replicação de dna

5/7/2018 Replicação de DNA - slidepdf.com

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REPLICAÇÃO DE DNA



MAPA DO CROMOSSOMA DE E.coli



TERMINOLOGIA

Regras básicas para a designação de genes e proteínas:

Genes bacterianos – 3 letras minúsculas em itálico que reflectema sua função aparente

Ex: dna (replicação do DNA), uvr (resistência à lesão porradiação UV), rec (recombinação)

Quando vários genes afectam o mesmo processo, acrescenta-seas letras A, B, C, etc, que reflectem a ordem de descoberta.

Proteínas bacterianas – geralmente a mesma designação do geneque as codifica; 3 letras não-itálicas, a 1ª maiúscula

Ex: DnaA, RecA



Conceito de Molde

Watson e Crick:

uma cadeia é o

complemento da outra



REGRAS BÁSICAS PARA

A REPLICAÇÃO DO DNA



EXPERIÊNCIA DE MESELSON - STAHL



Questões levantadas:

As cadeias parentais desenrolam-secompletamente antes da replicação?

O início da replicação é aleatório ou não?

Após o início da replicação numdeterminado ponto, a replicação prossegue

numa direcção ou em ambas?



REPLICAÇÃO DO DNA



Regiõesricas em

pares A = T



INÍCIO DA REPLICAÇÃO

A replicação inicia-se nas ORIGENS DE

REPLICAÇÃO, que são sequênciasespecíficas muito ricas em pares A=TE.coli - 1 origem de replicação

Eucariotas - múltiplas origens de replicaçãolocalizadas ao longo do cromossoma

REPLICÃO - unidade de replicaçãoporção de DNA que sofre um processoindividual de replicação



QUAL O SENTIDO DA REPLICAÇÃO?



DEFINIÇÃO DAS CADEIAS DE DNA

NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO

A síntese de DNA dá-se na direcção 5’ → 3’e é semi-descontínua

C ÇÃO É S SCO Í



A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA

CONTÍNUA

DESCONTÍNUA

Fragmentos de Okazaki :

Eucariotas: 100-200 nucleótidosE. coli : 1000-2000 nucleótidos



POLIMERIZAÇÃO DE NUCLEÓTIDOSFORMAÇÃO DA LIGAÇÃO FOSFODIÉSTER

(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiMg2+

Polimerase

Enzima de 3 substratos:

cadeia de DNA que é copiada cadeia neo-sintetizada ou cadeia em crescimento

2’-desoxirribonucleótido-5’-trifosfato incorporado



ELONGAÇÃO DA CADEIA DE DNA



PROPRIEDADES DAS DNA POLIMERASES

ACTIVIDADE POLIMERÁSICA 5’ → 3’

NECESSIDADE DE UM MOLDEA cadeia molde complementar é copiada no sentido 3’ → 5’

NECESSIDADE DE UM PRIMER

ACTIVIDADE EXONUCLEÁSICA 3’ → 5’ E 5’ → 3’

PROCESSIVIDADENúmero de nucleótidos adicionados antes que a enzima se dissocie do molde. Esta propriedade pode ser potenciada por proteínas associadas.



FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO

COMPLEMENTARIDADE DE BASESGeometria das bases

Formas tautoméricas das bases

ACTIVIDADE CORRECTORA DAS

DNA POLIMERASESActividade exonucleásica 3’ → 5’



A GEOMETRIA DAS BASES CONTRIBUIPARA A FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO



FORMAS TAUTOMÉRICAS DO URACILO



CORRECÇÃO DE ERROSPELA ACTIVIDADE 3’→5’

EXONUCLEÁSICA DADNA POLIMERASE I



DNA polimerase I não é a responsável pela

replicação do cromossoma de E.coli :

Velocidade de polimerização demasiado baixa

Processividade baixa

Estudos genéticos demonstraram que a DNApolimerase I não actua sòzinha

Em 1969 John Cairns isolou uma estirpe queproduzia uma DNA polimerase I inactiva



DNA polimerases IV e V identificadas em 1999Envolvidas numa forma específica de reparação de DNA

FRAGMENTO KLENOW DA DNA POLIMERASE I



FRAGMENTO KLENOW DA DNA POLIMERASE I

ANÁLISE POR DIFRACÇÃO DE RAIOS-X

Fragmento KlenowFrag. pequeno

N C

Tripsina

5’ → 3’exonuclease

3’ → 5’exonuclease Polimerase

MODELO PARA A ESTRUTURA DO COMPLEXO



MODELO PARA A ESTRUTURA DO COMPLEXODNA POLIMERASE I – DNA



DNA POLIMERASE III

Enzima responsável pela replicação de DNAem E.coli

In vivo Pol III é uma holo-enzima constituídapor, pelo menos, 10 sub-unidades:

α, ε e θ formam o núcleo da enzima τ liga dois núcleos da polimerase

γ2δδ’χψ associam-se para formar umcomplexo que posiciona o anel (β2)

β dimeriza para formar um anel em torno do

molde de DNA



A b id d d DNA P li III f



A sub-unidade β da DNA Polimerase III forma uma

estrutura em anel à volta do DNAe é responsável pela sua elevada

processividade (> 500.000 nucleótidos)



REPLICAÇÃO EM E.coli

Replissoma - complexo de enzimas e proteínasnecessários para a replicação

Polimerases Helicases Topo-isomerases

Proteínas de ligação ao DNA (DNA binding proteins) Primases Ligases

Ã



ETAPAS DA REPLICAÇÃO

1. ETAPA DE INICIAÇÃO (controlo da replicação)• Reconhecimento das origens de replicação por umcomplexo proteico• Abertura localizada da dupla cadeia de DNA pelaDNA helicase• Síntese do primer

2. ETAPA DE ELONGAÇÃO• Síntese contínua na cadeia leading

• Síntese descontínua na cadeia lagging 3. ETAPA DE TERMINAÇÃO

• Reconhecimento de sequências, sobre as quais se

fixam proteínas, bloqueando o movimento deprogressão da forquilha de replicação




INICIAÇÃO

1. Reconhecimento de sequências naorigem da replicação por uma únicaproteína que se fixa sobre estas mesmas

sequências2. Abertura da dupla cadeia de DNA a nívelda região rica em pares A=T, junto ou no

seio da origem de replicação3. Organização do complexo de replicação

na região aberta do DNA



oriC

ORIGEM DE REPLICAÇÃO EM E.coli ARRANJO DAS SEQUÊNCIAS CONSERVADAS




INICIAÇÃO

COMPLEXO DE INICIAÇÃOORISSOMA

Conjunto de proteínas que intervêm na

etapa de iniciação Algumas proteínas ligam-se ao DNA,

especificamente (DnaA) Outras participam no orissoma através

do reconhecimento de proteínas já

presentes (DnaB)



MODELO PARAINICIAÇÃO

DA REPLICAÇÃONA ORIGEMDE E.coli , ori C



CONTROLO DA ETAPA DE INICIAÇÃO

Permitir que a iniciação se faça no momentoadequado do ciclo de divisão

Impedir que o cromossoma se replique maisdo que uma vez por cada ciclo

Mecanismo de sequestraçãoMetilação de OriC, nas sequências GATC, pela DNA-adenina-metiltransferase (Dam-metilase)

Após replicação, o DNA semi-metilado liga-se àmembrana bacteriana, ficando as origens dereplicação inacessíveis

METILAÇÃO DO DNA E



ÇINICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO




REPLICAÇÃO EM E.coli REGULAÇÃO DA INICIAÇÃO

Ã




ELONGAÇÃO

Síntese contínua da cadeia leading

Síntese descontínua da cadeia lagging emfragmentos de Okazaki

Coordenação da síntese das duas cadeias:- Ambas as cadeias são sintetizadas por

uma única DNA polimerase assimétrica- O looping do DNA da cadeia lagging junta

os dois pontos de polimerização



SÍNTESE DOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI



SÍNTESE DOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI

SÍNTESE SEMI-DESCONTÍNUA DO DNA



PROBLEMA PRINCIPAL

SÍNTESE DE DNA NAS CADEIAS LEADING E LAGGING



CADEIA LAGGING - REMOÇÃO DE RNA PRIMER



ÇE SUBSTITUIÇÃO POR DNA



NICK TRANSLATION

ACTIVIDADES5’→3’ EXONUCLEÁSICA

EPOLIMERÁSICADA

DNA POLIMERASE I

MECANISMO DA REACÇÃO DE LIGAÇÃO DO DNA



MECANISMO DA REACÇÃO DE LIGAÇÃO DO DNA

REPLICAÇÃO EM E coli




TERMINAÇÃO

REPLICAÇÃO EM E coli




TERMINAÇÃO

Ã



REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS

A replicação é um acontecimento

muito mais raro nos eucariotas doque nos procariotas. A iniciação dareplicação é fortemente regulada

O DNA não se encontra nu na célula,mas sob a forma de cromatina. Esta

encontra-se organizada sob a formade nucleossomas. Nível superior deorganização implica complexidade

maior para a replicação

CONTROLO DA REPLICAÇÃO PELO CICLO CELULAR



A síntese de DNA tem início, em muitas origens diferentes,durante a fase S

A replicação produz uma única cópia de cada molécula.Bloqueio da iniciação da replicação até ao próximo ciclocelular

A replicação do genoma inteiro deve estar concluída antes dapassagem à fase G2

DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS



DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS

α - 4 sub-unidades: 180 kDa (actividadepolimerásica), 60 kDa + 50kDa (actividade primase) e72 kDa (?). Fracamente processiva, sem actividade

exonucleásica 3’ → 5’

δ - 2 sub-unidades: 125 kDa (actividade polimerásicae exonucleásica 3’ → 5’) e 50 kDa (?). Moderadamente

processiva quando só; elevada processividadequando associada ao PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)

ε - enzima multimérico: 256-258 kDa (actividadepolimerásica e exonucleásica 3’ → 5’); o nº de outrassub-unidades varia em função da espécie; elevadaprocessividade na ausência de PCNA



DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS γ - Actividade polimerásica e exonucleásica 3’ → 5’.

Responsável pela replicação do DNA mitocondrial,processo autónomo sob o ponto de vista cronológicoe enzimático

β - enzima monomérico (40 kDa); pouco processiva esem actividade exonucleásica 3’ → 5’. Não parece terpapel na replicação mas intervém nos processos de

reparação por excisão de bases erradas

HOMOTRÍMERO DE PCNAESTRUTURA



ESTRUTURA

Notar a semelhança desta estrutura comcom o dímero β2 da DNA Polimerase III de E.coli





INICIAÇÃO

A replicação inicia-se em múltiplas origens.

Porquê?O movimento da forquilha de replicação é ~20x mais lentonos eucariotas do que nos procariotas (50 nt/seg). A estavelocidade a replicação de um cromossoma humano detamanho médio levaria 500 horas

As origens de replicação ou sequências dereplicação autónoma (Autonomously Replicating

Sequence ou ARS) foram identificadas eestudadas na levedura. Existem cerca de 400ARS no genoma da levedura

CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ARS



Identificaram-se 400 ARS no genoma da levedura. Amaioria, mas não a totalidade, constitui origens dereplicação

As origens encontram-se espaçadas a intervalosirregulares ao longo do cromossoma. O intervalomédio é cerca de 40 kb

As ARS são constituídas por sequênciasconservadas: 5’ (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(T/A) 3’

O complexo de reconhecimento da origem (ORC),

constituído por pelo menos 6 polipéptidos, liga-seàquelas sequências conservadas A ligação de ORC induz modificação conformacional

no DNA, necessária para a replicação e transcrição

MECANISMO DE REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS



PCNA

RFC

RPA

Helicase

Primase

RNase HDNA ligase

Pol δ

Pol α

Pol δ = SSB

(remove RNA primers)

• Pol α / primase - síntese deRNA-DNA primers para

iniciação da replicação;baixa processividade

• Pol δ / PCNA - funçõescomplexas na replicação de

ambas as cadeias; elevadaprocessividade

REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR



Ç

+

5’ 3’

3’ 5’

Síntese da cadeia leading

5’ 3’3’ 5’

RNA

primer

Síntese da cadeia lagging 3’

5’

5’ 3’

Replicação

+

5’ 3’Cadeia filha completa

5’ 3’

Cadeia filha incompleta3’ 5’

Remoção do

RNA primer

REPLICAÇÃO NOS TELÓMEROS



As extremidades dos cromossomas são estabilizadas pelos telómeros,

requerendo uma transcriptase reversa para a sua replicação

Os telómeros humanos consistem em 1000-1500 cópias de TxGy

OUTRAS PROTEÍNAS



IMPLICADAS NA REPLICAÇÃO PROTEÍNAS COM ACTIVIDADE ENZIMÁTICA

Topo-isomerase tipo ITopo-isomerase tipo IIRNase H3 DNA ligases

DNA helicase

PROTEÍNAS COM PAPEL ESTRUTURALPCNA

RFCRPA

PROTEÍNAS MODULADORAS

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