Profa. Renata Faier Calegario

Ácidos Nucleicos e suas propriedades

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO

AF 060- Biotecnologia Vegetal

GENE

Sequência ordenada de nucleotídeos - DNA

Expressão

Codifica um produto funcional (proteína ou molécula de RNA)

Conceito:

� Perpetuada através da replicação do DNA

� Expressa através de dois processos:

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

Transcrição e Tradução

A informação genética:

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

DNA DNA

RNA

PROTEÍNA

Transcrição

Tradução

Replicação

ÁCIDOS NUCLEICOS

NUCLEOTÍDEO

Composição química:

Base Nitrogenada

Açúcar

Fosfato

5’

3’

1’

FOSFATO

Nucleotídeo

� RNA e DNA

5

PENTOSES

AÇÚCAR

DNA: Desoxirribose RNA: Ribose

PURINASBicíclicas

PIRIMIDINASMonocíclicas

Adenina Guanina

Citosina Uracila Timina

Bases Púricas e Pirimídicas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos

BASES NITROGENADAS

BASES NITROGENADAS

A C G TDNA

RNA A C G U

A T

C G

A U

PAREAMENTOS

_

___

_

__

DNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS

NUCLEOTÍDEOS

HO

HO3’

Lig

ação

fo

sfo

dié

ster

Filamento de nucleotídeos

5’

3’

DNA : ESTRUTURA

A = T

G C

3 pontes H

2 pontes H

2 Filamentos de nucleotídeosEstrutura Plana

DNA: estrutura tridimensional

� Duas fitas enroladas, complementares entre si e

invertidas

� Cada fita: composta por uma sequência linear de

nucleotídeos

� Estrutura Helicoidal em dupla hélice

Extremidade 5’ = Fosfato (PO4)

Extremidade 3’ = Hidroxila (HO)

Leitura e Escrita 5’ 3’

(Watson & Crick, 1953)

� Replicação: capacidade do DNA de originar cópias

idênticas (auto duplicação)

COMO O DNA SE REPLICA ?

O processo é dividido em 3 etapas:

Etapa Enzima Função

1ª DNA HelicaseDesenrola as duas hélices e rompe as pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos => separa fitas

2ª DNA Polimerase Encaixa os nucleotídeos na fita molde

3ª DNA LigaseRealiza a ligação dos nucleotídeos (fragmentos de Okasaki)

Primase (RNA polimerase) : confecção de primers para que a DNA polimerase inicie a síntese

DNA : DUPLICAÇÃO

DNA polimerase: requer primers para iniciar a síntese (5’-3’)

Cadeia atrasada

Cadeia líder = fita contínua

Forquilha de replicação

Helicase

DNA Ligase

Origem de Replicação: regiões ricas em AT = início da replicação

Primers

DNA polimerase

DNA : DUPLICAÇÃO

Semiconservativa

RNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS

1. DNA se abre: RNA polimerase (bolha de transcrição )

2. Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e uracila)

na fita molde de DNA

3. RNA pronto se solta e migra para o citoplasma

4. DNA se recompõe

TRANSCRIÇÃO: DNA => RNA

TRANSCRIÇÃO

• Enzima responsável: RNA polimerase

• Início da Transcrição: Região Promotora⇒ pequena sequência de nucleotídeos reconhecida pela

RNA polimerase como ponto onde deve se ligar ao DNA

Exemplos promotores:

Região TATA box => -10: 5’-TATAAT- 3’=> -35: 5’-TTGACA- 3’

Término da Transcrição:

TRANSCRIÇÃO

RNA polimerase encontra um Terminador

• Sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase

• Região com pares consecutivos de A/U

• Região rica em G+C (dependente de proteína)

O complexo de transcrição se dissocia

e há liberação da molécula de RNA

RNA : ESTRUTURA

RNA: Uma fita simples de nucleotídeos

RNA : ESTRUTURA

Bolha de Transcrição

RNA : ESTRUTURA

• Fita simples, helicoidal• Regiões complementares• Formando grampos e alças

• RNA mensageiro => informação genética para a

sequência de aminoácidos das proteína

• RNA ribossômico => constituinte dos ribossomos

• RNA transportador => identifica e transporta os

aminoácidos até os ribossomos

TIPOS DE RNA

TRADUÇÃO

Síntese de proteínas

Converte trincas de nt RNA => Aminoácidos => Proteína

• Local: Ribossomos (citoplasma)

• Início da Tradução: Códon de iniciação

=> AUG (Metionina)

• Término da Tradução: Códon de terminação

=> Não codifica aminoácido

Ex: UGA, UAG, UAA

TRADUÇÃO

BIOLOGIA MOLECULAR

� Possibilita a manipulação de moléculas

=> introdução de genes em um genoma receptor

� Enzimas replicar, cortar e ligar o DNA

� Bases nitrogenadas

Tecnologia do DNA recombinante

Depende:

� Clivar DNA com enzimas de restrição

� Inserir DNA eucariótico em bactérias

� Determinar a sequência de nt de um fragmento de DNA

� Amplificar e sintetizar DNA

� Recombinar fragmentos de DNA, etc.

DNA RECOMBINANTE

Ferramenta permite:

� Isolar um gene em particular, parte de um gene ou uma

região do genoma;

�Produzir proteína de interesse em larga escala;

�Aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogas

para comercialização;

�Modificar organismos existentes para que expressem uma

característica de interesse que não seja codificada pelo

genoma

Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível

• Plantas tolerantes à Doenças e a Pragas

• Feijão resistente ao vírus do mosaico dourado e Mamão papayaresistente ao vírus da mancha anelar

• Milho, algodão, batata (Bt) = resistentes ao ataque de insetos

• Plantas tolerantes à Herbicidas

• Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato

• Soja = tolerante ao 2,4-D

• Plantas tolerantes ao estresse ambiental (Seca, frio, calor,salinidade e acidez)

• Cana-de açúcar tolerante à seca

• Plantas com melhorias nutricionais (vitaminas e aa)

• Arroz dourado (Golden rice), rico em betacaroteno, precursor da vitamina A - evitar a cegueira noturna e desnutrição

AGRICULTURA

PROPRIEDADES DO DNA

• DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênio

entre as cadeias complementares do DNA

• RENATURAÇÃO → reanelamento das pontes de hidrogênio

entre as cadeias complementares do DNA

=> Fenômenos físicos fundamentais para os processosde replicação e transcrição

Esses processos podem ser realizados in vitro

A Desnaturação pode ser obtida através de:

� Aumento de temperatura

� Agentes desnaturantes (formamida e dimetil-sulfóxido)

� Titulação com ácido ou base

MANIPULAÇÃO DO DNA

Tm (°C) = 69,3 + 0,41 (GC%)

Temperatura média de fusão

A Renaturação pode ser obtida através de:

� Diminuição lenta de temperatura

Resfriamento abrupto: colapso do DNA

MANIPULAÇÃO DO DNA

T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC

MANIPULAÇÃO DO DNA

Enzimas => replicar, cortar e ligar

� Replicação: DNA polimerase e helicase

� Transcrição: RNA polimerase

� Corte do DNA: Enzimas de Restrição

� Ligação de DNA: DNA-ligases

=> Tornou possível transferir sequências específicasde DNA de uma molécula para outra

Acesso a vários tipos de enzimas:

MANIPULAÇÃO DO DNA

Enzimas de Restrição

Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA

• Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar

moléculas de DNA exógeno)

• Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA

• Reconhecem sequências de 4 a 8 nt

• Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

5’...

...5’

...3’

3’...

5’...

3’... ...5’

...3’

Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência

das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’

Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta)

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com

extremidades coesivas > eficiência de ligação

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas:

� Abreviação de 3 letras do nome da espécie

� Seguida da designação da linhagem

� Número Romano: se mais de uma enzima é produzida

Denominação Origem Sequência de Reconhecimento

Isoesquisômeros: enzimas provenientes de organismos diferentes que

reconhecem e cortam a mesma sequência de bases

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

ENZIMAS DE LIGAÇÃO

� Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os

nucleotídeos (hidroxila 3’+ fosfato 5´)

� Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma

enzima de restrição

Ex: T4 DNA ligase

DNA DNA3’ OH-

O O 5’P

O

-

O

DNA DNA3’ O O 5’

O

P

-

O

+

DNA-Ligase

ATP ou NAD

DNA RECOMBINANTE

DNA RECOMBINANTE

DNA RECOMBINANTE

DNA com diferentes tamanhos => migram em velocidades

diferentes => formam diferentes bandas

� Base: mobilidade de partículas em um suporte sólido sob

ação de um campo elétrico

� Separação de acordo com: o tamanho, forma e carga elétrica

COMO ANALISAR O DNA

� Método para separar ácidos nucleicos e proteínas

Eletroforese

DNA contém carga negativa => migra para o polo positivo

• Gel Agarose = agarose (polissacarídeo)

=> separação de fragmentos pequenos e grandes

• Gel Acrilamida = acrilamida e bisacrilamida (polímeros)

=> separação de proteínas ou partículas muito pequenas

ELETROFORESE

� Meios de suporte sólido

� Visualização das bandas: corantes de DNA

• Brometo de etídio (carcinogênico e teratogênico)

• SYBRGreen

• GelRedMoléculas se ligam ao DNA

ELETROFORESE

ELETROFORESE

-

+

Gel

Cuba de eletroforese

Gel

Fonte

Luz UV

ELETROFORESE

http://www.jove.com/video/3923/electroforese-em-gel-de-agarose-para-separao-dos-

fragmentos-de-dna?language=Portuguese

1. Amplificação do gene de interesse

2. Digestão do DNA e do plasmídeo com enzima de restrição

3. Ligação dos produtos de DNA e do vetor plasmídeo

4. Transformação da planta

5. Confirmação da presença do DNA na planta transformada

SOMATÓRIO DE CONHECIMENTO

Próxima Aula

BIBLIOGRAFIA

ZAHA, A. Biologia molecular básica. 5. ed. Porto Alegre:

Artmed, 2014. 416P