Replicação do DNA

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Mitose / Meiose

Como acontece a síntese do

DNA?

Meselson-Stahl experiment

• 1957

• Cresceram E. coli em meio com N-15 e depois voltaram pra N-14

• Purificação do DNA das bactérias

• Três tipos de DNA

– N-15 + N-15

– N-15 + N-14

– N-14 + N-14

• Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14

Replicação semi-conservativa

Origens de replicação

• Locais com um

contexto de

sequência específico

• Ligam proteínas

específicas

• Quando acionadas,

essas proteínas

permitem o início da

replicação

Origens de replicação

Replicação

• DNA Polimerase III

• Sentido 5’ → 3’

• Nucleotídeos 3P

são adicionados

– Liberação de

Pirofosfato

http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf

Primase

• Ribonucleoproteína

• Liga-se à helicase em procariotos formando o chamado primossomo

• Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH

• DNA polimerase lenta e sujeita a erros

• Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido

Micrografia, bolha de

replicação

Forquilhas de replicação

Forquilha de replicação

Replicação das fitas

• Fita líder

– Primase age uma vez

• Fita retardada

– Primase age várias vezes

– 1967, Fragmentos de OkasakiOkazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication

possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967

Jun;20(3):255-60

Primase na fita retardada

• Deslocamento da forquilha de replicação

• Primase faz primer

Direções de

replicação na Forquilha

Desenovelamento do DNA

• Retirada das histonas

• Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)

• DNA helicase

– Quebra pontes de H

• DNA topoisomerases

– Tiram a tensão

Forquilha de replicação

Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua)

DNA polimerase

• Enzimas que catalisa a reação de síntese do DNA

• Adiciona nucleotídeos tri-fosfato à extremidades 3’OH livre

• Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’)

• Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre)

• Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’)

Tipos de DNA polimerase

• DNA polimerase I

– Descoberta em 1956 (Kornberg pai)

– Função precisa descoberta apenas em 1969: remove

o primer de RNA da fita descontínua

• DNA polimerase III

– Descoberta em 1970 (Kornberg filho)

– Principal enzima que realiza a replicação em

procariotos

• DNA polimerase II

– Lenta, envolvida em reparo do DNA

DNA Replication

• DNA Pol precisa de um molde inicial

• Primase: gera um molde de RNA complementar

• A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH

Eliminação dos

fragmentos de Okasaki

DNA Pol I

Mecanismo da enzima Ligase

Visão geral

Repare na posição do primer de

RNA

Reparo pela

Polimerase

• Mecanismo de verificação

(Proof-reading)

• DNA-polimerase possui

– Uma atividade de

polimerização 5’→ 3’

– Uma atividade de

exonuclease 3’→ 5’

Reparo pela

Polimerase

• Mecanismo de verificação

(Proof-reading)

• DNA-polimerase possui

– Uma atividade de

polimerização 5’→ 3’

– Uma atividade de

exonuclease 3’→ 5’

DNA

Repair

• Checagem de

pareamento

incorreto

(eucariotos)

• Proteínas

especiais para

reparo do erro

E as extremidades dos cromossomos?

Doenças causadas por problemas

no mecanismos de replicação

• Ataxia de Friedreich's– dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares,

na fala e doenças no coração)

– forma mais comum das ataxias herdadas

– A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença.

• Xeroderma pigmentosum– envelhecimento precoce

– aumento na incidência de câncer

– Falha no mecanismo de reparaçãodo DNA causado pela luz UV

Ciclo celular

• A replicação do DNA é regulada temporalmente

• Fase S do ciclo celular

• Checkpoints do ciclo celular

• Ciclinas

Conclusões

• Replicação semi-conservativa

• Bolha de replicação avança em duas direções

• Fita líder e fita retardada

• Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA

• Primase faz o primer

• DNA polimerase III, DNA polimerase I

• DNA ligase

• Telomerase