Tecnologia do DNA Recombinante & Aplicações

Identificação Genética - Fingerprinting

Complementaridade de Cadeias

Tm

Estringência

Clonagem

Inserto

Amplicação do Clone em Bactéria

Utilizações do DNA Clonado

Utilizações do DNA Clonado

Retrotranscrição

Vetor & Inserto

Enzimas de Restrição

4 bases

Corte & Ligação

Vetores• Plasmídios

– Pequenos fragmentos circulares de DNA– Replicação independente do DNA bacteriano– Presença ou ausência dentro da bactéria– Quantidade variável– Resistência a drogas e outras características– Bom método para amplificar o DNA clonado– Fragmentos clonáveis até 20kb– Fragmentos grandes são perdidos– Plasmídios clássicos

• pBR322• pUC18

Modos de introdução de DNA recombinante em bactérias.

Vetores: pBR322 & pUC18

Seleção de vetores com clone

polylinker

Vetores

• Fago Lambda– Acomoda um total de 45-50kb– Inserto de cerca de 15kb– DNA automaticamente embalado em

partícula infectante

• Fagos Unifilamentares– DNA unifilamentar é convertido dentro da

bactéria para replicação– Facilidade para sequênciamento dos clones

Fago Lambda

Detecção de Gene de Interesse – Plaqueamento de Fagos

Uso de sondas de DNA e RNA para identificar o clone portador do gene de interesse.

Vetores

• Cosmídios– Híbridos de fago e plasmídio– Replicação em bactérias ou embalados

como fagos– Sequências virais eliminadas permitindo

introdução de DNA exógeno de até 45kb entre os sítios cos

– Partícula viral penetra na bactéria, mas não tem potencial replicativo

Vetores de Grande Porte

• BAC: Bacterial Artificial Chromosome– Cromossomo Artificial de Bactéria– Inserto médio de 150kb– Inserto máximo de 400kb– Se replica como um plasmídio dentro da

bactéria– Utilizado amplamento pelo Projeto

Genoma

Vetores de Grande Porte

• Cromossomo Artificial de Levedura– Se comporta como um pequeno

cromossomo que se replica dentro do eucarionte e carrega seu DNA de interesse

– Tamanho médio do inserto: 500Kb– Tamanho máximo do inserto: 1Mb– Contém todas os elementos necessários

para se replicar e segregar dentro da levedura

Cromossomo Artificial de Levedura

Introdução de DNA Exógeno

DNA Shotgun

Polimerase Chain Reaction - PCR

Gel de Agarose

Southern e Northern Blots

Mapas de Restrição - RFLP

Sequenciamento Capilar - Eletroferograma

Manipulação em Cultura de Células e Semeadura

Produção de Camundongos Transgênicos

Transgênico para Hormônio do Crescimento

Diagnóstico Pré-Natal