PRODUÇÃO DE UMA RECOMBINANTE DA ANEXINA HUMANA POR CULTIVO EM BATELADA ALIMENTADA

Marder et al. BMC Biotechnology 2014

Brisa Bartellt e Vanessa Schmidt

Roteiro

Anexina V ou A5; Apoptose; Diagnóstico clínico com ligação de A5

em corpos apoptótico; Diagnóstico in vivo; O estudo; Metodologias/Resultados; Conclusão

Anexina V (A5)

Proteína anticoagulante encontrada na placenta humana, que depende de cálcio para ligar-se aos fosfolipídios;

Possui alta afinidade com fosfoatidilserina (fosfolipídio do folheto interno da membrana plasmática);

Já com os FL do folheto externo (ex.: fosfatidilcolina e esfingomielina) a capacidade de ligação é reduzida.

Apoptose

“A apoptose é um processo de morte celular ativo, mas silencioso, que ocorre em condições fisiológicas, de resposta a uma variedade de estímulos fisiológicos ou patológicos e em que a célula participa na sua própria destruição. Normalmente, como não há perda da integridade membranar, a apoptose não é acompanhada de reacções inflamatórias drásticas.” (SOLÁ, S. ; PEDRO, T. ; FERREIRA, H.; RODRIGUES, C. M. P., 2001);

A exposição da fosfoatidilserina na superfície do folheto externo da membrana plasmática facilita o reconhecimento de células fagocíticas do sistema imune, e é uma característica dos primeiros estágios do processo apoptótico.

Esta externalização de fosfolipídios é mediada pelas caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)(GRIVICICH, I; REGNER, A; ROCHA,A. B., 2007)

Diagnóstico clínico com ligação de A5 em corpos apoptóticos

A5 é utilizada como um detector de células em apoptose, pois possui afinidade de ligação com a FAS na ordem de nanomolar-picomolar;

Dois marcadores são ligados ao A5 e permitem diferenciar as células quanto a sua integridade e estágio de apoptose;

Diagnósticos in vivo

Quando utiliza-se radionucleos como iodo-123 (123I) e o isótopo metastável de tecnécio-99 (99mTc) para marcar a proteína A5, permite-se avanços na área de pesquisa de apoptose por imagem na medicina nuclear;

Aplica-se muito na detecção de progressão ou regressão de carcinomas.

O estudo

Almeja o desenvolvimento de um processo eficiente e de alto rendimento para a produção, em cultivos em biorreator e posterior purificação da proteína recombinante Anexina V humana com alto grau de pureza, de modo a obter a matéria-prima para a produção de kits para detecção de apoptose tanto in vivo quanto in vitro.

Metodologia Cepas e Plasmídeos

A E. coli BL21 ( DE3 ) e C41 ( DE3 ) foram adquiridos a partir de Novagen® (EMD Biosciences , Inc. , Madison , WI , EUA ) e Lucigen Corporation ( Middleton , WI , EUA ) , respectivamente .

O vetor de clonagem de PCR - Blunt® foi comprado de Invitrogen® ( Carlsbad , CA , EUA ) e pET - 30a ( + ) a partir de vector de expressão foi Novagen®

Metodologia Clonagem molecular de rhanxa5 Sequência de codificação de ANXA5 humano na GenBank ( número de acesso : NM_001154.3 ) National Institute of Health ( NIH). NdeI ( primer direto : 5 ' GCG CAT ATG GCA CAG GTT CTC AGA GGC ACT 3') HindIII ( iniciador reverso : 5 ' GCG AAG CTT TTA GTC ATC TTC TCC ACA GAG C 3'). A sequência do gene ANXA5 humano foi amplificado partir de uma amostra de sangue humano .

Amplificação de AXNA5 por PCR

Clonagem em pCRBlunt® Digestão com Nde I e Hind III

Preparo do pET30a(+) com as mesmas enzimas de restrição

Confirmação da clonagem por

sequenciamento DNA automático

Fonte: As autoras (2015)

Metodologia Sequenciamento automático

Amaral et al. (2012)

Fonte: Amaral et al. (2012)

Metodologia Preparo dos meios

Nomenclatura

LB – caldo lisogenia

Componentes

Triptona –10 g L-1; Extrato de levedura – 5 g L-1; NaCl –10 g L-1.

Preparo Esterilizado em autoclave (30 min – 121ºC)

Aplicação Cultura em balão de agitação

Nomenclatura

SD – semi definido

Componentes

NaCl – 0,5 g L-1(a);NH 4 Cl – 1 g L-1 (b); Extracto de levedura – 20 g L-1(c); Na2HPO4 – 6 g L-1(d); KH2PO4 – 3 g L-1(e); Tiamina – 1 mg L-1(f); MgSO4 – 1 mM (g); solução de rastreio – 0,1% (h); CaCl2 – 0,1 mM (i).

Preparo (a,b,c,d,e), (g) e (i) foram esterilizados em autoclave (30 min – 121ºC);(f) Foi esterilizado por filtração;(h) – FeSO4 (2,8 g L-1), MnCl2 (2 g L-1), CaCl2 (2 g L-1), CuCl2 (0,26 g L-1) e ZnSO4 (0,3 g L-1);Tudo foi misturado em condições assépticas

Aplicação Cultura em balão de agitação; cultura em batelada alimentada; pré cultura.

Para a alimentação de meio de culturas de bioreactor, meio SD foi suplementado com glicose (concentração final de 300 g L-1) e MgSO4 (40 mM);

Canamicina (30 ug mL-1) foi adicionada em ambos os meios;Fonte: As autoras (2015)

Fonte: As autoras (2015)

MetodologiaCultivo em balão de agitação

As cepas transformadas com pET30a(+) ou com pET30a(+)::AXNA5 (ambas por eletroporação) foram selecionadas por placas de canamicina (30 ug mL-1);

Incubação de pré-inóculo overnight (37ºC ;180rpm) em 5 ml LB+canamicina;

Incubação em diferentes meios (LB ou SD) para determinar o perfil de expressão condições (50 ml; 37ºC; 180 rpm) atingir OD(600nm) = 0,4-0,6;

A expressão da proteína recombinante solúvel foi confirmada por 12% de dodecil sulfato de sódio-electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), visualizadas por coloração com Coomassie® Brilliant Blue R-250.

Metodologia SDS-PAGE

A eletroforese é uma técnica analítica que separa moléculas por carga e tamanho. Na eletroforese de proteínas utiliza-se o gel de poliacrilamida, o qual é formado pela

co-polimerização de acrilamida e bisacrilamida, constituindo-se em uma rede porosa, cujo diâmetro dos poros é inversamente proporcional a concentração de acrilamida.

Quando necessita-se separar as proteínas somente por tamanho, utiliza-se a técnica de SDS-PAGE (SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis). O SDS é um detergente aniônico forte, que se liga aos resíduos positivamente carregados das proteínas, conferindo às mesmas uma carga final negativa e ocasionando a desnaturação.

MetodologiaSDS-page

Fonte: http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810

Resultado Clonagem e expressão

Fonte: http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810

Metodologia Inoculo para biorreator Células transformadas de E. coli BL21(DE3) que

contém o plasmídeo recombinante pET-30a(+)::ANXA5 foram estocadas em 50% de

glicerol a -80°C. Para o desenvolvimento do pré-inóculo foram

cultivadas overnigth 150µL de células.

A densidade óptica final (OD600 ) do pré-inóculo foi medida por espectrofotometria.

Quando a cultura atingiu OD600 , dilui-se em meio LB até um volume total de 100 mL, para posterior inoculação em 900 mL de meio SD

Fonte: ca.vwr.com

Metodologia Espectrofotometria Espectrofotometria – Medida da absorção ou transmissão de luz.

Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. A absorção de luz depende basicamente da concentração das moléculas absorventes e da espessura da solução – caminho óptico.

Fonte: www.ebah.com.br

Metodologia Cultivo em biorreator

 

Fonte: www.sartorius.com

Metodologia Métodos analíticos

O crescimento celular foi monitorado medindo-se densidade a óptica a 600 nm (OD600 ). Para esta OD achou-se um equivalente de 0.3342 g/L de peso celular por quantificação gravimétrica.

A concentração de glicose foi medida através de um analisador de glicose.

A concentração de Acetato foi determinada por cromatografia de alta performance - HPLC (0.005 M H2SO4 como fase móvel e detector UV).

A expressão de proteínas foi analisada usando SDS-PAGE corada com Coomassie ® Brilliant Blue R-250.

A produção da proteína annexin V foi quantificada utilizando-se o Qubit ® Protein Assay Kit e o Qubit ® 2.0 Fluorometer.

Metodologia Gravimetria / análise de glicose A análise gravimétrica ou gravimetria, é um

método analítico quantitativo cujo processo envolve a separação e pesagem de um elemento ou um composto do elemento na forma mais pura possível.

Uma enzima específica para o substrato de interesse é imobilizada entre duas membranas: policarbonato e acetato de celulose.

O substrato é oxidado quando penetra na camada de enzima, produzindo peróxido de hidrogénio, que passa através do acetato de celulose a um eléctrodo de platina, onde o peróxido de hidrogénio é oxidado.

A corrente resultante é proporcional à concentração do substrato.

Fonte: www.equipar.com.mx

Metodologia Cromatografia e HPLC• O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de

substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.

• Tal separação dá-se através da migração da amostra através de uma fase estacionária por intermédio de um fluido (fase móvel).

• Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da fase estacionária.

• O equilíbrio de distribuição determina a velocidade com a qual cada componente migra através do sistema.

Metodologia Cromatografia e HPLC

• A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária.

• Um solvente é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades.

• As substâncias com maior afinidade com a fase estacionária movem-se mais lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a movem-se mais rapidamente.

• Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.

Fonte: waters.com/waters/nav.htm?cid=10049055

Metodologia Quantificação da produção de proteína

Qubit ® Protein Assay Kit

• Quantificação de DNA, RNA e proteínas.• Dilui-se o corante no buffer fornecido e adiciona-

se a amostra. O resultado é fornecido pelo leitor.

Fonte: www.b2b.invitrogen.com

Qubit ® 2.0 Fluorometer.

• Baseado na detecção de uma região específica marcada com fluorescência.

Fonte: www.lifetecnologies.com

Resultados Métodos analíticos

• Com 4 horas de cultivo, verificou-se que a glicose era totalmente consumida, o que indica que este é o tempo em que se deve iniciar a alimentação do biorreator.

• Depois de 4 horas de batelada sem alimentação a concentração de biomassa alcançada foi de 4.71 g/L.

• Com a indução do perfil linear de alimentação obteve-se uma concentração de biomassa de 26.01 g/L.

• Foi induzida a expressão de rhANXA5 com a adição de IPTG. A média obtida foi de 28.48 g/L de concentração de biomassa e 4.8 g/L de concentração de proteínas.

• A média obtida no cultivo em Shaker foi de 0.615 g/L após 6 horas de cultivo.

Figura 1 : Análise SDS-PAGE de expressão rhANXA5 em cultivos fed-batch. E. coli recombinante BL21 (DE3) células foram cultivadas em meio semi-definido (SD) durante 30 h em culturas fed-batch. Alimentação iniciada 4 horas após o início do cultivo em lotes e rhANXA5 expressão foi induzida após 18 horas de cultura através da adição de IPTG 1 mM e marcador; Pista 1: amostra recolhida imediatamente antes da indução IPTG (18 h de cultura); pistas 2-7: amostras recolhidas após indução de IPTG a partir de 20 h (pista 2), 22 h (pista 3), 24 h (pista 4), 26 h (pista 5), 28 h (faixa 6), e 30 h (pista 7).

Resultados Métodos analíticos

• Em um biorreator independente foram realizadas densitometrias das culturas para quantificar a rendimento da produção, o rendimento específico e a produtividade de rhANXA5. Os resultados obtidos foram 1.95 g/L, 0.0715 e 0.065 g/L respectivamente.

• Para o todo o procedimento (30 horas), desde o cultivo em biorreator até a purificação, obtiveram-se 28.5 mg de rhANXA5 purificado (ou 0.983 g/L) e 0.0361 g/L de rhANXA produtivo.

Metodologia Purificação

• ANXA5 proteína recombinante foi purificada utilizando uma cromatografia FPLC - sistema ÄKTA (GE Healthcare ©).

• Monitoramento por detecção UV a 215, 254 e 280 nm e as fracções foram analisadas por 12% SDS-PAGE.

• Células congeladas (3 g) foram suspensas em 30 mL de tampão A (Tris HCl (50 mM ); CaCl2 (10 mM); pH 7,2) e incubadas com fenil fluoreto de metanossulfonilo (1 mM) durante 30 min a 4 ° C.

• As células foram rompidas por sonicação e centrifugado a 38.900rpm durante 30 min. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi completamente dissolvido em 30 mL de tampão B (Tris HCl (50 mM); EDTA (20 mM) pH 7,2), agitou-se durante 30 min a 4 ° C, e clarificada por centrifugação a 38.900rpm durante 30 min a 4 ° C.

Metodologia Purificação • O sobrenadante foi dializado contra 20 mM Tris-HCl pH 8,0 Precipitado residual foi

removido por centrifugação e o sobrenadante foi carregado numa MonoQ HR 16/10 coluna de permuta aniônica, previamente equilibrada com 20 mM de Tris HCl pH 8,0.

• A proteína foi eluída com 25% de gradiente linear de 20 mM de Tris HCl, 1 M de NaCl pH 8,0 a 1 mL min-1 Caudal.

• RhANXA5 homogénea foi eluida a aproximadamente NaCl 190 mM. As frações contendo rhANXA5 homogénea foram reunidas, dialisadas contra 20 mM de N-2-hydroxy ethyl piperazyne -N'-2-etanossulfónico (HEPES), 100 mM de NaCl, pH 7,2 e concentrado usando uma AMICON (Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA) ultra- membrana de filtração (MWCO = 10 kDa), e armazenadas a -80 ° C.

• A concentração de proteína foi determinada com Qubit® Protein Assay Kit usando um Qubit® 2,0 Fluorômetro.

Resultado Purificação

Figura 2: A análise de SDS-PAGE de passos de purificação rhANXA5. SDS-PAGE (12%) Análise de fracções de diferentes passos de purificação rhANXA5. Cada amostra contém pista 8 ug de proteína total. M corresponde a Thermo Scientific Protein ™ não corado Marcador PM; Pista 1: as células em suspensão em tampão A (50 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 10 mMCaCl2) sem passo de centrifugação anterior; pista 2: sobrenadante de células em tampão A, após sonicação e centrifugação (durante 20 min, 24,400 x g, 4 ° C); pista 3: pelete de células a partir da centrifugação anterior suspensas em tampão B (50 mM de Tris-HCl, pH 7,2, EDTA 20 mM); Lane4: suspensão a partir do passo anterior dialisado contra 2 L de 20 mMTris-HCl, pH 8,0 por 3 vezes, durante a noite, no primeiro passo, seguido por diálise twosteps de 2 h cada; pista 5: sobrenadante após a centrifugação da amostra dialisada (durante 30 min, 24,400 x g, 4 ° C); pista 6: preparação homogénea de anexina V eluído a partir da coluna Mono Q.

Metodologia Identificação de rhANXA5 por espectrometria de massa

• Os preparados de rhANXA5 (1 nmol) foram dessalinizados e submetidos a degradação proteolítica usando tripsina.

• Os peptídeos resultantes foram separados por cromatografia capilar, usando uma coluna de 15 cm.

• Os peptídeos separados foram analisados usando um espectrômetro de massa híbrido LTQ-Orbitrap. Fonte:

www.analíticaweb.com.br

• Foram realizadas fragmentações MS/MS usando dissociação induzida por colisão (CID). Os espectros das amostras MS e MS2 foram comparados in silico com a tripsina digestiva humana.

• Um total de 320 espectros foram identificados com 29 diferentes peptídeos derivados da proteína rhANXA5. Estes peptídeos cobrem 80% da sequência rhANXA5.

Metodologia Identificação de rhANXA5 por espectrometria de massa

Metodologia Determinação da massa molecular• Purificada rhANXA5 amostras foram dessalinizadas , reconstituída em acetonitrilo 50 % / MilliQ

- água 49 % / ácido fórmico a 1 % e directamente injectada utilizando uma seringa de 500 uL ( Hamilton Company , Reno , NV , EUA) num modo estático numa fonte iónica de electrospray IonMax .

• Os parâmetros de fonte de electropulverização foram como se segue : modo de ião positivo , 4,5 kV de tensão aplicada à fonte de electrospray , 5 unidades arbitrárias (variação 0-100 ) de fluxo de gás bainha , 45,6 V de tensão capilar , 250 ° C de temperatura capilar , e 238,8 V de tensão de tubo de lente .

• Espectros completa (600-2000 m / intervalo z) foram coletados em um Thermo Orbitrap Descoberta XL no modo de perfil usando o analisador ion trap linear (modo ITMS ) . O espectro médio foi processado com o software MagTran [25] para a carga deconvolution estado.

Resultado Determinação da massa molecular

Figura 3: Determinação da massa molecular rhANXA5 por espectrometria de massa. a) espectros ESI-EMTF de rhANXA5 mostrando a distribuição estado de carga.B) valor determinado experimentalmente de 35804 da para a massa molecular média rhANXA5 após espectros.

Metodologia FITC-anexina V

• Para confirmar a capacidade de detectar células que sofrem apoptose, rhANXA5 foi marcado com Fluoro Tag ™ FITC Conjugation Kit.

• Células de melanoma B16F10 foram cultivadas em meio DMEM.

• Para induzir a apoptose as células foram tratadas com cisplatina em diferentes concentrações (0, 40, 80 e 160 µg/mL) e depois de 6 e 12 horas as células foram coradas com um home-made kit e um kit comercial da BD Biosciences.

• Todos os dados foram coletados em um Citômetro de fluxo FACS Canto II e analisados usando o software FlowJo.

• Células + 5 µL de corante não-vital PI + (5 µL de rhANXA5 conjugado com FITC home-made kit ou com 5 µL de rhANXA5 conjugado com FITC comercial)

Fonte: lamed.ccb.usp.br

Citometria de Fluxo

• A Citometria de Fluxo é uma tecnologia rápida e precisa que mede e analisa as propriedades ópticas de um grande número de células ou partículas separadamente. É necessário que as amostras a serem testadas estejam em suspensão.

• As amostras serão analisadas através da marcação por imunofluorescência com diferentes fluorocromos, os quais serão excitados pelo laser.

• O uso de fluorocromos com características diferentes de fluorescência, vários lasers e vários fotodetectores permite aos citômetros de fluxo medir muitas características de cada partícula simultaneamente, como diâmetro celular, estruturas granulares no interior das células e intensidade de fluorescência.

Conclusões • Cultivos em batelada alimentada representam uma alternativa para cultivos em Shaker,

permitindo o controle das variáveis do processo, melhoria na concentração de biomassa e rendimento do produto.

• Neste trabalho foram produzidas 28.5 mg de anexina V recombinante purificada, obtida em 3 g de células hidratadas cultivadas em batelada alimentada.

• A utilização do marcador fluorescente para marcar anexina V e assim identificar as células em apoptose está atualmente limitado a estudos histológicos de triagem de células realizados in vitro. A sua utilização para exames de imagem in vivo é dificultada principalmente por questões de custo. Assim, a produção em larga escala poderá ampliar a utilidade comercial para rhANXA5, reduzindo custos e permitindo um maior acesso as comunidades científica e médica para este produto.

Referências

• Sequenciamento automático. Disponível em: <http://www.scielo.org.bo/scielo.php?pid=S2072-92942012000100002&script=sci_arttext > . Acesso em: 2015•Eletroforese em gel de poliacrilamida. Disponível em: < http://biologia.ifsc.usp.br/biomolcel1/roteiros/roteiro08.pdf > . Acesso em: 2015.•SDS-page. Disponível em: < http://projectsday.hci.edu.sg/2011/15-FinalsWeb/Cat-01/1-084/exp.html > . Acesso em: 2015.•Cromatografia de alta performance HPLC. Disponível em: < http://www.crq4.org.br/sms/files/file/conceitos_hplc_2010.pdf >. Acesso em: 2015. •University Of California . Disponível em: < http://modbase.compbio.ucsf.edu/modbase-cgi/model_details.cgi?queryfile=1426345352_9844&searchmode=default&displaymode=moddetail&referer=yes&snpflag=&>. Acesso em: 2015. •Google scholar: Disponível em: < https://scholar.google.com.br/scholar?hl=en&q=apoptose+para+diagnosticos+de+cancer&btnG=&as_sdt=1%2C5&as_sdtp=>. Acesso em: 2015. •OLIVEIRA, Aline Llanos de et al . Avaliação da atividade mitocondrial no processo de morte celular em células tumorais de mama após tratamento com Ciclosporina A e Photosan3®. Rev. Bras. Eng. Bioméd., Rio de Janeiro , v. 29, n. 2, June 2013 . Available from <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1517-31512013000200009&lng=en&nrm=iso>. access on 2015. http://dx.doi.org/10.4322/rbeb.2013.021•INVITROGEN. A high efficiency system for cloning blunt-ended PCR products: Catalog numbers K2700-20, K2700-40, K2750-20, and K2750-40. Carlsbad, CA: Invitrogen, 2013.•AMARAL, C. B. et al. Discriminação alélica em ovinos naturalizados do Pantanal Sul-Matogrossense por meio de marcadores microssatélies. Journal Of TheSelva Andina Research Society. La Paz, p. 1-13. jul. 2012. Disponível em: <http://www.scielo.org.bo/pdf/jsars/v3n1/v3n1_a02.pdf>. Acesso em: 15 mar. 2015.MARDER, Laura S et al. Production of recombinant human annexin V by fed-batch cultivation. Bmc Biotechnology. Reino Unido, p. 1-9. abr. 2014. Disponível em: <http://www.biomedcentral.com/1472-6750/14/33>. Acesso em: 2015