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Unidade III: Tecnologiado DNA Recombinante Disciplina: Biologia Molecular Disciplina: Biologia Molecular Centro de Ciências da Saúde Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Pró-Reitoria de Pesquisa e de Pós-graduação – Bloco L E-mail: [email protected]

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Unidade III:Tecnologia do DNA Recombinante

Disciplina: Biologia MolecularDisciplina: Biologia MolecularCentro de Ciências da Saúde

Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini

Pró-Reitoria de Pesquisa e de Pós-graduação – Bloco L

E-mail: [email protected]

Conteúdo

• DNA recombinante

• Enzimas de restrição

• Vetores de clonagem

– Plasmídios– Plasmídios

– Bacteriófagos

– Cosmídeos

• Etapas de clonagem molecular

• Bibliotecas de DNA

• Aplicações

Brincando de Deus

http://www.marymeetsdolly.com/blog/index.php?/categories/10-Geneticshttp://www.cartoonstock.com/directory/m/microscope.asp

“Às vezes, você se pega pensando se isto é resultado de algum

experimento maluco?”

“J.B., tem alguém aqui reclamando que os genes que patenteamos foram criados

pelo chefe dele.”

DNA Recombinante

• É uma molécula de DNA formada pela ligação de duas moléculas de origens diferentes.

http://geneticamais.blogspot.com.br/2011/05/tecnologia-do-dna-recombinante-rdna.html

DNA Recombinante

• 1982 – Diabetes mellitus

Enzimas de Restrição

• 1970:

– DNA de bacteriófago é impedido de replicar em – DNA de bacteriófago é impedido de replicar em Escheria coli

• 1978:

– Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicinahttp://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/

Enzimas de Restrição

Enzimas Bacterianas

Protegem Bactéria contra Infecção Viral

Proteção DNADegradam DNA viral Proteção DNABacteriano(Metilação)

Enzimas de Restrição

• ou Endonuclease de Restrição

cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;

Sítio-específica

Enzimas de Restrição

• Nomemclatura: EcoRI

Enzima Organismo Sequênciab

Gênero

Espécie Linhagem

Ordem de descoberta

AluI Arthrobacter luteus 5’ AG CT

BamHI Bacillus amyloliquefasciens H 5’ G GATCC

HaeIII Haemophilus aegyptius 5’ GG CC

HindIII Haemophilus influenzae Rd 5’ A AGCTT

EcoRI Escherichia coli RY13 5’ G AATTC

Enzimas de Restrição

• Propriedades:

– Reconhecem Palíndromos ou SequênciasPalindrômicas � Sequencia de pares de nucleotídeos que tem a mesma leitura em ambos nucleotídeos que tem a mesma leitura em ambos os sentidos, a partir de um eixo central de simetria

Enzimas de Restrição

• Eixos de Clivagem:

a) Clivagem no eixo de simetria b) Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria

Fragmentos de restrição com extremidades abruptas

Fragmentos de restrição com extremidades coesivas

...TC GA...

...AG CT...

3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’

+

...GAA TTC...

...CTT AAG...

+

3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’

http://www.engenhariageneticabioq.page.tl/Clonagem-In-Vivo.htm

Enzimas de Restrição

http://www.engenhariageneticabioq.page.tl/Clonagem-In-Vivo.htm

Enzimas de Restrição

• Vídeo

• http://www.youtube.com/watch?v=yc-s-WojU5Y

Vetores de Clonagem

Organismos utilizados para

transferir

• Propriedades:

– Replicação autônoma

– Marcador de seleção (antibiótico)

– Sítio único de clonagemtransferir

DNA/RNA para uma célula hospedeira.

– Sítio único de clonagem

• Tipos:

– Plasmídeos:

– Bacteriófagos:

– Cosmídeos:

Vetores de Clonagem

• Tipos:– Plasmídeos:

• moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras

– pUC18– pUC18

– pBR322

– pUP310

– Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

http://www.mun.ca/biology/scarr/Plasmid_pUC18.html

Vetores de Clonagem

• Tipos:

– Bacteriófagos:

• Vírus que infectam bactérias;

• são usados para clonar fragmentos de DNA de 10.000 -• são usados para clonar fragmentos de DNA de 10.000 -20.000 pares de bases.

http://saladeestudosursamaior.webnode.com.br/materias/biologias/virus/

Vetores de Clonagem

• Tipos:– Cosmídeos:

• são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago e plasmídeos.

• Vantagens: • Vantagens: – capacidade do plasmídeo de replicação

autônoma

– capacidade do fago de embalagem do

cromossomo

• são utilizadas para a clonagem dos

maiores segmentos de DNA.

http://users.med.up.pt/med05009/bcm/vectores_frame.htm

Clonagem

• Produção de organismos geneticamente idênticos.

http://oincrivelmundodedolly.blogspot.com.br/2010/08/o-que-e-clonagem.html

Passos para Clonagem

1. Obtenção do DNA a ser clonado

2. Preparação do vetor

3. Ligação do vetor com o “inserto”

4. Transformação da bactéria4. Transformação da bactéria

5. Seleção dos clones recombinantes

Passos para Clonagem

1. Obtenção do DNA a ser clonado

– Extração de DNA; (Aula Prática)

– Digestão com Enzimas de Restrição;

– PCR; (realizaremos em Aula Prática, com o DNA – PCR; (realizaremos em Aula Prática, com o DNA extraído previamente)

Passos para Clonagem

1. Obtenção do DNA a ser clonado

• Digestão com Enzimas de Restrição

http://biologototal.blogspot.com.br/2012/02/enzimas-de-restricao.html

Passos para Clonagem

1. Obtenção do DNA a ser clonado

– PCR - Polymerase Chain Reaction

(Reação em Cadeia da Polimerase)

– 1983, Kary B. Mullis– 1983, Kary B. Mullis

• 1993 – Prêmio Nobel em Química

“Amplifica”o número de cópias de uma região específicado DNA � “Replicação seletiva de

fragmentos de DNA genômico”.http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html

Passos para Clonagem

O processo do PCR é composto de ciclos, contendo os seguintes passos:

http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html&do

Passos para Clonagem

O processo do PCR é composto de ciclos, contendo os seguintes passos:

Denaturação: O DNA é aquecido para

http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html&do

O DNA é aquecido para quebrar as pontes de

hidrogênio entre as fitas complementares, permitindo

a separação das fitas.

Passos para Clonagem

O processo do PCR é composto de ciclos, contendo os seguintes passos:

Anelamento: Fitas separadas, o DNA é

http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html&do

Fitas separadas, o DNA é resfriado para permitir que os

primers, se liguem nas seqüências complementares

específicas (não necessariamente TATA Box) do

molde.

Passos para Clonagem

O processo do PCR é composto de ciclos, contendo os seguintes passos:

Extensão: DNA polimerase começa a

http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html&do

DNA polimerase começa a estender os primers na

direção 5´�3´, pela adição de nucleotídeos usando as fitas

do DNA molde como modelo.

Passos para Clonagem

O processo do PCR é composto de ciclos, contendo os seguintes passos:

Processo é repetido por

http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html&do

repetido por vários ciclos,

dependendo da quantidade de

DNA necessário.

Passos para Clonagem

• Visualização do Produto de PCR

– Eletroforese em gel:

• é o processo no qual moléculas são separadas de acordo com o tamanho e carga elétrica pela aplicação acordo com o tamanho e carga elétrica pela aplicação de uma corrente elétrica. A corrente elétrica força as moléculas pelos poros de uma camada fina de gel.

• Fragmentos menores, geralmente movem-se mais rápidos que os maiores.

Passos para Clonagem

• Visualização do Produto de PCR

– Eletroforese em gel:

http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis/http://pt.scribd.com/adriana_l%C3%BAcio_1/d/53142512-Genetica-Forense

Passos para Clonagem

2. Preparação do Vetor:

Plasmídeo Circular Plasmídeo linear

Digestão com

Enzimas de

restrição

Passos para Clonagem

3. Ligação

Extremidades coesivas

DNA plasmidial

- vetor

Fragmento de

DNA - inserto LIGASELIGASE

Passos para clonagem

4. Transformação Bacteriana

• Choque Térmico: 3) Choque Térmico (37o a 42o C) � poros na membrana �

entrada do vetor

1) Tratamento com CaCl2

2) Neutralização de cargas (-) da membrana e do

DNA

http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAvZ4AL/dna-recombinantehttp://carlosferreirajf.blogspot.com.br/2010/11/corrida-da-fogueira-63-edicao.html

Passos para clonagem

4. Transformação Bacteriana

• Eletroporação: 3) Alta voltagem�

�poros na membrana �� entrada do vetor

1) Solução aquosa

2) Competentes a receber DNA

http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAvZ4AL/dna-recombinantehttp://leonardolimacordeiro.blogspot.com.br/2011/02/cuidado-alta-voltagem.html

Passos para Clonagem

5. Seleção dos Clones Recombinantes

Plaqueamento � Multiplicação e Crescimento de Colônias � Seleção

http://www.engenhariageneticabioq.page.tl/Clonagem-In-Vivo.htm

ClonagemVídeo sobre clonagem:http://www.youtube.com/watch?v=KQ2exY26AJE

http://www.engenhariageneticabioq.page.tl/Clonagem-In-Vivo.htm

Biblioteca de DNA

• Coleção de fragmentos de restrição clonados a partir do genoma de um único organismo.

– Biblioteca genômica;

– Biblioteca de cDNA;– Biblioteca de cDNA;

http://www.lu3.com.br/category/books/page/2/

Biblioteca de DNA

• Biblioteca genômica: biblioteca de DNAcontendo o genoma completo de umorganismo.

– Estudar a função de sequências reguladoras;– Estudar a função de sequências reguladoras;

– Estudar a natureza de como íntrons/éxons afetamo produto final (a proteína) de um gene.

Biblioteca de DNA

• Biblioteca de cDNA: – cDNA � DNA

complementar, copiado diretamente do mRNA.

– Transcriptase Reversa: polimeriza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA, exatamente o oposto do que geralmente ocorre nas células, nas quais é produzido RNA a partir de DNA.

http://9e.devbio.com/article.php?ch=4&id=32

Biblioteca de DNA

• Biblioteca de cDNA:

– cDNA não contêm íntrons ou qualquer seqüênciaanterior ou posterior do gene.

Toda biblioteca de cDNA é feita a partir de um Toda biblioteca de cDNA é feita a partir de um tecido.

Contêm somente a representação das sequênciastranscritas naquele tecido.

• É possível isolar cDNA de beta-globina a partir de uma biblioteca de cDNAde fibroblastos da pele?

Biblioteca de DNA

• Biblioteca de cDNA:

– Estudos de expressão;

– Determinar a função dos genes na célula eucariótica;eucariótica;

– Comparação com seqüências genômicas;

– Etiquetar genes com suas proteínas respectivas. Qual Gene? � Qual Proteina?

– ESTs (Expressed Sequence Tags): pequenos fragmentos de cDNA.

Aplicações

• Farmacogenômica;

• Vacinas Recombinantes;

• Terapia Gênica;

• Transgênicos;• Transgênicos;

Próximas Aulas

http://iecdpgolhosdafe.webnode.com.br/forum/

Referências Bibliográficas

• Nussbaum R.L.; McInnes R.R., Willard H.F. Thompson&Thompson Genética Médica, 7ª. Edição, ElsevierSaunders, 2008 – capítulo 4

• Watson J.D. DNA, O Segredo da Vida. Companhia dasLetras, 2005 – capítulo 4

• Snustad D.P.; Simmons M.J. Fundamentos de Genética, 2ª.Edição, Guanabara Koogan, 2001 – capítulo 20

• Snustad D.P.; Simmons M.J. Fundamentos de Genética, 2ª.Edição, Guanabara Koogan, 2001 – capítulo 20

• Alberts B. et al. Biologia Molecular da Célula, 3ª. Edição,Artmed, 1997 – capítulo 7

• Costa S.O.P. Genética Molecular e de Microrganismos – OsFundamentos da Engenharia Genética, Manole, 1987 –capítulo 32

• Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia Molecular.Embrapa, 2008