biologia molecular 1... · estuda a composição, estrutura e interações de moléculas celulares...

BIOLOGIA MOLECULAR

João Carlos Bespalhok Filho

Professor Associado

DFF/UFPR

Definição

• Biologia Molecular é o campo da biologia que estuda a composição, estrutura e interações de moléculas celulares - tais como ácidos nucléicos e proteínas - que realizam os nucléicos e proteínas - que realizam os processos biológicos essenciais para as funções e manutenção da célula.

Esquema da relação entre a bioquímica (biochemistry), a genética (genetics) e a biologia molecular (molecular biology).

BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR

� Possibilita a manipulação de moléculas=> introdução de genes em um genoma receptor

Tecnologia do DNA recombinante

� Enzimas replicar, cortar e ligar o DNA

� Bases nitrogenadas

Tecnologia do DNA recombinante

Depende:

� Clivar DNA com enzimas de restrição

� Inserir DNA eucariótico em bactérias

� Determinar a sequência de um fragmento de DNA

DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE

Ferramenta permite:

� Determinar a sequência de um fragmento de DNA

� Amplificar e sintetizar DNA

� Recombinar fragmentos de DNA, etc.

� Isolar um gene em particular, parte de um gene ou umaregião do genoma;

�Produzir proteína de interesse em larga escala;

Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível

�Aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogaspara comercialização;

�Modificar organismos existentes para que expressem umacaracterística de interesse que não seja codificada pelogenoma = Transgênicos

• Plantas tolerantes à Doenças e a Pragas

• Feijão resistente ao vírus do mosaico dourado e Mamão papayaresistente ao vírus da mancha anelar

• Milho, algodão, soja (Bt) = resistentes ao ataque de insetos

• Plantas tolerantes à Herbicidas

• Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato

AGRICULTURAAGRICULTURA

• Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato

• Soja = tolerante ao 2,4-D

• Plantas tolerantes ao estresse ambiental (Seca, frio, calo r,salinidade e acidez)

• Cana-de açúcar tolerante à seca

• Plantas com melhorias nutricionais (vitaminas e aa)

• Arroz dourado (Golden rice), rico em betacaroteno, precursor da vitamina A - evitar a cegueira noturna e desnutrição

ÁCIDOS NUCLEICOS E SUAS PROPRIEDADES

DNA, RNA

GENEGENE

GENEGENE

Sequência ordenada de nucleotídeos – DNA

Conceito:

Expressão

Codifica um produto funcional (proteína ou molécula de RNA)

� Perpetuada através da Replicação do DNA

� Expressa através de dois processos:

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULARDOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

A informação genética:

(Ácido nucleico)

Transcrição e Tradução

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULARDOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

DNA DNA

Transcrição

Replicação

TranscriçãoReversa

RNA

PROTEÍNA

Tradução

DNA E RNA: ÁCIDOS NUCLEICOSDNA E RNA: ÁCIDOS NUCLEICOS

NUCLEOTÍDEOComposição química:

FOSFATOFOSFATO

� RNA e DNA

Nucleotídeo

55

PENTOSES

AÇÚCARAÇÚCAR

DNA: Desoxirribose RNA: Ribose

PURINASBicíclicas

Bases Púricas e Pirimídicas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos

BASES NITROGENADASBASES NITROGENADAS

PIRIMIDINASMonocíclicas

Adenina Guanina

Citosina Uracila Timina

BASES NITROGENADASBASES NITROGENADAS

A C G TDNA

RNA A C G U

PAREAMENTOSA T

C G

A U

_

___

_

__

DNA : DNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOSPOLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS

NUCLEOTÍDEOS

HO

fosf

odié

ster

Filamento de nucleotídeos

5’

3’

5’

HO3’

Liga

ção

fosf

odié

ster

3’

3’HO

HO3’

5’

5’

DNA : DNA : ESTRUTURAESTRUTURA

A = T 2 pontes H

2 Fitas de nucleotídeosEstrutura Plana

Complementares e Invertidas

A = T

G C 3 pontes H

DNA: estrutura tridimensional

� Duas fitas enroladas, complementares entre si e

invertidas

� Cada fita: composta por uma sequência linear de

Extremidade 5’ = Fosfato (PO 4)

� Cada fita: composta por uma sequência linear de

nucleotídeos

� Estrutura Helicoidal em dupla hélice

Extremidade 3’ = Hidroxila (HO)

Leitura e Escrita 5’ 3’

(Watson & Crick, 1953)

REPLICAÇÃO

� Replicação: capacidade do DNA de originar cópiasidênticas (auto duplicação)

COMO O DNA SE REPLICA ?COMO O DNA SE REPLICA ?

O processo é dividido em 3 etapas:

Etapa Enzima Função

Desenrola as duas hélices e rompe as pontes de 1ª DNA Helicase

Desenrola as duas hélices e rompe as pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos => separa fitas

2ª DNA Polimerase Encaixa os nucleotídeos na fita molde

3ª DNA LigaseRealiza a ligação dos nucleotídeos (fragmentos de Okasaki)

Primase (RNA polimerase) : confecção de primers para que a DNA polimerase inicie a síntese

DNA : DNA : DUPLICAÇÃODUPLICAÇÃO

DNA polimerase: requer primers para iniciar a síntese (5’-3’)

Fita contínua Helicase

Origem de Replicação: regiões ricas em AT = início da replicação

Fita descontínua

DNA Ligase

Primers

DNA polimerase

Forquilha de replicação

(Primase)

DNA : DNA : DUPLICAÇÃODUPLICAÇÃO

Semiconservativa

TRANSCRIÇÃO

RNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS

1. DNA se abre: RNA polimerase (bolha de transcrição )

2. Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e uracila)

na fita molde de DNA

TRANSCRIÇÃO: DNA => RNATRANSCRIÇÃO: DNA => RNA

na fita molde de DNA

3. RNA pronto se solta e migra para o citoplasma

4. DNA se recompõe

RNA : RNA : ESTRUTURAESTRUTURA

Bolha de Transcrição

RNA polimerase : não necessita primers, abre e renatura o DNA

� DNA se abre� Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e

uracila) na fita molde de DNA� RNA pronto se solta e migra para o

citoplasma� DNA se recompõe

TRANSCRIÇÃOTRANSCRIÇÃO

• Enzima responsável: RNA polimerase

• Início da Transcrição : Região Promotora⇒ pequena sequência de nucleotídeos reconhecida pelaRNA polimerase como ponto onde deve se ligar ao DNA

Exemplos promotores :Exemplos promotores :Região TATA box => -10: 5’-TATAAT- 3’

=> -35: 5’-TTGACA- 3’

Término da Transcrição:

TRANSCRIÇÃOTRANSCRIÇÃO

RNA polimerase encontra um Terminador

• Sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase

• Região com pares consecutivos de A/U

• Região rica em G+C (dependente de proteína)

O complexo de transcrição se dissocia

e há liberação da molécula de RNA


RNA: Uma fita simples de nucleotídeos


• Fita simples (única), helicoidal• Regiões complementares• Formando grampos e alças

• RNA mensageiro (mRNA) => informação genética para asequência de aminoácidos das proteína

• RNA ribossômico (rRNA) => constituinte dos ribossomos

TIPOS TIPOS DEDE RNARNA

• RNA transportador (tRNA) => identifica e transporta osaminoácidos até os ribossomos

TRADUÇÃO

TRADUÇÃOTRADUÇÃO

Síntese de proteínas

Converte trincas de nt RNA => Aminoácidos => Proteína

• Local : Ribossomos (citoplasma)• Local : Ribossomos (citoplasma)

• Início da Tradução: Códon de iniciação=> AUG (Metionina)

• Término da Tradução: Códon de terminação=> Não codifica aminoácido

Ex: UGA, UAG, UAA

TRADUÇÃOTRADUÇÃO

PROPRIEDADES DO DNA

PROPRIEDADES DO DNAPROPRIEDADES DO DNA

• DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênioentre as cadeias complementares do DNA

• RENATURAÇÃO → reanelamento das pontes de hidrogênioentre as cadeias complementares do DNA

=> Fenômenos físicos fundamentais para os processosde replicação e transcrição

Esses processos podem ser realizados in vitro

A Desnaturação pode ser obtida através de:

� Aumento de temperatura

� Agentes desnaturantes (formamida e dimetil-sulfóxido)

� Titulação com ácido ou base

MANIPULAÇÃO DO DNAMANIPULAÇÃO DO DNA

� Titulação com ácido ou base

Tm (°C) = 69,3 + 0,41 (GC%)

Temperatura média de fusão

A Renaturação pode ser obtida através de:

� Diminuição lenta de temperatura

Resfriamento abrupto: colapso do DNA


Resfriamento abrupto: colapso do DNA

T (anelamento) ( oC) = Tm – 25oC


Enzimas => replicar, cortar e ligar

� Replicação: DNA polimerase e helicase

� Transcrição: RNA polimerase

� Corte do DNA: Enzimas de Restrição� Corte do DNA: Enzimas de Restrição

� Ligação de DNA: DNA-ligases

Tornou possível transferir sequências específicas de DNA de uma molécula para outra

Acesso a vários tipos de enzimas:


Enzimas de Restrição

Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA

• Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivarmoléculas de DNA exógeno)moléculas de DNA exógeno)

• Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA

• Reconhecem sequências de 4 a 8 nt

• Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster

ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas:

Denominação Origem Sequência de Reconhecimento

� Abreviação de 3 letras do nome da espécie

� Seguida da designação da linhagem

� Número Romano: se mais de uma enzima é produzida


5’...

...5’

...3’

3’...

Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’

5’...

3’... ...5’

...3’

Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta)


Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com extremidades coesivas > eficiência de ligação

Isoesquisômeros:


Enzimas provenientes de organismos diferentes quereconhecem e cortam a mesma sequência de bases

ENZIMAS DE LIGAÇÃOENZIMAS DE LIGAÇÃO

� Restabelecem as ligações fosfodiéster entre osnucleotídeos (hidroxila 3’+ fosfato 5´)

� Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesmaenzima de restrição

O

Ex: T4 DNA ligase

DNA DNA3’ OH - O O 5’P

O

- O

DNA DNA3’ O O 5’

O

P

- O

+

DNA-LigaseATP ou NADDNA ligase

DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE

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