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Técnica de DNA recombinante

DNA recombinante ou clonagem

ligar 2 ou + segmentos de DNA, gerando mólecula capaz de replicação autônoma em hospedeiro

Técnica de DNA recombinante

Base das técnicas de DNA recombinante– enzimas que modificam ácidos nucleicos– síntese, degradação, ligação ou remoção de partes

dos ácidos nucleicos de forma controlada

Enzimas• DNA Polimerases• Enzimas de restrição - corte• Ligases - ligação • Kinases e fosfatases - modificação de

terminações (alteração de PO4)

E. coli

Plasmídeo

Digestão

Digestão

Eucarioto

Ligação

Transformação

Escherichia coli• Escherichia coli - patogênica a humanos• cromossomo circular 4.639 Kpb

– http://wit.integratedgenomics.com/

– http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/277/5331/1453

• cepas derivadas de K-12• cepas + utilizadas

– denominadas por uma ou mais letras + números– JM 109, HB 101, DH5, DH10, BL21, XL blue,......

• cepas prototróficas ou auxotróficas

Escherichia coli• Cresce rapidamente a 37oC (ciclo de 20 min)• Meio mínimo ou rico

– Glucose - melhor fonte de C– Extrato de levedura - essenciais– Triptona e Peptona: fonte amino ácidos

• Cepas de E. coli - sem plasmídeo• Introdução de plasmídeo -> transformação

– tratamento químico (PEG, CaCl2) ou físico (eletroporação)

Vetores de clonagem

• Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb– pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET

• Fago lambda - ~0,1 a 18 Kb• Cosmídeo - ~35 a 50 kb• BAC e YAC - fragmentos maiores

• Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético

Vetores de clonagemPlasmídeos:• DNA circular acessório, auto-replicativo e

extra-cromossomial• tamanho de 1 a > 200 Kpb

Bacteriófagos ou fagos:• viróides de bactérias• capaz de replicação dentro de bactérias

Vetores de clonagemPlasmídeo

• Manipulação após purificacão– larga escala– “mini-prep” ou lise alcalina

• Características para uso:– origem de replicação– marcadores de seleção

• resistência a antibiótico (ampR e tetR)• gene lacZ - amino terminal -galactosidase (complementa)

– IPTG e X - Gal

– sítio múltiplo de clonagem (MCS)– tamanho (quanto menor melhor!)

pBR3221o plasmídeo -1977Bolivar et al 1977

Plasmídeos naturaispBR322 = R1 + R6.5 + pMB1

pBR322

pUC81982

Vieira & Messing

Plasmídeo

• Sistema lacZ’• Adicionar ao meio

– IPTG = isopropil thio galactose– X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil--d-

galactopiranosídeo (branco/azul)

• Outros sistemas (pZERO)

Vetores de clonagem Bacteriófago (fago)

• Ciclo de infecção: Lítico ou Lisogênico• Genoma de fago = 48,5 Kpb• Cerca de 15 Kb opcional - necessário para

integração no cromossomo de E. coli• Deleção desse fragmento não afeta ciclo lítico• Fago mantém ciclo lítico sem esse fragmento• Dois tipos de vetores:

– vetor de inserção: remoção DNA opcional– vetor de substituição: fragmento “stuffer”

Lítico

Lisogênico

Bacteriófago (fago)


• Genoma do fago é linear• Terminações fita simples de 12 bases - COS -

seqüências complementares -> pareamento• Vetor fago pode ser circular• Manipulado como plasmídeo e re-introduzido em

E. coli por transfecção (baixa eficiência)• Empacotamento in vitro:

– 2 ‘braços’ lineares ligados a insertos– adicionar mix de empacotamento (capa ptn)– partículas fago espontânea: DNA de 37 a 52 Kb


Empacotamento in vitro: – 2 ‘braços’ lineares ligados a insertos

• concatâmeros

– Adicionar mix de empacotamento (capa ptn)– Partículas de fago formam espontaneamente– DNA incluído de 37 a 52 Kb flanqueados por sítios COS– Misturar partículas de fago com E. coli – Plaquear as células - camada de bactérias– Lise de bactérias - “plaque”– fagos recombinantes -> restrição tamanho braços

Vetores de clonagemInsertos maiores

• Plasmídeo - acomoda até 10 Kb– rearranjos ou interfere com replicação

• Fago - acomoda até 18 Kb• Cosmídeo - plasmídeo contendo sitío COS

– concatâmeros de moléculas pelo sítio COS– apenas COS para empacotamento de fago

• partícula reconhece apenas sítio COS

– partículas de fago com cosmídeo - infectivas– replicação como plasmídeo - colônias– 35 a 50 kb, conforme cosmídeo (< 8 Kb) máx 52 kb

Z = tamanho médio do inserto em pbG = tamanho do genoma haplóide em pb

Manual

CosmídeopJB 8


YACs (yeast artificial chromosome) (Burker et al 1987)

– Mantido em S. cerevisiae – Cromossomos - centrômero, telômero e origem de

replicação– plasmídeo de 10-15 Kb– cromossomo original de 230 a 1700 Kb– acomoda até 600 Kb, máx 1400 Kb– grande problema de estabilidade e rearranjos

• uso de outros vetores menos instáveis mas acomodando fragmentos menores


Bacteriófagos P1 ou P1 (Sternberg 1990)

• similar ao fago • versão com deleções do fago natural• fago maior e acomoda fragmentos maiores• acomoda até 125 KpbBAC (bacterial artificial chromosome) (Shizuya et al

1992)

• baseado no plasmídeo natural F• clonagem de até 300 Kbp


PAC (P1 derived artificial chromosomes) (Ioannou et al 1994)

• combina características de fagos P1 e BACs• clonagem de até 300 KbpFosmídeos (Kim et al 1992)

• contém a origem de replicação do plasmídeo F e sítio COS de fago

• similar a cosmídeos• menor número de cópias por célula - < rearranjos

Tamanho de bibliotecas genômicas contendo seqüências humanas preparadas em diversos tipos de vetores de clonagem

Número de clones* Tipo de vetor Tamanho do Inserto

(kb) P = 95% P = 99%

λ substituição 18 532 500 820 000 Cosmid, fosmid 40 240 000 370 000 P1 125 77 000 118 000 BAC, PAC 300 32 000 50 000 YAC 600 16 000 24 500 Mega-YAC 1400 6850 10 500 * Calculado pela equação: onde N é o número de clones requerido, P é a probabilidade de qualquer segmento do genoma está presente na biblioteca, a é o tamanho médio dos fragmentos de DNA inseridos no vetor, e b é o tamanho do genome.

Vetores de clonagemoutros organismos

Existem vetores específicos para manipulações em outros organismos

• outras bactérias• S. cerevisae• Camundongos• Plantas - pBIN 19, série pCAMBIA

Enzimas de Restrição

– Endonucleases de restrição– Bacteriófagos - > vírus infectam bactérias– 1950s - fagos infectam cepas específicas

• certos fagos “restritos” a certas cepas (Luria)

– 1962 - endonuclease clivam DNA não protegido• DNA não protegido degradado por endonuclease

restringindo infecção

– 1968 - purificação 1a endonuclease de restrição– 1970 - purificação e caracterização Hin dII

• corte mesmo sítios - mapa de restrição Simian Virus 40


• Organismos possuem sistema de Restrição e Modificação associados

• Modificação - metilação de bases

• Enzimas de restrição ocorrem bactérias, vírus, alga eucarionte Chlorella


• Tipos de Enzimas de Restrição/Modificação:

– Tipo I - Restrição e Modificação na mesma enzima com 2 ou 3 subunidades heterólogas

– Tipo II - sistema R e M separados• Homodímeros• 93% das comerciais, outros 5% Tipo IIs

– Tipo III - R e M na mesma enzima

Tipos de Enzimasde Restrição

Tipos de Terminação


• Enzimas de Restrição Tipo II– reconhecem sítios palindrômicos - 4 a 8 bases– cortam no interior da seqüência– enzimas R e M adjacentes no genoma de origem– requerem Mg2+

– normalmente produzem 5’-fosfato e 3’-OH

– Tipo IIs -possui sítio de reconhecimento rara/ palindrômico (4 a 7 bases) e corta abaixo (até 20 pb)

Tipos de Enzimasde Restrição

Tipos de Terminação

Enzima Seqüência Reconhecimento Tipo Terminação Seqüências Finais

AluI 5′-AGCT-3′ Blunt 5′-AG CT-3′

3′-TCGA-5′ 3′-TC GA-5′

Sau3AI 5′-GATC-3′ Sticky, 5′ overhang 5′- GATC-3′

3′-CTAG-5′ 3′-CTAG -5′

HinfI 5′-GANTC-3′ Sticky, 5′ overhang 5′-G ANTC-3′

3′-CTNAG-5′ 3′-CTNA G-5′

BamHI 5′-GGATCC-3′ Sticky, 5′ overhang 5′-G GATCC-3′

3′-CCTAGG-5′ 3′-CCTAG G-5′

BsrBI 5′-CCGCTC-3′ Blunt 5′- NNNCCGCTC-3′3′-GGCGAG-5′ 3′- NNNGGCGAG-5′

EcoRI 5′-GAATTC-3′ Sticky, 5′ overhang 5′-G AATTC-3′

3′-CTTAAG-5′ 3′-CTTAA G-5′

PstI 5′-CTGCAG-3′ Sticky, 3′ overhang 5′-CTGCA G-3′

3′-GACGTC-5′ 3′-G ACGTC-5′

NotI 5′-GCGGCCGC-3′ Sticky, 5′ overhang 5′-GC GGCCGC-3′

3′-CGCCGGCG-5′ 3′-CGCCGG CG-5′

BglI 5′-GCCNNNNNGGC-3′ Sticky, 3′ overhang 5′-GCCNNNN NGGC-3′

3′-CGGNNNNNCCG-5′ 3′-CGGN NNNNCCG-5’


• Nomeclatura

– Nome específico do organismo:– 1a letra o gênero + 2 letras espécie = 3 letras– próximo letra da identificação da cepa– numeral romano indica ordem de identificação

• Escherichia coli = Eco R I• Haemophilus influenza = Hin d III


• Sítios de Reconhecimento de Tipo II– palíndrome de 4 a 8 base com eixo rotacional de

simetria• EcoRI - GATTC

– interrompido• SfiI - GGCCNNNNNGGCC• AccI - GTMKAC - M = A ou C; K = G ou T

• Sítio de Reconhecimento Tipo IIs• Mbo II - GAAGA cortando 8 bases 3’ e 7 bases 5’


Enzimas de restrição


• Reação de Digestão ou Restrição• Tampão típico:

– MgCl2 - requerimento absoluto

– NaCl ou KCl - força iônica– Tris-Cl - manutenção pH– -mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT) - estabilização– BSA - estabilização

• Específico para cada enzima• Problema - digestão ou reação múltiplas


• Tampão UNIVERSAL:– Glutamato de Potássio

– afeta eletroforese

– *Acetato de Potássio– Tris-acetato– baseado em análises de tampões celulares

• One-Phor-ALL - Amersham• Multi-core - Promega

• Várias enzimas mantêm atividade– T4 DNA ligase, T4 DNA polimerase


• Reação– 1 unidade - 1 g de DNA– DNA - s/ contaminações de fenol, álcool, detergentes,

EDTA, sais, polissacarídeos – estoque com 50% glicerol - máx 10% volume de reação

• glicerol não pode ultrapassar 5% do volume

– parar reação - adicionar EDTA, aquecer (65oC) ou extrair com fenol:clorofórmio

– enzimas mantidas máximo de tempo a -20oC (RT)– evitar contaminação

Enzimas de Restrição• Atividade não específica - STAR• sob condições não padronizadas extremas

enzimas perdem especificidade de sítio• específico para cada enzima

– alta concentração de glicerol = >5%– alta relação U de enzima/g DNA = >100 U/g– Baixa força iônica (< 25 mM)– Alto pH (>8,0)– presença solventes ôrganicos (DMSO, etanol, EG)– substituição de Mg2+ por cátions (Mn, Cu, Zn, Co)


http://rebase.neb.com

Enzimas de Clonagem

LIGASES• ligar ou juntar ácidos nucleicos

– clonagem de fragmento de DNA em vetor

FOSFATASES• remover grupo 5’ fosfato de fitas de DNA

– prevenir de re-ligação de vetor

– produzir substrato para quinase adicionar 32 PO4

QUINASES (Kinases)• adicionar grupos fosfato - marcação 32P

Ligases

• T4 DNA ligase: ligar ou juntar ácidos nucleicos– clonagem de fragmento de DNA em vetor

5’

P 5’3’

OH 3’ 5’ P

5’3’ OH

OH 3’

5’

3’ 5’

OH 3’

Mg 2+, ATP

Papel in vivo

Ligases

• Função biológica:– produzida por fago T4 em E. coli– ligar intervalos na replicação de DNA (“Okazaki”)– reparo de DNA e recombinação

• Catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre nucleotídeos e hidrólise de ATP->AMP + PPi

• DNA ligase: age em dsDNA ou RNA em duplex– ligação em terminais coesivos ou abruptos ou “nicks”

• RNA ligase: age em ssRNA ou ssDNA/RNA

Ligases

• Ligase catalisa a ligação de segmentos de DNA ou RNA formando ligações fosfodiéster entre 3’ OH e 5’ fosfato

• Requer fonte de energia - ATP• Ligação entre terminais abruptos ou

coesivos...TGGTATCTGTGTGACTGATOH P TAGCAGGCCATCC....

...ACCATAGACACACTGACTAP OHATCGTCCGGTAGG...

..CTTGATGGTATCTGTGTGOH P AATTCCTCAAGAACTGGACTTC..

..GAACTACCATAGACACACTTAAP OH GGAGTTCTTGACCTGAAG..

Ligases

Ligases

• T4 DNA de bacteriófago = comumente usada na construção de recombinantes

• Requer ATP como co-fator– Não utiliza NAD (E. coli DNA ligase)– usada em quebras ou ligação coesivas e não

abruptas

• Para reações intermoleculares requer que uma possua 5’-fosfato

• Usada ligar ssDNA (oligos) adjacentes - mutagênese sítio dirigida

Linkers x adaptadoresabrupto -> coesivo

digestão

Homopolímero tailing’terminal deoxinucleotidil transferase

DNA polimerase independe/ terminal deoxinucleotidil transferase

calf thymus

Fosfatase• Remover o grupo fosfato 5’

– Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)

• prevenir re-ligação de vetor de clonagem

• produzir substrato para quinase5’ P

3’ OH

OH 3’

P 5’

5’ OH

3’ OH

OH 3’

OH 5’

FosfataseUso• retirar grupo fosfato dos terminais 5’ do vetor

para prevenir auto-ligação durante clonagem– apenas uma fita precisa estar ligada antes de

introduzir plasmídeo na bactéria

• inserto não deve estar desfosforilado• remoção de fosfato - melhora marcaçãoMais usada:• Calf Intestinal alkaline phosphatase (CIAP)

Kinase• Adicionar novos grupos fosfatos a

ácidos nucleicos (ex. marcação radioativa)– T4 Polynucleotide kinase

• Permite troca de grupos fosfatos

5’ *P

3’ OH

OH 3’

Mg2+, [-32P] ATP

P* 5’

5’ OH

3’ OH

OH 3’

OH 5’

Kinase

5’ *P OH 3’

Mg2+, [-32P] ATP

5’ OH OH 3’

5’ *P OH 3’

ADP, Mg2+, [-32P] ATP

5’ P OH 3’

KinaseUso• transfere grupo -fosfato de nucleotídeo

trifosfato (ATP) para o terminal 5’ • usada para fosforilar DNA sintético para facilitar

ligação• marcação de sondas com [-32P]ATP• capacidade de troca de fosfato P-5’ -> 32P-5’• Mais usada:• T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)

Kinases

Clonagem

ETAPAS1. Preparação do vetor

2. Ligação do vetor e inserto

3. Transformação de hospedeiro

4. Seleção de clones

Preparação do vetor

• Digerir plasmídeo purificado com 2 enzimas de restrição do MCS– gerar terminais compatíveis com inserto– clonagem direcionada– coesivo + abrupto = 2a opção


• Ausência de sítio de enzima no inserto– digerir com enzima e tornar abrupto– usar Klenow (DNA polimerase I) ou T4 DNA

polimerase para preencher 5’ proeminente• atividade polimerase 5’-> 3’

– usar T4 DNA polimerase para remover 3’ proeminente

• atividade exonuclease 3’-> 5’ na presença de dNTPs

AATTCCTCAAG DNA polimerase I + dNTPs > AATTCCTCAAG

OH GGAGTTC T4 DNA Polimerase OH TTAAGGAGTTC


• Estratégia alternativa: – usar ligar linkers às extermidades com sítio de

restrição desejado

• Clonagem de produto de PCR– Usar sítios de restrição no primer

• 4 nt do terminal 5’ para permitir digestão

– Usar artefato de adicionar extra Adenina no 3’ pela Taq polimerase (ausência 3’-> 5’ exonuclease)

– vetor contém extra Timina no 3’ (ex. pGEM-T)


• Ligação com terminação abrupta ou enzima de restrição única -> defosforilar

• Prevenir auto-ligação do vetor– CIAP - 0,01 unidades/picomole de terminação– g DNA x 3,04 = pmoles de terminação

(kb do DNA)

• Inserto deve estar fosforilado no 5’– fragmentos de digestão - OK– produto de PCR ou sintético - fosforilar


• Purificar inserto e vetor– Vetor não digerido - falsos transformantes

• Purificar por gel eletroforese– kits comerciais– saco de diálise

Ligação

• Eficiência avaliada por # transformantes• Condições:

– relação molar inserto: vetor (3:1 a 1:3)(ng de vetor x tamanho inserto em kb) x (inserto:vetor)

tamanho vetor kb

– total de DNA– tamanho do inserto– unidades de ligase– concentração de ATP e Mg2+

– tempo e temperatura de incubação

Ligação

• Total de DNA em reação de ligação:– 1 a 10 ng/l reação (10 a 200 ng total em 20 l)– ligações mais difíceis - mais DNA

• Condições:– balanço entre tempo e temperatura (ótimo 25oC)– função tipo de terminação - função da Tm

• coesivo = 15-20oC por 3 a 16 hs• abrupto = 4-16oC por 4 a 18 hs• em geral = 20oC por 30 minutos

Ligação

• Reação de ligação:– requer [ATP] = 0,01 a 1 mM - muito lábil!– não descongelar muito e vortexar - gradiente

– requer 10 mM MgCl2 • EDTA quela - inibe atividade da T4 DNA Ligase• ativa nucleases - cepas que não são endA-

– tratar com fenol-clorofórmio

• Controles:– apenas plasmídeo - taxa de religação– apenas inserto - contaminação

Transformação e Seleção

• Eficiência– ufc na placa x 103 ng x diluição = ufc

ng de vetor g g DNA

Ex. 100 l céls. em 1 ng plasmídeo 10 l solução (0,1 ng) em 990 l SOC

100 l plaqueado = 100 colônias plasmídeo não digerido -> 109 ufc/g ligação abrupta -> 105 ufc/g ligação coesiva -> 106 ufc/g

técnica de dna recombinante dna recombinante ou clonagem ligar 2 ou + segmentos de dna, gerando...

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