dna revisado

163
INTRODUÇÃO A BIOLOGIA INTRODUÇÃO A BIOLOGIA MOLECULAR MOLECULAR DNA DNA

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Page 1: DNA revisado

INTRODUÇÃO A BIOLOGIA INTRODUÇÃO A BIOLOGIA MOLECULARMOLECULAR

DNADNA

Page 2: DNA revisado

ORGANISMO

CÉLULA

NÚCLEO

CROMOSSOMOS(DNA+PROTEÍNAS)

- Informação das proteínas e RNAs que serão sintetizadas pelas células do organismo ao longo da sua vida.-Capacidade de se auto-duplicar para originar outras células.

DNADNA

NOS SERES HUMANOSNOS SERES HUMANOS

Page 3: DNA revisado

AMBIENTE

CÉLULAS

TECIDOS

ÓRGÃOS

CORPO

CÉLULAS

TECIDOS

ÓRGÃOS

CÉLULAS

TECIDOS

ÓRGÃOS

Embriologia Amadurecimentoe Fase reprodutiva

Envelhecimento Morte

Desenvolvimento

Acúmulo demodificaçõese disfunções

MoléculasOrganelas

MoléculasOrganelas

Envelhecimento...Envelhecimento...

Page 4: DNA revisado

DNA

Controla: 1) homeostasia2) reprodução 3) morfologia4) função celular

A CÉLULA

TECIDOS

ÓRGÃOSE SISTEMAS

CORPO

UN

ICE

LU

LA

RE

S

MU

LT

ICE

LU

LA

RE

S

AMBIENTE

NÍV

EIS

DE

OR

GA

NIZ

ÃO

Page 5: DNA revisado

HISTÓRICO

1865 - GREGOR MENDEL

Estudou cruzamento entre diferentes tipos de ervilhas demonstrando que certas características físicas dessas plantas eram transmitidas de geração para geração através de “fatores”.

Page 6: DNA revisado

HISTÓRICO

1902 – SUTTON e BOVERI

Padrão de herança dos “fatores” acompanhava a segregação dos cromossomos de células em divisão

1909 – JOHANNSEN

Nomeou as unidades mendelianas da hereditariedade (“fatores”) de GENES

Page 7: DNA revisado

HISTÓRICO

1915 – THOMAS MORGAN

Concluiu que os genes estavam organizados de maneira linear nos cromossomos

Propôs, pela 1ª vez, uma correlação entre um gene (genótipo) e uma característica física (fenótipo)

1941 – BEADLE e TATUM

Demonstraram que os genes agiam através da regulação de diferentes eventos químicos

HIPÓTESE: UM GENE UMA ENZIMA

Page 8: DNA revisado

HISTÓRICO

1953 – JAMES WATSON e FRANCIS CRICK

Descrição da estrutura física do DNA baseando-se nos estudos de difração de raio X de

Rosalind Franklin e Maurice Wilkins e em estudos químicos da molécula

Modelo da dupla fita proposto foi fundamental para a compreensão do mecanismo de

transmissão e execução da informação genética

Page 9: DNA revisado

•1953: Watson and Crick

Estrutura do DNA

Page 10: DNA revisado

HISTÓRICO

1955 – JOE HIN TJIO

Definiu como 46 o número exato

de cromossomos humanos

ARTHUR KORNBERG

Isolou a enzima DNA polimerase da bactéria E.coli

Page 11: DNA revisado

HISTÓRICO

1957 – CRICK e GAMOV

Dogma Central da Biologia Molecular

DNA RNA PROTEÍNA

Page 12: DNA revisado

Dogma Central

da Biologia Molecula

r

Page 13: DNA revisado

• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON

• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma

HISTÓRICO

Page 14: DNA revisado

HISTÓRICO

1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA

Seqüências sucessivas de três nucleotídeos do DNA (codon) determinam a seqüência de aminoácidos de uma proteína

O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!

Page 15: DNA revisado

Com o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante (1972) e do seqüenciamento do

DNA (1975-77) tornou-se possível isolar e determinar a seqüência de genes dos mais

diferentes organismos.

Desta forma, com a disponibilidade de novos recursos, vários mecanismos biológicos,

como a replicação do DNA e a divisão celular, começaram a ser intensamente estudados.

Page 16: DNA revisado

DNA

1. Regulação transcricional

HnRNA2. Regulação no processamento do RNA primário

3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICORUGOSO

4. Regulação da síntese proteíca

Proteínasintetizada

5. Regulação pós-síntese

A CÉLULA

- DIFERENCIAÇÃO- CRESCIMENTO- FUNÇÃO CELULAR- RESPOSTA AO AMBIENTE

Page 17: DNA revisado

DNACromossoma

Gene

Promotor IntronExon

Núcleo

Page 18: DNA revisado

DNA

Page 19: DNA revisado

ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)

Contém toda a informação genética de um organismo

Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes

Page 20: DNA revisado

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatro diferentes nucleotídeos:

• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA e RNA

• Timina – encontrada somente no DNA

• Uracila – encontrada somente no RNA

Page 21: DNA revisado

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Todos os nucleotídeos apresentam uma estrutura em comum:

radical fosfato

pentose

Page 22: DNA revisado

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

As bases nitrogenadas podem ser divididas em dois grupos de acordo com sua estrutura:

Page 23: DNA revisado

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

O grupo hidroxil ligado ao carbono 3 da pentose de um nucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster com o fosfato do outro nucleotídeo

5’ C-A-G 3’

Page 24: DNA revisado

DNA

• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita e as bases projetam-se para o interior da mesma

• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes de hidrogênio entre as bases o que contribui para a estabilidade da dupla hélice

. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de hidrogênio

. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de hidrogênio

Page 25: DNA revisado

DNA

Page 26: DNA revisado

ESTRUTURA DO DNAESTRUTURA DO DNA

1) Estrutura primária - É um polímero não ramificado- Formado por monômeros chamados de nucleotídeos- Cada nucleotídeo contém os seguintes elementos:

1 Açúcar chamado DESOXIRRIBOSE Possui 5 Carbonos na sua molécula

1 Base orgânica nitrogenada (Por que contém nitrogênio na sua formação)

1 grupo fosfato (PO4-)

NUCLEOTÍDEO

As Bases Nitrogenadas podem ser de dois tipos:

PÚRICAS

N CH HC CH N

PIRIMÍDICAS

C N

N C CH HC C N N H

HC H

3C 2C

1C4C

5C

Page 27: DNA revisado

O

H H

H

HOO

CH2

PO O-

OO

O

H H

H H

CH2

HO

PO O-

OO

Carbono5’

Carbono3’

BaseNitrogenadaDesoxirribose

LigaçãoFosfodiesteGrupo fosfato +Grupo hidroxila(OH) do Carbono 3’

Desoxirribose

BaseNitrogenada

Como a ligaçãoentre uma desoxirribose

e outra desoxirribosesó pode ser feitaquando um grupofosfato liga-se no

Carbono 5’doprimeiro açúcar eno Carbono 3’do

segundo açúcar dizemosque a molécula

de DNA “cresce emdireção 5’ 3’

5’

3’

ESTRUTURA QUÍMICA DA MOLÉCULA DO DNAESTRUTURA QUÍMICA DA MOLÉCULA DO DNA

Page 28: DNA revisado

As fitas do DNA estão dispostas

em direções opostas

Antiparalelismo

Page 29: DNA revisado

Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita

Complementariedade

Page 30: DNA revisado

Durante a replicação do DNA

as duas fitas velhas ou mães servem de

molde para cada fita nova ou filha

complementar, que está sendo sintetizada.

Fita nova

Fita velha

Complementariedade

Page 31: DNA revisado

Fatores que estabilizam a dupla hélice:

• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio

• interações iônicas

Entre as bases nitrogenadas

Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+)

presentes na solução fisiológica

A Dupla Hélice

Page 32: DNA revisado

Sulco menor

Sulco maior

A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos

quais se ligam as proteínas da cromatina

A Dupla Hélice

Page 33: DNA revisado

Proteínas:níveis de complexidade estrutural

Page 34: DNA revisado

DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super-helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)

O Empacotamento do DNA:a estrutura terciária do DNA

Page 35: DNA revisado

O B-DNA é o predominante em condições fisiológicas

A Dupla Hélice

Page 36: DNA revisado

A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário

A Dupla Hélice

Page 37: DNA revisado

Propriedades Químicas e Físicas do DNA

Page 38: DNA revisado

REPLICAÇÃO DO DNA

Conservativa ou Semiconservativa?

Unidirecional ou Bidirecional?

Page 39: DNA revisado

REPLICAÇÃO

SEMICONSERVATIVA

Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958

• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio para crescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogênio pesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.

• As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14N (nitrogênio leve – “light”).

• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade que separa as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.

Page 40: DNA revisado

PNAS

44:671, 1958

Page 41: DNA revisado

•The Meselson-Stahl experiment

A replicação é semi-conservativa

Page 42: DNA revisado

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

Experimento com SV40 (Simian Virus)

• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com a enzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.

• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolha chamada bolha de replicação comprovando a existência de um ponto de origem da replicação

Características da origem de replicação:

. estrutura repetitiva

. seqüências ricas em AT

Page 43: DNA revisado

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

ORIGEM Sítio de restrição EcoRI

Cromossomo viral circular

EcoRI

Bolha de replicação

Page 44: DNA revisado

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

Page 45: DNA revisado
Page 46: DNA revisado

REPLICAÇÃO

BIDIRECIONAL

Um experimento através da autoradiografia de moléculas de DNA marcadas de culturas

de células mamárias revelou grupos de replicons (unidades de replicação) com um

ponto de origem de replicação central

OR OR

Page 47: DNA revisado

Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de Replicação”

• Nos eucariontes, a replicação requer “múltiplas origens”, devido ao tamanho de seu genoma. A replicação é bidirecional e, em ambas as fitas, simultânea.

• Este processo gera “bolhas de replicação”.

Page 48: DNA revisado

Região Gênica É a porção que codifica para um produto final,

que pode ser uma cadeia polipeptídica ou um RNA

O DNA é formado por 2 regiões:

Gênicas Intergênicas

Região IntergênicaÉ a porção regulatória,

que sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a transcrição

gênica, ou que é o ponto de início para a

replicação do DNA

Intergênicas Gênicas

Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA

Page 49: DNA revisado

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

Os mecanismos celulares responsáveis pela replicação do DNA foram descobertos primeiramente em bactérias.

A replicação em eucariotos ocorre através de proteínas análogas e com processos semelhantes à replicação do DNA de E. coli

Page 50: DNA revisado

1. DNA Polimerases

2. Endonucleases

3. Helicases

4. Topoisomerases

5. Primases

6. Telomerases

PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)

Page 51: DNA revisado

DNA POLIMERASE

• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA

• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente

• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radical hidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está se formando. Desta forma, as fitas só podem crescer no sentido 5’ 3’

Page 52: DNA revisado

DNA Polimerases

• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo

• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início – alongamento

• 3 tipos principais : I, II, III

I : importante no sistema de reparo

III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)

Page 53: DNA revisado

Adição de nucleotídeos

1

2

3

Page 54: DNA revisado

NUCLEASES

- Degradam o DNA, clivando-o em pedaços menores

1. EXONUCLEASES: clivam o DNA a partir do final da molécula

2. ENDONUCLEASES: clivam em qualquer local da molécula

Page 55: DNA revisado

OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO

HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula.

SSB (“single-strand-binding”) – ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.

PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNA utilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.

TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada.

Page 56: DNA revisado

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’

Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos

FITA “LEADING” – crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação

FITA “LAGGING” – crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação

Page 57: DNA revisado

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de um iniciador na fita molde 3’ 5’

FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir de múltiplos iniciadores

• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase.

• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.

•DNA polimerase remove o primer do RNA do fragmento adjacente e preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidos pela DNA ligase.

Page 58: DNA revisado

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

Page 59: DNA revisado

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua

Page 60: DNA revisado

TELOMERASE

• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades denominadas telômeros

• A síntese da fita “leading” continua até o término da fita molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na fita “lagging” não é digerida.

• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.

• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.

Page 61: DNA revisado

TELOMERASE

Page 62: DNA revisado

ESTÁGIOS DA REPLICAÇÃO

1. INICIAÇÃO

2. ALONGAMENTO

3. TERMINAÇÃO

Page 63: DNA revisado

1. INICIAÇÃO

ORIGEM DA REPLICAÇÃO – OriC :

- 245 pb ;

- 3 repetições de 13 pb;

- 4 repetições de 9 pb; (A=T)

Page 64: DNA revisado

2. ALONGAMENTO

Envolve duas operações distintas, mas relacionadas:

1. Síntese da fita líder

2. Síntese da fita tardia

Início comum na forquilha de replicação envolvendo:

- helicases

- topoisomerase

- DNA binding proteins

Page 65: DNA revisado
Page 66: DNA revisado

SÍNTESE DA FITA LÍDER

1. Síntese de um RNA primer pela primase na origem de replicação

2. Desoxirribunocleotídeos são adicionados pela DNA polimerase III continuamente a partir da forquilha de replicação

Page 67: DNA revisado

3. TERMINAÇÃO

-Procariotos: DNA circular, quando as duas forquilhas de replicação se encontram ela termina.

-Eucariotos: seqüências de nucleotídeos específicas no final dos cromossomos, incorporadas a telômeros.

Page 68: DNA revisado

REGULAÇÃO

-única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ;

-afetada pela metilação de DNA

-DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental

Page 69: DNA revisado

Gene

RNA polimerase

hnRNA

mRNA

Citoplasma

Transcrição

Processamento

Núcleo

Tradução

proteína

Page 70: DNA revisado

http://www.virtual.epm.br/cursos/biomol/replica/html/6.htm

http://www.johnkyrk.com/DNAreplication.html

Page 71: DNA revisado

Fim???

Page 72: DNA revisado

• 1985 – Alec Jeffreys1985 – Alec Jeffreys Fingerprint Fingerprint DNADNA

Page 73: DNA revisado

MedicinaDetecção do HIVDiagnóstico de DoençasPré-natal & Detecção de Portadores

IMPACTOIMPACTODADA

PCRPCR

Pesquisa Forense

ReuniõesSociais

Page 74: DNA revisado
Page 75: DNA revisado

223030 CópiasCópias223030 CópiasCópias

PCR !PCR !

1 original, 1X 1 original, 1X = 1 cópia= 1 cópia

1 original, 30X 1 original, 30X = 30 cópias= 30 cópias

Page 76: DNA revisado

Seqüência complementar 2

DNA dupla fita original

Primers Separação das duplas fitas e anelamento dos primers

primer 1primer 1

Extensão

40 vezes

Seqüência complementar 1

PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA - CÓPIADNA ORIGINAL

Page 77: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

• Genética de PopulaçõesGenética de Populações

Page 78: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

• Genética (hereditariedade): Genética (hereditariedade): Ciência da VariaçãoCiência da Variação

Page 79: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

• Genética HumanaGenética Humana Ciência da Variação Humana Ciência da Variação Humana

Page 80: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

• Genética MédicaGenética Médica Ciência da Variação Humana Ciência da Variação Humana

AnormalAnormal

Page 81: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

• Genética ClínicaGenética Clínica Ramo da Medicina voltado para Ramo da Medicina voltado para

as Pessoas e Famílias com as Pessoas e Famílias com Variação Anormal de Estrutura e Variação Anormal de Estrutura e

FunçãoFunção

Page 82: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

• Genética ClínicaGenética Clínica O paciente é um reflexo da O paciente é um reflexo da

família e da população à qual família e da população à qual pertence;pertence;

Page 83: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

• Genética MédicaGenética Médica# Diagnóstico;# Diagnóstico;

# Genótipos de outros membros da # Genótipos de outros membros da família;família;

# Avaliação dos riscos de # Avaliação dos riscos de recorrênciarecorrência

Page 84: DNA revisado

RFPRFPRFPRFPGenética MédicaGenética Médica

C itog en é tica C lín ica

C itog en é tica H u m an a

A con se lh am en to G en é tico

G en é tica C lín ica

G en é tica F orm a l

G en é tica M o lecu la r

G en é tica B ioq u ím ica

G en é tica

Page 85: DNA revisado

GenéticaGenética

TRANSMISSÃO DETRANSMISSÃO DECARACTERÍSTICASCARACTERÍSTICAS

VARIAÇÃO DASVARIAÇÃO DASCARACTERÍSTICASCARACTERÍSTICAS

Page 86: DNA revisado

Conceito:

A Genética de Populações é o estudo da distribuição dos genes nas populações e de como as freqüências dos genes e genótipos são mantidas ou alteradas

Page 87: DNA revisado

Genética de Populações

Fatores GenéticosMutaçãoReprodução

Fatores Ambientais e Sociais

SeleçãoMigração

Page 88: DNA revisado

http://ehp.niehs.nih.gov/txg/docs/2003/111-11/forum/atcgs.jpg?section=toxicogenomics

DIVERSIDADE GENÉTICA

EM POPULAÇÕES

HUMANAS

Page 89: DNA revisado
Page 90: DNA revisado

Natureza dos diferentes alelos;

Freqüências em muitos loci;

Variação entre grupos populacionais

Page 91: DNA revisado

Eletroforese de Hemoglobina

Page 92: DNA revisado

Southern blotting

Page 93: DNA revisado

RFLPs detectados por Southern blotting

Page 94: DNA revisado

Herança Codominante de um RFLP ligado ao X

Page 95: DNA revisado
Page 96: DNA revisado
Page 97: DNA revisado

Herança codominante de um polimorfismo do DNA autossômico hipervariável (VNTR).

Page 98: DNA revisado

Fingerprinting de DNA de gêmeos

Sonda que detecta polimorfismos de VNTRs em muitos loci

Southern blot.

Alec Jeffreys, (1985)Universidade de Leicester, UK

Page 99: DNA revisado
Page 100: DNA revisado
Page 101: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

FENÓTIPOS, GENÓTIPOS E FENÓTIPOS, GENÓTIPOS E FREQÜÊNCIAS GÊNICASFREQÜÊNCIAS GÊNICAS

Page 102: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

GENÓTIPOGENÓTIPOConstituição ou composição genética Constituição ou composição genética de um indivíduode um indivíduo

FENÓTIPOFENÓTIPOResultado observado da interação Resultado observado da interação do genótipo com fatores ambientaisdo genótipo com fatores ambientais

F = G + A

Page 103: DNA revisado

1. Obtenção das freqüências gênicas a partir das 1. Obtenção das freqüências gênicas a partir das freqüências genotípicasfreqüências genotípicas

Exemplo:Exemplo:

A Genética da Resistência ao Vírus da A Genética da Resistência ao Vírus da Imunodeficiência HumanaImunodeficiência Humana

Gene: Gene: CCR5CCR5

Page 104: DNA revisado

Albert’s Molecular Biology of the CellAlbert’s Molecular Biology of the Cell

Role of CCR5 in HIV infectionRole of CCR5 in HIV infection

Gene CCR5

Page 105: DNA revisado

Alelo CCR5 – codifica um receptor de citocina

Alelo ∆CCR5 – deleção de 32 pares de bases

Page 106: DNA revisado

CCR5/CCR5 647 .821

CCR5/CCR5 134 .168 CCR5 .906.906

CCR5/CCR5 7 .0108 CCR5

788 1

GenotypeGenotype # of people# of peopleObserved relativeObserved relativeGenotype freqGenotype freq AlleleAllele

Derived alleleDerived allelefreqfreq

Freq Freq CCR5CCR5 gene= 2(647) + (134) gene= 2(647) + (134)

2(788)2(788)= .906= .906

Determine frequency of the CCR5 geneDetermine frequency of the CCR5 gene

Total # of Total # of individualsindividuals

Page 107: DNA revisado

CCR5/CCR5 647 .821

CCR5/CCR5 134 .168 CCR5 .906.906

CCR5/CCR5 7 .0108 CCR5

788 1

GenotypeGenotype # of people# of peopleObserved relativeObserved relativeGenotype freqGenotype freq AlleleAllele

Derived alleleDerived allelefreqfreq

Freq Freq CCR5 CCR5 gene= 2(7) + (134)gene= 2(7) + (134)2(788)2(788)

= .094= .094

.094.094

1-.906 = .0941-.906 = .094

Page 108: DNA revisado

Freqüências Gênicas (Alélicas) Freqüências Gênicas (Alélicas) obtidas das obtidas das Freqüências Genotípicas.Freqüências Genotípicas.

Gene CCR5 – 0,906Gene CCR5 – 0,906

Gene ∆ CCR5 – 0,094Gene ∆ CCR5 – 0,094

Page 109: DNA revisado

2. Obtenção das freqüências genotípicas a partir das 2. Obtenção das freqüências genotípicas a partir das freqüências gênicas (alélicas)freqüências gênicas (alélicas)

Page 110: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

A Lei de Hardy-WeinbergA Lei de Hardy-Weinberg As freqüências gênicas e As freqüências gênicas e

genotípicas tendem a permanecer genotípicas tendem a permanecer em equilíbrio nas populações em em equilíbrio nas populações em panmixia e na ausência de panmixia e na ausência de fatores evolucionáriosfatores evolucionários

Page 111: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

panmixia – ocorrência de panmixia – ocorrência de casamentos ao acaso;casamentos ao acaso;

fatores evolucionários –fatores evolucionários – Mutação,Mutação, Seleção Natural; Seleção Natural; Deriva Genética; Deriva Genética; Fluxo GênicoFluxo Gênico

Page 112: DNA revisado

p = freq. do alelo normal, A q = freq. do mutante, a

AA p2= freq. de não-portadores

Três genótipos:

Aa 2pq = freq. de portadores

aa q2 = freq. de afetados

Equilíbrio de Hardy Weinberg(p + q)2 =p2 + 2pq + q2 = 1

p+q=1p+q=1

Page 113: DNA revisado

1ª Propriedade da Lei de Hardy-Weinberg:As freqüências dos três genótipos, AA, Aa e aa são dadas pelos termos da expansão binomial de :

(p + q)2 =p2 + 2pq + q2 = 1

Page 114: DNA revisado

2ª Propriedade da Lei de Hardy-Weinberg:As proporções dos genótipos não mudam de geração para geração:

(p + q)2 =p2 + 2pq + q2 = 1

As freqüências genotípicas da população permanecerão constantes, em equilíbrio, se as freqüências alélicas p e q se mantiverem constantes

Page 115: DNA revisado

Frequências genotípicas após uma Frequências genotípicas após uma geração de acasalamento ao acasogeração de acasalamento ao acaso

A1(p) A2 (q) Total

A1 (p) p2A1A1 pqA1A2 p

A2 (q) pqA1A q2A2A2 q

Total p q 1

2

SPTZ

Óvulo

Page 116: DNA revisado

Demonstração que as freqüências alélicas Demonstração que as freqüências alélicas (gênicas) não se alteraram de uma (gênicas) não se alteraram de uma geração a outrageração a outra

Nos pais as freqüências alélicas eram p e q e na descendência:

p = p2A1A1+ pqA1A2 = p (p+q) = p

q = pqA1A2 + q2A2A2 = q (p+q) = q

Page 117: DNA revisado

Exemplo do gene CCR5Exemplo do gene CCR5

0,906 para o alelo normal CCR50,906 para o alelo normal CCR50,094 para o alelo ∆CCR50,094 para o alelo ∆CCR5

p2 = 0,906 x 0,906 = 0,821

q2 = 0,094 x 0,094 = 0,009

2pq = (0,906 x 0,094) + (0,094 x 0,906) = 0,170

Page 118: DNA revisado

CCR5/CCR5 647 .821

CCR5/CCR5 134 .168 CCR5 .906.906

CCR5/CCR5 7 .0108 CCR5

788 1

GenotypeGenotype # of people# of peopleObserved relativeObserved relativeGenotype freqGenotype freq AlleleAllele

Derived alleleDerived allelefreqfreq

Freq Freq CCR5CCR5 gene= 2(647) + (134) gene= 2(647) + (134)

2(788)2(788)= .906= .906

Determine frequency of the CCR5 geneDetermine frequency of the CCR5 gene

Total # of Total # of individualsindividuals

Page 119: DNA revisado

Se o locus tem 3 alelos, com freqüências p, q, r

A distribuição genotípica pode ser determinada

por:

(p + q +r)2

Page 120: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

Uso da Lei de Hardy-WeinbergUso da Lei de Hardy-Weinberg

A principal aplicação prática da Lei de Hardy-Weinberg em Genética Médica é na consulta genética para distúrbios autossômicos recessivos

Page 121: DNA revisado
Page 122: DNA revisado

Risco Populacional?

Usando a equação de Hardy-Weinberg

p2 + 2pq + q2 = 1

onde p = alelo normal q = alelo para a doençae considerando que p + q = 1

Page 123: DNA revisado

Exemplo de cálculo

• Doença está presente em 1/10,000 da população

Page 124: DNA revisado

Exemplo de cálculo

• Doença está presente em 1/10,000 da população

• q2 = 1/10,000 então q = 1/100

Page 125: DNA revisado

Exemplo de cálculo

• Doença está presente em 1/10,000 da população

• q2 = 1/10,000 então q = 1/100

• p = 99/100

Page 126: DNA revisado

Exemplo de cálculo

• Doença está presente em 1/10,000 da população

• q2 = 1/10,000 então q = 1/100

• p = 99/100

• 2 x p x q = 2 x 1 x 1/100

Page 127: DNA revisado

Exemplo de cálculo

• Doença está presente em 1/10,000 da população

• q2 = 1/10,000 então q = 1/100

• p = 99/100

• 2 x p x q = 2 x 1 x 1/100

• 2pq = 1/50

Page 128: DNA revisado

Exemplo de cálculo

• Doença está presente em 1/10,000 da população

• q2 = 1/10,000 então q = 1/100

• p = 99/100

• 2 x p x q = 2 x 1 x 1/100

• 2pq = 1/50

• 1/50 da população é portador do gene

Page 129: DNA revisado

(p(p22 ++ 2pq + 2pq + qq2 = 2 = 1)1)

Freqüência observada da doença Freqüência observada da doença recessiva na população érecessiva na população é qq22 (Fenilcetonúria - PKU (Fenilcetonúria - PKU = 1/10,000)= 1/10,000)

qq22 = 1/10,000= 1/10,000então: então: qq = 1/100 = 1/100 (não é a freqüência de (não é a freqüência de

portadores)portadores)

p + q = 1p + q = 1pp = 1 – q = 1 – 1/100 = 99/100 = 1 – q = 1 – 1/100 = 99/100

Page 130: DNA revisado

Freqüência de portadores (2pq)Freqüência de portadores (2pq)

2pq2pq = 2 (99/100 x 1/100)= 2 (99/100 x 1/100)

= 2(~1 x 1/100)= 2(~1 x 1/100)

= 2/100= 2/100

= 1/50= 1/50

Probabilidade de um casal vir a ter uma Probabilidade de um casal vir a ter uma criança com PKU ( qcriança com PKU ( q22) :) :

1/50 x 1/50 x ¼ = 1/10,0001/50 x 1/50 x ¼ = 1/10,000

Page 131: DNA revisado

SexSex PhenotypePhenotypeApproximateApproximateincidenceincidenceGenotypeGenotype

Genes and Genotype frequencies for X-linked disorders

Male X+ normal p = .92

Xcb Color blind q = .08

Female X+ X+ normal p2=.8464

X+ Xcb normal 2pq= .147

Xcb Xcb Color blind q2= .0064

Page 132: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

Fatores que perturbam o Fatores que perturbam o equilíbrio de Hardy-Weinbergequilíbrio de Hardy-Weinberg

Suposições:1. A população é grande e as reproduções são aleatórias com relação ao locus em questão

Page 133: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

Fatores que perturbam o Fatores que perturbam o equilíbrio de Hardy-Weinbergequilíbrio de Hardy-Weinberg

Exceções à Reprodução Aleatória:1. Estratificação;2. Casamento Preferencial;3. Consangüinidade

Page 134: DNA revisado

Inteligência normalInteligência normal

Page 135: DNA revisado

Heredograma hipotético mostrando o Coeficiente de Consanguinidade (r)

Page 136: DNA revisado

Heredograma hipotético mostrando o Coeficiente de Endocruzamento (f)

Page 137: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

Fatores que perturbam o Fatores que perturbam o equilíbrio de Hardy-Weinbergequilíbrio de Hardy-Weinberg

Suposições:2. As freqüências alélicas permanecem constantes com o tempo

Page 138: DNA revisado

RFPRFPRFPRFP

Fatores que perturbam o Fatores que perturbam o equilíbrio de Hardy-Weinbergequilíbrio de Hardy-Weinberg

Exceções à Constância das Freqüências Alélicas:

1. Mutação e Seleção;2. Deriva Genética;3. Fluxo Gênico

Page 139: DNA revisado

RFPRFPSistemas ABO e Sistemas ABO e MNMN

Page 140: DNA revisado
Page 141: DNA revisado

RFPRFPPROBLEMAS ESPECIAIS DE IDENTIFICAÇÃOPROBLEMAS ESPECIAIS DE IDENTIFICAÇÃO

Page 142: DNA revisado

RFPRFPPROBLEMAS ESPECIAIS DE IDENTIFICAÇÃOPROBLEMAS ESPECIAIS DE IDENTIFICAÇÃO

Page 143: DNA revisado
Page 144: DNA revisado
Page 145: DNA revisado
Page 146: DNA revisado

ALELOS DETECTADOS – DNA – PCR/STR – 04F07158

R. F. Pilotto (2004)

Marcadores VALMOR ARMANDOCromossomo YDYS391 11 11DYS389I 13 13DYS439 12 12DYS389II 30 30DYS438 12 12DYS437 15 15DYS19 14 14DYS392 13 13DYS393 12 12DYS390 24 24DYS385 11 / 14 11 / 14

Compatível com uma mesma linhagem patrilínea.

Page 147: DNA revisado

ALELOS DETECTADOS – DNA – PCR/STR – 04F07158

MarcadorGenético

LocalizaçãoCromossômica

Posição dos Alelos

FREQ PIM C AF

D8S1179 (8) 12,0 e 14,0 13,0 e 14,0 13,0 e 14,0 28,50% 1,7544

D21S11 (21) 30,0 e 33,2 31,0 e 33,2 29,0 e 30,0 00,00% EXCLUI

D7S820 (7q11.21-22) 10,0 e 12,0 8,0 e 10,0 8,0 e 10,0 16,20% 3,0864

CSF1PO (5q33.3-34) 12,0 e 12,0 12,0 e 12,0 12,0 e 12,0 32,60% 3,0675

D3S1358 (3p) 17,0 e 17,0 15,0 e 17,0 15,0 e 16,0 29,20% 1,7123

TH01 (11p15.5) 9,3 e 9,3 9,0 e 9,3 6,0 e 6,0 00,00% EXCLUI

D13S317 (13q22-31) 9,0 e 10,0 9,0 e 11,0 11,0 e 11,0 29,80% 3,3557

D16S539 (16q24-qter) 8,0 e 10,0 8,0 e 12,0 11,0 e 12,0 25,00% 2,0000

D2S1338 (2q35-37.1) 20,0 e 24,0 20,0 e 23,0 17,0 e 17,0 00,00% EXCLUI

D19S433 (19q12-13.1) 12,0 e 15,2 12,0 e 14,0 13,0 e 13,0 00,00% EXCLUI

vWA (12p12p-ter) 17,0 e 18,0 17,0 e 18,0 14,0 e 17,0 27,40% 1,8248

TPOX (2p23-2per) 8,0 e 10,0 9,0 e 10,0 8,0 e 12,0 00,00% EXCLUI

D18S51 (18q21.3) 14,0 e 17,0 12,0 e 14,0 12,0 e 14,0 13,30% 3,7594

AMELOGENINA X / Y XX XY XY - -

D5S818 (5q21-31) 10,0 e 13,0 10,0 e 12,0 11,0 e 12,0 36,90% 1,3550

FGA (4q28) 20,0 e 24,0 20,0 e 24,0 24,0 e 24,0 15,00% 3,3333

ÍNDICE DE PATERNIDADE ACUMULADO: NIHILPROBABILIDADE DE PATERNIDADE: NIHIL

CAPACIDADE DE EFICIÊNCIA DOS MARCADORES: EXCLUSÃORESULTADO: NEGATIVO - EXCLUSÃO DA IMPUTADA

PATERNIDADERui Fernando Pilotto

(2004)

Page 148: DNA revisado

Locus do DNA Irma Valmor Armando FREQ. % IND. PAT.

D1S7 7,48 10,18 10,18 2,00 não

(MS1)1 6,06 7,48 5,40   aplicável

D2S44 1,74 1,51 3,53 2,00 não

(YNH24)2 1,51 1,22 1,22   aplicável

D4S163 7,48 7,48 5,75   Exclusão

(SLI604)1 4,48 4,30 1,98    

D5S110 5,66 3,96 3,11   Exclusão

(LH1)2 2,70 2,70 2,54    

D6S132 4,45 3,69 2,86   Exclusão

(SLI1090)2 3,69 3,14 1,88    

D7S467 4,50 4,50 4,83 8,27 não

(SLI989)1 4,50* 2,23 2,23   aplicável

D10S28 3,95 2,02 3,60 8,27 não

(TBQ7)1 2,02 1,79 1,79   aplicável

D17S79 1,52 1,52 1,30 2,00 não

(V1)1 1,30 0,80 0,80   aplicável

Page 149: DNA revisado

Parentes em Primeiro Grau

50% 50%

100% 50%

Page 150: DNA revisado

Parentes em Segundo Grau

25%

25%

25%

Page 151: DNA revisado

Parentes em Terceiro Grau

12.5%

Page 152: DNA revisado

Genetic Drift: founder effect among the Amish Genetic Drift: founder effect among the Amish

Ellis-van Creveld syndrome:.

Short rib, heart malformation and polydachtyly

Page 153: DNA revisado

Sickle cell disease: ex of deviation from H-WSickle cell disease: ex of deviation from H-Wbecause of Heterozygote Advantagebecause of Heterozygote Advantage

Actual Genotypes of 12,387 West Africans: Actual Genotypes of 12,387 West Africans: A/A-9365A/A-9365A/S-2993A/S-2993S/S-29S/S-29

p of A= 2(9365) + 2993 = .877p of A= 2(9365) + 2993 = .877

2(12,387)2(12,387)

q of S= 2(29) + 2993 = .123q of S= 2(29) + 2993 = .123

2(12,387)2(12,387)

HW: p2 + 2pq + q2 = 1 p2 = (.877)2x 12387=95272pq=2(.877)(.123)12387=2672q2 = (.123)2x 12387=188

Page 154: DNA revisado

Risk AssessmentRisk Assessment

2/3 x 1/22 x 1/4 =.0075= 0.75%2/3 x 1/22 x 1/4 =.0075= 0.75%

Page 155: DNA revisado

3 Basic principles necessary for risk calculation3 Basic principles necessary for risk calculation

1.1. Law of Addition--either/or rule.Law of Addition--either/or rule.the probability of 2 mutually exclusive events occurringthe probability of 2 mutually exclusive events occurringis the sum of their individual probabilitiesis the sum of their individual probabilities

One Coin TossOne Coin Toss

1/2

OR

1/2

+

Page 156: DNA revisado

3 Basic principles necessary for risk calculation3 Basic principles necessary for risk calculation

1.1. Law of Addition--either/or rule.Law of Addition--either/or rule.the probability of 2 mutually exclusive events occurringthe probability of 2 mutually exclusive events occurringis the sum of their individual probabilitiesis the sum of their individual probabilities

2.2. Law of Multiplication--and rule.Law of Multiplication--and rule.the probability of 2 independent events occurringthe probability of 2 independent events occurringis the product of their individual probabilitiesis the product of their individual probabilities

aaaa

AaAa AaAa

Page 157: DNA revisado

1/2 1/2 1/2X X

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

+

+

+

+

+

+

+

One Coin TossOne Coin Toss

1/2

1/2 1/2

OR

1/2

Two Coin TossesTwo Coin Tosses

1/4

1/4

1/4

1/4

++

++

++

Ad

d m

utu

ally exclusive p

rob

abilities

Ad

d m

utu

ally exclusive p

rob

abilitiesXX

Multiply independentMultiply independentprobabilitiesprobabilities

+

Three Coin TossesThree Coin Tosses

A simple exampleA simple example

Page 158: DNA revisado

3 Basic principles necessary for risk calculation3 Basic principles necessary for risk calculation

1.1. Law of Addition--either/or rule.Law of Addition--either/or rule.the probability of 2 mutually exclusive events occurringthe probability of 2 mutually exclusive events occurringis the sum of their individual probabilitiesis the sum of their individual probabilities

2.2. Law of Multiplication--and rule.Law of Multiplication--and rule.the probability of 2 independent events occurringthe probability of 2 independent events occurringis the product of their individual probabilitiesis the product of their individual probabilities

3.3. Bayes Theorem-Bayes Theorem- a mathematical model for calculating a mathematical model for calculating recurrence risk based on genetics, pedigree, and test resultsrecurrence risk based on genetics, pedigree, and test resultsto determine the probability that an individual is at riskto determine the probability that an individual is at risk

Page 159: DNA revisado

xxxx xxhhYY

xxhhxx

Page 160: DNA revisado

Emery and Rimoin’s Medical GeneticsEmery and Rimoin’s Medical Genetics

xxhhxx xxxx

??

Application of Bayes Theorem has reduced the risk of III-5 being a carrier from 25 to 3%

Page 161: DNA revisado

Reduced penetrance: Reduced penetrance: retinoblastomaretinoblastoma

This man is This man is non-penetrantnon-penetrant

What is the probabilityWhat is the probabilitythat this man has the that this man has the mutation assuming 90%mutation assuming 90%penetrance?penetrance?

Page 162: DNA revisado

Step by step risk calculationStep by step risk calculation

What is the probabilityWhat is the probabilityhe has the mutation he has the mutation assuming 90% assuming 90% penetrance?penetrance?

inherits mutationinherits mutation inherits normal copy inherits normal copy

Shows Shows symptomssymptoms

Shows no Shows no symptomssymptoms

Shows no Shows no symptomssymptoms

50% 50% 50% 50%

100% 100% 10% 10%

45% 45% Total risk Total risk 5% 5% 50% 50%

90% 90%

0% 0% Adjusted risk Adjusted risk given that he shows given that he shows

no symptomsno symptoms

99% % 91% 91%

Page 163: DNA revisado

9%

What is the probabilitythat this man has the mutation assuming 90%penetrance?

What is the probability that he willhave an affected child?

9% x 1/2 x 90% = 4%

Reduced penetrance: Reduced penetrance: retinoblastomaretinoblastoma