Profa. Renata Faier Calegario
Ácidos Nucleicos e suas propriedades
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO
AF 060- Biotecnologia Vegetal
GENE
Sequência ordenada de nucleotídeos - DNA
Expressão
Codifica um produto funcional (proteína ou molécula de RNA)
Conceito:
� Perpetuada através da replicação do DNA
� Expressa através de dois processos:
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
Transcrição e Tradução
A informação genética:
PURINASBicíclicas
PIRIMIDINASMonocíclicas
Adenina Guanina
Citosina Uracila Timina
Bases Púricas e Pirimídicas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos
BASES NITROGENADAS
DNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS
NUCLEOTÍDEOS
HO
HO3’
Lig
ação
fo
sfo
dié
ster
Filamento de nucleotídeos
5’
3’
DNA: estrutura tridimensional
� Duas fitas enroladas, complementares entre si e
invertidas
� Cada fita: composta por uma sequência linear de
nucleotídeos
� Estrutura Helicoidal em dupla hélice
Extremidade 5’ = Fosfato (PO4)
Extremidade 3’ = Hidroxila (HO)
Leitura e Escrita 5’ 3’
(Watson & Crick, 1953)
� Replicação: capacidade do DNA de originar cópias
idênticas (auto duplicação)
COMO O DNA SE REPLICA ?
O processo é dividido em 3 etapas:
Etapa Enzima Função
1ª DNA HelicaseDesenrola as duas hélices e rompe as pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos => separa fitas
2ª DNA Polimerase Encaixa os nucleotídeos na fita molde
3ª DNA LigaseRealiza a ligação dos nucleotídeos (fragmentos de Okasaki)
Primase (RNA polimerase) : confecção de primers para que a DNA polimerase inicie a síntese
DNA : DUPLICAÇÃO
DNA polimerase: requer primers para iniciar a síntese (5’-3’)
Cadeia atrasada
Cadeia líder = fita contínua
Forquilha de replicação
Helicase
DNA Ligase
Origem de Replicação: regiões ricas em AT = início da replicação
Primers
DNA polimerase
RNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS
1. DNA se abre: RNA polimerase (bolha de transcrição )
2. Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e uracila)
na fita molde de DNA
3. RNA pronto se solta e migra para o citoplasma
4. DNA se recompõe
TRANSCRIÇÃO: DNA => RNA
TRANSCRIÇÃO
• Enzima responsável: RNA polimerase
• Início da Transcrição: Região Promotora⇒ pequena sequência de nucleotídeos reconhecida pela
RNA polimerase como ponto onde deve se ligar ao DNA
Exemplos promotores:
Região TATA box => -10: 5’-TATAAT- 3’=> -35: 5’-TTGACA- 3’
Término da Transcrição:
TRANSCRIÇÃO
RNA polimerase encontra um Terminador
• Sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase
• Região com pares consecutivos de A/U
• Região rica em G+C (dependente de proteína)
O complexo de transcrição se dissocia
e há liberação da molécula de RNA
• RNA mensageiro => informação genética para a
sequência de aminoácidos das proteína
• RNA ribossômico => constituinte dos ribossomos
• RNA transportador => identifica e transporta os
aminoácidos até os ribossomos
TIPOS DE RNA
TRADUÇÃO
Síntese de proteínas
Converte trincas de nt RNA => Aminoácidos => Proteína
• Local: Ribossomos (citoplasma)
• Início da Tradução: Códon de iniciação
=> AUG (Metionina)
• Término da Tradução: Códon de terminação
=> Não codifica aminoácido
Ex: UGA, UAG, UAA
BIOLOGIA MOLECULAR
� Possibilita a manipulação de moléculas
=> introdução de genes em um genoma receptor
� Enzimas replicar, cortar e ligar o DNA
� Bases nitrogenadas
Tecnologia do DNA recombinante
Depende:
� Clivar DNA com enzimas de restrição
� Inserir DNA eucariótico em bactérias
� Determinar a sequência de nt de um fragmento de DNA
� Amplificar e sintetizar DNA
� Recombinar fragmentos de DNA, etc.
DNA RECOMBINANTE
Ferramenta permite:
� Isolar um gene em particular, parte de um gene ou uma
região do genoma;
�Produzir proteína de interesse em larga escala;
�Aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogas
para comercialização;
�Modificar organismos existentes para que expressem uma
característica de interesse que não seja codificada pelo
genoma
Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível
• Plantas tolerantes à Doenças e a Pragas
• Feijão resistente ao vírus do mosaico dourado e Mamão papayaresistente ao vírus da mancha anelar
• Milho, algodão, batata (Bt) = resistentes ao ataque de insetos
• Plantas tolerantes à Herbicidas
• Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato
• Soja = tolerante ao 2,4-D
• Plantas tolerantes ao estresse ambiental (Seca, frio, calor,salinidade e acidez)
• Cana-de açúcar tolerante à seca
• Plantas com melhorias nutricionais (vitaminas e aa)
• Arroz dourado (Golden rice), rico em betacaroteno, precursor da vitamina A - evitar a cegueira noturna e desnutrição
AGRICULTURA
PROPRIEDADES DO DNA
• DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênio
entre as cadeias complementares do DNA
• RENATURAÇÃO → reanelamento das pontes de hidrogênio
entre as cadeias complementares do DNA
=> Fenômenos físicos fundamentais para os processosde replicação e transcrição
Esses processos podem ser realizados in vitro
A Desnaturação pode ser obtida através de:
� Aumento de temperatura
� Agentes desnaturantes (formamida e dimetil-sulfóxido)
� Titulação com ácido ou base
MANIPULAÇÃO DO DNA
Tm (°C) = 69,3 + 0,41 (GC%)
Temperatura média de fusão
A Renaturação pode ser obtida através de:
� Diminuição lenta de temperatura
Resfriamento abrupto: colapso do DNA
MANIPULAÇÃO DO DNA
T (anelamento) (oC) = Tm – 25oC
MANIPULAÇÃO DO DNA
Enzimas => replicar, cortar e ligar
� Replicação: DNA polimerase e helicase
� Transcrição: RNA polimerase
� Corte do DNA: Enzimas de Restrição
� Ligação de DNA: DNA-ligases
=> Tornou possível transferir sequências específicasde DNA de uma molécula para outra
Acesso a vários tipos de enzimas:
MANIPULAÇÃO DO DNA
Enzimas de Restrição
Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA
• Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar
moléculas de DNA exógeno)
• Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA
• Reconhecem sequências de 4 a 8 nt
• Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
5’...
...5’
...3’
3’...
5’...
3’... ...5’
...3’
Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência
das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’
Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta)
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com
extremidades coesivas > eficiência de ligação
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas:
� Abreviação de 3 letras do nome da espécie
� Seguida da designação da linhagem
� Número Romano: se mais de uma enzima é produzida
Denominação Origem Sequência de Reconhecimento
Isoesquisômeros: enzimas provenientes de organismos diferentes que
reconhecem e cortam a mesma sequência de bases
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE LIGAÇÃO
� Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os
nucleotídeos (hidroxila 3’+ fosfato 5´)
� Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma
enzima de restrição
Ex: T4 DNA ligase
DNA DNA3’ OH-
O O 5’P
O
-
O
DNA DNA3’ O O 5’
O
P
-
O
+
DNA-Ligase
ATP ou NAD
DNA com diferentes tamanhos => migram em velocidades
diferentes => formam diferentes bandas
� Base: mobilidade de partículas em um suporte sólido sob
ação de um campo elétrico
� Separação de acordo com: o tamanho, forma e carga elétrica
COMO ANALISAR O DNA
� Método para separar ácidos nucleicos e proteínas
Eletroforese
DNA contém carga negativa => migra para o polo positivo
• Gel Agarose = agarose (polissacarídeo)
=> separação de fragmentos pequenos e grandes
• Gel Acrilamida = acrilamida e bisacrilamida (polímeros)
=> separação de proteínas ou partículas muito pequenas
ELETROFORESE
� Meios de suporte sólido
� Visualização das bandas: corantes de DNA
• Brometo de etídio (carcinogênico e teratogênico)
• SYBRGreen
• GelRedMoléculas se ligam ao DNA
ELETROFORESE
http://www.jove.com/video/3923/electroforese-em-gel-de-agarose-para-separao-dos-
fragmentos-de-dna?language=Portuguese
1. Amplificação do gene de interesse
2. Digestão do DNA e do plasmídeo com enzima de restrição
3. Ligação dos produtos de DNA e do vetor plasmídeo
4. Transformação da planta
5. Confirmação da presença do DNA na planta transformada
SOMATÓRIO DE CONHECIMENTO
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