informes de que las bacteriocinas se han usado para controlar algunas infecciones bacterianas y para la preservación de alimentos como lácteos y cárnicos.

En relación a S. aureus la producción de la bacteriocina se ha relacionado con la presencia de un plásmido y al respecto, en la literatura se han descrito dos tipos: plásmidos pequeños de aproximadamente 10 Kb y grandes, de aproximadamente 40 Kb. En el presente trabajo, se estudiaron cepas de S. aureus aisladas de ambiente intrahospitalario mexicano para establecer su comportamiento en relación a sensibilidad a los antimicrobianos, producción de bacteriocinas y la relación de ésta con la presencia de DNA plasmídico.

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METODOS.

1. Confirmación de género y especie.

a) Determinación de la morfología macroscópica y microscópica de las cepas de

Staphylococcus.

A partir de cada una de las muestras clínicas que se encontraban en agar sangre

se procedió a tomar una asada para sembrarla en 5 ml de caldo BHI, se incubó

a 37°C por 24 horas, se sembró por estría cruzada en agar BHI y nuevamente se

incubó a 37°C por 24 horas. Se verificó la morfología microscópica mediante la

Tinción de Gram y la morfología macroscópica observando el tamaño y aspecto

de las colonias en el agar.

b) Determinación de género por la prueba de catalasa (Espinosa, et al., 2003).

De acuerdo a la prueba de catalasa en portaobjetos, la determinación se realizó,

mezclando la colonia a probar con una gota de H2O2 al 3%, para poner de

manifiesto la presencia de la enzima catalasa.

c) Crecimiento en agar de sal y manitol (Espinosa et al., 2003).

De las colonias aisladas en Agar BHI se tomó una asada para sembrarla en 5

mL de caldo BHI, se incubó a 37 ºC por 24 horas. Después de la incubación se

sembró por estría cruzada en agar de sal y manitol y se incubó a 37 ºC durante

24 horas. El crecimiento y vire del indicador del medio se emplearon para

confirmar la especie.

d) Crecimiento en caldo BHI con NaCl al 15%.

De las cepas que crecieron en agar de sal y manitol, se tomó una colonia para

sembrarla en tubos con 5 ml de caldo BHI con NaCl al 15%. Los tubos se

incubaron a 37 ºC por 24 horas. El crecimiento confirma la resistencia de S.

aureus a concentraciones altas de NaCl, característico del género. Modificado de

Espinosa et al., 2003).

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3. Prueba de producción de la bacteriocina .

a. Se inocularon 10 mL de medio BHI con una asada de la cepa productora, se

incubó toda la noche a 37ºC.

b. Se sembraron 10 μL del cultivo de toda la noche de cada una de las

posibles productoras, en tres zonas de la caja de Petri con agar BES (BHI-

Extracto de levadura-Sacarosa) pH 6.5. Estas cajas se incubaron a 37ºC por

48 horas para permitir la producción de la bacteriocina.

c. Al término del período de incubación, se eliminó el crecimiento de la cepa

productora replicando sobre terciopelos estériles. Posteriormente, las placas

se expusieron a vapores de cloroformo (3 mL) durante 30 min. a 35ºC.

d. Una vez que se eliminó el crecimiento de la cepa productora, se procedió a

sembrar 0.1 ml de la cepa indicadora crecida a 25 Unidades Klett, usando la

técnica de vaciado con agar blando , sobre las placas que tenían el “parche”

de la productora, se dejó solidificar y se incubó a 37ºC por 12 a 14 h.

Posteriormente se verificó la ausencia o presencia de crecimiento de la cepa

indicadora. La ausencia de crecimiento de la cepa indicadora se tomó como

lisis total o parcial, dependiendo si la inhibición fue completa o parcial.

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4. Aislamiento del DNA plasmídico por la técnica de Birnboim & Doly

modificada por Zuccarelli).

a) En 15 mL de caldo BHI estéril contenidos en un matraz, se inoculó una asada de

la cepa productora de la bacteriocina y se incubó en agitación a 37ºC du rante

18 horas All término del período de crecimiento se cosechó por centrifugación

a 3,500 x g durante 15 minutos en una microcentrífuga Hettich,

posteriormente las células se resuspendieron en 1 mL de regulador TE y se

centrifugaron a 13,000 x g por 10 minutos en la microcentrífuga.

b) Las células se resuspendieron en 250 μL de TE más 20 μL de una solución

enzimática de lisostafina (2.5 mg/mL) y se incubaron a 37°C durante 30

minutos. Posteriormente se adicionaron 0.4 mL de la Sol. II de Birnboim &

Doly. La mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo.

c) Se adicionaron 0.3 mL de la solución III de Birnboim & Doly agitando

suavemente, el lisado se mantuvo en hielo por 10 minutos. La mezcla se

centrifugó a 13,000 x g por 10 minutos en la microcentrífuga. El

sobrenadante se trató con 400 μL de fenol equilibrado.

d) La preparación se dejó en reposo, se centrifugó a 13,000 x g durante 10

minutos. El sobrenadante se extrajo cuidadosamente.

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e) La preparación se incubó con 2 μL de RNAsa pancreática (10 mg/mL), por

15 minutos a 37°C. Se extrajo con 300 μL de fenol-cloroformo (1:2),

centrifugando a 13,000 x g durante 3 minutos.

f) g) Se colectó la fase acuosa y el DNA se precipitó con 3 volúmenes de

etanol absoluto frío durante 20 minutos. Después de este tiempo se colectó

el DNA por centrifugación a 13,000 x g en la microcentrífuga Hettich, durante

10 minutos.

g) h) El DNA se lavó con 1 mL de etanol frío al 70%. Se eliminó el etanol, se

dejó secar el DNA en la incubadora a 37°C y se le adicionaron 40 μL de

regulador TE o agua desionizada estéril para solubilizar el DNA.

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6. Determinación del patrón plasmídico de las cepas productoras de

bacteriocina.

a) Preparación de la muestra:

Se tomaron 10 μL de cada preparación de DNA obtenido por la técnica modificada de

Birnboim y Doly, se colocaron en tubos de microcentrífuga con 3 μL de regulador de

carga, se agitó y se centrifugó por para reunir el volumen de cada muestra.

b) Corrimiento electroforético.

Se preparon 25 mL de gel de agarosa al 1.2% usando como disolvente regulador

TAE1X.

La suspensión de agarosa se calentó a ebullición hasta observar su completa

disolución. Cuando el gel se enfrió a aproximadamente 70ºC se agregaron 2 μL de

una solución de bromuro de etidio (0.5 μg/mL).

Aparte se preparó el soporte del gel junto con el peine adecuado en un lugar nivelado

para que el gel quedara completamente horizontal.Cuando la agarosa alcanzó cerca

de 50°C se vació en el soporte, evitando la formación de burbujas y se colocó el

peine.

Después de 30 minutos aproximadamente, se trasladó el gel a la cámara de

electroforesis, la cual se llenó posteriormente con el regulador TAE 1X hasta cubrir los

pozos.

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Las muestras se depositaron en los pozos correspondientes, el corrimiento se

inició empleando una diferencia de potencial de 60 volts y se detuvo cuando el

azul de bromofenol del regulador de carga llegó a 1 cm del borde del gel.

El gel se observó en un transiluminador de luz ultravioleta de onda corta.

7.- Eliminación del DNA plasmídico por tratamiento con SDS

Para este fin, se decidió emplear como marcador de seguimiento, la resistencia

a ampicilina que presentaron todas las cepas, dada la facilidad para detectar su

pérdida.

A. Determinación de la concentración de SDS que produce el 90% de muerte

a) En un matraz Erlenmeyer de 125 ml se colocaron 10 mL de caldo BHI con

una asada de la cepa a tratar. El cultivo se incubó en agitación a 37°C toda

la noche.

b) En un matraz nefelométrico se depositaron 10 mL de caldo BHI con 0.1 mL

del cultivo de toda la noche y se incubó hasta alcanzar 70 Unidades Klett

(aproximadamente 5 X 10 8 células/mL).

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c) En 5 matraces Erlenmeyer conteniendo cada uno 10 mL de caldo BHI se

colocaron 0, 40, 80, 120 y 160 μg/mL de SDS más 0.1 mL de la cepa crecida

a 70 UK, las excepciones fueron la cepa 8 y la 50, que requirieron mayor y

menor concentración de SDS, respectivamente. La mezcla se incubó en

agitación a 37°C durante 3 horas.

d) Después del tiempo de incubación, se sembraron por duplicado en cajas de

agar BHI las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 de cada tratamiento para obtener

colonias aisladas, con la finalidad de contarlas y determinar el % de muerte.

B. Eliminación del marcador de resistencia a Ampicilina (AM).

Después del tratamiento con SDS, se comprobó la eliminación del marcador de

resistencia a ampicilina, para esto, las colonias sobrevivientes al tratamiento

con SDS se replicaron con terciopelos estériles, usando cajas con agar BHI +

ampicilina y sin ampicilina. Aquéllas colonias que crecieron en agar BHI sin

ampicilina pero que no lo hicieron en el agar BHI + ampicilina son las que

perdieron la resistencia a ampicilina; éstas se aislaron y purificaron para su

conservación.

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. RESULTADOS.

1. Confirmación de las características de género y especie.

El presente trabajó se realizó con 50 cepas de S. aureus aisladas de muestras

clínicas del Instituto Nacional de Rehabilitación (25 cepas) y del Centro Médico “La

Raza” (25 cepas) de la Ciudad de México.

De acuerdo a la identificación microscópica, las cepas utilizadas para este estudio

correspondieron en la tinción de Gram y en la prueba de catalasa al género

Staphylococcus.

En seguida, con el objeto de confirmar el género y la especie, así como de obtener

colonias puras, todas las cepas se inocularon en caldo BHI a 37ºC durante 24 horas

para estriarlas en el medio agar de sal y manitol, posteriormente, las colonias que

crecieron en este medio, se sembraron en caldo BHI con 15 % de NaCl.

Seis de las cepas del I.N.R. no crecieron (4, 6, 11, 19, 23, 24) o crecieron sin hacer

virar el indicador del medio agar de sal y manitol (9, 16, 18, 20). Todas las cepas del

C.M.R., crecieron en este medio.

Las cepas utilizadas (40) para la búsqueda de bacteriocinas fueron aquéllas que

crecieron en agar de sal y manitol, que además hicieron virar el indicador del medio de

cultivo y crecieron en BHI con 15% de NaCl .

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2. Sensibilidad a los antimicrobianos.

La determinación se efectuó empleando sensidiscos múltiples, como se indica en

Metodología. Los resultados obtenidos se presentan en las Tablas 1 y 2; como se

observa, todas las cepas independientemente de su origen presentaron resistencia a

penicilina G y ampicilina y sensibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol.

En el caso del I.N.R., se observó que sólo 7, el 46% presentaron resistencia a

antibióticos diferentes de penicilina y ampicilina, mientras que el 96% de las cepas del

C.M.R., presentaron resistencia a más de dos antimicrobianos, es decir, las cepas del

C.M.R., son multirresistentes, en tanto que la mayoría de las del I.N.R., sólo son

resistentes a penicilina y ampicilina.

Tabla 1. Determinación del patrón de sensibilidad a los antimicrobianos de las cepas del I.N.R.

ANTIBIÓTICO

Cepa de S. aureus

Am

pici

lina

Cef

alot

ina

Cef

otax

ima

Cef

tazi

dim

a

Cef

urox

ima

Dic

loxa

cilin

a

Eitr

omic

ina

Gen

tam

icin

a

Peflo

xaci

na

Peni

cilin

a

Tetr

acic

lina

Trim

etop

rim/s

ulf

amet

oxaz

ol

1 R S S S S S S S S R S S 2 R S S R S R S S S R S S 3 R S S S S S S S S R S S 5 R S S S S S R S S R S S 7 R S S S S S S S S R S S 8 R S S S S S R S S R S S 10 R S S S S I S S I R S S 12 R S S S S S S S S R S S 13 R S S S S S S S S R S S 14 R S S S S S S S S R S S 15 R S S S S R S S S R I S 17 R S S I S S I S S R S S 21 R S S R S S S S S R S S 22 R S S I S S S S S R S S 25 R S S R S S S S S R S S

S = Sensible, I = Intermedio, R = Resistente

R

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Tabla 2. Determinación del patrón de sensibilidad a los antimicrobianosde las cepas de S. aureus del C.M.R.

ANTIBIÓTICO

Cepas de S. aureus

Am

pici

lina

Cef

alot

ina

Cef

otax

ima

Cef

tazi

dim

a

Cef

urox

ima

Dic

loxa

cilin

a

Eitr

omic

ina

Gen

tam

icin

a

Peflo

xaci

na

Peni

cilin

a

Tetr

acic

lina

Trim

etop

rim/s

ulfa

met

oxa

zol

27 R S S S S S S S S R S S 28 R S S S S S R S R R R S 29 R S S S S S R S S R S S 30 R R R R R R R S R R S S

31 R R R R R R R S R R S S

32 R R R R R R R S R R S S

33 R I R R R R R S R R I S

34 R R R R R R R I R R S S

35 R R R R R R R S R R S S

36 R R R R R R R S R R S S

37 R R R R R R R R R R S S

38 R S S R S R S S R R S S

39 R S S R S I S S R R S S

40 R S S R S R S S S R S S

41 R R R R R S R S R R S S

42 R S S R S I S S S R S S

43 R R S S S R R S S R I S

44 R R S S S R R S S R I S

45 R R R R R S R S R R S S

46 R S S R S I S S R R S S

47 R S S R S I S S S R S S

48 R S S R S R S S S R S S

49 R R R R R R R S R R S S

50 R R R R R R R S R R S S

51 R R R R R R R S R R S S

S = Sensible, I = Intermedio, R = Resistente

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3. Producción de bacteriocinas.

Las 40 cepas de S. aureus (ver Tablas 3), se emplearon como productoras de

bacteriocina e indicadoras de sensibilidad a la misma. Como se observa en la Tabla

No. 3, el 77.5% de ellas son productoras de bacteriocina, aunque un pequeño

porcentaje de las cepas productoras no lisan completamente el cultivo de la cepa

indicadora (lisis parcial). Del total de cepas productoras, el mayor porcentaje (86.6%)

correspondió a las cepas del I.N.R., y sólo el 72% a las cepas del C.M.R.

Por otro lado, las bacteriocinas de las cepas del I.N.R., excepto de las cepas 12 y 13,

sólo actúan sobre las aisladas en el mismo hospital, en tanto que las cepas del

C.M.R., actúan tanto sobre las aisladas en el propio hospital como sobre algunas

aisladas en el I.N.R. (Tabla 3). Además, como era de esperarse, la cepa productora

es inmune a la bacteriocina que produce.

Se encontraron además, bacteriocinas con un espectro de acción muy amplio, que

lisan entre 9 y 11 cepas indicadoras, tanto del I.N.R. como del C.M.R. y algunas que

sólo lisan entre 1 y 4 cepas indicadoras (espectro de acción reducido), como se

muestra en la Tabla 3.

Finalmente, de un total de 1,600 cruzas entre productoras e indicadoras, se determinó

que aproximadamente el 77.5% de las cepas estudiadas, producen bacteriocinas,

independientemente de que la cepa sea resistente sólo a dos o más antimicrobianos.

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Tabla 3. Espectro de acción de las bacteriocinas producidas por las diferentes cepas de S. aureus.

LT = Lisis Total LP = Lisis Parcial

Cepas de S. aureus del I.N.R., productoras de bacteriocina

Número de cepas de S. aureus sensibles a la bacteriocina

Cepas de S. aureus del C.M.R., productoras de bacteriocina

Número de cepas de S. aureus sensibles a la bacteriocina

2 11 LT/1 LP 27 3 LT/10 LP

3 3 LP 30 2 LT/5 LP

5 3 LT/6 LP 31 8 LT/1 LP

8 6 LT/2 LP 32 8 LT

10 1 LT/4 LP 33 1 LT/9 LP

12 9 LT/5 LP 34 4 LP

13 6 LP 37 1 LT

14 10 LT/3 LP 38 2 LT

15 3 LT 39 9 LT/3 LP

17 6 LT 41 2 LP

21 3 LT 43 3 LP

22 7 LT/2 LP 44 2 LP

25 8 LT/1 LP 45 1 LT/1 LP

47 7 LT/4 LP

48 5 LT/3 LP

49 9 LT/5 LP

50 9 LT/9 LP

51 8 LT/11 LP

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4. Determinación del patrón plasmídico de las cepas en estudio.

Se emplearon para este propósito únicamente las cepas que produjeron bacteriocinas

que lisan completamente a las cepas sensibles (Ver Tabla 3). La presencia de

plásmidos se estableció mediante el aislamiento de su DNA y el análisis del

comportamiento electroforético del mismo.

Los resultados obtenidos se presentan en las figuras 2, 3 y 4. Puede observarse (Fig.

2 y 3) que la mayoría de las cepas del I.N.R., presentaron un solo plásmido que

mostró en cada aislado una migración electroforética de aproximadamente 15 mm 1).

Además se encontraron dos cepas, la 5 y la 14, en las que se presentan dos y tres

plásmidos, respectivamente.

Las cepas provenientes del C.M.R., presentaron un comportamiento ligeramente

diferente; en primer lugar, el número de cepas con un solo plásmido representa

aproximadamente el 50% del total, el resto presentan dos plásmidos; segundo, el

tamaño del plásmido único no es semejante para todas las cepas, como se observó

para las del I.N.R., y tercero, en las cepas que presentan dos plásmidos

(aproximadamente el 50%), el segundo es de mayor tamaño (Figs. 2, 3, 4) .

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17

12 142 15 175 8 10

Figura. No. 2. Electroferograma del DNA plasmídico de las cepas 2, 5, 8, 10, 12, 14,15 y 17 de S. aureus productoras de bacteriocina. Agarosa al 1.2%, 60 volts.

Figura. No. 3. Electroferograma del DNA plasmídico de las cepas 21, 25, 27, 30,31, 32, 37 y 39 de S. aureus productoras de bacteriocina. Agarosa al 1.2%, 60 volts.

25 27 30 31 3221 37 39

Figura. No. 4. Electroferograma del DNA plasmídico de las cepas 38, 45, 47, 48, 50 y 51 de S. aureus productoras de bacteriocina. Agarosa al 1.2%, 60 volts.

51504938 45 47 48

15 mm

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5. Curación del DNA plasmídico de las cepas en estudio.

Para llevar a cabo esta fase del estudio, se dividió a las cepas productoras en

aquéllas que producen bacteriocinas de amplio espectro (8 a 11 cepas lisadas), de

espectro medio (5-7 cepas lisadas) y de espectro reducido (lisis de 1 a 4 bacterias

sensibles diferentes), se seleccionaron 2 de espectro amplio, 1 de espectro medio y 1

de espectro reducido, provenientes de cada hospital para realizar la curación,

haciendo un total de 8 cepas.

Por otro lado, se eligió como marcador a seleccionar, la resistencia a ampicilina ya

que todas las cepas la presentan y es fácil de identificar.

En primer lugar, se determinó la curva de sobrevivencia al SDS de cada cepa, con el

objeto de establecer la concentración de SDS (agente curante) que produce el 90% de

muerte, proporción que se ha recomendado como óptima para eliminar plásmidos .

Los resultados se presentan en las figuras 5 y 6, a partir de estas figuras se estableció

la concentración de SDS para curar cada cepa (Tabla 14), las cuales indican que las

cepas del I.N.R., son ligeramente más resistentes a SDS que las del C.M.R.

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S = sensible, R = resistente, V = variable, ND = no demostrable

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

μg/mL de SDS

% d

e m

uert

e % de muerte cepa 2% de muerte cepa 5% de muerte cepa 14% de muerte cepa 8

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

μg/mL de SDS

% d

e m

uert

e % de muerte cepa 27% de muerte cepa 39% de muerte cepa 47% de muerte cepa 50

Figura 5. Curva de letalidad de SDS sobre las cepas 2, 5, 8 y 14 de S.aureus.

Figura 6. Curva de letalidad de SDS sobre las cepas 27, 39, 47 y 50 deS.aureus.

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Una vez conocida la dosis de SDS con la cual se obtiene el 90% de muerte para

cada una de las cepas de S. aureus, del I.N.R. y del C.M.R., se procedió a

determinar el efecto de curación sobre el marcador de resistencia a AM. La

metodología utilizada se describe en el capítulo de Materiales y Métodos. Después

de realizar el tratamiento, se procedió a analizar entre 500 y 1,000 colonias

sobrevivientes, para cada una de las cepas en estudio. La determinación de la

pérdida del marcador de resistencia a AM se realizó por comparación visual de las

réplicas en agar BHI con antibiótico (AM) y sin antibiótico. Las que perdieron la

resistencia al marcador se tomaron del agar BHI, se les comprobó la sensiblidad al

marcador, se purificaron y se sembraron en el medio especial de conservación para

analizar posteriormente su producción de bacteriocinas. Los resultados obtenidos se

presentan en la Tabla 15, como se observa, los porcentajes de curación son muy

bajos, sobre todo para las cepas del I.N.R (menos del 1%).

Tabla 4. Dosis de SDS seleccionadapara la curación plasmídica.

Cepa deS. aureus

Origen Conc. de SDSmg/mL

2 I.N.R. 69.8

14 I.N.R 69.8

5 I.N.R 83.0

8 I.N.R 126.0

50 C.M.R. 50.0

39 C.M.R. 57.5

27 C.M.R. 72.5

47 C.M.R. 83.7

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Posteriormente, a las sobrevivientes ampicilina sensibles se les determinó su patrón

de resistencia a los antimicrobianos, utilizando multidiscos comerciales (BioRad),

debido a que algunas cepas tenían más de un plásmido (Tabla 16).

Como se observa, todas las cepas curadas, fueron sensibles a los antimicrobianos a

los que sus progenitoras fueron resistentes, excepto, las derivadas de la cepa 8 y de

la cepa 14 que mantuvieron su resistencia a eritromicina.

Tabla 5. Curación del marcador de resistencia a ampicilina (AM) de las cepas de S. aureus por tratamiento con SDS.

Cepas de S. aureus

Origen No. de sobrevivientes

No. de sobrevivientes

ampicilinasensibles

% de curación

2 I.N.R. 737 1 0.13

5 I.N.R. 816 7 0.85

8 I.N.R. 845 6 0.71

14 I.N.R. 1,089 1 0.09

27 C.M.R. 552 1 0.18

39 C.M.R. 531 6 1.12

47 C.M.R. 785 11 1.4

50 C.M.R. 1,187 9 0.75

I.N.R. = Instituto Nacional de Rehabilitación.C.M.R. = Centro Médico “La Raza”.

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Tabla 6. Sensibilidad a los antimicrobianos de las cepas de S. aureus originales y curadas.

Cepas originales de S. aureus

Resistencia original * Cepas curadas (AM)s

Respuesta a los antimicrobianos

2 AM, CAZ, PE, DC 2 /C3 Sensible a todos

5 AM, CAZ, PE, E 5/C1 a ,5/C7 Sensibles a todos

8 AM, CAZ, PE, E 8/C1 a 8/C6 Sensibles a todos, excepto eritromicina

14 AM, CAZ, PE, DC, E 14/C1 Sensible a todos, excepto eritromicina

27 AM, PE 27/C1 Sensible a todos

39 AM, CAZ, PE, PEF 39/C1 a 39/C6 Sensibles a todos

47 AM, CAZ, PE 47/C1 a 47/C11 Sensibles a todos

50 AM, CF, CTX, CAZ, CXM, DC, E, PEF, PE

50/C1 a 50/C9 Sensibles a todos

6. Producción de bacteriocinas por las cepas curadas.

La producción de bacteriocinas se comprobó para todas las cepas curadas y para las

segregantes espontáneas, es decir, aquéllas cepas que perdieron la resistencia a

todos los antimicrobianos sin ningún tratamiento. Para tal efecto, se empleó la

metodología descrita en Materiales y Métodos, utilizando a la indicadora más sensible.

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 17.

* Ver el apartado de abreviaturas.

C = cepa curada.

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Tabla 7. Producción de bacteriocinas por las cepas curadas y por las segregantes espontáneas de Staphylococcus aureus.

Cepas de S. aureus curadas Cepa indicadora de

S. aureus

Producción de bacteriocinas

2C3 8 (+)

5C1 2 (-)

5 C2 a 5C7 2 (+)

8C2 15 (-)

8C1, 8C3 a 8C6 15 (+)

14C1 2 (+)

27C1 17, 21,38 (-)

39C3 14 (-)

39C1, 39C2, 39C4, 39C5 y 39C6 14 (+)

47C4 44 (-)

47C1 a 47C11 44 (+)

50C3 44 (-)

50C1 a 50 C9 44 (+)

Segregantes espontáneas de S. aureus

12 3 (-)

15 3 (-)

21 8 (-)

22 14 (+)

Como se observa, la gran mayoría de las cepas curadas para AMR a pesar de haber

perdido todas las resistencias, siguieron produciendo la bacteriocina,

independientemente de que las originales sólo tuvieran un plásmido.

C = cepa curada.

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7. Aislamiento del DNA plasmídico de las cepas originales y de las

curadas.

Dado el comportamiento anterior, se decidió buscar la presencia de DNA

plasmídico en las cepas curadas, para compararlo en su caso, con el de las

correspondientes sin curar. Cabe señalar, que para el aislamiento del DNA

plasmídico, se aumentó el tiempo de precipitación del DNA con etanol (24

horas), para optimizar el rendimiento.

Los DNAs aislados se sometieron a electroforesis, los resultados obtenidos

se presentan en las figuras 7 y 8. Puede observarse que en la electroforesis

del DNA de todas las cepas curadas que siguen produciendo bacteriocina,

excepto la 14, aparece una banda de DNA que migra ligeramente más que la

de la cepa sin curar correspondiente, indicando que se perdió un pequeño

fragmento. Con respecto a las pocas cepas curadas que perdieron la

producción de bacteriocina, se encontró que ninguna posee DNA plasmídico.

En el caso de las cepas 5 y 14 curadas, se observó la pérdida de uno y dos

plásmidos, respectivamente y a pesar de ello, continuaron produciendo la

bacteriocina.

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21 3 4 5 6 7 8 9

Figura 7. Electroferograma de las cepas originales y curadas (Ams) de S. aureus, I.N.R. Agarosa al 1.2%. Carril 1: Cepa 2; Carril 2: Cepa 2C1; Carril 3: Cepa 5; Carril 4: Cepa 5C4: Carril 5: Cepa 8; Carril 6: Cepa 8C4; Carril 7: Marcador de peso molecular de 1 Kb; Carril 8: Cepa 14; Carril 9: Cepa 14 C1.

1 2 3 4 5 6 7

Figura 8. Electroferograma de las cepas originales y curadas (Ams) de S. aureus, C.M.R. Agarosa al 1.2%. Carril 1: Cepa 39; Carril 2: Cepa 39 C4; Carril 3: Cepa 47; Carril 4: Cepa 47C7; Carril 5: Marcador de peso molecular de 1 Kb; Carril 6; Cepa 50; Carril 7: Cepa 50 C7.

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IMPACTO

Los resultados obtenidos permiten proponer el uso de trimetroprin-sulfametoxasol, tetraciclina y/o gentamicina para el tratamiento de infecciones por Staphylococcusaureus, obviamente bajo control médico.

En este mismo sentido, se encontraron bacteriocinas con un espectro de acción muy amplio, que podrían proponerse para el control de infecciones estafilocóccicas, incluso una de las cepas curadas perdió la resistencia a antibióticos pero continúa produciendo una bacteriocina de amplio espectro, situación muy importante porque la cepa como tal puede eliminarse después de su acción bacteriocinogénica, mediante el uso de antibióticos.

Por otro lado, el hecho de que aproximadamente el 75% de las cepas estudiadas sean productoras de bacteriocinas y que éstas tengan diferentes espectros de acción, da pie a la realización de experimentos complementarios para proponer el empleo del patrón estafilococínico como un marcador epidemiológico, útil para la identificación de cepas responsables de brotes epidémicos; como sucede por ejemplo con el patrón piocínico en el caso de epidemias por Pseudomonas.

Desde otro punto de vista, es importante el hallazgo de que todos los marcadores de resistencia a antibióticos en las diferentes cepas estudiadas, se localizan muy probablemente en un transposón que se puede eliminar del plásmido y de la célula que lo contiene por agentes curantes, como el dudecil sulfato de sodio (sds). Aunque se requiere más experimentación para comprobar el hallazgo, éste es importante porque podría realizarse el estudio correspondiente de este tipo de compuestos para su posterior empleo como sanitizador intrahospitalario e incluso como coadyuvante en el tratamiento de infecciones estafilocóccicas.