metabolismo do dna fidelidade da replicação regras fundamentais
TRANSCRIPT
1
Metabolismo do DNAMetabolismo do DNA
• Replicação do DNA
• fidelidade + velocidade
• Reparo
• múltiplos processos - resolução de injúrias
• Recombinação
• rearranjo da informação genética
Fidelidade da ReplicaFidelidade da Replicaççãoão
• Conceito de “molde”
• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.
• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.
Regras fundamentaisRegras fundamentais
• A replicação do DNA é semiconservativa
• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente
• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua
2
Watson & Crick
Meselsohn e Stahl,1958
.
A replicação do DNA ésemiconservativa
15N
15N + 14N
15N + 14N
14N
Regras fundamentaisRegras fundamentais
• A replicação do DNA é semiconservativa
• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente
• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua
OrigemOrigem de de replicareplicaççãoão
Fago λ• Seqüência nucleotídica
variável
• únicas X múltiplas
• múltiplas repetições curtas
• proteínas ligantes
(organização do sítio)
• ⇑ conteúdo AT
Características comuns
3
Regras fundamentaisRegras fundamentais
• A replicação do DNA é semiconservativa
• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente
• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua
SSííntesentese semi semi descontdescontíínuanua: : diredireççãoão 55’’ →→ 33’’
SSííntesentese de DNA: as DNA de DNA: as DNA PolimerasesPolimerases
A. Kornberg 1955: DNA polimeraseI
Requerimentos:
fita molde
iniciador (oligo 3’ OH livre)
4
DNA DNA PolPol I+ II e III: I+ II e III: pappapééisis definidosdefinidos
DNA Pol I -> 90% da atividade Polimerásica
Adição de nt ~20 x inferior ao movimento da forquilha
Processividade baixa
gene defectivo (DNA Pol I inativa) → linhagem viável (J. Cairns: 1969)
DNA polimerase II: reparo
DNA DNA polimerasepolimerase III: III: replicareplicaççãoão
A A precisãoprecisão do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
• E. coli = 1 erro / 109-1010 nucleotídeos adicionados
• DNA polimerases: 1 erro / 104-105
• Erro in vivo: +++ mecanismos enzimáticos
• Atividade exonucleásica 3’→ 5’ = prova de leitura
• Outros sistemas de reparo
↓
1 erro/104-105
PolimerizaPolimerizaççãoão && DNA DNA PolimerasePolimerase
fita molde
fita nova
5
DNA DNA polimerasespolimerases I, II, IIII, II, III
GENEESTRUTURAL
POL A POL B POL C
SUBUNIDADES 1 >4 >103’→5’ EXON. SIM SIM SIM
5’→3’ EXON. SIM NÃO NÃO
NT+/SEGUNDO
16-20 ~7 250-1000
PROCESSIVI// 3-200 >10.000 > 500.000
EmpacotamentoEmpacotamento X X precisãoprecisão funcionalfuncional
Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers
CompactaCompactaççãoão ddo DNA o DNA GenômicoGenômico
Precisão e dinâmica:replicação e transcrição
Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers
6
NemNem ssóó de DNA de DNA polimerasepolimerase vive a vive a ssííntesentese de DNA. . .de DNA. . .
• Catálise: + um nucleosídeo (5’-PO) ao 3’OH livre da cadeia
“Toda” DNA polimerase necessita da presença de um iniciador
para catalisar a + de nucleotídeos
• A dupla fita é antiparalela (polaridade química)
• As DNA polimerases não desespiralizam o DNA
MaquinariaMaquinaria: DNA: DNA replicase/replissomoreplicase/replissomo
Separação das Fitas: Helicases
Estresse Topológico: Topoisomerases
Manutenção da “bolha”: SSB
Adição de Iniciadores: Primases
Retirada de Oligo-RNA: Polimerase I
Resolução dos “Nicks”: DNA Ligase
EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
IniciaIniciaççãoão
Elongação
Terminação
7
IniciaIniciaççãoão
Estágio que
controla a replicação
IniciaIniciaççãoãoDNA molde superespiralado
OriC
Tetrâmeros de DnaA+ sítios de ligação
Monômeros DnaA = + sítios de ligação
Monômeros de DnaAenrolados sobre OriC
DnaA: 20 a 40 monômeros
Complexo Inicial
Hexâmeros de DnaB e C
Subunidades de DnaC
Complexo Aberto
Região OriC aberta
Ligação de SSB às regiões fita simples
Complexo de pré iniciação
“liberação” da região com DnaA associada
Região OriC aberta
Iniciação e replicação
Sítio Replicador:3 x 13nt – GATCTNTTNTTTT4 x 9nt – TTATCCACA
IniciaIniciaççãoão
Estágio que controlaa replicação
8
EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
Iniciação
ElongaElongaççãoão
Terminação
Duas operações similares
Dois mecanismos distintos
fita líder (contínua)
fita lerda ou atrasada (descontínua)
Enzimas necessárias: DNA helicase, DNA topoisomerase,
SSB, primase, etc...
ElongaElongaççãoão
ElongaElongaççãoão
9
ElongaElongaççãoão: : SSííntesentese dada fitafita atrasadaatrasada
ligase
DNA pol III +
DNA pol I
DNA pol III +
DNA pol I
primase(iniciase)
ElongaElongaççãoão
http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp11/1102003.html
http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0
DNA DNA polimerasepolimerase II
Atividade exonucleásica 5’-3’
Síntese da fita lerda
10
EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
Iniciação
Elongação
TerminaTerminaççãoão
Sítios TER (E. coli) + proteína TUS (Helicase impedida)
Separação das moléculas completas: Topoisomerase IV (tipo 2)
Partição das duas moléculas (?) mecanismo pouco conhecido
TerminaTerminaççãoão
CCéélulaslulas EucariEucarióóticasticas
Características gerais da replicação são as mesmas em pró e eucariotos.
Outras Proteínas/fatores, funções ≅ , complexidade ⇑
Mapeamento de diversas origens sugerem:
regiões permissivas para iniciação (bidirecional)
heterogeneidade em tamanho e comportamento
Mamíferos: decisão sobre sítio de iniciação a cada fase S.
Seqüência X Estrutura
11
EucariotosEucariotos X X ProcariotosProcariotos
Diferença: cromossomos lineares.
Telômeros: estrutura especializada na extremidade dos
cromossomos lineares.
Repetições em Tandem: TxGy
Replicação
Replicação do DNA é semi-conservativa;
Campisi et al. Experimental Gerontology 2001; 36: 1619-1637
Síntese pela telomerase (Transcriptase reversa)
Perda de extremidades a cada divisão celular;
(humanos 50-150pb por divisão)
TelômeroTelômero e telomerasee telomerase
5’
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
E o cromossomo encurta progressivamente. . .
Falta molde na extremidade 3’ para síntese. . .
http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s
12
Telomerase
Transcriptase reversa
RNA (molde)
proteína
atividade células tumorais e germinativas
http://bioweb.wku.edu/courses/biol22000/13DNAreplication/Telomerase.html
Estrutura
LeBel, C. et al. J Cell Sci 2005;118: 2785-2788
Centrômero
Centrômero
TAS
TAS
T-loop
Humano
Camundongo
Griffith,JD. et al. Cell 1999; 97: 503-514
A replicação da extremidade gera 3’ fita simples – formação de estrutura de laço (T-loop);
TAS – seqüências associadas a telômeros
TelômeroTelômeross
FunçãoTelômeros são essenciais para a integridade do genoma
Protegem as regiões terminais de degradação
Distinguem a extremidade normal de região de dano
Organização funcional dos cromossomos no núcleo
Funciona como relógio molecular (replicações e senescência)
13
Estrutura: proteínas associadas
Rodier et al/The international Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005; 37:977-990
Tankirase- poly ADP-ribosilaseRMN- Complexo RAD50-MRE11-NSB1WRN- DNA helicase e exonuclease
TelômeroTelômeross