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IFSC – Campus Lages

Prof. Silmar Primieri

Biologia Molecular

O que é Biologia Molecular?

Aplicabilidades da Biologia Molecular

• Genética do Câncer

• Doenças com herança complexa

• Preservação de espécies ameaçadas de extinção

• Taxonomia molecular

• Diagnóstico pré-implantacional de embriões

• Aconselhamento genético

• Genética Forense

• Controle biológico

• Transgênicos

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Descoberta do DNA

1860 – Miescher isolou uma substância nova de dentro das células, chamada nucleína.

1881 – Em 1881, Albrecht identificou a nucleina como um ácido nucleico. Ele também isolou os cinco nucleotídeos. adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracilo (U).

Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1910. 1900. O trabalho de Gregor Mendel foi redescoberto 1909 – Levine e Jacobs determinaram a organização

das moléculas que compõem o ácido nucléico

Descoberta do DNA

• Estrutura helicoidal do DNA

Na década de 40 os biofísicos utilizaram difração de raios X para determinar a estrutura do DNA.

DNA como material hereditário

Experiência de Avery-Macleod-McCarty ---- Frederick Griffith

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Experiência de Avery-Macleod-McCarty ---- Frederick Griffith

DNA

DNA

DNA – ácido desoxirribonucléico.

O DNA é o material genético dos organismos vivos e muitos vírus (alguns vírus utilizam o RNA como material genético).

O DNA é uma molécula simples que consiste de uma cadeia polinucleotídica na forma de dupla hélice.

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Nucleotídeos

Base Nitrogenada

Fosfato

Desoxirribose

Adenina Guanina

Bases púricas

Bases pirimídicas

Citosina Timina Uracila

Do que é formado o DNA?

PENTOSES

Nucleotídeos

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Ligação fosfodiéster

Ocorre entre o fosfato do carbono 5 da pentose de um nucleotídeo e a hidroxila do carbono 3 da pentose do nucleotídeo seguinte

Como os nucleotídeos de ligam entre si?

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Cinco tipos: Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila.

Adenina e Guanina: Duplo anel de átomos de carbono (anéis aromáticos); chamadas de purinas ou bases púricas.

Citosina, Timina e Uracila: Um anel de carbono; chamadas pirimidinas ou bases pirimídicas.

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS

NUCLÉICOS - NUCLEOTÍDEOS

DNA: Adenina – Timina; Citosina – Guanina RNA: Adenina – Uracila; Citosina - Guanina

Duas fitas se enrolam em torno de um eixo imaginário;

Desoxirriboses ficam externas (expostas ao meio aquoso) e bases ficam internas (anéis são hidrofóbicos);

Fitas em direções opostas: 5’-3’ e 3’-5’ = FITAS ANTIPARALELAS;

As bases ficam pareadas entre as duas fitas, mantendo a estrutura da molécula.

DUPLA HÉLICE DO DNA

O DNA É UMA DUPLA HÉLICE

Em 1953 Watson & Crick demonstram que o DNA é uma dupla hélice, com as cadeias de DNA em orientação antiparalela, com as bases emparelhadas:

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A ligação feita por pontes de hidrogênio:

Timina (T) liga-se à Adenina (A) - duas pontes de hidrogênio;

Citosina (C) liga-se à Guanina (G) - três pontes de hidrogênio.

LIGAÇÃO ENTRE BASES NITROGENADAS

Tais pontes de hidrogênio são formadas em decorrência da presença de grupos ceto (C=O) e amino (C-NH2) nas bases;

T e U A

ceto amino

G C grupo ceto grupo ceto

e amino e amino

LIGAÇÃO ENTRE BASES NITROGENADAS

Pareamento entre as fitas de

DNA

Na molécula de DNA o pareamento das fitas é antiparalelo (esquema ao lado) 3' – 5' / 5' – 3'

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Pontes de hidrogênio

Se uma sequência de uma fita de polinucleotídeos fosse AATCCATGT, qual seria o filamento complementar?

Questão

São processos importantíssimos para a replicação, recombinação e transcrição do material genético;

Desnaturação: pontes de hidrogênio entre as fitas complementares são rompidas;

Renaturação: inverso da desnaturação.

DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO

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Pode ocorrer por aumento de temperatura, tratamento com ácidos ou bases, agentes desnaturantes e concentração de sal;

Pareamento entre as bases não apresenta a mesma estabilidade – separação de GC exige temperaturas mais altas, ou concentração de agentes desnaturantes, devido à diferenças do número de pontes de hidrogênio.

DESNATURAÇÃO

Tm: Temperatura na qual 50% do DNA encontra-se desnaturado;

A Tm depende da proporção de bases AT em relação à GC;

[ ] GC Temperatura Tm

DESNATURAÇÃO

Ocorre através do resfriamento;

O anelamento ocorre a uma temperatura de 25ºC abaixo da Tm;

À medida que algumas bases se associam, a velocidade de renaturação aumenta;

Caso ocorra um resfriamento abrupto, as fitas de DNA podem colapsar e não renaturar.

RENATURAÇÃO

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A velocidade de renaturação do genoma

depende do seu tamanho e

da sua complexidade

RENATURAÇÃO

TIPOS DE DNA

Sintético

Oligonucleotídeos: sequências curtas e pré-determinadas de DNA sintético;

Fisiológicos (in vivo)

Tipo B, A e Z: Diferem quanto à conformação e podem facilitar ou dificultar a interação da molécula com proteínas.

Polímero linear de nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster 5’3’;

Ribose - açúcar presente;

Timina (T) é substituída pela Uracila (U);

Normalmente fita simples, embora possa apresentar pareamento intracadeia (estrutura similar ao DNA tipo A);

Alguns vírus apresentam RNA fita dupla como genoma;

ESTRUTURA DO RNA

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mRNA (mensageiro): transfere a informação do DNA ao ribossomo para a síntese de proteínas;

rRNA (ribossomal): componente dos ribossomos. Representa 75% do RNA total da célula;

tRNA (transportador): carrega os resíduos de aminoácidos até os ribossomos para a síntese de proteínas.

TIPO DE RNA: LOCALIZAÇÃO E FUNÇÃO

mRNA

Replicação do DNA

• Todos os organismos devem duplicar o seu DNA com extrema precisão antes de cada divisão celular;

• Mecanismos básicos de replicação:

Separação das cadeias de DNA

Cópia de cada cadeia que serve como molde

Síntese da nova cadeia complementar

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Replicação do DNA

A replicação ou duplicação do DNA representa a transmissão fiel da informação hereditária

Tipos de replicação

8.13

Forquilha de Replicação Região do DNA onde ocorre a transição do

DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas

https://www.youtube.com/watch?v=27TxKoFU2Nw

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Replicon Unidade do DNA onde está ocorrendo um

evento de replicação Origem + Término Ativados apenas uma única vez em cada

ciclo celular O genoma de uma célula procariótica

possui um único replicon Cada cromossomo eucariótico possui

vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente

Existem origens de replicação

• Se a replicação começasse por um extremo da molécula de DNA e terminasse em outro, estima-se que seria necessário 1 mês para o cromossomo humano se replicar;

• No genoma procarioto existem uma origem de replicação; já em células eucariontes existem múltiplas origens de replicação.

• Em um cromossomo médio existem, pelo menos 200 origens de replicação;

• Unidades de replicação (replicons): início da replicação em várias origens ao longo do genoma.

Replicação é bidirecional

• Uma vez iniciada a replicação em cada ponto da origem ela se propaga para os dois lados da molécula de DNA até encontrar replicons vizinhos

• Replicação bidirecional envolve duas forquilhas de replicação que se locomovem em direções opostas.

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Replicon em célula procariótica

A velocidade da forquilha de replicação bacteriana é 50.000 pb/min

• Um única origem de replicação em E.coli

Replicon em genoma eucarioto

A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é 2.000 pb/min

Fase S do ciclo celular demora ~ 6hrs em uma

célula somática

Replicação é semidescontínua

• A polimerização dos desoxirribonucleotídeos na síntese do DNA acontece somente na direção 5’ 3’;

• Porém, as duas fitas são antiparalelas.... logo, como ambas as fitas podem ser sintetizadas simultaneamente???

• A cópia da cadeia parental 3’ 5’ pode ser sintetizada continuamente. Essa cadeia filha que avança na direção 5’ 3’ recebe o nome de cadeia líder ou cadeia contínua;

• A cadeia parental 5’ 3’ deve ser copiada de forma descontínua, a qual recebe o nome de cadeia retardatária, ou cadeia descontínua.

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Replicação é semidescontínua

• Os fragmentos da cadeia descontínua recebem o

nome de fragmentos de Okazaki;

• São cadeias curtas:

Procariontes: 1000-2000pb;

Eucariontes: 200-300pb.

Origens de replicação

• Locais com sequência específica fácil de separar

• Ligam proteínas iniciadoras

• Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação

Origens de replicação

Tendem a ser ativadas em grupo, formando unidades de replicação.

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Micrografia, bolha de replicação

Forquilhas de replicação

Primase

• Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases;

• DNA-polimerase adiciona os nucleotídeos iniciais na origem de replicação dos pequenos fragmentos de Okazaki;

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Replicação das fitas

• Fita líder

– Primase age uma vez

• Fita retardada

– Primase age várias vezes

– Fragmentos de Okasaki

Direções de replicação na Forquilha

Enzimas que promovem a quebra de ligações fosfodiéster;

As fitas de DNA podem, assim, passarem uma sobre a outra e alterarem o superenrolamento da molécula;

São importantes nos eventos de replicação, transcrição e recombinação;

Enzimas alvos de drogas antimicrobianas e anticancerígenas.

TOPOISOMERASES

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DNA polimerase

• Enzimas que catalisam a reação de síntese do DNA.

• Adiciona nucleotídeos tri-fosfato à extremidades 3’OH livre.

• Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’-3’.

• Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre).

• Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’-5’)

DNA-polimerases - Procariotos

Tipo Função

DNA Polimerase I Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’;

Atividade de exonuclease 3’5’

Remove o primer de RNA da fita descontínua.

DNA Polimerase II Polimerase alternativa de reparo.

DNA Polimerase III Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’. É a polimerase primária durante a replicação normal do DNA

DNA-polimerases - Eucariotos

Tipo Função

DNA Polimerase α (alfa) Replicação do cromossomo nuclear (fita descontínua)

DNA Polimerase δ (delta) Replicação do filamento contínuo do cromossomo nuclear

DNA Polimerase ε (épsilon) Reparo do DNA do cromossomo nuclear

DNA Polimerase β (beta) É pequena e atua no reparo de DNA

DNA Polimerase γ (gama) Replicação de DNA mitocondrial

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Forquilha de replicação

Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua)

A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA

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A DNA ligase une os pedaços quebrados de DNA, catalisando a formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 5’ com a 3’ adjacente.

Fita contínua

Fita descontínua

Síntese da Fita descontínua

Síntese da Fita Contínua

Reparo pela Polimerase

• Mecanismo de verificação (Proof-reading)

• DNA-polimerase possui

– Uma atividade de polimerização 5’→ 3’

– Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’

DNA Repair

• Checagem de pareamento incorreto (eucariotos)

• Proteínas especiais para reparo do erro

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Doenças causadas por problemas no mecanismos de

replicação Ataxia de Friedreich's

dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares, na fala e doenças no coração)

forma mais comum das ataxias herdadas

A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença.

Xeroderma pigmentosum

envelhecimento precoce

aumento na incidência de câncer

Falha no mecanismo de reparação do DNA causado pela luz UV

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Síndrome de Werner

Envelhecimento precoce, incluindo rugas, cataratas, osteoporose, cabelos grisalhos e doenças cardiovasculares.

Telômeros mais curtos.

Doenças causadas por problemas no mecanismos de

replicação

Conclusões

• Replicação semi-conservativa

• Bolha de replicação avança em duas direções

• Fita líder e fita retardada

• Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA

• Primase faz o primer

• DNA polimerase III, DNA polimerase I

• DNA ligase

• Telomerase