Tecnologia Tecnologia do DNA recombinantedo DNA recombinante

BIOLOGIA MOLECULAR

1. DNA recombinante

2. Enzimas de restrição

3. Vetores de clonagem

- Plasmídios

- Bacteriófagos

- Cosmídeos

4. Etapas de clonagem molecular

5. Aplicações

1. DNA recombinante

2. Enzimas de restrição

3. Vetores de clonagem

- Plasmídios

- Bacteriófagos

- Cosmídeos

4. Etapas de clonagem molecular

5. Aplicações

Conteúdo

HISTÓRICO

Watson & CrickEstrutura do

química do DNA (1953)

Nature, 25 - Abr - 1953

Tecnologia DNA recombinante

Insulina recombinante(1978)

Ian Wilmutclonagem de mamífero

(1997)

HISTÓRICO

Prática clínicaTestes genéticos

(1995...)

PGHConhecer genoma H. sapiens

(1995-2003)

Transgenia(1995...)

O que é um DNA recombinante?

- É uma molécula de DNA formada

pela ligação de duas moléculas de

origens diferentes (Ex. DNA de

planta ligado a um plasmídio)

““A engenharia genética atua no nível A engenharia genética atua no nível

molecular, onde as diferenças molecular, onde as diferenças

entre espécies desaparecem”entre espécies desaparecem”

ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

W. Alber H. Smith D. Nathans

• Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;

Descritas em 1970,

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno

Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno

A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita:

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

- reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares

BamHI

• BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H5’ G/GATCC 3’

• EcoRI - Escherichia coli R5’ G/AATTC 3’

• HaeIII - Haemophilus aegyptius5’ GG/CC 3’

• PstI - Providencia stuartii5’ CTGCA/G 3’

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Nomenclatura

370 C, 1 hora, com tampão

adequado

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

EcoRI

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Tipos de cortes:

- Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) - Produção de terminais abruptos (ou cegos)

NarI ~~~~~~ 181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG

241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA

301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA

HindIII PstI ~~~~~~~ ~~~~~~ 361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC

XbaI BamHI KpnI EcoRI ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ ~~~~~~~ 421 ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

TIPOS DE VETORESTIPOS DE VETORES

TIPOS DE VETORES

VetoresVetores HospedeiroHospedeiross

Plasmídeos

Cosmídeos

Bactérias / levedurasclonagem

Bacteriófagos

UtilizaçãUtilizaçãoo

• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras– pUC18– pBR322– pUP310

Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

VETORES PLASMIDIAIS

VETORES PLASMIDIAIS

pUS9744039 pb

rCanamicina

MT19

oriM

hsp60RBS

oriEHindIIIXbaI

Vetor de Expressão em Procarioto

pTarget5670 bp

rNeomicina

rAmpicilina

Intron

Poly A

Promotor CMV

Bam HI (1257)

Eco RI (1251)

Eco RI (1319)

HindIII (1326)

VETORES PLASMIDIAIS

Vetor de Expressão em Eucariotos

pUS9733984 bp

rCanamicina

oriM Promotor hsp60

RBS

oriE HindIIIXbaI

Vacina Vetorizada (rBCG)

pUS9744039 pb

rCanamicina

MT19

oriM

hsp60RBS

oriEHindIIIXbaI

pUS9773984 bp

rCanamicina

oriM Promotor pAN

RBS

oriE HindIIIXbaI

pUS20003759pb

Kan(R)

OriMp18kDa

oriC

XbaI

HindIII

Vetor de Expressão em Eucariotos

VETORES PLASMIDIAIS

- Vírus que infectam bactérias;

- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

BACTERIÓFAGO

BACTERIÓFAGO

Ciclo Lítico

Ciclo Lisogênico

- São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos;

- Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;

COSMÍDEOS

Características essenciais

• Replicação autônoma

• Marcador de seleção (antibiótico)

• Sítio único de clonagem

VETORES DE CLONAGEM

• Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG

• Promotores induzíveis• Sinais de secreção• Fusão com proteínas carreadoras

VETORES DE EXPRESSÃO

CLONAGEM MOLECULARCLONAGEM MOLECULAR

• É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA

CLONAGEM MOLECULAR

CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

1. Obtenção do DNA a ser clonado1. Obtenção do DNA a ser clonado

2. Preparação do vetor2. Preparação do vetor

3. Ligação do vetor com o “inserto”3. Ligação do vetor com o “inserto”

4. Transformação da bactéria4. Transformação da bactéria

5. Seleção dos clones recombinantes5. Seleção dos clones recombinantes

- Extração de DNA;- PCR- Digestão - Purificação

1.Obtenção do DNA a ser 1.Obtenção do DNA a ser clonadoclonado

1.Obtenção do DNA a ser 1.Obtenção do DNA a ser clonadoclonado94 0C por 5 min

94 0C por 1 min

55 0C por 1 min

72 0C por 1 min

72 0C por 5 min

4 0C

35 ciclos

PCR

Eletroforese em gel de agarose

Visualização do DNA em luz ultravioleta

• Digestão • Purificação

3.Preparação do vetor3.Preparação do vetor

Plasmídeo Circular

Plasmídeo linear

Digestão com

Enzimas de restrição

Extremidades coesivas

Fragmento de DNA - inserto

DNA plasmidial -

vetor

LIGASELIGASE

4. Ligação4. Ligação

CH

OQ

UE T

ÉR

MIC

O

5.Transformação da bactéria

5.Transformação da bactéria5.Transformação da bactéria

ELETR

OP

OR

AÇ

ÃO

5.Transformação da bactéria5.Transformação da bactéria

ELETR

OP

OR

AÇ

ÃO

6.Seleção dos clones recombinantes6.Seleção dos clones recombinantes

Construção do DNA Recombinante

Molécula de DNA de um plasmídeo circular

Clivagem com enzima de restrição

Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas

anelamento

Ligação covalente pela DNA ligase

Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

Inserção em uma célula hospedeira

Extração de DNA de L. interrogansExtração de DNA de L. interrogans

Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA

PCR

94ºC – 5 min

94ºC – 1 min50ºC – 1 min72ºC – 1 min

72ºC – 7 min

30 cicloslipL32

768 pb

Primer RPrimer F

 PCR Clonagem em

Vetores de expressão

Transformação E. coli

Seleção dos Clones recombinantes

768 pb

TriagemDigestão

Construção dos VetoresConstrução dos Vetores

lipL32 768 pb

Extração

Expressão de Proteínas RecombinantesExpressão de Proteínas Recombinantes

Purificação da Proteína

Cultura de Células

Transformação da E. coli

pAE2831 bp

rAmpicilina

6X His

f1 ori

oriE

Promotor T7

Bam HI (137)

Hin dIII (178)

Xba I (59)

Purificação de proteínas recombinantesPurificação de proteínas recombinantes

LigaçãoTransformação por

Eletroporação

E. Coli DH5

Extração de DNA plasmidial

pLysS

codon pluss

SI

DE3

Transformação por Choque Térmico

Cepas de E. coli para expressão de proteínas

pAE/LipL323547 bp

AmpR

LipL32

6x His

f1 ori

pUC ori

pT7

Bam H I (468)

Eco R I (887)

Hin d III (894)

Xba I (59)

Xho I (131)

E. coli (BL21)

SDS-PAGE

SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas)

Expressão em diferentes cepas de E.coli

Expressão de Proteínas RecombinantesExpressão de Proteínas Recombinantes

1 2 3 4

30kDa

1. BENCHMARKTM Protein Ladder em kDa

2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições).

Gel de poliacrilamida 15%.

Purificação de Proteínas Recombinantes

Purificação de Proteínas Recombinantes

Akta Prime

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

VACINAS RECOMBINANTESVACINAS RECOMBINANTES

1. PCR

2. Clonagens

3. Multiplicação

Proteína Recombinante

4. Vacinação

lipL32768 bp

LipL32 0906

Primer RPRIMER F

Bam HI (342) Hin dIII (761)Xba I (4)

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

L. interrogans

pAE

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

Vetor Plasmidial

pTARGET

pUS973pUS974pUS977

E.coli (BL21) E.coli TOP10 E.coli TOP10

Vacina de DNA BCGr

lipL32

ANIMAIS TRANSGÊNICOSANIMAIS TRANSGÊNICOS

PLANTAS TRANSGÊNICASPLANTAS TRANSGÊNICAS