producción de la enzima recombinante n-acetilgalactosamina
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Producción de la enzima recombinante N-acetilgalactosamina-6-
sulfato sulfatasa sin péptido señal (GALNSNSP) en Pichia pastoris
mediante coexpresión con el gen SUMF1
Andrea Leonor Pardo Diazgranados
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
INSTITUTO DE ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO
EXPRESION DE PROTEINAS
BOGOTÁ D.C.
2013
2
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos
por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no
se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y
porque las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien, se vean en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia”
3
AGRADECIMIENTOS
A Dios por guiar cada uno de mis pasos para terminar una etapa más en mi carrera y
darme la sabiduría en los momentos difíciles
A mis padres, hermana y demás personas por apoyarme ,por siempre estar ahí cuando
necesitaba motivación para seguir con este proyecto ,por sacar lo mejor de mí siempre.
Al grupo IEEM por darme la posibilidad de aprender cada día más en la realización de
este proyecto
Al Profesor Carlos Javier y al profesor Alexander que siempre estuvieron de la mano con
el proyecto con la mejor actitud a pesar de los momentos difíciles y de los impases del
día a día
A Joko, Dennise por aportar con su experiencia a este proyecto y por toda su paciencia ,y
colaboración a pesar de los errores cometidos en este proceso
A todos los chicos de semillero por todos los momentos de alegría y buena energía que
me dieron en este tiempo
4
CONTENIDO
1. RESUMEN………………………………………………………………………………..11
2. INTRODUCCION………………………………………………………………………..12
3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………..…13
4. MARCO TEÓRICO- REFERENTES CONCEPTUALES
4.1. Mucopolisacaridosis (MPS)……………………………………………………..…14
4.2. Enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS)………………...…14
4.3. Gen GALNS y GEN SUMF1………………………………………………………..15
4.4. Enfermedad de Morquio A………………………………………………………….15
4.5. Tratamiento-Terapia de reemplazo Enzimático ………………………………...15
4.6. P. pastoris……………………………………………………………………………16
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo general……………………………………………………………………..18
5.2. Objetivos específicos. ……………………………………………………………..18
6. METODOLOGÍA
6.1. Evaluación de los clones de Pichia pastoris GS115 co-transformados con los
plásmidos pPIC9-GALNSnsp y pPIC9-SUMF1.
6.1.1. Obtención de los clones de P. pastoris pPIC9 –GALNSnsp /SUMF1 P.
pastoris……………………………………………………………………………….|19
6.1.2. Confirmación de la Inserción del gen GALNS y SUMF1 ….…………………....20
6.1.3. Determinación del fenotipo (Mut+/Mut s)……………………………………….….21
6.2. Evaluación de los clones a escala 10ml ………………………………………..21
6.3. Evaluación de los clones a escala 100ml ………………………………………..21
6.4. Evaluación de los clones a escala Biorreactor 1.65L …………………………..21
6.5. Determinación de biomasa ………………………………………………………..22
6.6. Determinación de Proteínas ……………………………………………….……..22
6.7. Determinación de Actividad enzimática …………………….…………………..22
7. RESULTADOS
5
7.1. Evaluación de los clones de Pichia pastoris GS115 co-transformados con los
plásmidos pPIC9-GALNSnsp y pPIC9-SUMF1.
7.1.1. Confirmación de la Inserción del Gen GALNS y SUMF………………………..23
7.1.2. Determinación del fenotipo (Mut+/Mut s) ………………………………………..24
7.2. Evaluación a escala de 10 ml
7.2.1. Determinación del crecimiento celular y concentración de proteínas ………..25
7.2.2. Determinación de Actividad Enzimática……………………………………..…..25
7.3. Evaluación a escala de 100 ml.
7.3.1. Determinación del crecimiento celular y concentración de proteínas…………26
7.3.2. Determinación de Actividad Enzimática ………………………………….……..27
7.4. Evaluación a escala de Biorreactor 1.65 L
7.4.1. Determinación del crecimiento celular y concentración de proteínas…………28
7.4.2. Determinación de Actividad Enzimática ………..……………………………….29
7.4.3. Determinación de Parámetros …………………………………………….……..30
8. ANALISIS DE RESULTADOS………………………………………………………..31
9. CONCLUSIONES………………………………………………………………..……..33
10. RECOMENDACIONES……………………………………………….………………..34
11. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………..………………………..35
INDICE DE FIGURAS
6
Figura 1. PCR de confirmación de inserción de los genes ………………………………....23
Figura 2. Determinación del fenotipo MUT………………………………………………..…..24
Figura 3. Evaluación a escala 10 ml ……………………………………………………..…....25
Figura 4. Actividad enzimática a escala 10 ml…………………………………..…………....27
Figura 5. Evaluación a escala 100 ml ………………………………………………………....27
Figura 6. Actividad enzimática a escala 10 ml………………………………………………..28
Figura 7. Evaluación a escala 1,65 L ……………………………………………………..…..29
7
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de las mucopolisacaridosis …………………...………………………14
Tabla 2. Componentes de la PCR de para la confirmación de la inserción de los genes
GALNSnsp y SUMF1……………………………………………………………………………..20
Tabla 3. Condiciones de PCR para la confirmación de la inserción de los
clones………………………………………………………………………………………….…..20
Tabla 4: Parámetros cinéticos clon 2P1 escala de Biorreactor 1,65 L……………………30
Tabla 5: Parámetros cinéticos clon 1P2 escala de Biorreactor 1,65 L…………………..30
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INDICE DE ANEXOS
Anexo 1 .Protocolos
I. Extracción del DNA Genómico de P.pastoris ……………………38
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1. RESUMEN
La enfermedad de Morquio A (Mucopolisacaridosis IV A) es un error innato del
metabolismo caracterizado por la acumulación lisosomal de los glicosaminoglicanos
queratán sulfato y condroitin-6-sulfato debido a la deficiencia de la enzima N-
acetilgalactosamida-6-sulfato sulfatasa (GALNS). En la actualidad no se cuenta con un
tratamiento específico que controle en su totalidad los síntomas de esta enfermedad.
Dentro de los tratamientos posibles para esta enfermedad se encuentra la Terapia de
Reemplazo Enzimático, mediante el empleo de una enzima producida de forma
recombinante. Recientemente se ha demostrado la posibilidad de producir esta enzima en
la levadura metilotrófica Pichia pastoris, como una alternativa a la enzima que
actualmente se encuentra en estudios de fase clínica III producida en células de
mamífero. Sin embargo, con miras a la en evaluación preclínica y clínica de la enzima
producida en P. pastoris es necesario continuar incrementando los valores de actividad
enzimática. En este trabajo, se evaluó la coexpresión del gen de la enzima activadora de
sulfatasa (SUMF1) con el del gen de la enzima GALNS sin el péptido señal (GALNSnsp).
Dos estrategias de cotransformación fueron evaluadas. Los clones obtenidos fueron
confirmados mediante extracción de DNA genómico y PCR para los genes GALNS y
SUMF1. Los clones positivos para los dos genes fueron evaluados a escala de 10 ml, en
la cual la mayor actividad específica fue 0,24 U/mg a las 48h de inducción. Los tres
mejores clones fueron posteriormente evaluados a escala de 100ml mostrando valores de
actividades específicas entre 0,29 U/mg y 0,64 U/mg. Finalmente, dos clones fueron
evaluados a escala de 1,7 L obteniéndose actividades máximas de 0,17 y 0,28 U/mg. En
general, los valores obtenidos en este trabajo fueron más elevados que los reportados
previamente en ausencia de SUMF1, confirmando la ventaja de la coexpresión de este
gen y permitiendo continuar aumento los niveles de producción de GALNS con miras al
desarrollo de una terapia de reemplazo enzimático para la enfermedad de Morquio A.
10
2. INTRODUCCIÓN
La mucopolisacaridosis IV A, también llamada Enfermedad de Morquio A, es un error
innato del metabolismo que pertenece a las enfermedades de depósito lisosomal. Esta es
una enfermedad autosómica recesiva caracterizada por la acumulación lisosomal de los
glicosaminoglicanos queratán sulfafo (QS) y condroitín-6-sulfato (CS), debido a la
deficiencia de la enzima lisosomal N-acetilgalactosamida-6-sulfato sulfatasa (GALNS) (1).
En la actualidad no existe un tratamiento específico para el para el tratamiento de esta
enfermedad. Entre las diferentes opciones de tratamientos que se encuentran en
evaluación, la Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE) representa la principal y más
cercana opción de tratamiento. Esta consiste en la producción de la enzima que se
encuentra deficiente en los pacientes, mediante tecnología de ADN recombinante en
células de mamífero, plantas, insectos o en sistemas de expresión como E.coli o
P.pastoris para su posterior administración a los pacientes en forma intravenosa La TRE
para la enfermedad de Morquio A se encuentra en fase clínica III empleando una proteína
recombinante producida en células de mamífero (2). Aunque los ensayos preclínicos y los
primeros resultados de los ensayos clínicos han mostrado beneficios importantes en
algunas de las manifestaciones clínicas de la enfermedad, una vez sea aprobada la
terapia puede tener un costo aproximado de US$500.000 por paciente/año, lo cual se
encuentra asociado principalmente a los costos del sistema de producción (3,4).
Desde su comienzo, el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha empleado E. coli y
Pichia pastoris como sistemas de expresión de proteínas recombinantes como alternativa
para la producción de proteínas de interés terapéutico a menores costos que los
asociados con el uso de células de mamífero. Para el caso específico de la enzima
GALNS, la producción de esta se realizó inicialmente en E. coli observando la posibilidad
de producir una enzima activa, aunque la ausencia de glicosilaciones limitó la captura
celular de la enzima recombinante purificada. Con el objetivo de producir una enzima
glicosilada, recientemente se realizó la producción de la enzima recombinante en la
levadura metilotrófica Pichia pastoris, encontrándose mayores valores de actividad
enzimática que lo observado con E. coli. Adicionalmente, los resultados mostraron que la
enzima puede ser capturada por células en cultivo y que el uso de un péptido señal
heterólogo favorece la producción de la enzima. Con el objetivo de continuar
incrementando los niveles de en este trabajo se evaluó la producción de la enzima
recombinante GALNS en P. pastoris empleando el gen GALNS sin el péptido señal nativo
(GALNSnsp) coexpresado con el gen de la enzima activadora de sulfatasas (SUMF1), la
cual se encarga de la formación de un residuo de Formilglicina en el sitio activo de la
enzima y que permite la hidrólisis de los grupos sulfato de los respectivos sustratos. Los
genes GALNS y SUMF1 fueron cotransformados mediante dos estrategias diferentes y los
clones obtenidos fueron evaluados a escala 10 ml, 100 ml y 1,65 L.
11
3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La terapia de reemplazo enzimático constituye la alternativa más cercana para el
desarrollo de un tratamiento de la enfermedad de Morquio A. En la actualidad, la enzima
empleada en los ensayos preclínicos y clínicos de TRE es producida de forma
recombinante en células de mamífero, la cual presenta la desventaja de estar asociada a
altos costos de producción que impactan de forma directa en el costo final de la terapia
además del alto riesgo de contaminación que acarrea este tipo de células (1,5). Como una
alternativa para la producción de esta enzima recombinante, el IEIM ha realizado
investigaciones empleando E. coli y P. pastoris. En el caso de la levadura metilotrófica P.
pastoris como sistema de expresión para la enzima GALNS, se evaluó la producción de
la enzima GALNS sin péptido nativo, el cual se remplazó por la señal de la secreción del
alfa-factor, logrando un aumentado de 1,5 veces en los valores de actividad de la enzima
producida (7), en comparación con el estudio realizado por este autor, en el cual el vector
de expresión contenía la secuencia del gen GALNS con el péptido señal nativo (6).
Por otro lado, en el IEIM evaluaron por primera vez el efecto de la coexpresión con el gen
SUMF1 en la producción de sulfatasas humanas recombinantes en P. pastoris,
obteniendo 7,5 veces mayor actividad a escala de Biorreactor 1,65 ml con respecto a los
valores obtenidos en ausencia de SUMF1 y empleando el gen GALNS con la secuencia
del péptido señal nativo (8).
Dado al proceso que se viene desarrollando en el IEIM de mejorar la producción de esta
enzima recombinante, este trabajo busca caracterizar la producción de GALNS
empleando el gen GALNS sin péptido señal (GALNSnsp) bajo la coexpresión del gen
SUMF 1.
12
4. REFERENTES CONCEPTUALES - MARCO TEÓRICO
4.1. Mucopolisacaradosis
Los Errores Innatos del Metabolismo (EIM) fueron descritos inicialmente por Sir Archibald
Garrod a principios del siglo XX estudiando cuatro enfermedades monogénicas: la
alcaptonuria, el albinismo, la pentosuria y la cistinuria. Por lo general, los errores en el
metabolismo son pocos frecuentes y son debidos a un daño en la estructura o función de
una proteína involucrada en el metabolismo de aminoácidos, lípidos, ácidos nucleicos y
azúcares (9).
Dentro estas enfermedades se encuentran las Mucopolisacaridosis, que son un grupo
heterogéneo de trastornos hereditarios poco frecuentes causados por la deficiencia de
una enzima lisosomal necesaria para realizar el catabolismo de los glicosaminoglicanos
(GAG) (10). Esta deficiencia conlleva a la acumulación de GAG dependiendo de la enzima
que se encuentre afectada (Tabla 1)
Tabla 1: Clasificación de las mucopolisacaridosis (10).
MUCOPOLISACARIDOSIS ENZIMA ALTERADA NOMBRE
MPS IH α- L- iduronidasa Enfermedad de Hunter
MPS IS α- L- iduronidasa Enfermedad de Scheie
MPS II Iduronato sulfatasa Enfermedad de Hunter grave
MPS IIIA Heparán N-sulfatasa Enfermedad de Sanfilippo A
MPS IIIC Acetil CoA: α- glucosaminidotransferasa
Enfermedad de Sanfilippo C
MPS IIID N-acetilglucosamina-6-sulfatasa
Enfermedad de Sanfilippo D
MPS IV A N-acetilglucosamina-6-sulfatasa
Síndrome de Morquio A
MPS IV B Β-galactosidasa Síndrome de Morquio B
MPS VI N-acetilglucosamina-4- sulfatasa
Síndrome de Marotaux- Lamy
MPS VII Β-D-glucoronidasa Enfermedad de Sly
MPS IX Hialorunidasa Deficiencia de hialorunidasa
4.2. ENZIMA N-ACETILGALACTOSAMINA-6-SULFATO SULFATASA (GALNS)
La enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (EC 3.1.6.4), es una proteína
lisosomal encargada de hidrolizar el grupo 6-sulfato de las unidades N-
acetilgalactosamina-6-sulfato del CS y de las unidades de D-Galactosa-6-sulfato del QS
13
(11). Los defectos de la enzima GALNS conducen a la acumulación de estos sustratos,
desarrollando la enfermedad MPS IV A o Morquio A (12). GALNS es un homodímero
de 120 kDa, con un péptido señal de 26 aminoácidos que dirige la proteína
inicialmente al retículo endoplasmático (RE) (2). Durante el proceso de
maduración de la proteína, antes de ser plegada en el RE, GALNS es activada por
la enzima generadora de formilglicina (FGE) que es la responsable de la
conversión de cisteína a formilglicina en el sitio activo de las sulfatasas y que es
codificada por el gen SUMF1 (Sulfatase Modifying Factor 1) (2).
4.3. GEN GALNS Y SUMF1
El gen GALNS humano se encuentra localizado en el brazo largo (q) del cromosoma 16
en la posición 24.3 y presenta 14 exones y 13 intrones. Este gen codifica para una
proteína de 522 aminoácidos incluyendo un péptido señal de 26 aminoácidos (2). Hasta
el momento se han descrito cerca de 150 mutaciones con una amplia heterogeneidad y
sin una clara asociación genotipo-fenotipo (13). Por su parte, el gen SUMF1 (Factor de
Modificación de Sulfatasas 1) es el responsable de codificar para la Enzima generadora
de Formilglicina (FGE) que permite la oxidación de un residuo de cisteína a formilglicina
(FGly) en el sitio activo de la enzima. FGE es una proteína localizada en el RE con 374
aminoácidos (2,14).
4.4. ENFERMEDAD DE MORQUIO
La enfermedad de interés en esta investigación es Mucopolisacaradosis IV A, también
conocida como Enfermedad de Morquio A. Esta es una enfermedad de tipo de depósito
lisosomal, con un patrón de herencia autosómico recesivo. La enfermedad se caracteriza
por la acumulación lisosomal de los GAG QS y CS, afectando principalmente el tejido
óseo y la córnea (1).
Los pacientes Morquio A presentan displasia esquelética, estatura corta, facies toscas,
hipoplasia del odontoides, pectus carinatum, cifoescoliosis, genu valgum, laxitud de
articulaciones, y pérdida auditiva. Sin embargo, los diversos síntomas se presentan de
con diversas intensidades, dependiendo de la a actividad residual de la enzima (2)
El diagnóstico de la enfermedad se realiza de forma inicial de manera evaluación clínica y
posteriormente mediante el análisis de GAG en orina y la cuantificación de la actividad
enzimática la en leucocitos o fibroblastos empleando el sustrato artificial fluorogénico 4-
metilumbeliferil-β-D-galactopiranósido-6-sulfato (15)
4.5. Tratamientos –Terapia de reemplazo enzimático
En la actualidad no se cuenta con un tratamiento específico para los pacientes con
enfermedad de Morquio A. Entre los tratamientos que se encuentran disponibles se
encuentran el empleo de medidas paliativas como intervenciones quirúrgicas para corregir
14
algunos problemas óseos, terapia respiratoria, uso de analgésicos y antibióticos, y
trasplante de médula ósea (16 ). Adicionalmente, la terapia génica se encuentra en etapas
preclínicas, aunque ha mostrado la posibilidad de realizar la corrección del defecto
genético (17). Por su parte, la terapia de reemplazo enzimático, que consiste en la
producción de en la producción de enzimas recombinantes tanto en células de mamíferos
como en o en sistemas de expresión como E.coli o P.pastoris para su posterior uso
clínico, aun, se encuentra en fase clínica III ( 18), por lo que representa la alternativa más
cercana para el desarrollo de una terapia específica para esta enfermedad. Los resultados
preclínicos y clínicos han mostrado resultados prometedores para el tratamiento de la
enfermedad, empleando una enzima producida en células CHO (18 ). Sin embargo, una
vez sea aprobada la terapia, esta puede llegar a tener un costo que puede superar US$
300.000 por paciente/año, principalmente debido al sistema de expresión empleado para
la producción de la enzima (3,4). Es importante entonces, evaluar otros sistemas de
expresión que permitan obtener una enzima activa y con características similares a las de
la proteína humana, pero que permitan reducir los costos de producción de dicha enzima.
Dado a que la enzima necesita de glicosilaciones para que pueda ser capturada por las
células de los tejidos afectados (5), es necesario seleccionar un sistema de expresión que
realice este tipo de modificaciones postraduccionales, de forma similar a las realizadas en
humano.
4.6. Pichia Pastoris.
Con el objetivo de superar algunos de los inconvenientes asociados al uso de los diversos
sistemas de expresión microbianos para la producción de las proteínas recombinantes, la
levadura metilotrófica Pichia pastoris ha sido investigada recientemente como sistema de
expresión viable para la producción de enzimas sulfatasas que están involucrada en
enfermedades de errores del metabolismo. Esta levadura tiene la capacidad de crecer en
un mínimo medio, y producir alta concentración de biomasa y proteína recombinante de
forma extracelular, lo que facilita su recuperación y purificación. Además permite la
inducción de la expresión de la proteína recombinante mediante el uso del promotor del
gen de la alcohol oxidasa (pAOX)(5). El funcionamiento de los genes AOX (AOX1 y
AOX2) determina el fenotipo de la levadura en cuanto a su capacidad de metabolizar el
metanol. La integración del transgen se realiza mediante linealización del vector con
enzimas de restricción, lo que permite la integración mediante recombinación homóloga el
genoma del microorganismo obteniendo mutantes tales como: Mut+, las cuales presentan
un fenotipo de degradación rápido de metanol dado a que conserva en su genoma el gen
AOX1 funcional, o mutantes Muts que presentan un consumo de metanol más lento dado
a que el gen AOX1 esta suprimido debido que a la integración del vector en esta región
(15,19 )
La asimilación del metanol por parte de cada una de las mutantes Mut+ / Muts se realiza
mediante componentes citosólicos que transportan el metanol hacia el perixosoma en
donde este es metabolizado por la enzima alcohol oxidasa. Esta enzima, cataliza la
15
conversión de metanol a formaldehido y a peróxido de hidrogeno. Este último puede llegar
ser toxico para la levadura, por lo que la enzima catalasa lo degrada a H2O y O2 (16,17).
En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) se han realizados varios
estudios en expresar la forma activa de la enzima GALNS tanto en E.coli (6) como en
Pichia pastoris (1). En estudios anteriores, se ha expresado el gen GALNS con el péptido
nativo humano, obteniendo niveles de actividad máxima de 0,106 U/mg a la 86 h (6).
También se empleó el gen GALNS sin el péptido señal nativo obteniendo actividades
enzimáticas específicas de 0,16 U/mg a la 24 horas (7) además también se ha
coexpresado el gen GALNS con el gen SUMF1 teniendo valores de actividad enzimática
de 0,09 U/mg hacia la hora 96 mostrando un aumento importante en la actividad de la
enzima.(8)
16
5. OBJETIVOS:
5.1. General
Determinar los niveles de producción en Pichia pastoris GS115 de la enzima humana
recombinante GALNS sin péptido señal nativo (GALNSnsp) coexpresada con el gen
SUMF1.
5.2. Específicos:
Evaluar la inserción de los genes GALNSnsp/ SUMF1 y Fenotipo de los clones de
Pichia pastoris GS115 cotransformados con los plásmidos pPIC9-GALNSnsp y
pPIC9-SUMF1
Determinar niveles de producción de la enzima GALNS recombinante en los
clones a escala de 10 ml y 100ml
Determinar la producción de la enzima GALNS recombinante en el mejor clon a
escala de biorreactor de 1,65 L
17
6. METODOLOGIA
6.1. Evaluación de los clones de Pichia pastoris GS115 cotransformados con
los plásmidos pPIC9-GALNSnsp y pPIC9-SUMF1
6.1.1. Obtención de los clones de P.pastoris pPIC9 –GALNSnsp/SUMF1
Los Clones de pPIC9–GALNSnsp/SUMF1 fueron obtenidos previamente en el laboratorio
empleando la cepa Pichia pastoris GS115 (Life Technologies Corporation) (24)
Los vectores de expresión pPIC9-GALNSnsp y pPIC9-SUMF1, previamente construidos
en el IEIM, portan el ADNc de GALNS sin péptido señal (GALNSnsp) o de SUMF1
humanos insertados en el sitio múltiple de clonación del vector pPIC9 (Life Technologies
Corporation). Este vector posee en el promotor AOX1, una secuencia de ADN que
codifica para la señal de secreción de la proteína (alfa- factor), el gen HIS4, y el gen de
resistencia a ampicilina (23)
Para la transformación de P. pastoris GS115 se realizaron dos protocolos diferentes. En el
primer protocolo 1 (P1) se insertó el plásmido pPIC9-SUMF1 a la cepa de P. pastoris que
estaba previamente transformada con el plásmido pPIC9-GALNSnsp. El segundo
protocolo (P2) se insertaron los plásmidos al mismo tiempo. Las transformaciones fueron
realizadas previamente en el IEIM, mediante electroporación previa linealización de los
vectores pPIC9-GALNSnsp y pPIC9-SUMF1 con las enzimas PmeI y SalI,
respectivamente. Para todos los clones obtenidos con los dos protocolos se realizó un
banco y fueron almacenados a -80 °C hasta su posterior caracterización(23)
18
6.1.2. Confirmación de la Inserción de los genes GALNS y SUMF 1
Los clones de P. pastoris de los dos protocolos fueron evaluados en cuanto a la
presencia de los genes de las enzimas GALNS y SUMF1. Para este fin, se realizó la
extracción del ADN genómico de los clones (Anexo 1 No. 3), el cual fue empleado para la
realización de una PCR. En el caso del gen GALNSnsp los cebadores utilizados fueron
TOMF23 5’-ACAGGGCCATTGATGGCCTCAACCTCCT-3’ y TOMF34R 5’-
GCTTCGTGTGGTCTTCCAGATTGTGAGTTG-3’, los cuales amplifican un fragmento de
250pb del gen GALNS. Para el caso del gen SUMF1 se emplearon los cebadores MSDF2
5’ACAATGGGCACAGATGATCCTCAG3’, reverse MSDR2
5’ACTATGTTGTATAAGCCATAACCA’, los cuales amplifican un fragmento de 500 pb apx
. La PCR para los dos genes se realizó mediante las condiciones presentadas en las
Tablas (Tabla 1,Tabla 2)
Tabla 2 . Componentes de la PCR de para la confirmación de la inserción de los genes
GALNSnsp y SUMF1
Componente Concentración final
ADN molde 2 µl
dNTP (10mM) 0,3mM
Buffer (10X) 1X
MgSO4 (50 mM) 1mM
Primers (10 µM cada uno) 0,3 µM
ADN taq polimerasa 1 U
H2O Completar volumen final 50 µl
Tabla 3.Condiciones de PCR para la confirmación de la inserción de los clones
Etapa GALNSnsp SUMF1
Temperatura (oC)
Tiempo (min)
Temperatura (oC)
Tiempo (min)
Denaturación inicial
94 5 94 5
Denaturación 94 1 94 1
Anillamiento 60 1 60 0:45
Extensión 72 0:30 72 0:45
Extensión Final 72 5 72 5
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El resultado de PCR se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 % y
posterior tinción con bromuro de etidio. Con los clones positivos para los dos genes se
realizó un banco de trabajo, el cual se almacenó a -80 °C.
6.1.3. Determinación del fenotipo (Mut+/Mut s)
La determinación del fenotipo se realizó mediante el crecimiento en medio MM (YNB 1,34
%, Biotina 4X10-5 %, metanol 0,5%), durante 48 h. El crecimiento de los clones se
comparó con el observado para los controles de MUT+ y MUTs suministrados por el
fabricante del kit Life Technologies Corporation).
6.2. Evaluación de Clones a escala de 10 ml
Con un vial del banco de P. pastoris de cada uno de los clones se inocularon en 10 ml de
medio YPD (Extracción de levadura 1%, Peptona 2%, Dextrosa 2%), incubando durante
24 horas a 30oC y 290 rpm. Transcurrida la incubación, se tomó 1 ml para inocular 9 ml de
Medio BMG (Buffer fosfato de potasio 100 mM, YNB 1.34 %, Biotina 4X10-5 %, glicerol
30%), incubando a 30 oC y 290 rpm durante 24 horas. Después de la incubación, se
realizó el cambio de medio a BMM (Buffer fosfato de potasio 100 mM, YNB 1,34 %,
Biotina 4X10-5 %). Para esto, se centrifugó el cultivo a 3500 rpm a 4oC y la biomasa
resultante se resuspendió en 10 ml del medio BMM, incubando a 30oC y 290 rpm durante
96 horas. Cada 24 horas se tomaron alícuotas de 200 µl para la realización de los
ensayos posteriores, y se adicionaron 50 µl de metanol puro. Sobre las diferentes
alícuotas se realizó la determinación de Biomasa, Concentración de proteína y actividad
específica GALNS. Cada clon fue evaluado por duplicado.
6.3. Evaluación de clones a escala de 100 ml
Los clones que mostraron mayores valores de actividad a escala 10 ml fueron evaluados
a escala de 100 mL. Para esto, se tomó un vial del banco de P. pastoris de cada clon y se
inoculó en 10 ml de medio YPD( Extracción de levadura 1%,Peptona 2%Dextrosa 2%),,
incubando por 24 horas a 30 oC y 290 rpm. Posteriormente, este empleó para inocular a
90 ml de Medio BMG (Buffer fosfato de potasio 100mM, YNB 1,34 %, Biotina 4X10-5 %,
glicerol 30%), incubando a 30oC y 290 rpm durante 24 horas. Después de la incubación,
se realizó el cambio a medio BMM como se describió anteriormente. La biomasa
resultante se resuspendió en 100 ml de medio BMM (Buffer fosfato de potasio 100 mM,
YNB 1,34 %, Biotina 4X10-5 %), incubando a 30 oC y 290 rpm durante 120 horas
manteniendo una concentración de metanol a 0.5 % (v/v) mediante la adición de 500 µl de
metanol puro y tomando alícuotas de 250 µl cada 24 horas. Sobre las diferentes
alícuotas se realizó la determinación de Biomasa, Concentración de proteína y actividad
específica GALNS. Cada clon fue evaluado por duplicado.
6.4. Evaluación de clon a escala de Biorreactor 1,65 L
Para la evaluación de los clones de mayor actividad a escala 1.65 L VET, se realizó el
cultivo empleando un Biorreactor Bioengineering® a KFL2000 de 3,7 L.
20
Inicialmente para este cultivo se tomaron dos viales del clon a evaluar del banco de P.
pastoris que se inocularon en 20 ml de medio YPD, incubando durante 48 h 30°C a 280
rpm. Este cultivo se transfirió a 180 mL de medio MGli (YNB 1.34 % Biotina 4E-5% Agua
estéril Glicerol 60%), incubando durante 24 h a 30°C a 280 rpm. Posteriormente, el cultivo
fue transferido a medio BSM (composición para 1,65 L: glicerol 66 g, sulfato de calcio
dihidratado 0,99 g, fosfato de potasio 42,47 g, sulfato de amonio 4,95 g, sulfato de potasio
14,15 g, sulfato de magnesio 11,58 g) para obtener un volumen de trabajo de 1,65 L.
Después se le adicionó 1 ml de solución traza de minerales, 1 ml de antiespumante y 1,5
ml de Biotina 0,02%
Esté cultivo se realiza generalmente en dos etapas., La primera consistió en un cultivo de
lote hasta alcanzar una biomasa de 60 g/l. La etapa final consiste en la fase de inducción
en la cual se realizó un un cultivo de lote alimentado con metanol manteniendo una
concentración de 0.5 % v/v durante 120 horas. Durante todas las fases del cultivo se
reguló el pH 5,0 empleando hidróxido de amonio al 7%. El oxígeno disuelto se mantuvo
por debajo del 10 % durante la fase de inducción.
Cada 8 a 12 horas se tomaron alícuotas de 10 mL para la determinación de biomasa,
concentración de proteína y actividad específica de GALNS. Con estos resultados se
evaluó la cinética de crecimiento; mediante el cálculo de velocidad especifica de
crecimiento(x) (h-1), tiempo de duplicación td (h) y rendimientos P(x).
6.5. Determinación de Biomasa
La determinación de la biomasa se realizó mediante medición espectrofotometría a 610
nm. Para la determinación en g/l se empleó la siguiente ecuación (7)
𝑋 =(0,619 ∗ 610 Do nm)
0,528∗ Factor de dilución
6.6. Determinación de concentración de proteína
La determinación de la concentración de proteína se realizó mediante el método de
Lowry (22), empleando una curva patrón de albúmina entre 0,2 hasta 3,3 mg/ml.
6.7. Determinación de la actividad especifica
La determinación de la actividad se lleva a cabo mediante la adición de 10 µl del extracto
crudo y 20 µl del sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-β-d-galactopiranosido-6-sulfato.
La mezcla se incubó durante 17 h a 37 oC. Después de ese tiempo se adicionaron 2 µl de
de β-galactosidasa 10 mg/ml y se incubó a 37 °C por 2 h. La lectura de la fluorescencia se
realizó empleando un fluorómetro Modulus (Turner Byosystems) a una longitud de onda
de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 455 nm. Una unidad de
actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1
nmol de sustrato por hora. La actividad específica se expresa U/mg de proteína total
determinada por el método de Follin-Lowry, y al actividad volumétrica esta expresada
como U/ml de muestra (8)
21
7. RESULTADOS
7.1. Evaluación de los clones de Pichia pastoris GS115 co-transformados con
los plásmidos pPIC9-GALNSnsp y pPIC9-SUMF1
7.1.1. Confirmación de la Inserción del Gen GALNS y SUMF 1
Cinco clones obtenidos a partir del protocolo 1 y tres clones a partir de del protocolo 2
fueron evaluados, para un total de ocho clones. Como se observa en la Figura 1, para
los clones del protocolo 1 se logró determinar la inserción de ambos genes en los clones
2, 4 y 5, mientras que para los clones del protocolo 2 se determinó la presencia de los dos
genes en los clones 1 y 2.
Figura 1: PCR de confirmación para inserción de los genes GALNSnsp y SUMF1. la
presencia de los genes GALNS y SUMF1 fue evidencia mediante PCR empleando
cebadores específicos para cada gen, los cuales generan fragmentos de 200 y 500 pb,
respectivamente. (A) gen SUMF1 protocolo 1, (B) gen GALNnsp protocolo 2 (C) Genes
GALNnsp y SUMF1 protocolo 2.
22
7.1.2. Determinación del fenotipo (Mut+/Mut s)
En la determinación del fenotipo tanto como para los clones del protocolo 1, como para
los clones del protocolo 2 , se compararon los resultados con los controles para Muts y
Mut+ suministrados por la casa comercial. Todos los clones evaludos mostraron un
fenotipo Muts (Figura 2)
Figura 2: Determinación de fenotipo mediante crecimiento en medio MM. (A) Clones
2, 4 y 5 protocolo 1; (B) Clones 1 y 2 Protocolo 2; (C) Controles MUT s y MUT +
23
7.2. Evaluación escala 10 ml
7.2.1. Crecimiento celular y Concentración de proteína
La curva de crecimiento que se observó en los 5 clones fue similar alcanzando
concentraciones promedio de 27 g/l con un aumento progresivo a medida que fueron
transcurriendo las horas de cultivo pasando (Figura 3A). Sin embargo, se observó un
menor crecimiento para el clon 4P1
En cuanto a la concentración de proteínas los clones tuvieron mayor concentración hacia
las últimas horas del cultivo, con una máxima concentración de 0,59 mg/ml para el clon 1
del protocolo 2 (Figura 3B). Para el clon 4P1 no se observó una concentración de
proteína cuantificable, lo que correlaciona con el bajo crecimiento de este clon.
Figura 3. Concentración de Biomasa (A) y de proteína (B) para los clones evaluados a
escala de 10 mL.
7.2.2. Actividad Enzimática GALNS
Dado a que el clon 4P1 no mostró una concentración de proteína cuantificable este fue
descartado para la determinación de la actividad enzimática. En cuanto a la actividad
específica, se obtuvieron valores máximos de 0,24 U/mg a las 48 h y 0.12 U/mg a las
48h y 96h para el clon 2p1. En cuanto al clon 5P1 se observaron actividades hacia la
24
ultima hora de 0,11 U/mg siendo menor que el obtenido con el clon 2P1 por lo tanto no
se evaluó a escala 100 ml. En cuanto a los clones del protocolo 2, la actividad más alta
fue del clon 2P2 con un valor de 0,15 U/mg a la hora 24. Dado a que el clon protocolo 1P2
obtuvo actividad hacia las ultima horas por lo tanto se decidió evaluar ambos a escala de
100 ml (Figura 4)
Figura 4: Actividad enzimática de los clones 2p1 ,5p1,1p2, 2p2 10ml
7.3. Evaluación escala 100 ml
Según los resultados de actividad enzimática a escala a 10 ml se decidió escalar los
clones 2P1, 1P2 y 2p2. Adicionalmente, teniendo en cuenta la tendencia de las
actividades enzimáticas de algunos de los clones, se decidió realizar la fase de inducción
durante 120 h.
7.3.1. Crecimiento celular y concentración de proteína
Los resultados demostraron que se obtuvieron menores valores en biomasa que los
observados en esta escala de 10 ml. Sin embargo, se mantuvo la tendencia que se
observó a esa escala, con un promedio de 20 g/l que fue aumentado durante el cultivo
(Figura 5A).
25
En cuanto a la concentración de proteína, se observó una tendencia similar entre los
clones. El clon 2P1 presentó las menores concentraciones de proteína, mientras que el
clon 1P2 mostró las mayores (Figura 5B).
Figura 5 .Evaluación escala 100 ml :(A) concentración de biomasa (B) concentración de
proteína
7.3.2. Actividad Enzimática
La actividad enzimática en esta escala mantuvo la misma tendencia que en la escala
anterior. Cada uno de los clones presentó los picos de actividad enzimática en horas
similares a las observadas a escala de 10 mL. Los mayores niveles de actividad se
obtuvieron hacia las 72h para el clon 2P2 con 0,28 U/mg, mientras que los clones 2P1 y
1P2 mostraron la actividad máxima hacia el final del cultivo, con valores de actividad entre
0,687 y 0,57 U/mg (Figura 6).
26
Figura 6: Actividad Enzimática clones 2p1 ,1p2, 2p2 a escala 100 ml
7.4. Evaluación escala 1.65 L escala Biorreactor
Teniendo en cuenta los resultados de la escala anterior, se decidieron escalar los clones
2P1 y 1P2, dado que fueron los que mostraron mayores valores de actividad enzimática.
7.4.1. Crecimiento celular y Concentración de proteína
En cuanto al crecimiento celular se obtuvieron resultados de densidad celular de 270 g/L
para el clon 2P1 y de 215 g/L para clon 1P2. A pesar de que se obtuvieron valores
mayores de densidad celular para el clon 2p1, se observó que el clon 1p2 tuvo un una
mayor cinética de crecimiento (Figura 7) (Tabla 3,4). Las concentraciones de proteínas
mostraron la misma tendencia que la densidad celular, teniendo una máxima
concentración de 2,9 mg/ml para el clon 2P1 y de 1,5 mg/ml para el clon 1P2 a las 120
horas (Figura 7)
7.4.2. Actividad Enzimática
Para el clon 1P2 se observaron dos picos de actividad a las 24 y 68 h con 0,28 y 0,17
U/mg, respectivamente, (Figura 7B), mientras que el clon 2P1 mostró una actividad
máxima de 0,10 U/mg a las 47 h, (Figura 7 A)
27
A.
B.
Figura 7. Evaluación a escala de 1,65L en biorreactor de los clones 2P1 y 1P2 La figura
muestras los resultados de concentración de biomasa y proteína, así como de actividad
enzimática volumétrica y especifica
28
7.4.3. Determinación de parámetros cinéticos
En cuanto a los parámetros cinéticos de la fase de inducción con metanol obtenidos del
clon 2P1 según los datos obtenidos hubo una tasa de crecimiento máxima de 0,05 /h
hacia la hora 24. Adicionalmente se estableció que en el momento de mayor actividad
hacia la 47 h se observó una tasa de crecimiento negativa, lo que sugiere que en ese
momento el microorganismo se encontraba sintetizando proteína y no se encontraba en
crecimiento.
Tabla 3. Parámetros cinéticos clon 2P1 escala de biorreactor 1,65 L
En el caso del clon 1P2 se obtuvo una mayor tasa de crecimiento con respecto al clon
anterior, con un valor de 0,0627 h-1 a las 20 h, Adicionalmente, este clon también mostró
una mayor tasa de producción, con un valor de 0.17 mg g-1 (Tabla 4).
Tabla 4. Parámetros cinéticos clon 1P2 escala de Biorreactor 1,65 L
29
8. ANALISIS DE RESULTADOS
La TRE representa la opción más cercana para el desarrollo de una terapia específica
para la enfermedad de Morquio A. En la actualidad la TRE para esta enfermedad se
encuentra en estudios de fase clínica III, empleando una enzima producida en células
CHO. Como una alternativa para la producción de esta proteína, se ha explorado su
producción en E. coli (3,5) y P. pastoris (6,7,8). De manera notable se destacan los
resultados obtenidos con este último sistema de expresión, dada su capacidad de
producir una proteína glicosilada que puede ser capturada por células en cultivo (7), lo
cual representa un requisito indispensable para el desarrollo de una TRE para una
enfermedad lisosomal. Adicionalmente, los resultados previos han mostrado que la
coexpresión con SUMF1 permite incrementar los valores de actividad enzimática GALNS,
así como también el uso de la secuencia GALNS sin el péptido señal nativo (GALNSnsp).
Sin embargo, la coexpresión de SUMF1 y el uso del gen GALNSnsp, no han sido
evaluados de forma simultánea. En este orden de ideas, este proyecto caracterizó el
efecto de estos dos factores sobre los niveles de actividad GALNS en P. pastoris, con el
objetivo de lograr mayores valores de actividad enzimática que permitan continuar en el
desarrollo de una TRE para la enfermedad de Morquio A.
La inserción de los genes GALNSnsp y SUMF1 se realizó previamente empleando dos
metodologías. En el protocolo 1 el gen SUMF1 fue insertado en una cepa previamente
transformada con el gen GALNSn sp, mientras que en el protocolo 2 los dos genes fueron
insertados de forma simultánea en el microorganismo. De los ocho clones obtenidos en
total se determinaron que 5 clones portaban los dos genes de interés. Adicionalmente
estos clones mostraron un fenotipo MUTs. Dicho fenotipo fue favorecido al linealizar el
vector para realizar la inserción del gen en el genoma de P.pastoris empleando como
enzima de restricción Sal I y PmeI que permite la inserción de los vectores en los genes
AOX1 y HIS dando así mayor posibilidad de obtener un fenotipo MUTs (5,19). Los
resultados de actividad enzimática GALNS obtenidos a 10 ml fueron entre 2 y 3,3 veces
mayores que los observados con del gen GALNS con péptido señal nativo y en presencia
o ausencia de SUMF1 (5,6), y 1,2 veces mayores que los valores observados con el uso
del gen GALNS sin péptido señal nativo (7). A esta escala los clones con mayor actividad
fueron 2P1 y 2p2 con actividades entre 0,23 y 0,15 U/mg respectivamente. En cuanto al
clon 4 del protocolo 1 se observó que fue el único que no presento niveles de producción
de proteínas y un crecimiento limitado. Teniendo en cuenta que todos los clones fueron
tratados bajo las mismas condiciones de cultivo, se puede considerar que la inserción
posterior del gen SUMF1 sobre un clon previamente transformado con el gen GALNS,
puedo haber afectado el gen AOX que se encontraba activo, obteniendo un mutante MUT0
limitando de este forma la posibilidad del microorganismo de metabolizar el metanol (19).
A escala de 100 ml se observó un marcado incremento en los valores de actividad
enzimática con respecto a lo observado a esta misma escala en trabajos previos. Los
niveles de actividad enzimática fueron 18,6 (GALNS) 2,4 (GALNS/SUMF1) y 5,3 veces
(GALNSNSP). En esta escala los clones con mayores niveles de actividad enzimática
30
fueron los clones 2P1 y 1P2 con 0,68 U/mg y 0,57 U/mg, Estos niveles fueron obtenidos
hacia las últimas horas de inducción lo que correlaciona con el fenotipo MUTs observado
para estos clones. Adicionalmente puede existir una represión del promotor AOX frente a
los metabolitos producidos en el metabolismo del microrganismo en la fase de inducción,
dado a que el gen GALNS es un gen foráneo regulado por dicho promotor que puede ver
afectada su expresión (19)
Los clones 2P1 y 1P2 presentaron los mayores valores de actividad en la escala de 100
mL fueron escalados a 1,65 L en biorreactor. Los valores de actividad GALNS fueron 2,8
veces mayores que los observados con GALNS con péptido señal nativo y 1,47 veces los
valores observados con el gen GALNSnsp (6,7). De igual forma, estos valores fueron
entre 1,1 y 3,1 veces mayores, respectivamente, que los observados bajo las mismas
condiciones de cultivo (0,5% de metanol) empleando el gen GALNS con péptido señal
nativo coexpresando con SUMF1 (8). Sin embargo, los valores obtenidos en el presente
trabajo son menores que los observados empleando el clon con el gen GALNS con
péptido señal nativo coexpresado con SUMF1, cultivado bajo condiciones optimizadas de
metanol (1,3%) y oxígenos disuelto del 25 %(8), lo que que futuras investigaciones deben
considerar la optimización del clon 1P2. Para dicha optimización se deben tener en cuenta
paramentos como el oxígeno disuelto y metanol que influyen en el crecimiento y en la
producción de proteínas recombinantes. La mayor disponibilidad de óxigeno permite que
haya un mejor metabolismo del metanol, lo que puede favorecer la producción de la
proteína recombinante. En condiciones de oxigeno el microorganismo tienden a
reorganizar su metabolismo para hacer frente a la disponibilidad reducida de energía y de
esta forma se ve disminuido su crecimiento. Por otra parte el metanol influye también en
la producción de proteínas recombinantes dado a que estas se encuentran regulada por
el promotor AOX (20,21)
En resumen estos resultados muestran la ventaja de utilizar el gen GALNSnsp y la
coexpresión con el gen SUMF1, como una estrategia para aumentar los valores de
actividad de la proteína recombinante GALNS producida en P. pastoris GS115, aportando
así en la búsqueda de la optimización de las condiciones de producción de la enzima
GALNS recombinante para su posible uso en la Terapia de Reemplazo Enzimático.
Además de determinó que el protocolo 2 es más eficiente a la hora realizar la inserción
de los genes mediante los plásmidos en el genoma de P.pastoris dado que al realizar la
inserción simultanea puede haber mayor probabilidad de encontrar clones transformados
con los genes de interés y no que solo se haya transformado solo con uno de ellos como
ocurrio en el protocolo 1
31
9. CONCLUCIONES
1. En los clones obtenidos previamente en el laboratorio se confirmó la presencia de
los genes GALNS y SUMF1 en cinco clones, los cuales mostraron un fenotipo
MUTs.
2. Los clones 2P1 y 1P2 mostraron los mayores valores de actividad a escalas de 10
y 100 mL, con valores hasta de 0,687 y 0,57 U/mg, los cuales fueron hasta 18,6
veces más altos que los osbervados en trabajos previos de expresión de GALNS
en P. pastoris.
3. El clon 1P2 fue el clon con mayor actividad enzimática a escala de bioreactor, lo
grando valores de actividad enzimática hasta 3,1 veces mayores que los
observados a esta misma escala en trabajos previos, mostrando la ventaja de la
coexpresión de los genes GALNSnsp y SUMF1
32
10. RECOMENDACIONES
1. Optimizar la producción de la enzima GALNS a escala de biorreactor empleando el
clon 2P2 y considerando variables como pH, oxígeno disuelto y concentración de
metanol para confirmar que la tendencia de la cinética de esta y un posible aumento
de la actividad enzimática
2. Emplear genes GALNS y SUMF1 optimizados para P. pastoris, con el fin de contar
con un uso de codones para P.pastoris y así continuar mejorar la producción de la
enzima GALNS.
3. Continuar con la caracterización in-vitro e in-vivo de la enzima GALNS recombinante
producida en P. pastoris, con el objetivo consolidar el potencial de esta enzima para el
desarrollo de una TRE para la enfermedad de Morquio A.
33
11. BIBLIOGRAFÍA.
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protein in Pichia pastoris. Cat No. K1710-01 California. Invitrogen
PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Junio de 2013
1
ANEXO 3 BIBLIOTECA ALFONSO BORRERO CABAL, S.J.
DESCRIPCIÓN DE LA TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO FORMULARIO
TÍTULO COMPLETO DE LA TESIS DOCTORAL O TRABAJO DE GRADO
Producción de la enzima recombinante N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa sin péptido señal (GALNSNSP) en Pichia pastoris mediante coexpresión con el gen SUMF1
SUBTÍTULO, SI LO TIENE
AUTOR O AUTORES
Apellidos Completos Nombres Completos
Pardo Diazgranados Andrea Leonor
DIRECTOR (ES) TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO
Apellidos Completos Nombres Completos
Alméciga Díaz Carlos Javier
Rodríguez Edwin Alexander
FACULTAD
Ciencias
PROGRAMA ACADÉMICO
Tipo de programa ( seleccione con “x” )
Pregrado Especialización Maestría Doctorado
X
Nombre del programa académico
Microbiología Industrial
Nombres y apellidos del director del programa académico
Janeth del Carmen Arias Palacios TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE:
Microbióloga Industrial PREMIO O DISTINCIÓN (En caso de ser LAUREADAS o tener una mención especial):
CIUDAD AÑO DE PRESENTACIÓN DE LA TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO
NÚMERO DE PÁGINAS
Bogotá 2013 38
TIPO DE ILUSTRACIONES ( seleccione con “x” )
Dibujos Pinturas Tablas, gráficos y
diagramas Planos Mapas Fotografías Partituras
x
SOFTWARE REQUERIDO O ESPECIALIZADO PARA LA LECTURA DEL DOCUMENTO Nota: En caso de que el software (programa especializado requerido) no se encuentre licenciado por la Universidad a través de la Biblioteca (previa consulta al estudiante), el texto de la Tesis o Trabajo de Grado quedará solamente en formato PDF.
PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Junio de 2013
2
MATERIAL ACOMPAÑANTE
TIPO DURACIÓN (minutos)
CANTIDAD FORMATO
CD DVD Otro ¿Cuál?
Vídeo
Audio
Multimedia
Producción electrónica
Otro Cuál?
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVE EN ESPAÑOL E INGLÉS Son los términos que definen los temas que identifican el contenido. (En caso de duda para designar estos descriptores, se recomienda consultar con la Sección de Desarrollo de Colecciones de la Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J en el correo [email protected], donde se les orientará).
ESPAÑOL INGLÉS
Enfermedad de Morquio A Morquio A disease
Terapia de reemplazo enzimatico enzyme replacement therapy
Pichia pastoris Pichia pastoris
Enzima activadora de sulfatasa (SUMF1)
sulfatase activator enzyme (SUMF1
N-acetilgalactosamida-6-sulfato sulfatasa (GALNS)
N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase (GALNS)
RESUMEN DEL CONTENIDO EN ESPAÑOL E INGLÉS (Máximo 250 palabras - 1530 caracteres)
La enfermedad de Morquio A es un error innato del metabolismo causado por la acumulación lisosomal de los glicosaminoglicanos queratán sulfato y condroitin-6-sulfato debido a la deficiencia de la enzima N-acetilgalactosamida-6-sulfato sulfatasa (GALNS). Actualmente existen diversos tratamientos para esta enfermedad, en la que se encuentra la terapia de reemplazo enzimático, mediante el empleo de una enzima producida de forma recombinante. Recientemente se ha demostrado la posibilidad de producir esta enzima en la levadura metilotrófica Pichia pastoris, como una alternativa a la enzima que actualmente se encuentra en estudios de fase clínica III producida en células de mamífero, por lo tanto con miras a la evaluación preclínica y clínica de la enzima producida en P. pastoris es necesario continuar incrementando los valores de actividad enzimática. En este trabajo, se evaluó la coexpresión del gen de la enzima activadora de sulfatasa (SUMF1) con el gen de la enzima GALNS sin el péptido señal (GALNSnsp), mediante la evaluación dos estrategias de cotransformación. Los clones obtenidos fueron confirmados mediante extracción de DNA genómico y PCR para los genes GALNS y SUMF1.Los clones positivos para los dos genes fueron evaluados a escala de 10 ml, obteniendo su mayor actividad específica de 0,24 U/mg. Los mejores clones fueron posteriormente evaluados a escala de 100ml mostrando valores de actividades específicas entre 0,29 U/mg y 0,64 U/mg. Finalmente, dos clones fueron evaluados a escala de 1,7 L obteniéndose actividades máximas de 0,17 y 0,28 U/mg. Mostrando en general mayores valores de actividad especifica que resultados reportados anteriormente en ausencia de SUMF1.
PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Junio de 2013
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Morquio A disease is an inherited defect of metabolism caused by the lysosomal accumulation of the glycosaminoglycans keratan sulfate and chondroitin-6-sulfate due to the deficiency of the N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase (GALNS) enzyme. Currently there is a variety of treatments for this disease, such as the enzyme replacement therapy, which employs an enzyme produced in a recombinant form. Recent research has shown the possibility of producing this enzyme in the methylotrofic yeast Pichia pastoris, as an alternative to the enzyme produced in mammal's cells, currently on phase III clinical trials. Therefore, with a view to preclinical and clinical assessment of the enzyme produced in P. pastoris, it is necessary to keep on increasing the enzymatic activity values. In this work it was evaluated the gene co-expression of the sulfatase activator enzyme (SUMF1) with the GALNS enzyme gene without the signal peptide (GALNSnsp) through the assessment of two co-transformation strategies. The obtained clones were confirmed by means of extraction of genomic DNA and PCR for the GALNS and SUMF1 genes. The positive clones for the two genes were evaluated on a scale of 10 ml, being their highest specific activity of 0,24 U/mg. The best clones were evaluated on a scale of 100 ml, showing specific activity values between 0,29 U/mg and 0,64 U/mg. Finally, two clones were evaluated on a scale of 1,7 L, getting maximum activities of 0,17 and 0,28 U/mg, showing in general larger specific activity values than previously reported results in the absence of SUMF1.