adn recombinante
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TECNOLOGÌA DEL ADN RECOMBINANTE
Andrea Bonelli
Neiry Briceño
Enzimas de restricción.
o Cortan las cadenas de ADN en sitios específicos.
o Son enzimas defensivas, protegen el ADN de los huéspedes bacterianos de otros mo extraños.
Enzimas de restricción.
Reciben su nombre a partir de la bacteria de la cual fueron aisladas. Ejemplo: EcoRI
Cada enzima puede reconocer y separar una secuencia especifica de ADN de tira doble de 4 a 7 pb.
Los cortes de ADN pueden producir extremos romos o extremos adherentes o cohesivos.
Los extremos adherentes son muy útiles a la hora de construir moléculas hibridas de ADN.
Enzimas de restricción.
Frecuencia con la que una enzima escindirá una molécula de ADN: 4 (nºde pb`s).
Importancia:
Poseen gran especificidad de reconocimiento de una
secuencia corta de ADN dúplex y la subsiguiente
hidrólisis de un enlace fosfodiester en cada hebra. Los
fragmentos originados son útiles para iniciar la clonación
celular o acelular y la creación de mapas de restricción.
Tipos de enzimas de restricción.
Endonucleasas de restricción Tipo I Tipo II Tipo III
Actividad enzimáticaEndonucleasa y metilasa en
una misma proteína (distintas subunidades)
Endonucleasa (metilasa en una proteína independiente)
Endonucleasa y metilasa en una misma proteína (distintas
subunidades)
Coenzimas o cosustratos ATP, Mg2, S-adenosilmetionina Mg2 ATP, Mg2, S-adenosilmetionina
Estructura proteica
3 subunidades:S reconocimiento
R restricciónM metilación
1 subunidad, aunque actúa como homodìmero
2 subunidades:MS reconocimiento y metilación
R restricción
Sitio de reconocimiento No palindròmico, 2 partes separadas Palindròmico No palindromico
Punto de corte
Corta las 2 hebras en puntos cercanos entre sí, poco
específicos, a unos 1000 pb del sitio de reconocimiento
Corta las 2 hebras en puntos equivalentes, muy específicos,
dentro de la secuencia de reconocimiento
Corta las 2 hebras en puntos distintos entre sí, situados a 24-
26 pb del sitio de reconocimiento
Punto de metilaciónDentro de la secuencia de reconocimiento. En ambas
hebras
Adenia o citosina muy específicas dentro de la secuencia de reconocimiento. En ambas
hebras
Adenina dentro de la secuencia de reconocimiento. En una sola
hebra
Ejemplos Eco k, Eco B Numerosos Eco PI, Eco P15
Papel biológico de sistema metilación- restricción.
Por cada enzima de restricción, una metilasa reconoce la misma secuencia que forma parte del sistema de restricción y une de manera covalente grupos metilo a bases de esa secuencia.
Papel biológico de sistema metilación- restricción.
El ADN de la bacteria se metila de forma especifica.
La metilación impide la unión de la enzima de restricción (El ADN no es hidrolizado).
Al entrar en la célula ADN de otro organismo, este ADN puede ser degradado por la ER.
Las nucleasas restringen la posibilidad de infección por virus.
Papel biológico de sistema metilación- restricción.
Si 1 sola hebra de ADN esta metilada, la ER no reconoce el sitio. La metilasa añade el grupo metilo a la otra hebra.
Afecta principalmente a citosinas y adeninas. Las metilasas utilizan como donador a S-
adenosilmetionina.Este mecanismo regula la expresión génica,
en eucariotas.
Acción de las enzimas de restricción de tipo II.
Funcionan a manera de tijeras para el corte del ADN. El sitio de restricción es también el lugar de reconocimiento e hidrólisis.
Se hidrolizan enlaces fosfoèster del ADN, uno en cada hebra, generando 2 segmentos de restricción. Quedan fragmentos 3’OH y 5’P.
ADN ligasas.Los fragmentos generados con una misma
restrictasa a partir de ADN’s distintos se aparean por medio de sus extremos cohesivos a partir de ADN ligasas.
Las ligasas forman el enlace fosfodiester que falta, consumiendo energía.
Proceso general para la clonación de genes
Comprende siete pasos:Preparación del inserto de ADN.Preparación del vector de clonación.Formación de la molécula de ADN
recombinante.Incorporación del ADN recombinante a la
célula anfitriona.Propagación del cultivo.Detección y selección de los clones
recombinantes. Expresión génica.
1.-Preparacion del inserto de ADN
Lisis de células,(suspensión o centrifugación).
Se eliminan proteínas, enzimas o fragmentos proteolíticos y se precipita y se concentra el ADN.
Se fragmenta con endonucleasas de restricción.
Los fragmentos son aislados:
ADN vírico o de un plásmido, electroforesis en gel de agarosa. ADN genómico, un fragmento de ADN marcado con 32P, llamado
sonda, se une con el inserto.
2.- Preparación del vector para la clonación
Las características de la molécula de ADN para el vector:Pequeña.Con una secuencia de ADN y mapa de
restricción reconocible.De fácil introducción a la célula anfitriona.Con capacidad de replicación autónoma.Que posea varios sitios de restricciónQue incluya un gen marcador (resistente a un
antibiotico)
El vector puede provenir de una célula eucariota o procariota (bacteriófagos, plásmidos, quimeras…)
Se fracciona con las mismas enzimas de restricción del inserto ADN
3.- Formación del ADN recombinanteUnión in vitro del ADN de restricción y el
vector, con el uso de ligasas:Une extremos cohesivosUne extremos romos con menor afinidad
Las asociaciones pueden ser:Intramoleculares: baja concentración de ADNIntermoleculares: se forma el ADNr,
vector+vector o inserto+inserto.
4.- Incorporación del ADNr a la célula anfitriona
Para incorporar el ADNr a la célula se necesitan ciertos métodos:Físicos y químicosPasivosActivos: uso de vectores víricos o aplicación de
descargas eléctricas.
-El inserto puede permanecer unido al vector o recombinarse con el ADN cromosomico
5.-Propagacion del cultivoLa división de las células en el cultivo junto
con la de su genoma, producirá la formación de copias de ADNr incorporados…Clonación.
Estas células se colocan en un medio liquido donde forman poblaciones con copias de la célula original (clones celulares)
6.- Detección y sección de los clones recombinantes
A través de la clonación se obtienen varias colonias y para seleccionar la necesaria se usan 3 tipos de métodos:
Métodos de hibridación: uso de una sonda marcada.
Métodos inmunoquímicos: uso de anticuerpo especifico.
Métodos genéticos o selección fenotípico: genes marcadores
7.- Expresión génicaSe necesitan vectores de expresión, que
incluyen un promotor
Región reguladora de transcripciónDebe ser inducible, que se active bajo alguna
circunstancia experimental controlable (adición de algún nutriente).
