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RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
SECCIÓN DE APROBACIÓN
ELABORADO POR/ MsC. Alejandro Portillo Vaquer FIRMA/
Responsabilidad/ J´Dpto de Control de la Calidad EPOVAC FECHA/
REVISADO POR/ MSc. Jinnay Rodríguez FIRMA/
Responsabilidad/ Especialista Asuntos Regulatorios CIMAB S.A FECHA
REVISADO POR/ Dra. Giselle Suárez Martínez FIRMA/
Responsabilidad/ Asesor Médico CIMAB S.A FECHA
REVISADO POR/ MSc. Anamary Bencomo FIRMA/
Responsabilidad/ Comercial Regional CIMAB S.A FECHA/
REVISADO POR/ MSc. Aurora Tamara García Melo FIRMA/
Responsabilidad/ J´ Dpto. Aseg. Calidad EPOVAC FECHA/
REVISADO POR/ Dra.C. Yamile González González FIRMA/
Responsabilidad/ Gerente Producto. FECHA/
REVISADO POR/ Dra. Yusnely Román Rodríguez FIRMA/
Responsabilidad/ Responsable de Farmacovigilancia CIMAB S.A FECHA/
APROBADO POR/ MSc. Yanet Borrego Morales FIRMA/
Responsabilidad/ Directora de EPOVAC FECHA/
APROBADO POR/ MSc. Yamira Busutil Sosa FIRMA/
Responsabilidad/ Directora de Calidad y Asuntos Regulatorios FECHA/
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INDICE PAG
RESUMEN.............................................................................................................................3
INDICE DE ABREVIATURAS ..............................................................................................4
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................5
LISTA DE TABLAS ...............................................................................................................9
1. INTRODUCCION ......................................................................................................... 12
2. OBJETIVO ................................................................................................................... 12
3. ALCANCE .................................................................................................................... 12
4. DESCRIPCION DEL PROCESO DE ior®EPOCIM (eritropoyetina). .......................... 12
5. MATERIALES Y METODOS. ...................................................................................... 35
6. RESULTADOS Y DISCUSION. .................................................................................... 47
7. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 127
7. REFERENCIAS ............................................................................................................. 128
8. REVISIÓN HISTÓRICA ................................................................................................ 133
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RESUMEN
El producto terminado (PT) de eritropoyetina humana recombinante (EPOhr) producido por el
Centro de Inmunologia Molecular (CIM), se comercializa bajo el nombre de ior® EPOCIM en
Cuba, con número de registro sanitario: 0095 aprobado el 21/abril/1998 para EPO 2 000 UI/mL,
B-17-148-B03 aprobado el 25/octubre/2017 para EPOhr 3 000 UI/mL, 0096 aprobado el
21/abril/1998 para EPOhr 4 000 UI/mL, B-17-146-B03 aprobado el 25/octubre/2017 para EPOhr
5 000, B-04-020-B03 aprobado el 23/enero/2004 para EPO 10 000 UI/mL, B-17-145-B03
aprobado el 25/octubre/2017 para EPOhr 30 000 UI/mL y B-17-147-B03 aprobado el
25/Xoctubre/2017 para EPOhr 40 000 por el Centro para el Control Estatal de los Medicamentos,
Dispositivos y Equipos médicos de Cuba (CECMED).
La experiencia comercial de ior® EPOCIM en el mercado, incluye, el registro sanitario en 29
países demostrando su seguridad y eficacia.
La eritropoyetina (EPO) es un factor estimulante de la eritropoyesis en los mamíferos producido
por tecnología del ADN recombinante. Tiene una estructura y un mecanismo de acción bien
caracterizado y establecido.
Con el fin de establecer la biocomparabilidad, el CIM realizó este estudio de comparabilidad
para demostrar la similitud físico-química, biológica, preclínica y clínica del producto
ior®EPOCIM con el producto de referencia, EPREX®/ERYPO® (Estudios realizados en
laboratorios en México, Canada, Cuba y Tailandia).
La estructura y funcionabilidad de ior®EPOCIM se ha caracterizado a través de métodos
analíticos sensibles y robustos. Las diferencias obtenidas en la caracterización entre ior®
EPOCIM y EPREX®/ERYPO®, específicamente en los estudios de N-Glicosilación y el perfil
de isoformas por electroforesis capilar de zona (EC) no tuvieron un impacto en los estudios
preclínicos, al no obtenerse diferencias estadísticas significativas en los resultados de actividad
biológica in vitro (proliferación celular) e in vivo (ratones normocitemicos) y afinidad (Biacore)
de ior® EPOCIM y EPREX®/ERYPO®.
Los resultados de los estudios preclínicos y clínicos obtenidos, confirman la similitud del
ior®EPOCIM con el producto de referencia. La totalidad de evidencia documentada en este
reporte incluye los datos analíticos, funcionales, preclínicos y clínicos, y permite determinar la
biocomparabilidad del ior®EPOCIM con el producto de referencia EPREX®/ERYPO®
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INDICE DE ABREVIATURAS
ADN: Ácido Desoxirribonucleico.
ANOVA: Análisis de Varianza.
AUC: Área bajo la curva
BioCen Centro Nacional de Biopreparados.
BRP Preparación Biológica de Referencia
BSA Suero de Albumina Bovina
CECMED: Centro para el Control Estatal de los Medicamentos, Dispositivos y Equipos
CENPALAB: Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio.
CIGB Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
CIM: Centro de Imunologia Molecular.
CIMAB Representante exclusivo del Centro de Inmunología Molecular para la
comercialización de productos biofarmacéuticos.
Empresa comercializadora de produto biotecnológicos.
Cl Aclaramiento total
CME: Centro de Masa Espectral.
COFEPRIS: Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.
COP Parámetros Críticos de Operación
CRS Sustancia Química de Referencia
CV%: Coeficiente de variación en porciento.
CHCM: Concentración Hemoglobina Corpuscular Media.
CHO Célula de Ovario de Hámster Chino
DC Dicroísmo circular
DE: Desviación estándar.
DO: Densidad óptica.
EAG: Evento Adverso Grave
EC Electroforesis capilar de zona
EM Espectrometría de masas
Emax: Respuesta máxima
EPO Eritropoyetina
EPOhr Eritropoyetina humana recombinante
FB: Farmacopea Británica
FE: Farmacopea Europea.
FR Fase reversa
GF Gel filtración
Hb Hemoglobina
HCM: Hemoglobina Corpuscular Media.
HCP Proteína contaminante de la célula hospedera
HPLC Cromatografía liquida de alta resolución
Hto Hematocrito
IEF Isoelectroenfoque
IFA Ingrediente Farmaceutico Activo
IFA: Ingrediente Farmacéutico Activo.
IPC Control en proceso
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IPC Controles de proceso
IPT Ensayos de proceso
Ka: Constante de asociación.
KD Farmacodinamia
Kd: Constante de disociación.
KOP Parámetros de Operación Claves
LAL: Lisado de Amebocitos de Limulus
LAMMB: Laboratorio Nacional para la Producción y Análisis de Moléculas y
Medicamentos Biotecnológicos.
MRT Material de Referencia de Trabajo
MRT: Tiempo médio de residencia.
OP Parámetros de Operación
Phe Fenil alanina
PP Parámetro de desempeño
PRCA Aplasia de células rojas
PT Producto terminado
QFB Químico físico y biológico
RAP: Revisión Anual de Producto.
EPOhr Eritropoyetina humana recombinante
Rmax Respuesta máxima.
SEPB Subcomité de evaluación de productos biotecnológicos
T ½ α: Tiempo vida media de la fase de distribución
T ½ β: Tiempo vida media de la fase de eliminación
TA Tanque agitado
TC Toxicocinética
Trp Triptófano
Tyr Tirosina
UDIBI: Unidad de desarrollo e investigación en bioprocesos.
UE: Unidades de Endotoxinas.
UI Unidades internacionales
UNAM: Universidad Nacional Autónoma de México.
USP Farmacopea de los Estados Unidos de América
VCM Volumen corpuscular medio
VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana
Vss Volumen de distribución en el estado estacionario
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Comparación de los espectros de emisión de 10 lotes del IFA a una longitud de onda de
excitación de 280 y 295 nm utilizando el buffer de formulación en cada corrida.
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Figura 2. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-250 nm) de las muestras: CE-C01-M77
(3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505), CE-C01-M80
(3342/P1506), CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540), CE-C01-M83
(3342/P1541), CE-C01-M84 (3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y CE-C01-M86
(3342/P1544).
Figura 3. Espectro de dicroísmo circular en la región del UV cercano (260-330 nm) de las muestras:
CE-C01-M77 (3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505),
CE-C01-M80 (3342/P1506), CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540),
CE-C01-M83 (3342/P1541), CE-C01-M84 (3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y
CE-C01-M86 (3342/P1544).
Figura 4. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-260 nm) de las muestras del IFA de
ALVERITIN® y EPREX® analizadas en SBS/Tailandia.
Figura 5. Cromatograma del mapeo peptídico del blanco.
Figura 6. Cromatograma del mapeo peptídico de las muestras analizadas. De arriba hacia abajo:
MRT(QFB)rh-EPO/0113, 3342/P1511, 3342/P1512, 3342/P1513, el lote de EPREX® FDS
6Q01 y el blanco del ensayo.
Figura 7. Secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina (Referencia FE 1316, 2016):
Figura 8. Secuencia de aminoácidos del IFA de ALVERITIN®
Figura 9. Secuencia de aminoácidos del lote de EPREX®
Figura 10. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes reductoras teñido con azul de
Coomassie. Se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular Bench
Mark, carril 2 Lote: FDS6Q01, carril 3 Lote: FAS 4800, carril 4 Lote: FBS 4Z00, carril 5
vacío, carril 6 Lote: 3342/P1511, carril 7 Lote: 3342/P1512, y carril 8 Lote: 3342/P1513.
Figura 11. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes no reductoras teñido con azul de
Coomassie. Se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular Bench
Mark, carril 2 Lote: FDS6Q01, carril 3 Lote: FAS 4800, carril 4 Lote: FBS 4Z00, carril 5
vacío, carril 6 Lote: 3342/P1511, carril 7 Lote: 3342/P1512, y carril 8 Lote: 3342/P1513.
Figura 12. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes no reductoras teñido con azul de
Coomassie. Se cargó 12 μl de cada muestra. Carril 1 Lote FBS 4Z00, carril 2 Lote: FAS
4800, carril 3 vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote: LP00515 y carril 6 Lote:
LP00615. MP corresponde al marcador de peso molecular Bench Mark.
Figura 13. Western Blot en membrana de PVDF revelada con solución de carbazol. Carril 1 Lote FBS
4Z00, carril 2 Lote: FAS 4800, carril 3 vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote:
LP00515 y carril 6 Lote: LP00615. MP corresponde al marcador de peso molecular Dual
color.
Figura 14. Western Blot. Carril 1: 10 ug MRT(QFB)EPOhr/0113. Carril 2: 0,2 ug
MRT(QFB)EPOhr/0113. Carril 3: 10 ug Lote FDS 6Q01. Carril 4: 0,2 ug Lote FDS 6Q01.
Carril 5: 10 ug Lote LP00615. Carril 6: 0.2 ug Lote LP00615. Carril 7: 10 ug Lote
3342/P1513. Carril 8: 0.2 ug Lote 3342/P1513
Figura 15. Western Blot .Carril 1: 10 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 2: 0,2 ug
MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 3: 10 ug Lote FAS 4800.Carril 4: 0,2 ug Lote FAS
4800.Carril 5: 10 ug Lote LP00415.Carril 6: 0.2 ug Lote LP00415.Carril 7: 10 ug Lote
3342/P1511.Carril 8: 0.2 ug Lote 3342/P1511
Figura 16. Western Blot.Carril 1: 10 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 2: 0,2 ug
MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 3: 10 ug Lote FAS 4Z00.Carril 4: 0,2 ug Lote FAS
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4Z00.Carril 5: 10 ug Lote LP00515.Carril 6: 0.2 ug Lote LP00515.Carril 7: 10 ug Lote
3342/P1512.Carril 8: 0.2 ug Lote 3342/P1512
Figura 17. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.996, el
cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).
Figura 18. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.993, el
cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).
Figura 19. Gel de IEF teñido con nitrato de plata..MRT: 4 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 1: 4 ug
FDS6Q01.Carril 2: 4 ug 3342/P1512
Carril 3: 4 ug 3342/P1513.
Figura 20. Gel de IEF tenido con nitrato de plata.MRT: 4 ug MRT(QFB)EPOhr/0113.Carril 1: 4 ug
FAS4800.Carril 2: 4 ug FBS4Z00.Carril 3: 4 ug 3342/P1511
Figura 21. Perfil de IEF de varias eritropoyetinas biosimilares y original. IEF fue desarrollado en un
rango de pH de 2-6. Fuente: Reichel y cols, 2009.
Figura 22. Espectro originado de cálculos derivativos de segundo orden de Tiroglobulina. El eje X
corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda
derivada del espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos
correspondientes al análisis del 17dic2015.
Figura 23. Espectro originado de cálculos derivativos de segundo orden de Tiroglobulina. El eje X
corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda
derivada del espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos
correspondientes al análisis del 10may2016.
Figura 24. Comparación de los espectros (orden cero) obtenidos del barrido de adsorción UV de 250 a
350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA de ALVERITIN®.
Figura 25. Comparación de los espectros derivativos de segundo orden obtenidos del barrido de
adsorción UV de 250 a 350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA de
ALVERITIN®.
Figura 26. Espectro de emisión de BSA a excitando a 280 y 295nm. Datos correspondientes a la
verificación del 16dic2015.
Figura 27. Espectro de emisión de BSA a excitando a 280 y 295nm. Datos correspondientes a la
verificación del 26abri2016.
Figura 28. Comparación de los espectros de emisión de EPREX®/ERYPO® y el IFA excitando a 280
y 295nm.
Figura 29. Curva de calibración del estándar de homopolímero de glucosa. Se muestra la correlación
después de un ajuste polinomial de tercer orden, la cual fue usada para el cálculo de las
unidades de glucosa (UG) en los cromatogramas. Verificación correspondiente al
03dic2015 (A) y al 17ago2016 (B).
Figura 30. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de
EPREX®/ERYPO®.
Figura 31. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras del IFA.
Figura 32. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de EPREX®/
ERYPO® y el IFA.
Figura 33. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Vera y cols, 2011.
Figura 34. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Liem y cols, 2016.
Figura 35. Cromatogramas obtenidos por el método de HPLC-GF.
1- MRT: MRT(QFB)EPOhr/0113
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2- IFA Lote: 3342/P1511
3- IFA Lote: 3342/P1512
4- IFA Lote: 3342/P1513
5- Innovador ERYPO® Lote: FAS 4800
6- Innovador ERYPO® Lote: FBS 4Z00
7- Innovador EPREX® Lote: FDS 6Q01
Figura 36. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor
de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).
Figura 37. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor
de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).
Figura 38. Comparación del efecto proliferativo in vitro del EPREX®/ERYPO® vs ALVERITIN®.
Figura 39. Frecuencia de reticulocitos en respuesta a 67.5, 90 y 120 UI/ratón del medicamento de
prueba, referencia y Material de Referencia Interno, 72 horas después de su administración
a ratones B6D2F1. A los ratones B6D2F1 se les administró vía subcutánea uno de los
tratamientos: medicamento de prueba, medicamento de referencia, Material de Referencia
Interno en concentración de 67.5, 90 y 120 UI/ratón o control negativo (SF). Después de 72
horas de la administración de los tratamientos se obtuvo una muestra sanguínea de cada
uno de los ratones y se tiño con azul de metileno) para evaluar la frecuencia de reticulocitos
por cámara de neubauer. La gráfica muestra la frecuencia media de reticulocitos inducidos
por las muestras en 6 ratones por grupo. Las barras corresponden a la desviación estándar
de cada media. Los valores medios de los ratones controles negativos estuvieron entre 10-
15 reticulocitos (Datos no incluidos en las gráficas).
Figura 40. Sensogramas obtenidos en los lotes de EPREX®/ERYPO®. Tiempo vs Respuesta (RU).
Figura 41. Sensogramas obtenidos en los lotes de ALVERITIN®. Tiempo vs Respuesta (RU).
Figura 42. Respuesta a Altas dosis (600 UI/kg) de ior®EPOCIM y EPREX® para reticulocitos, RBC,
hemoglobina y Hematocritos. A y C (machos) y B y D (hembras).
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LISTA DE TABLAS
Tabla A: Resgistros sanitarios otorgados.
Tabla 1: Controles de proceso para medio de cultivo.
Tabla 2: Controles y criterios de aceptación de las soluciones para su uso en la etapa de
purificación.
Tabla 3. Controles de proceso de la etapa descongelación.
Tabla 4. Controles de proceso de la etapa de cultivo en frascos T.
Tabla 5. Controles de proceso de la etapa de cultivo en rollers (inóculo).
Tabla 6. Controles de proceso de la etapa de fermentación en 30 L.
Tabla 7. Parámetros de operación de la etapa de fermentación en 1000 L.
Tabla 8. Controles de proceso de la etapa de fermentación en 1000 L.
Tabla 9. Parámetros de desempeño de la etapa de fermentación en 1000 L.
Tabla 10. Parámetros de operación de la etapa de cosecha.
Tabla 11. Controles de proceso de la etapa de cosecha.
Tabla 12. Controles de proceso de la etapa de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.
Tabla 13. Controles de proceso de la etapa de Sephadex G-25.
Tabla 14. Controles de proceso de la etapa de Quelatos Metálicos.
Tabla 15. Controles de proceso de la etapa de Sephadex G-25.
Tabla 16. Controles de proceso de la etapa de Q.
Tabla 17. Controles de proceso de la etapa de Superdex.
Tabla 18. Comportamiento de los controles de proceso en la etapa de cromatografía filtración en gel
durante los años 2015 y 2016.
Tabla 19. Controles de proceso de la etapa de confección del IFA.
Tabla 20. Controles de proceso en la etapa de Microfiltración.
Tabla 21. Resultados de los atributos de calidad, especificaciones y métodos de análisis del IFA
obtenidos en el CIM durante los años 2014, 2015 y 2016. Valores medios anuales.
Tabla 22. Resultados del nivel de contaminantes y concentración de proteínas presentes en los lotes
de IFA utilizados en el estudio de biocomparabilidad.
Tabla 23. Comparación estadística entre los espectros del grupo 1 y el grupo 2 del IFA. El análisis
estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo ANOVA.
Tabla 24. Determinación del centro de masa espectral (CME) a 280 y 295nm de excitación para los
10 lotes de IFA evaluados.
Tabla 25. Conformación estructural delas muestras del bloque 1 y 2.
Tabla 26. Resultados del análisis de secuenciación N-terminal de 10 lotes de IFA.
Tabla 27: Listado de lotes utilizados en el estudio de biocomparabilidad.
Tabla 28. Listado de matriz para caracterización física/química/biológica y laboratorio participante.
Tabla 28A: Listado de ensayos preclínicos y laboratorio participante.
Tabla 28B: Listado de ensayos clinicos
Tabla 29. Resultados del análisis de secuenciación del lote de IFA y EPREX®.
Tabla 30. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante reductoras de las muestras
de EPREX®/ERYPO®.
Tabla 31. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante reductoras de las muestras
del IFA.
Tabla 32. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las
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muestras de EPREX®/ERYPO®.
Tabla 33. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las
muestras del IFA.
Tabla 34. Análisis estadístico tipo t-Student.
Tabla 35. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras del IFA.
Tabla 36. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras de EPREX®/ERYPO®.
Tabla 37. Resumen de biocomparabilidad entre los espectros derivativos de segundo orden de los
medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.
Tabla 37A. Resumen de biocomparabilidad entre las intersecciones obtenidas en el rango 285-295nm
de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.
Tabla 38. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 16dic2015
Tabla 39. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 26abri2016
Tabla 40. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras de
EPREX®/ERYPO®.
Tabla 41. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras del IFA.
Tabla 42. Resumen de la comparación de espectros de fluorescencia. Los resultados obtenidos se
presentan tal y como los arroja el ANOVA.
Tabla 43. Resumen de la comparación de CMEs por medio del análisis estadístico t de Student. Los
resultados obtenidos se presentan tal y como los arroja el software Prism 6.
Tabla 44. Resumen de biocomparabilidad entre los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.
Estructuras propuestas para los N-glicanos con base en su migración en unidades de
glucosa, asumiendo que la proteína se produjo en una línea celular murina El análisis
estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p
de dos colas y un intervalo de confianza del 95%. Estructuras propuestas murina. Las
abreviaturas utilizadas son: A: Núcleo quitobiosa con tres manosas y dos N-
acetilglucosaminas. F: Fucosa. G: Galactosa. M: Manosa. S: Ácido siálico. LAC:
Lactosamina (N-acetilglucosamina-G). Los números se refieren al número de cada residuo
en el glicano.
Tabla 45. Resumen de biocomparabilidad entre los grupos de N-glicanos encontradas en las
muestras de EPREX®/ERYPO® y el IFA (producción en línea celular murina). El análisis
estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p
de dos colas y un intervalo de confianza del 95%.
Tabla 46. Verificación del sistema.
Tabla 47. Resultados de electroforesis capilar.
Tabla 48. Resultados de electroforesis capilar.
Tabla 49. Resultados de electroforesis capilar.
Tabla 50. Resumen de la verificación por HPLC-GF.
Tabla 51. Resumen de la comparación por HPLC-GF.
Tabla 52. Resumen de la comparación de los resultados de HPLC-GF por medio de un ANOVA
Tabla 53. Resultados del contenido de ácido siálico en las muestras del IFA.
Tabla 54. Determinación de endotoxinas bacterianas por LAL.
Tabla 55. Resultado de endotoxinas para los lotes de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®.
Tabla 56. Resultados de conteo de partículas subvisibles para los lotes de ALVERITIN®.
Tabla 57. Resultado de partículas visibles en los lotes de EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN®.
Tabla 58. Resumen estadístico de la comparación entre el efecto del medicamento
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RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN® sobre la proliferación en células TF-1.
Tabla 59. Resultados de potencia y rango mínimo- máximo para los lotes de ALVERITIN® y
EPREX®/ERYPO® determinados por ANOVA de líneas paralelas.
Tabla 60. Potencia: Resultados del ANOVA entre los valores de % potencia de ALVERITIN® y
EPREX®/ERYPO®.
Tabla 61. Resultados de actividad específica de los tres lotes de IFA de ALVERITIN®
determinados mediante el método in vivo de ratones normocitemicos.
Tabla 62. Biacore: Análisis t Student de los parámetros cinéticos entre ALVERITIN® y
EPREX®/ERYPO®.
Tabla 63. Listado de estudios no clínicos realizados y laboratorio participante.
Tabla 64. Registros sanitarios otorgados de ior® EPOCIM hasta el 31 diciembre 2016.
Tabla 65. Pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización por año.
Tabla 66. Total de pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización y en ensayos
clínicos.
Tabla 67. Ensayos clínicos terminados con ior® EPOCIM hasta 31 diciembre 2016
Tabla 68. Reportes espontáneos de EAG.
Tabla 69. Relación de EAG relacionados con ior®EPOCIM reportados hasta 31 diciembre de 2016.
Tabla 70. Relación de eventos adversos graves con incidencia ≥ 5 % en pacientes tratados con ior®
EPOCIM en las indicaciones aprobadas independientemente de su causalidad (acumulado
PSUR 2005-2010, PSUR 2011, IPS-2017).
Tabla 71. Resultados de la determinación de anticuerpos anti-EPO en pacientes a los que se les ha
suministrado ior® EPOCIM. Ensayo realizado el día 10nov2004.
Tabla 72. Resultados de la determinación de anticuerpos anti-EPO en pacientes a los que se les ha
suministrado ior® EPOCIM. Ensayo realizado el día 27oct2004.
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1. INTRODUCCION
La eritropoyetina humana recombinate es una hormona glucoproteína de 30.4 kDa compuesta por
165 aminoácidos, la cual es secretada en respuesta a la hipoxia celular (Jelkman, 2011). La
actividad principal es controlar la producción de células eritroides a través de la promoción de la
sobrevivencia, proliferación y diferenciación de progenitores eritroides en la medula ósea
(Miyajima y Kinoshita, 1999). Es utilizada para corregir la anemia asociada a insuficiencia renal
terminal, falla renal crónica, distintos tipos de cáncer, enfermedades autoinmunes, VIH, hepatitis
C, incrementar los niveles de eritrocitos, evitar el riesgo de contraer infecciones post-
transfusionales y mejorar la calidad de vida del paciente (Jelkman, 2003; García, 2011).
Actualmente los biosimilares en general, y más específicamente los de EPOhr, muestran ventajas
significativas para la salud pública aumentando su disponibilidad en el acceso de los pacientes a
medicamentos. Así como la seguridad en el suministro, permitiendo ahorros para los sistemas de
salud, como ya se ha visto en otras regiones como Europa (IMS, 2012).
La comercialización de medicamentos biosimilares permite la competencia con los
medicamentos innovadores de referencia y abre una oportunidad para la reducción de los costos,
especialmente en situaciones de crisis económica contribuyendo a la sostenibilidad del sistema
sanitario (Beatriz, 2015).
Con la introducción de los biosimilares en Cuba, la población cubana se beneficia con el acceso
adecuado a los tratamientos terapéuticos avanzados en la actualidad.
Los resultados obtenidos usando los métodos analíticos recomendados en la guía de
biocomparabilidad emitida por la FDA (FDA/Biosimilarity, 2015), en cuanto a la estructura y
función, demostraron que ior®EPOCIM, con un alto grado de confianza, es biosimilar al
producto de referencia (EPREX®/ERYPO®). Además, los estudios incluyen resultados sobre
efectos toxicológicos y farmacocinéticos en animales de laboratorio y resultados clínicos que
demuestran la no inferioridad del ior® EPOCIM.
2. OBJETIVO
Demostrar la biocomparabilidad del ior®EPOCIM utilizando EPREX®/ERYPO® como
producto de referencia.
3. ALCANCE
Es aplicable a la producción y la analítica del producto ior®EPOCIM.
4. DESCRIPCION DEL PROCESO DE ior®EPOCIM (eritropoyetina).
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El biomedicamento ior®EPOCIM se fabrica utilizando el Ingrediente farmacéutico activo (IFA)
producido en el CIM.
4.1 Experiencia comercial de ior®EPOCIM.
La experiencia comercial de ior®EPOCIM en el mercado, incluye hasta el cierre del año 2016, el
registro sanitario en 29 países (Tabla A) demostrando su seguridad y eficacia. Para mas detalles
puede remitirse al acápite 5.4.2 de este informe.
Tabla A. Registros sanitarios otorgados.
No País
1 Cuba
2 Chile
3 República Dominicana
4 Jamaica
5 Colombia
6 Brasil
7 Ecuador
8 Perú
9 Honduras
10 México
11 Panamá
12 EL Salvador
13 Guatemala
14 Venezuela (SERTERE) (Espromed
BIO)
15 Costa Rica
16 India
17 Nicaragua
18 Bolivia
19 Vietnam
20 Argentina
21 Túnez
22 Filipinas
23 Bielorrusia
24 Ucrania
25 Tailandia
26 Turquía
27 Nigeria
28 Myanmar
29 Paraguay
4.2 Proceso de producción del Ingrediente Farmaceutico Activo.
El proceso de producción del IFA consta de las siguientes etapas:
- Preparación de medios y soluciones.
Procesos de expansión celular fermentación
- Descongelación.
- Proceso de cultivo de células en frascos “T”.
- Expansión en frascos rotatorios e inóculo.
- Fermentación en 30 L para la escala productiva.
- Fermentación a escala de producción de 1000 L.
- Cosechas.
Proceso de purificación.
- Cromatografía de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.
- Cromatografía de filtración en gel.
- Cromatografía de pseudo-afinidad por Quelatos metálicos.
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- Cromatografía de filtración en gel.
- Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose Fast Flow .
- Cromatografía de filtración en gel.
- Confección del IFA.
- Microfiltración.
- Definición del lote en cada una de las etapas del proceso hasta la confección del IFA.
Preparación de medios y soluciones.
El medio de cultivo empleado se preparara con agua purificada; cumpliendo con los estándares
establecidos en la USP para la industria biotecnológica y farmacéutica. El medio preparado es filtrado,
esta consiste en un esquema de filtración en serie; primeramente por un tamaño de poro 3 +0,8 μm y
posteriormente una filtración esterilizante de 0,45 +0,2 μm. El medio es almacenado en bolsa estéril y
apirogénica realizándose un muestreo para su liberación. En la tabla 1, se exponen los controles de
proceso (IPC) a cumplir para que el medio de cultivo sea usado en la etapa productiva de fermentación.
Tabla 1: Controles de proceso para medio de cultivo.
Controles Clasificación Criterios de aceptación
pH IPC 6,85 < pH < 7,22
Conductividad IPC 11 mS/cm < Conductividad < 15
mS/cm
Inspección visual IPC Solución transparente después
de 48h a 37ºC
Viabilidad IPC Viabilidad > 85 %
Xv células IPC Xv > 0,6 x 106 células/mL
Las soluciones se prepararan con agua purificada y con agua para inyección según corresponda. Todas
las soluciones preparadas son filtradas a través de filtros de tamaño de poro 0,45 +0,2 μm y
almacenadas en bolsa estéril y apirogénica por no más de 30 días según procedimientos. En la tabla 2
se expone para cada solución sus IPC y criterios de aceptación para que las soluciones preparadas sean
usadas en la etapa productiva de purificación de la EPOhr.
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Tabla 2: Controles y criterios de aceptación de las soluciones para su uso en la etapa de purificación.
Soluciones Controles y Criterios de aceptación
Agua para inyección
pH: 5,0-7,0
Conductividad : ≤ 1,2µS/cm
Biocarga:< 10 UFC/100mL
Endotoxinas: < 0,25 UE/mL
Agua Purificada
pH: 5,0-7,0
Conductividad : ≤ 1,2µS/cm
Biocarga:< 100 UFC/mL
Endotoxinas: < 0,25 UE/mL
Tris 20mM, Tween 20 al 1%, pH 7,5 (T1) pH: 7,39-7,58
Conductividad (mS/cm): 0,9 - 3
Tris 20mM, NaCl 1M,Tween 20 al 1%, pH 7,5 (T3) pH: 7,39-7,58
Conductividad (mS/cm): 70 - 90
Alcohol etílico al 20%, KH2PO4 0,1M, pH 8 pH: 7,7-8.3
Conductividad (mS/cm): 12 - 16
Na2HPO4 17mM, NaH2PO4 3mM, NaCl 0,5M, pH 7,2 pH: 7,15 – 7,25
Conductividad (mS/cm): 40 - 60
Na2HPO4 0,2 mmol/L, NaH2PO4
99, 8 mmol/L, NaCl 0, 5 mol/L pH 4,1
pH: 4,1 – 4,3
Conductividad (mS/cm): 40 - 60
Na2HPO4 1,81 mmol/L, NaH2PO4 18,18 mmol/L, pH 6 pH: 5,9 – 6,1
Conductividad (mS/cm): 0,9 - 3
Acetato de sodio 50 mmol/L, Tween 0,01%, pH 4,5 pH: 4,3 – 4,5
Conductividad (mS/cm): 2,0 – 3,5
Na2HPO4 3 mmol/L, NaH2PO4 17 mmol/L,
NaCl 164 mmol/L pH 6
pH: 5,9 – 6,1
Conductividad (mS/cm): 16 - 20
NaCl 100mM, Citrato de sodio 20mM, Ácido cítrico
0,36mM, Tween 20 al 0,02%, pH 6,9
pH: 6,85 – 6,95
Conductividad (mS/cm): 10 – 15
Alcohol etílico al 70% pH: NA
Conductividad (mS/cm): NA
Hidróxido de sodio 0,01 M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 1,5 - 4
Hidróxido de sodio 0,1 M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 21 - 24
Hidróxido de sodio 0,5 M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 90-105
Hidróxido de sodio 1,0 M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 160 - 190
Sulfato de Cobre 0,1M pH: NA
Conductividad (mS/ cm): 7 - 10
Cloruro de sodio 3M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 180 - 200
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Soluciones Controles y Criterios de aceptación
Cloruro de sodio 0,09% pH: NA
Conductividad (mS/cm): 1 - 3
Cloruro de sodio 0,5 M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 42 - 49
Cloruro de sodio 2M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 140 - 150
EDTA 50 mM, NaCl 1M pH: NA
Conductividad (mS/cm): 85 - 92
Alcohol etílico al 20% pH: NA
Conductividad (mS/cm): NA
* A todas las soluciones se le realiza inspección visual, Criterio: solución transparente después de 24 h.
Procesos de expansión celular y fermentación.
- Proceso de expansión celular.
La línea se obtuvo por co-introducción de los plásmidos pKG-Xho-EPO-Hind y pSV2 DHFR en el
genoma de células CHO dhfr-. Las células CHO dhfr- son un clon de células de ovario de hámster
chino, deficientes del gen para la dihidrofolato reductasa (dhfr). La línea productora de la EPOhr se
obtuvo por la transfección efectiva de las células CHO dhfr- con el DNA exógeno que son dos
plásmidos que contienen entre otros los genes de la eritropoyetina humana y el de la DHFR.
El primer paso del proceso de producción es la descongelación de un ámpula del banco de trabajo. Las
ámpulas deben contener una cantidad de células ≥ 5x106 células, con una viabilidad ≥ 80%. El ámpula
extraída se lleva desde la temperatura de −196ºC hasta la temperatura ambiente (18-24ºC) por
inmersión en un baño de agua a 37,0 ± 1,0˚C. Una vez descongeladas, las células se resuspenden en
medio libre de proteínas, luego se siembran en frascos “T” para comenzar la expansión. La operación
se realiza en cabina de flujo laminar. Los controles de proceso en la descongelación de muestran en la
siguiente tabla.
Tabla 3. Controles de proceso de la etapa descongelación.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Cantidad de células totales IPC ≥ 5x106 células
Viabilidad celular IPC ≥ 80%
Concentración de EPO IPC ≥ 5 µg/mL
Las células resuspendidas en medio fresco se incuban en frascos “T” de cultivo a una concentración
inicial ≥ 0,25 x 106 células/mL. Las condiciones de cultivo son: temperatura 36,0 ± 1,0 ºC, pH de 6,85 -
7,22. El proceso debe durar entre 48 y 96 horas hasta alcanzar una masa celular confluente para
expandir a botellas rotatorias. La operación se realiza en condiciones asépticas bajo cabina de flujo
laminar. Los controles de proceso se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 4. Controles de proceso de la etapa de cultivo en frascos T.
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Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Observación al microscopio IPC No se observa presencia de contaminación
microbiana
Una vez confluente la suspensión celular proveniente de los frascos “T” se une para ser sembrada en
botellas rotatorias ≥ 0,25 x 106 células/mL. Las condiciones de cultivo que se establecen en esta etapa
son: temperatura 36,0 ± 1,0 0C, velocidad de rotación de 2 a 5,3 r.p.m. Se le adiciona a cada botella
rotatoria medio de cultivo hasta completar el volumen de 500 mL, el objetivo es generar la suficiente
biomasa para inocular el fermentador semilla. Las operaciones se realizan en condiciones asépticas
bajo cabina de flujo laminar.
Se toma una muestra de cada botella rotatoria para cuantificar las células y determinar la viabilidad
celular. Se seleccionan las botellas rotatorias que se emplearán en la confección de inóculo, teniendo en
cuenta que el número de células totales debe ser ≥ 3 000x106 y la viabilidad celular ≥ 80%. Los
controles de proceso se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Controles de proceso de la etapa de cultivo en rollers (inóculo).
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Viabilidad celular IPC ≥ 80%
Contaminación microbiana (Observación
al microscopio) IPC
No se observa presencia de
contaminación microbiana al
microscopio
Tiempo de las células en cultivo entre la
descongelación y el inóculo en roller IPC ≤ 60 días
Cantidad de células totales en el inoculo
en rollers IPC ≥ 3 000x106 células
- Proceso de fermentación.
Previo a que dé inicio el proceso de fermentación, el bioreactor debe prepararse para tal
acontecimiento. Se somete a un procedimiento de limpieza, que se considera aceptado cuando la
conductividad del agua contenida en el vaso del fermentador sea ≤ 1,3 µS/cm; luego se realiza una
prueba de hermeticidad y posteriormente se procede a la esterilización del vaso y sus periféricos, donde
se tendrán en cuenta todas las medidas de seguridad necesarias de acuerdo con lo establecido en el
registro de lote. Posterior a la esterilización, al fermentador se le aplica medio de cultivo desde la bolsa
de medio hasta que el mismo cubra los electrodos y se activa el control de temperatura en 36 ± 1˚C, el
control de pH en 7,0 ± 0,3 y el control de la velocidad del impelente en 100 r.p.m. Pasadas 48 - 24
horas, se toma una muestra del fermentador para corroborar la esterilidad del medio de cultivo y
comprobar pH. Verificada la esterilización, se comienza el proceso de inóculo del fermentador a partir
de botellas rotatorias.
Una vez que el inóculo esté listo y ha sido aceptado se transfiere al fermentador semilla. Las
condiciones de cultivo son las siguientes: velocidad inicial de agitación del impelente de 100 ± 5 r.p.m.
La temperatura de trabajo 36,0 ± 1 0C; flujo de aireación por la cabeza es de 120 mL/min,
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concentración de oxígeno disuelto en el caldo de cultivo de 50,0 ± 30 % y el pH controlado entre 7,0 ±
0,3.
Una vez que las células alcanzan la densidad celular máxima ≥ 1,0x106 células/mL, se comienza a
adicionar el medio de cultivo hasta alcanzar el volumen de trabajo de 30 L y una población celular
mayor que 24 000 x106 células.
Una vez completado el volumen de trabajo se inicia el proceso de perfusión, con el objetivo de
incrementar la biomasa. Al agotarse la bolsa de medio de cultivo y al llenarse la bolsa de cosecha, éstas
se desconectan empleando vapor limpio para realizar una desconexión aséptica y las nuevas bolsas son
conectadas a las líneas de medio y de cosecha y se esterilizan con vapor limpio suministrado desde el
fermentador.
Cuando se alcance una cantidad de células totales mayor de 60 000 millones, se procederá a transferir
el volumen de sobrenadante que contiene la cantidad de células requeridas hacia el fermentador de
1000L. Durante la fermentación, alrededor de 4 días se dedican a crecer el cultivo en la fase a templa y
más de 15 días al proceso en perfusión. Los controles de proceso de la etapa de fermentación 30L se
muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Controles de proceso de la etapa de fermentación en 30 L.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Viabilidad celular IPC ≥ 70%
Contaminación microbiana (Observación
al microscopio) IPC
No se observa presencia de
contaminación microbiana al
microscopio.
Concentración de Glucosa IPT 5–20 mM
Concentración de EPO IPT ≥ 5 µg/ml
pH IPT 7±0,3
El propósito del Fermentador de Tanque Agitado (TA) 1000L, es la obtención de sobrenadante rico en
EPOhr a partir del cultivo de las células CHO-TA encargadas de su secreción.
Para lograr lo anteriormente descrito se somete a un procedimiento de limpieza, que se considera
aceptado cuando la conductividad del agua contenida en el vaso del fermentador sea ≤ 1,3 µS/cm,
luego se realiza una prueba de hermeticidad y posteriormente se esteriliza a vaso vacío el Fermentador,
empleando vapor limpio, luego se esteriliza la línea de adición de medio conectada a su respectiva
bolsa de medio y la línea de cosecha conectada a su respectiva bolsa.
Una vez concluida la esterilización, se adiciona medio de cultivo desde la bolsa de medio y se activa el
control de temperatura en 36 ± 1º C, el control de pH en 6,8 ± 0,3 y el control de la velocidad del
impelente en 30 ± 5 r.p.m.
Pasadas 48 24 horas se toma una muestra del fermentador para corroborar la esterilidad del medio de
cultivo y comprobar pH, y se procede a realizar el inóculo del fermentador. Una vez concluida la
operación de inoculación, se cultiva a una temperatura de 36 ± 1˚C, concentración de oxígeno disuelto
de 20 -100 % de saturación con respecto al aire, velocidad de agitación del impelente de 30-100 r.p.m,
pH controlado en 6,8 ± 0,3 y velocidades de los filtros rotatorios entre 500 - 800 r.p.m .
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Al agotarse la bolsa de medio de cultivo y llenarse la bolsa de cosecha éstas se desconectan, empleando
vapor limpio para realizar una desconexión aséptica y las nuevas bolsas son conectadas a las líneas de
medio y de cosecha y se esterilizan con vapor limpio suministrado desde el fermentador.
Durante el proceso de fermentación se establecen varios criterios para detener las fermentaciones, entre
ellos:
- Contaminación microbiana.
- Viabilidad por debajo de 70%, por un período de 3 días consecutivos.
- Tiempo de cultivo, considerando desde la descongelación del ámpula, mayor de 140 días.
- Ocurre un fallo del equipamiento o de algún sensor crítico para el seguimiento de la corrida.
- Por decisión administrativa asociado a los planes de producción.
Los controles establecidos en esta etapa de fermentación de 1000L aparecen en las tablas 7, 8 y 9.
Tabla 7. Parámetros de operación de la etapa de fermentación en 1000 L.
Parámetro de operación Clasificación Intervalo de operación
Cantidad de células totales en el inóculo KOP ≥ 60 000 106 células
Viabilidad del inóculo KOP ≥ 80 %
Velocidad de agitación OP 30-100 rpm
Volumen de trabajo OP 270–1150 L
Temperatura KOP 36±1 ⁰C
Flujo de aireación en la cabeza OP 10-40 L/min
Flujo de aire al burbujeador OP 1-30 L/min
Concentración de oxígeno disuelto OP 20–100 % de saturación
pH OP 6,8±0,3
Concentración celular para inicio de
perfusión y/o cultivo continuo KOP ≥ 1,5x106 cel/mL
Velocidad de dilución OP 0,25–1,5 vvd
Velocidad del filtro rotatorio OP 500-800 rpm
Tiempo máximo de las células en cultivo
desde la descongelación COP 140 días
Frecuencia de muestreo del fermentador OP ≤ 4 días
Tabla 8. Controles de proceso de la etapa de fermentación en 1000 L.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Observación al microscopio IPC
No se observa presencia de
contaminación microbiana al
microscopio
Viabilidad celular IPC ≥ 70 %
Concentración de Glucosa IPC 5–20 mmol/L
Concentración de EPOhr IPC ≥ 5 µg/mL
pH IPT 6,8±0,3
Concentración celular IPT ≥ 8x106 cel/mL
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Tabla 9. Parámetros de desempeño de la etapa de fermentación en 1000 L.
Parámetro de desempeño Clasificación Criterio de Aceptación Alcance
Volumen de sobrenadante generado PP ≥ 10 000 L Una fermentación
Concentración de EPOhr en
sobrenadante PP ≥ 5 µg/mL Por cosecha
- Cosechas.
La cosecha se comienza una vez que se inicia la perfusión y/o el cultivo continuo. Se colectará en
bolsas estériles y apirogénicas de 500 L, 1000 L ó 2500 L. Una vez llena la bolsa de cosecha, se retira
la misma y se filtra por una batería de filtros cuyo poro inferior es de 0,22 µm y posteriormente se
almacena a una temperatura entre 2,0 ºC–24 ºC. Se envía una muestra al Laboratorio de Control de
Proceso y se le mide la concentración de EPOhr por el método de Cromatografía Liquida de Alta
Resolución (HPLC), donde el valor obtenido debe ser ≥ 5μg/mL y además debe estar libre de
contaminantes. Las cosechas filtradas para usar en la purificación se codifican con el código de la
fermentación, luego el consecutivo de la cosecha para cada fermentación, ejemplo
3222/TA1201/FCS01.
Los parámetros de operación de la etapa de cosechas se muestran en la Tabla 10 y los controles de
proceso en la Tabla 11.
Tabla 10. Parámetros de operación de la etapa de cosecha.
Parámetro de operación Clasificación Intervalo de operación
Volumen OP ≤ 2500 L
Tiempo de almacenamiento COP ≤ 4 días (18-24 ˚C)
≤ 21 días (2-8˚C)
Tabla 11. Controles de proceso de la etapa de cosecha.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Observación al microscopio IPC No se observa presencia de contaminación
microbiana al microscopio
Concentración de EPOhr IPC ≥ 5 µg/mL
Proceso de purificación.
- Cromatografía de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.
El primer paso se realiza empleando la cromatografía de afinidad Blue Sepharose Fast Flow, en una
columna Novasep 600/500 empleando como sistema cromatográfico el BIOPROCESS. El objetivo de
este paso es la captura de EPOhr y la eliminación parcial de los principales contaminantes presentes en
el sobrenadante. En esta columna las proteínas se unen de forma reversible al ligando coloreado
Cibacron BLUE 3G, el cual está acoplado covalentemente a la matriz Sepharose Fast Flow.
La columna se equilibra con buffer tris 20 mM, Tween 20 al 1 % a pH 7,5; posteriormente se aplica el
sobrenadante. Seguidamente, la EPOhr es eluída de la columna por aumento de fuerza iónica con
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solución de Tris 20 mM, Tween 20 al 1 %, NaCl 1M a pH 7,5 a un flujo lineal de 56 cm/h. El
procedimiento de limpieza de la matriz se realiza con la solución de NaOH 0,1 M; el procedimiento de
higienización se realiza con solución de NaOH 0,01 M y se conserva de acuerdo a las recomendaciones
del fabricante en una solución de Alcohol etílico al 20 %, KH2PO4 0,1 M, pH 8,0. Dos veces a la
semana se limpia con Etanol al 70%. Los controles de proceso esta etapa se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12. Controles de proceso de la etapa de pseudo-afinidad Blue sepharose Fast Flow.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Relación Ve/Vc IPC ≥0,3
- Cromatografía de filtración en gel
Esta operación se realiza empleando una cromatografía de exclusión molecular, utilizando como matriz
Sephadex G-25 medium en una columna BPG 450/1000, empleando el sistema de purificación
BIOPROCESS. El volumen máximo de muestra a aplicar en cada ciclo debe estar entre el 15 - 30 %
del volumen del gel y el flujo lineal empleado será de 95 cm/h.
Este paso tiene como objetivo realizar un cambio de tampón de la proteína al buffer Na2HPO4 17 mM,
NaH2PO4 3 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,2; preparándola así para el siguiente paso de cromatografía de
afinidad por Quelatos metálicos. En la cromatografía de filtración en gel las moléculas de bajo peso
molecular (sales) se introducen en los poros de la matriz, retrasándose en su salida, mientras que las de
alto peso molecular (proteínas) salen con más rapidez, de esta manera ocurre la sustitución de un buffer
por otro.
Si la elución del desalaje de Blue se aplica seguidamente a la columna de quelatos, se omite el paso de
microfiltración; si esto no ocurre, se filtra el producto por un sistema de 0,2 µm. Finalmente se realiza
la higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna. Para la higienización se aplica la
solución NaOH 0,5 M, para la limpieza se emplea la solución 1 M y la solución de mantenimiento es
NaOH 0,01 M. Los controles de proceso de esta etapa se muestran en la Tabla 13.
Tabla 13. Controles de proceso de la etapa de Sephadex G-25.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Valor de DO a 280 nm IPC ≥ 0,1
Prueba de integridad a la membrana de
microfiltración IPT
Filtro
Sartopore 2 3,2-4 bar (46 psig)
Sartobran 3,2-4 bar (46 psig)
Millipak 3,45-4 bar (50
psig)
- Cromatografía de pseudo-afinidad por Quelatos metálicos
Este paso se realiza empleando la cromatografía de afinidad Chelating Sepharose Fast Flow en una
columna BPG 300/500, usando el sistema de purificación BIOPROCESS y manteniendo un flujo lineal
de 85 cm/h durante el equilibrio de la columna y de 76 cm/h durante la aplicación y la elución del
producto. El objetivo de este paso es la captura de la eritropoyetina y la eliminación total de la fracción
de contaminantes que no fueron removidos en los pasos anteriores del proceso.
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La preparación de la columna se realiza de la siguiente manera:
- Adición de agua purificada (5 volúmenes de columna) (VC)
- Aplicación de Sulfato de Cobre 0,1M hasta saturación de la columna.
- Adición de agua purificada (5 VC).
- Lavado de la columna con solución buffer de elución Na2HPO4 0,2 mM, NaH2PO4 99,8 mM NaCl
0,5 M, pH 4,1, para eliminar el cobre unido débilmente a la columna.(2 -3 VC).
- Equilibrio con el buffer Na2HPO4 17 mM, NaH2PO4 3 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,2.
Esta laboriosa operación de equilibrio se realiza con el fin de que se forme el complejo metálico entre
los iones Cu2+ y los grupos imidazol de la matriz.
Después de equilibrada la columna, se aplica la elución de la G-25 de la Blue y finalizada la aplicación,
se continúa pasando solución de equilibrio hasta que la DO alcance línea base, luego se hace circular a
través de la columna buffer de elución compuesto por Na2HPO4 0,2 mM, NaH2PO4 99,8 mM, NaCl 0,5
M, pH 4,1 permitiendo que por disminución de pH, eluya la eritropoyetina. La elución de la matriz se
filtra y almacena a 4˚C, para su posterior tratamiento. Seguidamente, se regenera la columna para
romper el complejo IDA-Cu2+ con solución EDTA 50 mM, NaCl 1 M.
Si se realiza una higienización, previo al procedimiento de higienización se elimina el EDTA pasando
2VC de NaCl 0,5 M, la solución de higienización es NaOH 0,5 M. Si se va a realizar una limpieza,
previo a la misma se hacen circular 2 VC de la solución NaCl 2M para eliminar el EDTA, la solución
de limpieza es NaOH 1 M. La solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M. Los controles de proceso
se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 14. Controles de proceso de la etapa de Quelatos Metálicos.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Valor de DO 280 nm IPC ≥ 0,12
- Cromatografía de filtración en gel.
Esta operación se realiza empleando una cromatografía de exclusión por tamaño, usando como matriz
Sephadex G-25 medium, empleando las columnas ISOPACK 630/500 y BPG 200/950, además es
posible emplear en el paso las columnas cromatográficas BPG 450/1000 y Novasep 450/500, utilizando
el sistema de purificación BIOPROCESS. El volumen máximo de muestra a aplicar en cada ciclo debe
estar entre el 15-30 % del volumen de gel y se mantendrá un flujo lineal de 148 cm/h.
Este paso tiene como objetivo realizar un cambio de buffer de la proteína al buffer NaH2PO4 1,81 mM,
Na2HPO4 18,18 mM, pH 6,0, preparándola así para el siguiente paso de cromatografía de intercambio
iónico.
Una vez terminado el paso cromatográfico, se realiza una microfiltración del producto si el mismo será
almacenado para unirlo con otro lote y realizar la cromatografía de intercambio aniónico en Q
Sepharose FF, sino se continúa con el próximo paso cromatográfico.
Finalmente, se realiza la higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna.
Para la higienización se aplica la solución NaOH 0,5 M, para la limpieza se emplea la solución NaOH 1
M y la solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M. Los controles de proceso se muestran en la Tabla
15.
Tabla 15. Controles de proceso de la etapa de Sephadex G-25.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
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Valor de D.O 280 nm IPC ≥ 0,1
Pureza por HPLC-RP IPC ≥ 90 %
Prueba de integridad a la
membrana de microfiltración IPT
Filtro Punto de Burbuja
Sartopore 2 3,2-4 bar (46 psig)
Sartobran 3,2-4 bar (46 psig)
Millipak 3,45-4 bar (50 psig)
- Cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose Fast Flow.
Este paso se realiza empleando la cromatografía de intercambio iónico en columnas BPG 100/500 y
BPG 200/500, considerando como carga máxima a cada columna de 4 g/L de gel, el gel empleado es Q
Sepharose fast Flow. Esta cromatografía se realiza utilizando el sistema BIOPROCESS. El objetivo de
este paso es la separación de las isoformas ácidas (biológicamente activas) de las básicas, la retención
de ADN y realizar la concentración del producto. En este paso se eleva la pureza de la EPOhr por
encima del 98 %.
La columna se equilibra con solución NaH2PO4 18,18 mM, Na2HPO4 1,81 mM, pH 6,0. El flujo lineal
es de 128 cm/h. Posteriormente se aplica la elución de la G-25 de la cromatografía de afinidad
Chelating Sepharose Fast Flow a la columna de Q Sepharose Fast Flow. El flujo lineal de aplicación es
de 102 cm/h. El siguiente paso es realizar un lavado de la columna de Q con acetato 50 mM, Tween 20
0,01%, pH 4,5 a un flujo lineal de 153 cm/h, para garantizar la eliminación de las isoformas básicas
que se retengan en este gel, y seguidamente se procede a reequilibrar la columna empacada con Q
pasando 5 VC de la solución NaH2PO4 1,81 mM, Na2HPO4 18,18 mM, pH 6,0 a flujo lineal de 128
cm/h. Una vez equilibrada la columna, comienza la elución al circular por la columna el buffer de
elución Na2HPO4 3 mM, NaH2PO4 17 mM, NaCl 164 mM, pH 6,0. El flujo lineal para la elución es de
90 cm/h. Finalmente, se regenera la matriz, para restaurar su condición de adsorción con solución de
NaCl 3M, a un flujo lineal de 102 cm/h.
Finalmente se realiza la higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna.
Para la higienización se aplica la solución NaOH 0,5 M, para la limpieza se emplea la solución NaOH 1
M y la solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M. Los controles de proceso se muestran en la tabla
16.
Tabla 16. Controles de proceso de la etapa de Q.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Valor de D.O 280 nm de elución IPC ≥ 0,8
Valor de DO a 260 nm IPC ≥0,2
Prueba de integridad a la membrana de
microfiltración IPT
Filtro Punto de Burbuja
Sartopore 2 3,2-4 bar (46 psig)
Sartobran 3,2-4 bar (46 psig)
Millipak 3,45-4 bar (50 psig)
- Cromatografía de filtración en gel.
Esta operación se realiza empleando una cromatografía de exclusión molecular, utilizando una columna
BPG 200/950, usando una matriz Superdex 200, empleando el sistema cromatográfico BIOPROCESS.
Este último paso tiene como objetivo almacenar la proteína en la solución de formulación. El equilibrio
de esta columna se realiza aplicando solución final que está compuesta por NaCl 100 mM, Citrato de
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sodio 20 mM, Ácido cítrico 0,36 mM, Tween 20 al 0,02 %, pH 6,9. El volumen máximo de la muestra
a aplicar será del 5-15 % del volumen de la columna a flujo lineal de 30 cm/h. Finalmente, se realiza la
higienización, la limpieza y el mantenimiento de la columna.
Para la higienización se aplica la solución NaOH 0,5 M, para la limpieza se emplea la solución NaOH 1
M y la solución de mantenimiento es NaOH 0,01 M.
Una vez terminado el proceso de filtración en gel, al producto se le realiza una microfiltración por 0,2
µm y se almacena a 4˚C. Los controles de proceso se muestran en la tabla 17.
Tabla 17. Controles de proceso de la etapa de Superdex.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Pureza IPC ≥ 98 %
Concentración (mg/mL) IPC ≥ 0,5
Valor de DO a 280nm IPC ≥ 0,22
Relación DO a 280nm / DO a 260nm IPT ≥ 1,5
Prueba de integridad a la membrana de
microfiltración IPT
Filtro Punto de Burbuja
Sartopore 2 3,2-4 bar (46 psig)
Sartobran 3,2-4 bar (46 psig)
Millipak 3,45-4 bar (50 psig)
En la tabla 18 se muestran los valores medios de los variables de los controles de proceso realizados en
la etapa de cromatografía filtración en gel durante los años 2015 y 2016 donde se observa que los
mismos cumplen con los criterios de aceptación establecidos para cada parámetro evaluado. Todos los
lotes analizados cumplieron con los criterios establecidos y fueron incluidos en el cálculo de la media
de cada variable (Datos obtenidos de la Revisión Anual de Producto (RAP): G11 RAP-0001/2015,
2015 y G11 RAP-0001/2016, 2016).
Tabla 18. Comportamiento de los controles de proceso en la etapa de cromatografía filtración en gel
durante los años 2015 y 2016.
Variables Criterio de aceptación 2015 2016
Pureza ≥ 98% 99,48 99,46
Concentración (mg/mL) ≥ 0,5 1,04 1,08
Valor de DO a 280nm ≥ 0,22 0,78 0,80
- Confección del IFA.
La confección del IFA se realiza a partir de la unión de dos a cuatro lotes de purificados de una misma
fermentación. Estos lotes se homogenizan para conformar un IFA hasta 1 500 000 bulbos equivalentes
de 2000 UI, para más de 2 500 millones de UI/ lote de IFA. Cuando existan remanentes de IFAs
liberados, se conformará un pool. Los controles de esta etapa se muestran en la Tabla 19.
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Tabla 19. Controles de proceso de la etapa de confección del IFA.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Concentración (mg/mL) IPC ≥ 0,5
Valor de DO a 280nm IPC ≥ 0,37
Relación DO a 280nm / DO a 260nm IPT ≥ 1,5
Biocarga IPC ≤ 50 UFC/mL
- Microfiltración.
El objetivo de este paso es mantener el producto libre de contaminación microbiana hasta que se
someta al proceso de formulación. El paso de filtración se realiza con filtros cuya membrana tiene una
porosidad de 0,2 µm y su material de construcción es inerte con relación al producto. En este paso se
realiza la prueba de integridad de la membrana para comprobar el desempeño adecuado de la barrera
filtrante según lo establecido en los procedimientos vigentes. Los controles de esta etapa se muestran
en la Tabla 20.
Tabla 20. Controles de proceso en la etapa de Microfiltración.
Controles de Proceso Clasificación Criterio de Aceptación
Prueba de integridad a la membrana
de microfiltración IPT
Filtro Punto de Burbuja
Sartopore 2 3,2-4 bar (46 psig)
Sartobran 3,2-4 bar (46 psig)
Millipak 3,45-4 bar (50 psig)
Flujo (L/min) OP 0,9-1,6
Tiempo de filtración (min) PP 12-23
El producto obtenido se almacena, por un tiempo no mayor de 1 año, en bolsas plásticas flexibles
estériles y apirogénicas listas para el uso hasta que sea necesario para la fabricación del producto
terminado. Se realiza un muestreo del producto para evaluar las siguientes características de calidad:
pureza, identidad, concentración, pH, DNA contaminante, proteínas contaminantes de célula
hospedera, inspección visual, actividad específica, ácido siálico y endotoxinas bacterianas.
Las etapas de purificación fueron diseñadas para producir un producto de calidad adecuada y que
permitieran reducir la agregación y degradación del producto así como los niveles de las impurezas
residuales que pueden estar presentes.
4.2 Consistencia y caracterización del Ingrediente Farmaceutico Activo.
Se realizó un análisis con los resultados de los principales atributos de calidad del IFA. Los datos
analizados fueron obtenidos en el CIM de la Revision Anual de Producto (RAP) correspondientes a los
años 2014, 2015 y 2016: G11 RAP-0002/2014, G11 RAP-0002/2015 y G11 RAP-0002/2016. Todos
los lotes de IFA analizados (45 lotes producidos en el 2014, 41 en el 2015 y 49 en el 2016 para un total
de 135 lotes de IFA) durante estos tres años consecutivos cumplieron con los criterios de aceptación
establecidos tanto para los parámetros cuantitativos como cualitativos o semicualitativos. El análisis de
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los parámetros cuantitativos mostró bajos coeficientes de variación cuando se analizó la media para
cada parámetro entre los tres años lo que demuestra una adecuada consistencia del proceso de
fabricación del IFA en el CIM (Tabla 21).
Tabla 21. Resultados de los atributos de calidad, especificaciones y métodos de análisis del IFA
obtenidos en el CIM durante los años 2014, 2015 y 2016. Valores medios anuales.
Atributo de
calidad Especificación
Método de
análisis
Media±DE Media DE CV%
Año 2014
(45 lotes)
Año 2015
(41 lotes)
Año 2016
(49 lotes)
Total
(135 lotes)
Pureza
≥ 98,00% del
monómero
(< 2.00% de
dímeros y
sustancias
relacionadas de alto
peso molecular*)
HPLC-GF 99.93±0.06
(*0.07)
99,82±0.13
(*0.18)
99.86±0.06
(*0.14)
99.87
(*0.13) 0.10 0.10
≥ 98,00% de
proteína HPLC-FR 99,60±0.26 99,48±0,28 99,65±0,21 99.58 0.26 0.26
Actividad
especifica
Potencia estimada
entre 80 y 125%
de la potencia
asignada. Limites
confianza entre 64
y 156 %.
In vivo en
ratones
normocitemicos
100±7,34 105±12,53 101±6,45 102 9.11 8.94
Concentración 0,50-10,00 mg/mL Densidad
óptica 280nm 1,38±0,20 1,06±0,32 1,07±0,23 1,17 0.29 24,71
Ácido siálico ≥ 10,00 moles/mol
de proteína Colorimétrico 12,29±0,84 11,78±1.00 11,68±0,89 11.92 0.94 7.91
pH 6,5-7,5 pHmetro 6,85±0,05 6,81±0,07 6,80±0,05 6.82 0.06 0.89
Biocarga ≤ 10 UFC/mL Filtración por
membranas Conforme Conforme Conforme NA
DNA
contaminante ≤ 10 ng/ dosis Hibridación Conforme Conforme Conforme NA
HCP
contaminante ≤ 0.4% ELISA Conforme Conforme Conforme NA
Endotoxinas
bacterianas
<20 UE/ 100 000
UI de
eritropoyetina
LAL Conforme Conforme Conforme NA
Punto
isoeléctrico
Conforme al
estándar: 8 isoformas, al
menos 5
mayoritarias
IEF Conforme Conforme Conforme NA
Identidad Conforme al
estándar
SDS-
PAGE/WB Conforme Conforme Conforme NA
Identidad Conforme al
estándar
HPLC-FR
Mapeo
peptídico
Conforme Conforme Conforme NA
Apariencia Solución Inspección Conforme Conforme Conforme NA
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transparente,
incolora, libre de
partículas
sedimentadas
visual
NA: No aplicable. DE: Desviación estándar. CV%: Coeficiente de variación.
Los tres lotes de IFA que dieron origen a los tres lotes de ior®EPOCIM incluidos en el estudio de
biocomparabilidad mostraron un cumplimiento de las especificaciones de calidad y niveles bajos de
agregación, degradación y de contaminantes de CHO (Tabla 22) lo cual disminuye los riesgos de
inmunogenicidad del producto y garantizan la eficacia y seguridad del uso del producto en la clínica
(Carlos y cols, 2016).
Tabla 22. Resultados del nivel de contaminantes y concentración de proteínas presentes en los lotes de
IFA utilizados en el estudio de biocomparabilidad.
Atributo de
calidad Especificación Método de análisis 3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513
Pureza
≥ 98,00% del
monómero
(<2.00% de
dímeros y
sustancias
relacionadas de
alto peso
molecular*)
HPLC-GF 99.82
(*0,18)
99.72
(*0,28)
99.80
(*0,20)
≥ 98,00% de
proteína HPLC-FR 98,78 99,37 99,37
HCP ≤0,400% ELISA 0,035 0,028 0,039
ADN
contaminante 10,00 ng/dosis Hibridación <1,25 <1,25 <5,00
Endotoxinas
<20 UI/100 000
UI de
eritropoyetina
LAL cromogénico <0,83 <0,83 3,93
Trazabilidad
Lote de IFA Lote de ior®EPOCIM
3342/P1511 LP00415
3342/P1512 LP00515
3342/P1513 LP00615
Como parte de la caracterización y evaluación de la consistencia del IFA producido en el CIM se
evaluó la estructura secundaria y terciaria de 10 lotes del producto (Grupo 1: 5 lotes de inicio de la
producción y Grupo 2: 5 lotes al final de la producción del año 2015). Para demostrar la similitud con
respecto a la estructura secundaria y terciaria, se utilizó el método de dicroísmo circular (DC) UV
lejano y cercano y se analizó el plegamiento al nivel de la estructura secundaria, es decir, el
enrollamiento de la hebra de aminoácidos en hélices alfa o su organización en hojas beta y
espectroscopia de fluorescencia. Los estudios fueron realizados en los laboratorios LAMMB de la
UNAM.
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En la Figura 1 se observa la semejanza de los espectros de emisión por fluorescencia de los 10 lotes de
IFA y no se obtuvieron diferencias significativas entre los mismos cuando fueron evaluados por un
ANOVA para un 95% de confianza (Tabla 23). En la Tabla 24 se muestran los coeficientes de
variación obtenidos (<0.1 %) para la media de los Centros de Masa Espectral (CME) a 280 y 295nm
de excitación lo que demuestra la consistencia del proceso productivo y la similitud, lote a lote, en la
estructura terciaria del IFA.
Figura 1. Comparación de los espectros de emisión de 10 lotes del IFA a una longitud de onda de
excitación de 280 y 295 nm utilizando el buffer de formulación en cada corrida.
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Tabla 23. Comparación estadística entre los espectros del grupo 1 y el grupo 2 del IFA. El análisis
estadístico se realizó por medio de la prueba estadística tipo ANOVA.
Tabla 24. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación para los 10 lotes de IFA evaluados.
Lote de IFA Excitación 280nm Excitación 295nm
CME (nm) CME (nm)
3342/P1503 342.87 342.40
3342/P1504 343.06 343.55
3342/P1505 343.02 343.61
3342/P1506 343.06 343.36
3342/P1507 342.97 343.47
3342/P1540 343,02 343.33
3342/P1541 342.99 343.41
3342/P1542 343.07 343.34
3342/P1543 342.93 343.18
3342/P1544 343.02 343.23
Media 343.00 343.29
DE 0.06 0,34
CV % 0.02 0.10
DE: Desviación estándar, CV%: Coeficiente de variación
Quedo demostrada la similitud con respecto a la estructura secundaria de las muestras analizadas al
superponerse los espectros de DC UV lejano obtenidos para los 10 lotes de IFA analizados. Al ajustar
los datos al modelo de Micsonai y cols (2015) se observa que se componen fundamentalmente de α-
hélices (Figura 2). No se obtuvieron diferencias significativas entre los grupos mayoritarios cuando
fueron evaluados por un ANOVA para un 95% de confianza (Tabla 25) lo que demuestra la
consistencia del proceso productivo y la similitud, lote a lote, en la estructura secundaria del IFA.
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Figura 2. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-250 nm) de las muestras: CE-C01-M77
(3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505), CE-C01-M80 (3342/P1506),
CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540), CE-C01-M83 (3342/P1541), CE-C01-M84
(3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y CE-C01-M86 (3342/P1544).
Tabla 25. Conformación estructural delas muestras del bloque 1 y 2.
La estructura terciaria de las muestras de los 10 lotes del IFA mostró similitud con base en los
espectros de DC cercano (Figura 3).
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Figura 3. Espectro de dicroísmo circular en la región del UV cercano (260-330 nm) de las muestras:
CE-C01-M77 (3342/P1503), CE-C01-M78 (3342/P1504), CE-C01-M79 (3342/P1505), CE-C01-M80
(3342/P1506), CE-C01-M81 (3342/P1507), CE-C01-M82 (3342/P1540), CE-C01-M83 (3342/P1541),
CE-C01-M84 (3342/P1542), CE-C01-M85 (3342/P1543) y CE-C01-M86 (3342/P1544).
Como parte de la caracterización y consistencia del IFA se evaluaron 6 lotes consecutivos producidos
durante el año 2014 por DC UV lejano en comparación con cuatro lotes de EPREX® y el Material de
Referencia de Trabajo (MRT(QFB)EPOhr/0113) utilizado en la liberación de los lotes de EPOhr
producidos en el CIM (Figura 4). Se observa una superposición de los espectros obtenidos para todas
las muestras demostrando una similitud con respecto a la estructura secundaria entre las mismas y que
se componen mayoritariamente de α-hélices. Coincidiendo estos resultados con los obtenidos en los
laboratorios LAMMB en la caracterización del IFA (Figura 2).
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Figura 4. Espectro de DC en la región del UV lejano (200-260 nm) de las muestras del IFA de
ior®EPOCIM y EPREX® analizadas en los laboratorios de ScianBioscence Co., Ltd., Tailandia.
Adicionalmente, la secuenciación N-terminal de 10 lotes del IFA, de ellos 3 lotes al final de un estudio
de estabilidad acelerada (6 meses) fue identificada por el método de degradación de Edman (Tabla 26).
La secuencia obtenida para cada muestra es consistente con la secuencia declarada en la monografía de
la EPOhr de la Farmacopea Europea (FE) (FE 1316, 2016). La correcta secuencia N-Terminal de la
EPOhr fue hallada para los primeros 15 residuos con excepción del residuo 7 debido a que la cisteína
no es identificada por este método. Aspecto que queda solventado ya que este aminoácido fue
secuenciado en el estudio de biocomparabilidad por el método de espectrometría de masas (EM).
190 200 210 220 230 240 250 260 270
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
CD
(md
eg
)
Wavelength(nm)
3342/P1401
3342/P1402
3342/P1403
3342/P1404
3342/P1405
3342/P1406
EDS5L00
EES4F00
EGS7R00
EHS3H00
MRT(QFB)rhEPO/0113
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Tabla 26. Resultados del análisis de secuenciación N-terminal de 10 lotes de IFA realizado en los
laboratorios SGS de Inglaterra (Reporte: 128-001-001). Se utilizó un Procise Automatic Protein
Sequencer 494.
4.3 Proceso de fabricación del Producto Terminado (ior® EPOCIM).
El proceso de fabricación de ior® EPOCIM consta de 5 etapas:
- Formulación.
- Llenado.
- Etiquetado.
- Envase.
- Almacenamiento.
4.4.1 Formulación, llenado, etiquetado, envase y almacenamiento.
Sobre la base de los resultados de potencia, concentración y volumen del IFA, se ajusta la
concentración del producto a granel a 2000 UI/mL, 3000 UI/mL, 4 000 UI/mL, 5 000 UI/mL, 10 000
UI/mL, 30 000 Ui/mL o 40 000 UI/mL según corresponda; adicionando la cantidad de solución final
(5,8 g/L de la solución de Citrato de Sodio; 0,069 g/L ácido cítrico; 5,8 g/L cloruro de sodio; Tween 20
al 0,02 %, pH 6,9) necesaria para cada concentración final. Durante el ajuste también se adiciona
albúmina humana de calidad inyectable, de forma tal que la concentración final de la misma se
encuentre entre 2 - 3 mg/mL. El producto final formulado se filtra por filtros de 0,2 m acoplados a
bolsas desechables estériles y apirogénicas de 3; 5; 10; 20 y 50 L. Todas estas bolsas se utilizan además
para el almacenamiento del producto de 2-8ºC, hasta realizar la operación de llenado de los viales.
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El producto formulado es sometido a un segundo proceso de filtración esterilizante por membrana de
0,2 µm inmediatamente antes de ser sometido al proceso de llenado. Posterior a esto ocurre el proceso
de llenado en bulbos 2R calidad hidrolítica I, a 1,1 mL por cada bulbo, en la máquina llenadora-
cerradora de bulbos KSF-1020 de la firma Bausch+Ströbel (B+S), rodeada de un ambiente clase 100,
según lo establecido. A partir de técnicas estadísticas una muestra representativa del lote es enviada al
Departamento de Control de la Calidad para ser evaluada en cuanto al cumplimiento de las
especificaciones establecidas para este producto.
Una vez que se concluye el llenado del lote, se procede a la inspección visual del 100 % de los bulbos
de cada lote para comprobar las características organolépticas del producto.
Los lotes aprobados durante el proceso de inspección visual y liberados por control analítico son
suministrados al área de etiquetado automatico a través de una carretilla hacia la máquina etiquetadora
Bauch + Strobel. Se rotula en la etiqueta el No. lote, fecha de producción, fecha de vencimiento
mediante termo impresión.
El almacenaje de este producto se realiza en la cámara fría de producto final en espera de su liberación
por destino certificado que emite Aseguramiento de la Calidad después del envase final del mismo.
4.4 Estudios de Estabilidad.
Estudios de estabilidad anaquel (Largo plazo), acelerado y estrés (determinación del perfil de
degradación) han sido realizados con el IFA por el CIM. Los resultados de los estudios evidencian que
los atributos de calidad (físicos, químicos, fisicoquímicos, microbiológicos y biológicos) del IFA
soportan una vida útil de 12 meses cuando el producto es almacenado entre 2 y 8 ° C y, de 6 meses en
condiciones aceleradas cuando es almacenado a una temperatura 25 oC±2 oC/ 60%±5% Humedad
Relativa. En el estudio de estrés se observó que la principal afectación del producto fue la aparición de
bandas adicionales que corresponden al producto agregado cuando fue sometido a diferentes
condiciones de estrés. La agregación fue identificada, principalmente, utilizando la metodología por
HPLC-GF.
Estudios de estabilidad anaquel (largo plazo), en curso, acelerados y de excursión han sido conducidos
con el producto ior® EPOCIM por el CIM. Los resultados de los estudios evidencian que los atributos
de calidad (físicos, químicos, fisicoquímicos, microbiológicos y biológicos) del producto cumplen con
sus especificaciones. Los datos de estabilidad proporcionados soportan una vida útil de 36 meses (para
las presentaciones entre 2 000 y 10 000 UI/mL) y 12 meses para las presentaciones 30 000 y 40 000
UI/mL) cuando el producto es almacenado entre 2 y 8°C, de 4 meses cuando el producto es almacenado
entre 28 y 32oC/ 60%±5HR, 24 meses cuando es almacenado entre 2 y 8 oC luego de sufrir excursiones
de temperaturas por un periodo de cinco días entre 28-32 oC y de 36 meses cuando es almacenado entre
2 y 8 oC luego de sufrir excursiones de temperaturas por tres días entre 0 oC ≤ X < 2 0C.
4.5 Experiencia post comercialización.
Los resultados de la farmacovigilancia y post-comercialización se proporcionan en el capitulo 6.10 de
este documento.
4.6 Agentes adventicios.
No se utilizan en el proceso de producción del ior®EPOCIM ninguna materia prima o excipientes de
origen biológico animal, ni en la fabricación del IFA ni en la fabricación del PT. Debido a esta
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característica, se considera que estas materias primas presentan un riesgo muy bajo con respecto a la
seguridad viral. Adicionalmente, todo el proceso de fabricación está bien controlado para garantizar la
seguridad microbiológica. Los bancos maestros y de trabajo han sido sometidos a pruebas apropiadas
que garantizan su uso.
4.7 Indicaciones aprobadas.
Las indicaciones aprobadas por el CECMED para el ior®EPOCIM en Cuba se mencionan a
continuación:
- Tratamiento de la anemia renal crónica.
- Tratamiento de la anemia de pacientes con SIDA en régimen terapéutico con zidovudina.
- Tratamiento de la anemia inducida por quimioterapia en pacientes oncologicos.
- Profilaxis t tratamiento de la anemia de la prematuridad.
5. MATERIALES Y METODOS.
5.1 Descripción de las muestras.
Para los estudios de biocomparabilidad se utilizaron 3 lotes de IFA, 3 lotes de ior®EPOCIM
(originados de los 3 lotes de IFA) y 3 lotes de EPREX®/ERYPO como se muestra en la Tabla 27. Los
productos durante todo el estudio fueron almacenados de acuerdo a sus instrucciones.
Tabla 27: Listado de lotes utilizados en el estudio de biocomparabilidad.
Nombre del producto Lote Fabricante Presentación Concentración
IFA
3342/P1511 CIM Bolsas desechables 0,60 mg/mL
3342/P1512 CIM Bolsas desechables 0,60 mg/mL
3342/P1513 CIM Bolsas desechables 0,60 mg/mL
ALVERITIN®
LP00415 ALVARTIS P. Caja con 6 frascos 4000 UI/mL
LP00515 ALVARTIS P. Caja con 6 frascos 4000 UI/mL
LP00615 ALVARTIS P. Caja con 6 frascos 4000 UI/mL
Hema-Plus® 0221602 Siam Bioscience Jeringa pre llenada 4000 UI/mL
EPREX® FDS6Q01 Lilly Jeringa pre llenada 40 000 UI/mL
ERYPO® FAS4800 Janssen Jeringa pre llenada 4000 UI/ 0.4mL
FBS4Z00 Janssen Jeringa pre llenada 4000 UI/ 0.4mL
EPREX® GDS3700 Cilag Fracos 4000 UI/mL
ALVERITIN®: Nombre registrado en México (COFEPRIS) del ior®EPOCIM comercializado en este
país a través de la empresa mexicana ALVARTIS PHARMA. ALVERITIN®= ior®EPOCIM.
Hema-Plus®: Nombre registrado en Tailandia (FDA Thai) del ior®EPOCIM comercializado en este
país a través de la empresa tailandesa Siam Bioscience Co., Ltd Tailandia. Hema-Plus®=
ior®EPOCIM.
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5.2 Materiales de Referencia utilizados.
Se utilizaron los Estándares Físico Químico de la FE (CRS lote 1) y la preparación Biológica de
Referencia (BRP) Lote.3 de EPOhr. Los Materiales de Referencia de Trabajo de EPOhr con código
MRT (QFB) EPOhr/0208 y MRT (QFB)EPOhr/0113 producidos en el CIM y trazables a los estándares
regionales de la FE.
5.3 Estudios de biocomparabilidad y laboratorios participantes.
Los estudios fueron llevados a cabo a través de una matriz de caracterización analítica realizada en
laboratorios acreditados y/o habilitados para ese fin. El objetivo principal fue identificar cualquier
diferencia en los atributos de calidad (estructurales, fisicoquímico, biológicos y/o funcionales) entre
ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO (FDA/Biosimilarity, 2015) (Tabla 28, 28A y 28B).
Tabla 28. Listado de matriz para caracterización física/química/biológica y laboratorio participante.
Característica Método analítico Informe/referencia del estudio Laboratorio
participante
Bioactividad/
Identidad/Estructura
terciaria
in vitro por proliferación celular FTU/BIO/15/002-PRO/REP-002 UDIBI, IPN/
UNAM/México.
Bioactividad/Estructura
terciaria in vivo en ratones normocitemicos Farmacopea Europea
Laboratorio de Control
de la Calidad.
CIM/Cuba
Unión a receptor Afinidad por Biacore FTU/BIO/15/002-PRO /REP-001 UDIBI, IPN/
UNAM/México
Estructura primaria Secuenciación del IFA/espectrometría de
masas REP-LB-C008 ed.1
LAMMB,
UNAM/México.
Peso y pureza SDS-PAGE desnaturalizante Red y no
Red para el IFA REP-LB-C016 ed.1
Peso y pureza SDS-PAGE e inmunodeteccion para el
PT REP-LB-C006 ed.1
Estructura terciaria
Sulfidrilos libres para el IFA REP-LB-C014 ed.1
Estructura terciaria Espectroscopia de adsorción UV para el
IFA REP-LB-C009 ed.1
Estructura terciaria Espectroscopia de fluorescencia para el
IFA REP-LB-C013 ed.1
Pureza/Estructura terciaria
Perfil de isoformas por EC para el IFA REP-LB-C020 ed.1
Estructura terciaria
Perfil de N-Glicosilación por HPLC Fase
normal (HILIC) para el IFA
REP-LB-C017 ed.1
Estructura primaria
Mapeo peptídico para el IFA Farmacopea Europea
Laboratorio de Control
de la Calidad.
CIM/Cuba
Identidad, carga y pureza
Isoelectroenfoque para el IFA Farmacopea Europea
Pureza/agregados de alta
masa molecular
SDS-PAGE e inmunodeteccion para el
IFA y el PT Metodología Interna*
Pureza/ Agregados de alta
masa molecular HPLC-GF para el IFA Farmacopea Europea
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Contenido de ácido siálico
Método colorimétrico para el IFA Farmacopea Europea
Seguridad y pureza
Endotoxinas bacterianas para el IFA y PT Farmacopea Europea
Heterogeneidad de tamaño
Partículas subvisibles para el PT Farmacopea Europea
Heterogeneidad de tamaño
Partículas visibles para el IFA y PT. Farmacopea Europea
*La validación del método está documentada en el G10 INF-0071.
Tabla 28A: Listado de ensayos preclínicos y laboratorio participante.
Tipo de estudio Informe del estudio Laboratorio
participante
Preclínico in vitro por proliferación celular FTU/BIO/15/002-
PRO/REP-002
UDIBI,
IPN/México
Preclínico in vivo en ratones
normocitemicos Farmacopea Europea CIM/Cuba
Preclínico Afinidad por Biacore
FTU/BIO/15/002-PRO
/REP-001
UDIBI,
IPN/México
Preclínico
Farmacocinética comparada del
ior®EPOCIM en monos con el
producto de referencia
EPREX®.
97/23 IFAL/Cuba
Preclínico
Farmacocinética comparada del
ior®EPOCIM en conejos con el
producto de referencia
EPREX®.
97/22 IFAL/Cuba
Preclínico Toxicidad aguda endovenosa
del ior®EPOCIM en primates ERITO497
CETEX/Cuba
Preclínico Toxicidad aguda endovenosa
del ior®EPOCIM en ratas ERITO799
Preclínico
Estudio comparativo de
Toxicidad del ior®EPOCIM a
dosis intravenosas repetidas por
28 días en ratas Sprague
Dawley con EPREX® como
producto de referencia seguido
de un periodo de recuperación
de 14 días.
No.270994
Pucaj et al., Journal of
Pharmaceutical Sciences
103:3432–3441, 2014
Nucro-
Technics,/Canadá
CIM/Cuba
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Tabla 28B: Listado de ensayos clínicos.
Ensayo clínico
Código/País/Año/Publicación
Fase No.
Pacientes
Exposición
máxima
(semanas/
meses)
Vía
admon
Grupo
edad
(años/
días)
Farmacocinética comparada
A bioquivalence study of two-treatmen and
two sequence of Epoetin alfa 4000 IU
injection pre-filled siringe 4000 IU relative to
EPREX in healthy Thai volunteers under
fasting condition.
Report No. EPO-037-15/ Thai/2017
I 22 72 horas SC >18
Anemia por Insuficiencia Renal Crónica
Evaluación de la farmacocinética y el efecto
terapéutico de la hr-EPO en el tratamiento de
la anemia.
NC/Cuba/ /1997
I/II
25 16 semanas IV >18
Efecto terapéutico del uso subcutáneo de la
hr- EPO en el tratamiento de la anemia.
NC/Cuba/ 1998
Pérez-Oliva Díaz Rev Habanera de
Ciencias Médicas, vol. 3, n.o 10, 2004
I/II 24 12 semanas SC >18
Estudio abierto prospectivo para la
evaluación de la eficacia y la seguridad de hr-
EPO (CIMAB, Cuba) en pacientes en diálisis
o pre diálisis en el manejo de la anemia en la
insuficiencia renal crónica.
CLG002/BIO002/CKD/EPO/2005/
India/2005.
III 42 12 semanas IV/SC >18
Equivalencia terapéutica entre la
eritropoyetina humana recombinante y la hr-
EPO sin albúmina (EPO/ SA) en pacientes
con insuficiencia renal crónica en métodos
dialíticos (hemodiálisis o diálisis peritoneal).
IIC RD EC068/Cuba/2004
Pérez-Oliva y cols, Rev. Habanera Cienc.
Médicas, vol. 7, n.o 3, pp. 0-0, sep. 2008.
III
60 (30
pacientes
en cada
grupo)
12 semanas SC >18
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina
humana recombinante en pacientes con
insuficiencia renal crónica en métodos
dialíticos (hemodiálisis o diálisis peritoneal).
IIC RD EC091/Cuba/2006
IV 617 24 meses IV/SC >18
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Estudio abierto prospectivo para la
evaluación de la eficacia y seguridad de
Erypro-SafeTM (hr-EPO inyección) en
pacientes en diálisis o pre diálisis en el
manejo de la anemia en la insuficiencia renal
crónica.
BN002/CKD/2007/India/2007
IV 151 12 semanas IV/SC >18
Comparación de eficacia de la eritropoyetina
producida por el Instituto de Tecnología de
Inmunobiológicos de la Fundación Oswaldo
Cruz y una eritropoyetina biosimilar en
pacientes con insuficiencia renal crónica.
NCT01184495C/Brasil/2008
Paulo y cols. Clinics, vol. 69, n.o 8, pp. 547-
553, ago. 2014.
IV 74 24 meses SC >18
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina
humana recombinante en pacientes con
insuficiencia renal crónica en pre-diálisis.
IIC RD EC112/Cuba/2011
Alicia y cols. Rev.Habanera de Cienc.
Médicas, vol 15, Núm.6 (2016).
IV 242 12 meses IV/SC >18
Anemia por Quimioterapia/Radioterapia
Impacto de la hr-EPO (eritropoyetina humana
recombinante) en pacientes oncológicos con
anemia post quimioterapia/radioterapia.
IIC RD EC092/Cuba/2004
IV 338 8 semanas SC >18
Impacto de la hr-EPO (eritropoyetina humana
recombinante) en pacientes pediátricos
oncológicos con anemia post
quimioterapia/radioterapia
IIC RD EC099/Cuba/2004
Alicia V y cols. MEDICC Rev, vol 12, n.o
3, p. 28, 2010.
IV 157 8 semanas SC <18
Anemia del Recién Nacido Pretérmino
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina
humana recombinante en anemia del recién
nacido.
IIC RD EC121/Cuba/2010
Sijo Y y cols. Rev. Cuba. Pediatría, vol. 85,
n.o 2, pp. 202–212, 2013.
III 72 8 a 10
semanas SC
> 7 días
y
< 30
días
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Evaluación de la seguridad y efectividad de
ior®EPOCIM en el manejo de la anemia del
recién
Nacido prematuro.
M9/CIMAB/AEC-2/ Cuba/2013
RPC. Registro Público Cubano de Ensayos
Clínicos». [En línea]. Disponible en: http:
//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC000
00149-Sp. [Accedido: 07-dic-2015].
IV 131 8 a 10
semanas SC
> 15
días de
nacido.
Prevención de transfusiones de sangre en cirugías electivas con alto potencial de pérdida de
sangre
Eficacia y seguridad de la eritropoyetina
humana recombinante en la disminución de
los requerimientos de transfusiones de sangre
en pacientes con cirugías electivas de
hiperplasia prostática benigna.
IIC RD EC 096/Cuba/2009
Lamelas T y cols. Rev. Cuba. Urol., vol. 2,
n.o 2, ene. 2014.
III 250 3 semanas SC >18
años
Cardio-protección en el esquema de tratamiento con antraciclinas
Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en
pacientes con linfoma No Hodgkin tratados
con antraciclinas.
(IIC RD EC126) Cuba (2010)
RPC0096. Registro Público Cubano de
Ensayos Clínicos». [En línea]. Disponible
en: http:
//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC000
00096-Sp. [Accedido: 07-dic-2015
II
44 (22
pacientes
en cada
grupo)
8 meses IV >18
años
RCP: Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos/ Registro primario de la OMS:
http://registroclinico.sld.cu.
Leyenda: IV: Intravenoso; SC: Subcutáneo
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5.4 Resumen de los métodos estructurales.
5.4.1 Mapeo peptídico.
Para determinar el mapa de péptidos se realizó una hidrolisis parcial de los tres lotes del IFA y el lote
de EPREX® con tripsina siguiendo las recomendaciones que aparecen en la monografía para le EPOhr
en la FE (FE 1316, 2016). Los fragmentos peptídicos fueron separados por el método de HPLC-FR
midiéndose con un detector de diodos a una absorbancia de 214 nm realizando una comparación de los
cromatogramas obtenidos para cada producto (G10 PNO-0087).
5.4.2 Secuenciación por espectrometría de masas.
La muestra de un lote de IFA y de un lote de EPREX® fueron previamente reducida con ditiotreitol
(Sigma-Aldrich), alquiladas con iodoacetamida (Sigma-Aldrich) y digeridas “in solution” con tripsina
(Promega Sequencing Grade Modified Trypsin). También fue digerida con Glutámico C (Roche
Sequencing Grade - No. catalogo 11 047817001). Los péptidos producidos por corte enzimático fueron
desalados con Zip Tip C18 (Millipore) y aplicados en un sistema LC-MS (Liquid Chromatography-
Mass Spectrometry) compuesto de una bomba de nanoflujo EASY-nLC II (Thermo-Fisher Co. San
Jose, CA) acoplada a un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Velos (Thermo-Fisher Co., San Jose,
CA) con fuente de ionización tipo nano-electrospray (ESI). El análisis para la identificación automática
de proteínas se realizó a través el software Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific). La secuencia
de aminoácidos de las muestras fue comparada con la secuencia de la eritropoyetina según la referencia
FE 1316, 2016. Finalmente se compararon las coberturas obtenidas entre las muestras (PNO-IT-030).
5.4.3 SDS-PAGE reducido y no reducido.
Para determinar la migración por electroforesis en gel de poliacrilamida y determinar el peso molecular
aparente de la EPO se colocó 3.0 μg de proteína de cada muestra de los tres lotes del IFA y de los tres
lotes de innovador de referencia EPREX®/ERYPO® en un gel de poliacrilamida al 13% en
condiciones desnaturalizantes reductoras y no reductoras. Se utilizó como referencia una solución de
marcadores de peso molecular Bench Mark. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie y se realizó un
análisis densitométrico utilizando el equipo ChemiDoc™ XRS+ y el software ImageLab 4.1™ de Bio-
Rad. Se determinó la media y la desviación estándar del peso molecular relativo y se realizó un análisis
de t de Student con un 95% de confianza de los datos obtenidos del software ImageLab 4.1™ (PNO-
IT-004).
5.4.4 SDS-PAGE y Western Blot.
Se aplicaron 12 uL provenientes de los viales de los tres lotes de ALVERITIN® y de las jeringas
provenientes de los dos lotes de ERYPO® en un gel en condiciones reductoras y desnaturalizantes al
12% de poliacrilamida y se tiño con azul de Coomassie. Se transfirió el gel a una membrana PVDF y se
realizó una inmunodetección con el anticuerpo policlonal anti-EPO (GeneTex, No. Catalogo
GTX52386) a una dilución 1:1000 en PBS. El anticuerpo secundario utilizado fue un anti-conejo HRP
a una dilución 1:2000 en PBS y finalmente se revelo con una solución de carbazol (PNO-LB-008 y
035).
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5.4.5 SDS-PAGE y Western Blot. Determinación de impurezas de alto peso ≥ 2%.
Se realizó una electroforesis SDS-PAGE en condiciones no reductoras y desnaturalizantes. Se
aplicaron en geles de 12% acrilamida-bisacrilamida 29:1 (BIORAD), tanto las muestras de los tres
lotes de AlVERITIN®, de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® a una
concentración de 0,02mg/mL (0,4µg), como a una dilución al 2% de su concentración inicial. Se
aplicaron 20 µL de una dilución de las muestras volumen/volumen preparadas en tampón de
preparación de las muestras 2X (BIORAD). Posteriormente se transfirió el gel de la corrida a una
membrana de nitrocelulosa de 0,2µm de diámetro (SIGMA) y se realizó la inmunodetección con un
anticuerpo primario anti-EPO (CBSS EPO.1) a una dilución 1:250 en solución de TBS-BSA 1%. Se
utilizó como anticuerpo secundario un anticuerpo anti IgG-HRP (SIGMA A-4416) a una dilución
1:1000 en solución de TBS-BSA 1%. Para la detección se empleó una solución de 1mL de
dimetilformamida (MERCK), 0.02g de N-N diaminobenzidina (SIGMA) y 20µL de peróxido de
hidrógeno al 30% (SIGMA) (G10-PNO-0054).
5.4.6 Sulfidrilos libres.
El método se basó en un ensayo colorimétrico ultrasensible para cuantificar tioles proteicos y no
proteicos reportado por Singh y cols (1993, 1995). Se determinó la concentración de tioles libres con el
reactivo de Ellman en cada muestra de los tres lotes de IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO®.
Los tioles o sulfidrilos inorgánicos que se encuentran en las proteínas reducen a los disulfuros presentes
en la papaína-SSCH3 (derivado de la papaína) de manera estequiométrica, activando a esta enzima. La
papaína activada cataliza la hidrólisis de un sustrato cromogénico (L-BAPNA) resultando en un
aumento de la señal espectrofotométrica proporcional a la cantidad de tioles iniciales. Adicionalmente,
se utiliza la cistamina para detectar tioles de difícil acceso en la proteína o tioles con un valor alto de
pKa. Los disulfuros de la cistamina sufren una reacción de intercambio con los sulfidrilos de las
proteínas para generar 2- mercaptoetilamina (cisteamina), la cual activa a la papaína-SSCH3. Cada
muestra fue analizada por triplicado y se analizaron las medias, desviación estándar y coeficiente de
variación (PNO-IT-0006).
5.4.7 Espectroscopia de adsorción UV.
El método se basó en la caracterización de la EPOhr mediante la obtención del espectro de adsorción
de la radiación UV para cada uno de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO®
mediante el escaneo espectrofotométrico en el rango de 250 a 350nm. Los experimentos se llevaron a
cabo en el equipo eppendorf-BioSpectrofotometer. Se calcularon la media aritmética, desviación
estándar y se realizó un análisis tipo ANOVA y t de Student con un intervalo de confianza del 95%
para determinar si hay diferencia significativa entre las muestras de ambos productos (PNO-LB-024).
5.4.8 Espectroscopia de fluorescencia.
El método se basó en la caracterización de la estructura terciaria de la EPOhr a través del análisis de su
espectro de fluorescencia intrínseca como indicador de la calidad y estabilidad de la proteína. Se
adquirió el espectro de fluorescencia para cada uno de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y los tres
lotes del IFA a las longitudes de onda de excitación de 280 y 295nm. Se realizaron los cálculos de la
media aritmética, desviación estándar, análisis tipo ANOVA y t de Student con un intervalo de
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confianza del 95% para determinar si hay diferencia significativa entre las muestras de ambos
productos (PNO-IT-019).
5.4.9 Perfil de isoformas por electroforesis capilar.
Muestras de los tres lotes del IFA y de un lotes ERYPO® fueron analizadas por el método de
electroforesis capilar de zona. Se utilizó un capilar de sílica fundida y una solución amortiguadora pH
5.55. La separación de las diferentes isoformas de EPOhr se da por su diferencia en su relación
carga/masa. La EPOhr tiene 8 diferentes isoformas (Estándar de Referencia Europeo BRP) y cada
medicamento biotecnológico puede presentar diferentes perfiles de isoformas los cuales dependerán de
la línea celular utilizada y el proceso de producción. La FE define un criterio de aceptación con base en
el porcentaje de isoformas contenido en el medicamento (FE 1316, 2016). Los análisis se realizaron en
el equipo de electroforesis capilar (Código de equipo: E.Capilar.01). El método descrito en este
procedimiento se encuentra en la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (PNO-IT-035 ed.1).
5.4.10 Perfil de N-Glicosilación.
Muestras de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® fueron desnaturalizadas y
digeridas con PNGasa F para separar los oligosacáridos (glicanos) en tres días diferentes.
Posteriormente, los glicanos son derivatizados con 2AB y separados por HPLC para ser detectados por
un detector de fluorescencia. La cromatografía de fase normal en HPLC requiere una columna con
grupos funcionales polares, los cuales interaccionan con los grupos hidroxilo de los azúcares. La
muestra de glicanos-2AB se inyecta al cromatógrafo en una alta concentración de solvente orgánico,
donde se absorben a la superficie de la columna y son eluidos por un gradiente acuoso. De esta forma,
los glicanos son removidos de la columna y separados con base en su hidrofilicidad. Los glicanos más
pequeños, con menos grupos hidroxilo (menos hidrofílicos), eluirán a bajas concentraciones de
solvente acuoso y por lo tanto, antes que los glicanos más grandes (más hidrofílicos). En el análisis de
los datos de la corrida cromatográfica se determina el tiempo de retención, el área y porcentaje de área
de cada pico y el área total de glicanos del cromatograma. Con los resultados obtenidos se puede llevar
a cabo un análisis de la microheterogeneidad y macro heterogeneidad de la glicosilación. De esta
manera, se proponen estructuras para cada uno de los picos identificados utilizando una escalera de
glucosa y bases de datos de estructuras publicadas en la literatura bajo las mismas condiciones
cromatográficas. Se calculó la media aritmética, la desviación estándar y se realizó análisis de t de
Student con un intervalo de confianza del 95% para ver si existían diferencias entre las muestras de
ambos productos (PNO-IT-028).
5.4.11 Punto isoeléctrico por isoelectroenfoque.
Se determinó la distribución de cargas en el perfil de isoformas de la molécula de la EPOhr mediante
isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida en muestras de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de
EPREX®/ERYPO®. Se realizó la corrida electroforética en geles de poliacrilamida (gradiente de pH
2,5-5). Se realizó una tinción con nitrato plata para la visualización de las bandas. Se determinó el
porcentaje de cada una de las bandas del perfil de isoformas de las muestras (G10 PNO-0081).
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5.4.12 Cromatografía en gel filtración.
El análisis y el contenido de dímeros y especies de alto peso molecular de la EPOhr se realizó mediante
la técnica de HPLC-FG empleando un equipo de HPLC modelo LC-2010C HT (Shimadzu) y siguiendo
lo recomendado en monografía para el producto de la FE (FE 1316, 2016). En los ensayos se empleó
como fase estacionaria una columna TSK gel G2000SWXL de 300 x 7,8 mm (TOSOH), con un tamaño
de partículas de 5µm y como fase móvil tampón fosfato 1x a pH 7,2-7,4. Se inyectó un volumen
correspondiente a 30µg de masa de cada muestra de los tres lotes del IFA y de los tres lotes de
EPREX®/ERYPO®. Se compararon los resultados de cada muestra evaluada con el criterio que
recomienda la Farmacopea Europea (FE 1316, 2016) de ≤ 2,00% de dímeros y especies de alto peso
molecular. Se compararon los resultados obtenidos entre los productos mediante un ANOVA para un
95% de confianza para evaluar si existen diferencias estadísticas entre los mismo (G10 PNO-0056).
5.4.13 Contenido de ácido siálico.
El método se basó en realizar una hidrolisis acida de las estructuras sialidadas enlazadas a la proteína
de le EPO presente en las muestras de los tres lotes del IFA. Posteriormente estas muestras se ponen a
reaccionar con el reactivo Resorcinol para formar un complejo violáceo, cuya absorbancia es
proporcional a la concentración de ácido siálico presente en la muestra y es medida utilizando un
espectrofotómetro Shimadzu. Se parte de una curva estándar de ácido siálico acetilado de cuatro puntos
8, 16,3 2 y 64 nmol/ml. (del inglés NANA). Los resultados obtenidos se compararon con el límite
establecido de no menos de 10 moles de ácido siálico/ mol de proteína recomendado por la FE (FE
1316, 2016) para la EPOhr (G10-PNO-0032).
5.4.14 Endotoxinas bacterianas.
El método se basó en determinar la concentración de endotoxinas en los tres lotes de ALVERITIN® y
los tres lotes de EPREX®/ERYPO® por el método del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL),
empleando el ensayo cromogénico cinético según recomendaciones de la FE (FE 5.1.10, 2016). Se
detectó o cuantificó el nivel de endotoxinas procedentes de bacterias gram-negativas utilizando el
lisado de amebocitos del cangrejo de herradura Limulus polyphemus (LAL) basado en el desarrollo de
color después de la escisión de un complejo sintético de péptido-cromógeno teniendo como principio
que las endotoxinas que existen en la muestra, activan una enzima proteolítica presente en lisado de
amebocitos del cangrejo Limulus polyphemus, ocasionando una cascada de reacciones enzimáticas,
que convierten la enzima pro-coagulable en coagulable, esta enzima actúa sobre el sustrato sintético
que lleva unido p-nitroanilina (pNa), provocando la liberación de la misma y desarrollando un color
amarillo. La cantidad de pNa es medida espectrofotométricamente a 405 nm y es proporcional a la
cantidad de endotoxinas presentes en la muestra. Los resultados fueron comparados entre sí y con el
límite establecido de < 20UE/10 000 UI de EPO según recomendaciones de la FB (FB, 2016) (G10-
PNO-0021).
5.4.15 Partículas subvisibles.
Se determinó, con ayuda de un contador de partículas en solución del fabricante RION modelo KL-
04A, la contaminación por partículas subvisibles en los tres lotes de ALVERITIN® (partículas que
aparecen de forma no intencionada como contaminantes en las preparaciones inyectables y
preparaciones para perfusión y consisten en partículas extrañas, partículas móviles no disueltas, aparte
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de burbujas de gas) por el método de bloqueo de la luz. Las operaciones fueron realizadas según la
metodología recomendada por la FE (FE 2.9.19, 2016), en un área controlada bajo una cabina de flujo
laminar. Los resultados fueron comparados con el límite establecido de valores medios de partículas
presentes en las unidades ensayadas menores de 6000 por envase para las partículas iguales o mayores
que 10 µm y menores de 600 por envase para las partículas iguales o mayores que 25 µm según
recomendaciones de la FE (FE 2.9.19, 2016) y la FB (FB apéndice XIIIB, 2016) (G10-PNO-0026).
5.4.16 Partículas visibles.
Se determinó, con ayuda de un banco de inspección óptica, la contaminación por partículas visibles en
muestras de los tres lotes de ALVERITIN® y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® por el método de
inspección visual (G10-PNO-0002). Las operaciones fueron realizadas según recomendaciones de la
FE (FE 20920, 2016) en un área controlada bajo un banco óptico. Los resultados fueron comparados
con lo recomendado en la monografía de la EPO inyectable de la FB (FB, 2016) para este parámetro de
calidad.
5.5 Resumen de los métodos funcionales.
5.5.1 Actividad biológica in vitro.
Se determinó el efecto proliferativo de muestras de los tres lotes de ALVERITIN® y de los tres lotes
de EPREX®/ERYPO® sobre la línea celular TF-1 por un método colorimétrico útil para determinar el
número de células vivas. El método colorimétrico consistió emplear el colorante MTS el cual es
reducido por enzimas deshidrogenasas que se encuentran en las células metabólicamente activas
generando un derivado de formazán. La cantidad de este producto se midió en un espectrofotómetro a
490nm y la absorbancia se consideró proporcional al número de células vivas. Se compararon los
valores medios del logaritmo de la concentración efectiva 50 % de la respuesta (log EC50) y de la
pendiente de Hill utilizando el software Prism 6.0 (Graphpad). (FTU/BIO/15/002-PRO/REP-002).
5.5.2 Actividad biológica in vivo.
El modelo biológico consistió en la administración de diferentes dosis de EPOhr en ratones B6D2F1
de 6-8 semanas de edad provenientes de CENPALAB. Se administraron, por vía subcutánea tres dosis
de las muestras de ALVERITIN® y de EPREX®/ERYPO®. Al final del tratamiento (72hrs) se colectó
una muestra de sangre vía seno venoso orbital y se realizó el análisis por cámara de neubauer para la
cuantificación de los reticulocitos y se compararon las pendientes de las curvas obtenidas. Se calculó la
potencia en UI/mL para cada lote evaluado por comparación con un Material de Referencia Interno
trazable al BRP de la FE mediante un ANOVA de líneas paralelas según recomendaciones
bioestadísticas de la FE (FE 5.3, 2016) para con un intervalo de confianza entre 64-156% y se evaluó
que las potencias halladas se encontraban entre un 80 a 120% de la potencia asignada de acuerdo a
recomendaciones de la FE (FE 1316, 2016) y de la FB (FB, 2016) para la EPOhr Se calcularon las
medias de potencia, desviación estándar y se realizó un análisis tipo ANOVA con un intervalo de
confianza del 95% para determinar si hay diferencia significativa entre los resultados de potencia de
ambos productos. Los animales fueron mantenidos durante toda la etapa de experimentación en un
régimen de luz/oscuridad de 12 horas con suministro ad libitum de agua/ alimento, una temperatura
entre 18-25oC y una humedad entre 20-70%.
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5.5.3 Afinidad por Biacore.
El análisis de interacción biomolecular se basó en la resonancia de plasmones superficiales mediante el
uso de biosensores determinándose la K de afinidad y disociación de los tres lotes de ALVERITIN® y
los tres lotes de EPREX®/ERYPO® utilizando al menos cinco concentraciones del analito. Se utilizó
el chip CM5 de una celda en la que se inmovilizo el receptor de EPO recombinante humana utilizando
unión química de aminos estándar. Los datos obtenidos en tiempo real de las cinéticas de asociación y
disociación en el equipo Biacore 3000 GE healthcare, fueron analizados mediante el software
BIAevaluation, mediante el cual se obtuvieron las constantes de afinidad y disociación de la unión
ligando-receptor de forma automática. Se calcularon las medias de las constantes para cada producto y
los resultados, en su conjunto, fueron analizados estadísticamente mediante un análisis tipo t de Student
con un intervalo de confianza del 95% para determinar si hay diferencia significativa entre las
constantes de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® (FTU/BIO/15/002-PRO/REP-001).
5.6 Marco regulatorio.
El estudio de biocomparabilidad se realizó tomando como referencia principal:
- FDA/Biosimilarity. 2015. FOOD & DRUG ADMINISTRATION. Quality Considerations in
Demonstrating Biosimilarity of a Therapeutic Protein Product to a Reference Product.
- Comité de medicamentos patentados (CPMP), Nota de orientación sobre la toxicidad repetida
de dosis. Documento de orientación. EMEA CPMP / SWP / 1042/99 / corr., 27 de julio de
2000.
- Directrices sobre medicamentos biológicos similares que contienen proteínas derivadas de la
biotecnología como sustancia activa: cuestiones no clínicas y clínicas. EMEA / CHMP / BMWP
/ 42832/2005, 22 de febrero de 2006.
- ICH Good Clinical Practice (ICH-GCP).
- OECD Good Laboratory Practice (OECD-GLP).
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6. RESULTADOS Y DISCUSION.
La complejidad estructural de los medicamentos biológicos solo puede ser reproducida por sistemas
vivos. Por ello, su proceso de producción puede provocar cierto grado de variabilidad natural entre las
distintas moléculas del mismo principio activo y entre los diferentes lotes del medicamento. Sin
embargo, aunque se reconoce que puede haber pequeñas diferencias entre ellos, la autorización de un
biosimilar se basa en la demostración de que éstas no tienen ni relevancia clínica ni conducen a
diferencias de seguridad o eficacia (EMA, 2012).
6.1 Resultados de la caracterización fisicoquímica.
6.1.1 Mapeo de péptidos.
Verificación del sistema:
Se realizó una inyección de un blanco (Fase móvil) y se determinaron los picos utilizando un detector
de arreglo de diodos a una absorbancia de 214 nm (Figura 5). Este blanco sirve para evitar seleccionar
los picos que son propios de la fase móvil.
Además, se verificó que el cromatograma obtenido para el MRT utilizado coincidía con el descrito en
su certificado de caracterización.
Figura 5. Cromatograma del mapeo peptídico del blanco.
Resultados:
En este ensayo analítico, la proteína se digirió en fragmentos más pequeños usando una proteasa
específica los cuales fueron separados posteriormente mediante HPLC-FR. En la figura 6 se muestran
los cromatogramas obtenidos después de la digestión con tripsina utilizando un detector de arreglo de
diodos a una absorbancia de 214nm. En la figura se compara el lote de EPREX®, los tres lotes de IFA
y el MRT con código MRT (QFB)rh-EPO/0113 trazable al BRP lote 3 de la FE.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 min
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275000uV
Data6:Blanco 170316.lcd Detector A:214nmData5:FDS6Q01 170316.lcd Detector A:214nmData4:3342P1513M 170316.lcd Detector A:214nmData3:3342P1512M 170316.lcd Detector A:214nmData2:3342P1511M 170316.lcd Detector A:214nmData1:MRT rhEPO0113 170316.lcd Detector A:214nm
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Fig
ura
6.
Cro
mat
ogr
am
a
del
ma
peo
pep
tídi
co
de
las
mu
estr
as
ana
liza
das.
De
arri
ba
hac
ia
aba
jo:
MRT (QFB)rh-EPO/0113, 3342/P1511, 3342/P1512, 3342/P1513, el lote de EPREX FDS 6Q01 y el
blanco del ensayo.
Conclusión:
El mapeo peptídico de las muestras analizadas del IFA y el lote de EPREX® es cualitativamente
similar. No se observaron diferencias notables entre los cromatogramas del análisis por mapeo
peptídico entre las muestras analizadas lo que demuestra una secuencia de aminoácidos idéntica y
formación de enlaces disulfuros.
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Data6:Blanco 170316.lcd Detector A:214nmData5:FDS6Q01 170316.lcd Detector A:214nmData4:3342P1513M 170316.lcd Detector A:214nmData3:3342P1512M 170316.lcd Detector A:214nmData2:3342P1511M 170316.lcd Detector A:214nmData1:MRT rhEPO0113 170316.lcd Detector A:214nm
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6.1.2 Secuenciación por espectrometría de masas.
Verificación del sistema:
Antes de la inserción de las muestras se realizó una calibración del espectrómetro en modo positivo,
con una solución de estándares de pesos moleculares conocidos (Calmix®: N-butilamina, cafeína,
H2N-MRFA-CO2 y Ultramark 1621). Después se corrió una muestra de albúmina y se determinó su
masa molecular. La calibración fue conforme ya que se determinó la masa molecular con una exactitud
menor a 5 ppm (partes/millón).
Resultados:
A continuación (figura 7) se presenta la secuencia de epoetina alfa contra la cual se compararon las
secuencias de las muestras analizadas. Se marcan en color azul y rojo los pares de cisteínas que forman
puentes disulfuro, con verde los sitios potenciales de N-glicosilación y naranja el sitio de O-
glicosilación.
Figura 7. Secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina (Referencia (FE 1316, 2016).
La Epoetina alfa tiene un peso molecular de 37 kDa y su secuencia está compuesta de 165 aminoácidos.
Las secuencias obtenidas del lote IFA y de EPREX® se compararon con la secuencia de referencia. Se dejó
en blanco los aminoácidos que no fueron secuenciados. La secuencia del lote del IFA se muestra en la figura 8, en amarillo se señalan los aminoácidos que fueron
secuenciados y que coinciden con la secuencia de referencia. Se obtuvo un 68.48 % de cobertura.
Figura 8. Secuencia de aminoácidos del IFA.
En la Figura 9 se muestra la secuencia del lote de EPREX®. En amarillo se señalan los aminoácidos
que fueron secuenciados y que coinciden con la secuencia de referencia. Se obtuvo un 63.64 % de
cobertura.
Figura 9. Secuencia de aminoácidos del lote de EPREX®.
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El análisis que se realizó a través el software Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific) de la
secuenciación del IFA y EPREX® se detalla en la tabla 29.
Tabla 29. Resultados del análisis de secuenciación del lote de IFA y EPREX®.
Muestra Score Cobertura (%) No de péptidos
Masa intacta
desglicosilada
(kDa)
IFA
3342/P1511 4518.44 68.48 23 18.4
EPREX®
FDS6Q01 1573.61 63.64 28 18.4
Tambien se realizaron otros estudios como parte de la verificación de la estructura primaria de la
EPOhr producida en el CIM por espectrometría de masas donde se obtuvo en su conjunto un 98% de
cobertura según la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 7 (CIM D701OT-007 2007, CIGB
MISC2-3 2017).
Conclusión parcial:
Se obtuvo una cobertura del 68.48% para el IFA y una cobertura del 63.64% para EPREX®. Al
integrar todos los resultados se obtuvo una cobertura del 98% para el IFA al compararla con la
estrustura primaria declarada en las referencias internacionales. De los aminoácidos secuenciados, se
mostró que las muestras del IFA y EPREX® comparten la misma secuencia de aminoácidos, las que
coinciden con la reportada para EPO en la FE (FE 1316, 2016) y que el IFA posee una correcta
secuencia de los primeros 15 residuos N-terminal, C-terminal, tres sitios de N-Glicosilacion, 1 sitio de
O-Glicosilacion, las 4 cisteinas y una correcta formación de los puentes disulfuros.
6.1.3 SDS-PAGE reducido y no reducido en condiciones desnaturalizante.
Verificación del sistema:
Se comprobó que el perfil del marcador Bench Mark coincidía con el perfil descrito por el proveedor
en la información del producto. Que las bandas del marcador se encontraban definidas y resueltas y que
el frente de corrida se ubica como mínimo al 90% del gel.
Resultados:
Condiciones desnaturalizante reductoras.
El gel de poliacrilamida al 13% en condiciones desnaturalizantes reductoras que se obtuvo de las
muestras de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® analizadas se muestran en la
Figura 10.
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FIGURA 10. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes reductoras teñido con azul de
coomassie se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular bench mark, carril 2
lote: FDS6Q01, CARRIL 3 lote: FAS 4800, carril 4 lote: FBS 4Z00, CARRIL 5 VACÍO, CARRIL 6
lote: 3342/P1511, CARRIL 7 lote: 3342/P1512, Y CARRIL 8 lote: 3342/P1513.
La Epoetina alfa es una proteína que tiene un peso molecular relativo en su forma glicosilada de ~37
kDa (EPO-alpha, 2016). La Epoetina alfa es una proteína que migra por electroforesis como única
banda ancha en condiciones desnaturalizantes no reductoras (FE 1316, 2016). Tanto
EPREX®/ERYPO® y el IFA cumplen lo establecido en la FE ya que se observa una sola banda ancha
principal.
Para determinar el peso molecular aparente en cada uno de los geles se realizó una curva estándar con
el marcador de peso molecular Bench Mark, la R2 del ajuste exponencial fue mayor a 0.95.
Se realizó un análisis por densitometría del gel mostrado en la Figura 10 utilizando el equipo
ChemiDoc™ XRS+ y el software ImageLab 4.1™ de Bio-Rad y en la tabla 30 y 31 se muestran los
pesos moleculares relativos determinados para la banda principal observada en cada muestra analizada.
Tabla 30. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante reductoras de las muestras de
EPREX®/ERYPO®.
Lote FDS6Q01 Lote FAS 4800 Lote FBS 4Z00 Media aritmética y
DE
31.7 KDa 31.7 KDa 31.5 KDa 31.6 ±0.1 KDa
Tabla 31. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante reductoras de las muestras
del IFA.
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RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Lote 3342/P1511M Lote 3342/P1512M Lote 3342/P1513M Media aritmética y
DE
30.3 KDa 30.4 KDa 31.2 KDa 30.6 ±0.5 KDa
Condiciones desnaturalizante no reductoras.
El gel de poliacrilamida al 13% en condiciones desnaturalizantes no reductoras que se obtuvo de las
muestras de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® analizadas se muestra en la
Figura 11.
Figura 11. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes no reductoras teñido con azul de
Coomassie. Se cargó 3μg de cada muestra. Carril 1 y 9 marcador de peso molecular Bench Mark, carril
2 Lote: FDS6Q01, carril 3 Lote: FAS 4800, carril 4 Lote: FBS 4Z00, carril 5 vacío, carril 6 Lote:
3342/P1511, carril 7 Lote: 3342/P1512, y carril 8 Lote: 3342/P1513.
En las Tabla 32 y 33 se muestran los pesos moleculares relativos determinados para la banda principal
observada en cada muestra analizada.
Tabla 32. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las muestras
de EPREX®/ERYPO®.
Lote FDS6Q01 Lote FAS 4800 Lote FBS 4Z00 Media aritmética y
DE
30.9 KDa 31.0 KDa 30.9 KDa 30.9 ±0.05 KDa
Tabla 33. Resultados del peso molecular en condiciones desnaturalizante no reductoras de las muestras
del IFA.
Lote 3342/P1511 Lote 3342/P1512 Lote 3342/P1513 Media aritmética y
B
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DE
29.5 KDa 29.5 KDa 30.4 KDa 29.8 ±0.5 KDa
Para los datos obtenidos de los geles se realizó la prueba de t-Student con un intervalo de confianza del
95% (p 0.05) y se encontró que no existe diferencia estadística significativa en el peso molecular
aparente entre el IFA y los medicamentos EPREX®/ERYPO® en condiciones desnaturalizantes
reductoras, mientras que en condiciones no reductoras se observa diferencia estadística significativa
(Tabla 34).
Tabla 34. Análisis estadístico tipo t-Student.
Conclusión parcial:
Se determinó el peso molecular aparente bajo condiciones reductoras y no reductoras desnaturalizantes.
Se observó una única banda ancha característica de EPOhr tanto en EPREX®/ ERYPO® y el IFA,
como se describe en la FE (FE 1316, 2016) y la FB (FB, 2016). No se observaron, en ninguna de las
muestras analizadas, bandas de bajo o altos pesos moleculares adicionales a la banda principal
observada lo que demuestra la pureza del producto. Por medio de un análisis de t-Student se determinó
que no existe diferencia significativa en el peso molecular relativo calculado en la condición
desnaturalizante reductora, mientras que si existe diferencia estadística significativa en la condición
desnaturalizante no reductora, con un intervalo de confianza del 95%. Las diferencias en el peso
molecular relativo es debida a un diferente perfil de N-glicosilación entre las muestras de
EPREX®/ERYPO® y el IFA aunque para ambos productos los valores medios del peso molecular
estuvieron muy cerca del peso molecular relativo (30.6 KDa) recomendado por la FE (FE 1316, 2016)
para la EPOhr.
6.1.4 SDS-PAGE y Western Blot para el biomedicamento.
Verificación del sistema:
Se comprobó que el perfil del marcador Bench Mark coincidía con el perfil descrito por el proveedor
en la información del producto. Que las bandas del marcador se encontraban definidas y resueltas y que
el frente de corrida se ubica como mínimo al 90% del gel.
Resultados:
Gel SDS-PAGE en condiciones reductoras y desnaturalizantes.
El gel en condiciones reductoras y desnaturalizantes que se obtuvo de las muestras de los tres lotes de
ALVERITIN® y los dos lotes de ERYPO® analizadas se muestra en la figura 12.
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Figura 12. Gel de SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes no reductoras teñido con azul de
Coomassie. Se cargó 12 μl de cada muestra. Carril 1 Lote FBS 4Z00, carril 2 Lote: FAS 4800, carril 3
vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote: LP00515 y carril 6 Lote: LP00615. MP corresponde al
marcador de peso molecular Bench Mark.
Mediante el análisis de imágenes en ImageLab 4.1 se detectó una sola banda difusa en las muestras de
los dos lotes de ERYPO®, aproximadamente a la altura de 40 KDa, que corresponde al peso molecular
esperado para la EPO. En ensayos SDS-PAGE se ha observado que la banda difusa correspondiente a
la EPO (ERYPO®) se atribuye principalmente a la presencia de glicoformas (Gianoncelli y cols, 2015;
Reichel y Thevis, 2013).
En relación a las muestras evaluadas correspondientes a los tres lotes de ALVERITIN® se detectaron
varias bandas, incluyendo una banda correspondiente a la albumina (~67 KDa) y una banda apenas
perceptible a la altura de los 40 KDa aproximadamente. El peso molecular de EPO glicosilada es de
aproximadamente 37
KDa (EPO- Alpha, 2016), por lo
cual se supone que esta última banda
corresponde a la EPO.
6.1.5 Inmunodetección
mediante Western Blot
La membrana PVDF transferida con
las 5 muestras mencionadas
anteriormente se muestra en la
Figura 13.
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Figura 13. Western Blot en membrana de PVDF revelada con solución de carbazol. Carril 1 Lote FBS
4Z00, carril 2 Lote: FAS 4800, carril 3 vacío, carril 4 Lote: LP00415, carril 5 Lote: LP00515 y carril 6
Lote: LP00615. MP corresponde al marcador de peso molecular Dual color.
En la Figura 13 se observa una sola banda ancha difusa que fue detectada por al anticuerpo anti-EPO en
todas las muestras analizadas, lo que confirma que la banda observada en el SDS-PAGE para las
muestras de ALVERITIN® y alrededor de los 67 KDa no corresponde a EPO sino a la albumina
presente en la formulación del producto. El peso molecular aproximado de la banda correspondiente a
la EPO en todas las muestras fue de ~37 kDa que corresponde al esperado a la EPO glicosilada (EPO-
Alpha, 2016). Resultados similares fueron obtenidos por Schmidt y cols (2003) cuando caracterizaron
productos biofarmacéuticos que contenían eritropoyetina como principio activo y albumina en su
formulación.
Conclusión parcial:
La migración de la molécula de EPOhr en SDS-PAGE y Westem Blot (-40 kDa) fue la misma para
ERYPO® y ALVERITIN®. No se observaron bandas adicionales de alto o bajo peso molecular en
ninguno de los biomedicamentos.
6.1.6 Western blot para el IFA y el PT.
Verificación del sistema:
En todos los geles revelados se visualiza la banda ancha del MRT con código MRT (QFB)
EPOhr/0113.
Resultados:
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Las membranas transferida con las muestras de los tres lotes del IFA, los tres lotes de ALVERITIN® y
los tres lotes de EPREX®/ERYPO® se muestran en las figuras 14, 15 y 16. En cada membrana se
evaluó 1 lote del producto innovador de referencia, 1 lote del producto candidato a biocomparable
ALVERITIN® y el lote de IFA que le dio origen.
En las Figuras se observa una sola banda ancha difusa que fue detectada por al anticuerpo anti-EPO en
todas las muestras analizadas (IFA, medicamento candidato a biocomparable e innovador) al aplicar 10
µg de las mismas lo que confirma la identidad del IFA y ALVERITIN® en relación al MRT y al
producto innovador utilizado.
Adicionalmente en ninguna de las muestras analizadas se observó una banda de agregados o especies
de alto peso molecular en relación a la masa aplicada correspondiente al 2% (0.2 µg) lo que confirma
una pureza similar entre el IFA, ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® mayor al 98% y un bajo riesgo
de respuesta inmune inducida por agregados (Vera y cols, 2011).
Conclusión parcial:
Figura 14. Western Blot
Carril 1: 10 µg MRT (QFB)EPOhr/0113
Carril 2: 0,2 µg MRT(QFB)EPOhr/0113
Carril 3: 10 µg Lote FDS 6Q01
Carril 4: 0,2 µg Lote FDS 6Q01
Carril 5: 10 µg Lote LP00615
Carril 6: 0.2 µg Lote LP00615
Carril 7: 10 µg Lote 3342/P1513
Carril 8: 0.2 µg Lote 3342/P1513
Figura 15. Western Blot
Carril 1: 10 µg MRT (QFB)EPOhr/0113
Carril 2: 0,2 µg MRT(QFB)EPOhr/0113
Carril 3: 10 µg Lote FAS 4800
Carril 4: 0,2 µg Lote FAS 4800
Carril 5: 10 µg Lote LP00415
Carril 6: 0.2 µg Lote LP00415
Carril 7: 10 µg Lote 3342/P1511
Carril 8: 0.2 µg Lote 3342/P1511
Figura 16. Western Blot.
Carril 1: 10 µg MRT (QFB)EPOhr/0113
Carril 2: 0,2 µg MRT(QFB)EPOhr/0113
Carril 3: 10 µg Lote FAS 4Z00
Carril 4: 0,2 µg Lote FAS 4Z00
Carril 5: 10 µg Lote LP00515
Carril 6: 0.2 µg Lote LP00515
Carril 7: 10 µg Lote 3342/P1512
Carril 8: 0.2 µg Lote 3342/P1512
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Se observó una única banda ancha característica de EPO tanto en EPREX®/ERYPO®, el IFA y
ALVERITIN®, como se describe en la FE (FE 1316, 2016) y la FB (FB, 2016). No se observaron, en
ninguna de las muestras analizadas, bandas de altos pesos moleculares adicionales a la banda principal
observada ni mayores a la masa del producto aplicada correspondiente al 2% (0,2 µg) lo que demuestra
una pureza del producto superior al 98%.
6.1.7 Sulfidrilos libres.
Verificación del sistema:
Se obtuvieron dos curvas estándar de L-cisteína debido a que el análisis se realizó en dos días
independientes. En la Figura 17 se muestra la curva obtenida en el análisis realizado el día 01dic2015 y
en la Figura 18 la curva obtenida en el análisis realizado el día 14 jun2016. Figura 17. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.996, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).
Figura 18. Curva estándar de L-cisteína. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.993, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.950).
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Las curvas estándares obtenidas son adecuadas para realizar la cuantificación de las muestras.
Se determinó la concentración de tioles libres en la L-cisteína con el reactivo de Ellman. En 0.1 mM de
L-cisteína hay 0.072 ± 0.001 mM de tioles libres. En el ensayo realizado el día 01dic2015 se encontró
que en 0.1 mM de L-cisteína hay 0.072 ± 0.001 mM de tioles libres. En el ensayo realizado el día
14jun2016 se encontró que en 0.1 mM de L-cisteína hay 0.056 ± 0.000 mM de tioles libres. Resultados:
En la tablas 35 y 3 6 se muestran los contenidos de sulfidrilos libres por mol de proteína de las
muestras de los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® evaluados.
Tabla 35. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras del IFA.
Lote mol de tiol libre/ mol de proteína ± DE
3342/P1511 1Menor a 0.043
3342/P1512 1Menor a 0.043
3342/P1513 1Menor a 0.043 1 determinado a partir del límite de detección del kit utilizado lote: 1652339
Tabla 36. Contenido de sulfidrilos libres para las muestras de EPREX®/ERYPO®.
Lote mol de tiol libre/ mol de
proteína ± DE
FDS 6Q01 1Menor a 0.168
FAS 4800 1Menor a 0.168
FBS 4Z00 1Menor a 0.168 1 determinado a partir del límite de detección del kit utilizado lote: 1737934
Conclusión parcial:
Los tres lotes del IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® muestran un contenido menor a 0.168 mol
de tiol libre por mol de proteína lo que indica que prácticamente todas las cisteínas se encuentran
formando puentes disulfuro. Este resultado permitió analizar la formación correcta de los enlaces
disulfuros.
6.1.8 Punto isoeléctrico por isoelectroenfoque.
Verificación del sistema:
El criterio para determinar la adecuabilidad del sistema de acuerdo al procedimiento establecido en el
laboratorio resultó conforme ya que se visualizan las 5 bandas mayoritarias del MRT según su
certificado.
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Resultados:
Los geles obtenidos se muestran en las Figuras 19 y 20.
Se ha descrito que debido a diferencias en la composición de las cadenas de carbohidratos, la EPO
exhibe microheterogeneidad causada por modificaciones postraduccionales (Choi y cols, 1996). La
separación isoeléctrica muestra una variedad de diferentes isoformas (Sherwood y cols, 1988, Lasne y
de Ceaurriz, 2000; Lasne, 2001).
Fueron observadas entre 5–6 isoformas coincidentes entre los productos evaluados (Figuras 19 y 20).
Los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y del IFA mostraron 5 isoformas mientras que el lote 3342/P1513
Figura 19. Gel de IEF teñido con nitrato de plata.
MRT: 4 µg MRT (QFB) EPOhr/0113
Carril 1: 4 µg FDS6Q01
Carril 2: 4 µg 3342/P1512
Carril 3: 4 µg 3342/P1513
MRT 1 2 3
MRT 1 2 3
Figura 20. Gel de IEF teñido con nitrato de plata.
MRT: 4 µg MRT (QFB)EPOhr/0113
Carril 1: 4 µg FAS4800
Carril 2: 4 µg FBS4Z00
Carril 3: 4 µg 3342/P1511
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del IFA mostro una isoforma adicional (6 isoformas). Estos resultados son semejantes a los citados por
otros autores, que describen entre 5-7 isoformas para la EPOhr α e β (Gokana A y cols, 1997; Storring
PL y cols, 1998). Otros autores plantean, que por lo general en geles de IEF, ERYPO® (EPOhr α)
muestra un máximo de 6 isoformas, Neorecormon (EPOhr β) un máximo de hasta 8 isoformas y la EPO
urinaria entre 14 y 15 isoformas. Siendo algunas isoformas más abundantes que otras (Thieme y
Hemmersbach, 2010).
Las diferencias entre biosimilares y los productos originales pueden ser fácilmente reveladas por IEF
como demuestra en la figura 21 (Thieme y Hemmersbach, 2010). La ALFAEPOETINA® es el nombre
comercial de la EPOhr producida en el CIM y comercializada en Brasil. En la figura 21 se puede
observar que la ALFAEPOETINA® posee un perfil de isoformas similar al obtenido por el producto
de referencia ERYPO®, resultados que coinciden con los obtenidos al comparar los tres IFAs contra
tres lotes de EPREX®/ERYPO® como parte del estudio de biocomparabilidad de ALVERITIN® y
descritos en las figuras 19 y 20.
Figura 21. Perfil de IEF de varias eritropoyetinas biosimilares y original. IEF fue desarrollado en
un rango de pH de 2-6. Fuente: Reichel y cols, 2009.
Conclusión parcial:
El perfil de isoformas obtenidos en las muestras de EPOhr en el IFA y EPREX®/ERYPO® son
similares y se encuentran dentro del rango aceptado para la EPOhr en las diferentes monografías.
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6.1.9 Espectroscopia de adsorción UV.
Verificación del sistema:
Se realizó el escaneo espectrofotométrico por triplicado de Tiroglobulina (Tg) a 0,5 mg/mL en el rango
de 250-350nm de adsorción para determinar el correcto funcionamiento del equipo. Posteriormente, se
realizó el cálculo derivativo de segundo orden de cada curva realizada en dos ensayos (17dic2015 y
10may2016). Los datos fueron graficados como se presenta en las Figuras 22 y 23.
Figura 22. Espectro originado de cálculos derivativos de segundo orden de Tiroglobulina. El eje X
corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda derivada del
espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos correspondientes al análisis
del 17dic2015
Figura 23. Espectro originado de cálculos derivativos de segundo orden de Tiroglobulina. El eje X
corresponde a la longitud de onda (250–350nm). El eje Y corresponde a la segunda derivada del
espectro de absorción. Se muestran seis mediciones independientes. Datos correspondientes al análisis
del 10may2016.
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Posteriormente se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA a los datos de la segunda derivada de
cada medición. Los criterios de aceptación fueron: Emparejamiento significativo (P<0.05) y R2 ≥0.98.
Los datos obtenidos de análisis estadístico tipo ANOVA indican la existencia de emparejamiento y se
obtuvo una R2 =0.99 para el ensayo realizado el día 17ene2015 y una R2 =0.99 en el ensayo realizado
el día 10may2016, por lo que la verificación de la adecuabilidad del sistema resulto conforme para
ambos ensayos realizados.
Resultados:
Se realizó el escaneo espectrofotométrico en el rango de 250-350nm de todas las muestras de los tres
lotes de IFA y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® (Figura 24). Posteriormente, se realizó el cálculo
derivativo de segundo orden y los datos fueron graficados según se muestra en la Figura 25.
Figura 24. Comparación de los espectros (orden cero) obtenidos del barrido de adsorción UV de 250 a
350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.
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Figura 25. Comparación de los espectros derivativos de segundo orden obtenidos del barrido de
adsorción UV de 250 a 350nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA de ALVERITIN®.
Se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA entre los espectros derivativos de segundo orden de los
medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA (Tabla 37) y se obtuvieron diferencias significativas.
Tabla 37. Resumen de biocomparabilidad entre los espectros derivativos de segundo orden de los
medicamentos EPREX®/ERYPO® e el IFA.
ANOVA
F 4.6
Valor P 0.0004
Existe diferencias estadísticamente significativas entre las medias? (P<0.05) SI
R cuadrada 0.037
Se realizó un análisis estadístico tipo t de Student entre las intersecciones obtenidas en el rango 285-
295nm de los medicamentos EPREX®/ERYPO y el IFA y se obtuvieron diferencias significativas para
la segunda intersección (Tabla 37A).
Tabla 37A. Resumen de biocomparabilidad entre las intersecciones obtenidas en el rango 285-295nm
de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA de ALVERITIN®.
T de Student
Intersección 1 2 3
Valor P 0.1139 0.0138 0.2067
Existe diferencias estadísticamente significativas? (P<0.05) NO SI No
Es importante señalar que las diferencias observadas podrían deberse al excipiente, el cual es diferente
entre el IFA y EPREX®/ERYPO®, ya que, aunque se realizó un diafiltración de las muestras, aun
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pudieron haber contenido trazas de los excipientes que hayan influenciado el resultado. El espectro
mostrado en la figura 25 de la segunda derivada de las muestras de EPREX®/ERYPO® y el IFA
presenta similitud, ya que las bandas corresponden y se puede observar como las intersecciones son
muy similares en el rango 385-295nm, aunque, los datos exactos muestren que para la segunda
intersección dicha diferencia es estadística significativa.
Conclusiones parciales:
- Las diferencias estadísticamente significativas encontradas entre las medias de los espectros y la
segunda intersección de los lotes de EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes del IFA
puede deberse a trazas de los excipientes presentes después de la diafiltración de cada muestra.
- No se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de la 1 y 3 intersección
correspondiente a EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes del IFA.
- Se obtuvieron, aunque los datos exactos muestren diferencia es estadística significativa, espectros
similares de la segunda derivada con correspondencia de la bandas de adsorción para
EPREX®/ERYPO® y el IFA.
6.1.10 Espectroscopia de fluorescencia.
Verificación del sistema:
Se realizó la adquisición del espectro de fluorescencia intrínseca de albumina sérica bovina (BSA) a 0.5
mg/mL para determinar el correcto funcionamiento del equipo. Posteriormente, se obtuvo el CME y
coeficiente de variación (CV). Los resultados obtenidos de los CME, presentaron coeficientes de
variaciones menor a 0.2% por lo que la verificación del sistema fue adecuado para los dos ensayos
realizados (16dic2015 y 26abri2016) (Figuras 26 y 27, Tabla 38 y 39).
Figura 26. Espectro de emisión de BSA a excitando a 280 y 295nm. Datos correspondientes a la
verificación del 16dic2015.
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Figura 27. Espectro de emisión de BSA a excitando a 280 y 295nm. Datos correspondientes a la
verificación del 26abri2016.
Tabla 38. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 16dic2015
Longitud de onda 280nm 295nm
CME Promedio (nm) 344.93 ± 0.23 346.30 ± 0.07
Coeficiente de variación (%) 0.07 0.02
Tabla 39. Determinación del CME de BSA. Datos correspondientes a la verificación del 26abri2016
Longitud de onda 280nm 295nm
CME Promedio (nm) 344.62 ± 0.11 345.48 ± 0.07
Coeficiente de variación (%) 0.03 0.02
Los coeficientes de variación fueron menores al 0.2%, indicando que el sistema era adecuado para
realizar las mediciones.
Resultados:
La muestra de EPREX® tuvo una concentración inicial 40 000UI/mL mientras que las muestras de
ERYPO® tuvieron una concentración inicial de 4 000 UI/0,4 mL.
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Se adquirió el espectro de fluorescencia de todas las muestras a las longitudes de onda de excitación de
280 y 295nm (Figura 28).
Figura 28. Comparación de los espectros de emisión de EPREX®/ERYPO® y el IFA excitando a 280
y 295nm.
Posteriormente, se realizó el cálculo del CME (Tablas 40 y 41).
Tabla 40. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras de
EPREX®/ERYPO®.
excitación 280 nm excitación 295 nm
Lote CME (nm) CV (%) CME (nm) CV (%)
FAS 4800 343.52 0.04 344.87 0.04
FBS 4Z00 343.57 0.03 344.78 0.09
FDS 6Q01 343.52 0.03 343.99 0.03
Media aritmética y DE 343.54 ± 0.03 - 344.55 ± 0.48 -
DE, Desviación estándar
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Tabla 41. Determinación del CME a 280 y 295nm de excitación de las muestras del IFA.
excitación 280 nm excitación 295 nm
Lote CME (nm) CV (%) CME (nm) CV (%)
3342/P1511 344.21 0.03 345.26 0.03
3342/P1512 343.97 0.06 344.55 0.09
3342/P1513 343.13 0.04 343.12 0.05
Media aritmética y DE 343.77 ± 0.57 - 344.31 ± 1.09 -
DE, Desviación estándar
Se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA entre los espectros de fluorescencia obtenidos de los
medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA (Tabla 42) y se obtuvieron diferencias significativas y
entre los CMEs por medio del análisis estadístico t de Student (Tabla 43) y no se obtuvieron diferencias
significativas.
Tabla 42. Resumen de la comparación de espectros de fluorescencia. Los resultados obtenidos se
presentan tal y como los arroja el ANOVA.
Tabla 43. Resumen de la comparación de CMEs por medio del análisis estadístico t de Student. Los
resultados obtenidos se presentan tal y como los arroja el software Prism 6.
Las diferencias significativas obtenidas entre la intensidad de la fluorescencia entre el producto
EPREX®/ERYPO® y el IFA pueden deberse a las diferencias en la composición de la formulación
entre ambos productos y a la utilización del buffer PBS en vez del buffer de formulación de cada
producto. Esto coincide con los resultados obtenidos por Deechongkit y cols en el 2006 donde
demuestran que existen diferencias entre las proteínas contenidas en EPREX® y EPOGEN®, con
diferente tampón de formulación, al evaluarlas por fluorescencia del Trp intrínseco.
Sin embargo, no existen diferencias significativas entre los CME de los tres lotes de IFA y los tres
lotes de EPREX®/ERYPO® comparados lo que confirma que tienen igual estructura terciaria de la
molécula.
Como parte de la caracterización del IFA producido en el CIM se evaluó la estructura terciaria de 10
lotes del producto por espectroscopia de fluorescencia en los laboratorios LAMMB de la UNAM
ANOVA
Excitación 280nm 295nm
F 9.4 8.1
Valor P < 0.0001 < 0.0001
¿Existen diferencias estadísticamente significativas
entre las medias? (P < 0.05) Si Si
R cuadrada 0.025 0.022
t de Student
Excitación 280nm 295nm
Valor P 0.5501 0.7484
¿Significativamente diferente? (P < 0.05) No No
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utilizando el buffer de formulación en las corridas. En la figura 1 se observa la semejanza el los
espectros de emisión de los 10 lotes de IFA y no se obtuvieron diferencias significativas entre los
mismos cuando fueron evaluados por un ANOVA para un 95% de confianza (Tabla 23). En la tabla 24
se muestran los bajos coeficientes de variación obtenidos (<0.1 %) para la media de los CME a 280 y
295nm de excitación lo que demuestra la consistencia del proceso productivo y la similitud en la
estructura terciaria entre lotes del IFA.
Conclusiones parciales:
- Las diferencias estadísticamente significativas encontrada entre las medias de los espectros de
fluorescencia de los lotes de EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes del IFA se debe a la
utilización del PBS en vez de los buffer de formulación de cada producto.
- El análisis t de Student no mostró diferencias significativas entre los CEMs de los lotes de
EPREX®/ERYPO® en comparación con los lotes de IFA por lo que podemos concluir que los
productos tienen igual estructura terciaria.
6.1.11 Perfil de N-Glicosilación.
Verificación del sistema:
Se obtuvieron dos curvas de calibración con el estándar de homopolímero de glucosa debido a que el
análisis se realizó en dos días independientes. Estas curvas fueron usadas para la transformación de los
tiempos de retención en unidades de glucosa (UG). El ajuste polinomial deberá presentar una R2 mayor o
igual a 0.98. En la figura 29A se muestra la curva obtenida en el análisis realizado el día 03dic2015
cuando se analizaron los tres lotes del IFA y en la figura 29B la curva obtenida en el análisis realizado
el día 17ago2016 cuando se analizaron los tres lotes de EPREX®/ERYPO®.
Figura 29. Curva de calibración del estándar de homopolímero de glucosa. Se muestra la
correlación después de un ajuste polinomial de tercer orden, la cual fue usada para el cálculo de las
unidades de glucosa (UG) en los cromatogramas. Verificación correspondiente al 03dic2015 (A) y al
17ago2016 (B).
Las curvas de calibración obtenidas del estándar de homopolímero de glucosa presentaron una R2
mayor a 0.99, indicando que el sistema era adecuado para realizar las determinaciones.
A B
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Resultados:
Se realizó la determinación del perfil de N-glicosilación por medio de HPLC fase normal de las
muestras de los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y de los tres lotes del IFA. En las figuras 30 y 31 se
muestran los perfiles de glicanos obtenidos del análisis.
Figura 30. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de EPREX®/ERYPO®.
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Figura 31. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras del IFA.
En las Figuras 30 y 31 se observa que los 3 lotes de cada producto poseen un perfil de glicosilación
similar. Adicionalmente se realizó el estudio de biocomparabilidad mediante análisis estadístico entre los resultados
de los tres lotes del medicamento EPREX®/ERYPO y tres lotes del IFA. El análisis de biocomparabilidad
fue realizado mediante la prueba “t de Student” con un valor de p de dos colas y un intervalo de confianza
del 95%. Esta prueba fue aplicada a todas y cada una de las estructuras propuestas, así como a los
porcentajes relativos de glicanos por grupos. En la Figura 32 se muestra el empalme de los perfiles de
glicosilación de los 6 lotes analizados. En la Tabla 44 se muestran los resultados obtenidos del análisis
estadístico para cada estructura propuesta. En la Tabla 45 se muestra el resumen de biocomparabilidad por
grupos de las estructuras identificadas.
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Figura 32. Cromatograma correspondiente al perfil de N-glicosilación de las muestras de EPREX®/
ERYPO® y el IFA.
Tabla 44. Resumen de biocomparabilidad entre los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.
Estructuras propuestas para los N-glicanos con base en su migración en unidades de glucosa,
asumiendo que la proteína se produjo en una línea celular murina El análisis estadístico se realizó por
medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p de dos colas y un intervalo de
confianza del 95%. Estructuras propuestas murina. Las abreviaturas utilizadas son: A: Núcleo
quitobiosa con tres manosas y dos N-acetilglucosaminas. F: Fucosa. G: Galactosa. M: Manosa. S:
Ácido siálico. LAC: Lactosamina (N-acetilglucosamina-G). Los números se refieren al número de cada
residuo en el glicano.
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Tabla 45. Resumen de biocomparabilidad entre los grupos de N-glicanos encontradas en las muestras
de EPREX®/ERYPO® y IFA (producción en línea celular murina). El análisis estadístico se realizó
por medio de la prueba estadística tipo t de Student con un valor de p de dos colas y un intervalo de
confianza del 95%.
Nota: Debido a la diferencia de intensidades en las unidades de florescencia de cada lote, todos los cromatogramas
fueron normalizados tomando como referencia el pico mayoritario correspondiente a la estructura A4G4S4
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Mediante el análisis del perfil de glicosilación de los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA,
fueron encontradas 24 estructuras glicosídicas comunes. Las 24 estructuras encontradas fueron
evaluadas mediante el análisis estadístico t de Student. Cuatro de las 24 estructuras no presentaron
diferencias estadísticamente significativas, mientras que 20 estructuras si presentaron diferencias
estadísticamente significativas entre los medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA.
Independientemente las diferencias obtenidas entre el IFA y EPREX®/ERYPO® en este estudio se
puede observar que se obtuvo un mismo perfil de glicosilación entre ambas moléculas difiriendo en el
contenido relativo de algunas especies y no se observaron estructuras inusuales con posible potencial
inmunogénico. También se observó que no se obtuvieron diferencias estadísticas entre ALVERITIN®
y EPREX®/ERYPO® en los estudios preclínicos (afinidad, actividad biológica in vivo e in vitro,
farmacocinética) por lo que consideramos que las diferencias en el contenido relativo de algunas
especies de ALVERITIN® en relación al observado en EPREX®/ERYPO® no impacta sobre estos
atributos de la molécula lo que garantiza la seguridad y eficacia del uso del producto en la clínica
demostrado a través de los informes de más de 10 años en el proceso de farmacovigilancia
internacionales reportadas al CIM (29 países y 1 505 941 pacientes). Dado que la glicosilación no sólo
depende de la línea celular utilizada para la expresión de las epoetinas sino también de todo el proceso
biotecnológico, los patrones de glicosilación de los biosimilares no reflejan necesariamente los
patrones de los compuestos innovadores (Schellekens, 2004; Michail y Farouk, 2013). Resultados
similares fueron obtenidos en los estudios de biocomparabilidad de la epoetin zeta aprobado como
biosimilar de EPREX® (EMA SB309, 2007). La epoetina zeta es otra EPOhr biosimilar comercializada
en Europa (aprobada en diciembre de 2007) y distribuida como Retacrit®y y Silapo®. Tanto la HX575
como la epoetina zeta tienen patrones de glicosilación diferentes de los de la epoetina alfa; sin
embargo, ambos fueron aprobados como formulaciones biosimilares de epoetina alfa (Islah y cols,
2012).
De igual manera en este estudio de biocomparabilidad los grupos de glicanos fueron evaluados por
medio de análisis estadístico t de Student. Se encontró que los grupos biantenarios, sialidados y altos de
manosa no presentan diferencias estadísticamente significativas entre ambas moléculas. Por lo antes
expuesto y al no obtener diferencias significativas entre los grupos de glicanos sialidados entre ambas
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moléculas consideramos que las mismas poseen similar contenido de ácido siálico en su estructura, lo
cual fue verificado al no obtener diferencias estadísticas en los resultados de afinidad y ensayos in vivo
e in vitro realizados entre ambas moléculas. Se pudo comprobar que el contenido de ácido siálico de las
muestras evaluadas de los tres lotes del IFA (12.00; 12.00 y 13.60 moles/mol de proteína) es mayor de
10 y menor de 14 moles/mol de proteína, cumpliendo con lo remomendado por la FE (FE 1316, 2016)
para la EPOhr y por lo reportado por otros autores que plantean que por la presencia de hasta cuatro
ácidos siálicos cargados negativamente en cada una de las tres cadenas de carbohidratos unidos a N y
hasta dos ácidos siálicos en la única cadena de carbohidratos unidos a O da como resultado hasta 14
ácidos siálicos tanto en la EPO endógena como en la recombinante (Egrie y Browne, 2001). La EPO
humana es una hormona conformada por dos partes, la secuencia de aminoácido (165 aminoácidos)
responsable de la unión a su receptor (Jelkmann, 2005) y la parte glicosilada (35-40 % de la molécula)
responsable de la estabilidad y del tiempo de vida media de la molécula en la circulación sistémica
(Alegre, 2005). Se ha demostrado que la actividad hematopoyética aumenta con un número creciente
de sialiloligosacáridos (Murakami y cols, 2016). La sialilación de los residuos de galactosa
preterminales es necesaria para la actividad in vivo. Se ha demostrado que la asialo-EPO es eliminada
rápidamente por los hepatocitos (Jelkmann 2003).
De la evaluación estadística por grupos de glicanos realizada en este estudio se obtuvo que los grupos
tri- y tetraantenarios así como fucosilados si muestran diferencias estadísticas significativas entre los
medicamentos EPREX®/ERYPO® y el IFA, siendo en el IFA los grupos tri- y tetraantenarios mayores
(50.39 y 55.73% respectivamente) y los fucosilados menores (44.93%). Valorando que el contenido de
glicanos tri y tetraantenas es mayor en el IFA que EPREX® y que en ambos productos hay mucho
mayor porciento de tetraantena que biantena y por la función que desempeñan los glicanos tetraantena
en la estabilidad de la molecular, solubilidad, actividad in vivo, semivida en suero, agregación y
protección de los sitios hidrófobos de la molécula antes señalados consideramos que las diferencias
obtenidas en estos glicanos no tiene un impacto biológico significativo lo cual quedó demostrado al no
obtener diferencias estadística entre ambas moléculas en relación a su actividad biológica in vivo e in
vitro, afinidad por el receptor, farmacocinética y bajo contenido de agregación determinado por
SDS.PAGE/WB y HPLC-GF. Además, se establece que la actividad específica de las muestras
evaluadas de los tres lotes del IFA (103 797; 113 789 y 100 074 UI/mg de proteína) cumplen con lo
remomendado por la FE (FE 1316, 2016) para la EPOhr quedando corroborado al no obtenerse
deferencias estadísticas en la actividad biológica entre ambos biomedicamentos. La estructura y
composición de los carbohidratos son importantes para el mantenimiento de la molécula en circulación.
La glicosilación también es necesaria para el transporte plasmático de la molécula, para el paso de la
misma desde la sangre a la médula ósea través de las células endoteliales de la barrera sangre-médula
ósea (J.Miguel, 2015), para la estabilidad molecular, la solubilidad, la actividad in vivo, la semivida y la
inmunogenicidad (Zoltan y cols, 2010). La EPO posee 4 sitios de glicosilación y tres de ellos ligados al
residuo asparagina 24, 38 y 83 (Takeuchi y Kobata, 1991). Estas glicosilaciones exhiben un diverso
rango que van desde formas bi hasta tetraantenas y juegan un rol critico en el incremento del tiempo de
vida media de la EPO en sangre y en la actividad biológica (Dordal, 1985). Algunos autores han
demostrado que los sialiloligosacáridos de la asparagina 24 de la EPO urinaria humana y la EPOhr
exhiben diversidad en un intervalo de un patrón bi a tetraantenario, mientras que los
sialiloligosacáridos en la asparagina 38 y 83 se demostró que existían principalmente en forma
tetraantenaria (Rahbek-Nielsen y cols, 1997). Otros autores sugieren que los sialiloligosacáridos en la
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asparagina 38 y 83 son necesarios para cubrir la superficie de la proteína hidrófoba con
sialiloligosacáridos tetraantenario, que es necesario para retener su solubilidad de la molécula en la
sangre y para prevenir la agregación proteína-proteína (Murakami y cols, 2016; Murakami y cols,
2012; Hirano y cols, 2011; Hirano y cols, 2009). Considerando estos efectos de las proteínas,
Murakami y cols (2016) tomaron como hipótesis que el cuerpo humano usa la glicosilación como una
modificación postraslacional para regular la hidrofibicidad de la proteína secretada y protegerla de la
agregación proteína-proteína, así como para regular la filtración renal en el caso de la EPO porque el
oligosacárido exhibe propiedades altamente hidrofílicas y de baja propiedades antigénicas en el cuerpo.
Esto significa que la posición de glicosilación y el patrón de glicosilación son críticos para la
bioactividad de las glicoproteínas (Murakami y cols, 2016). Mientras que las diferencias en el
contenido de carbohidratos de la EPO puede afectar la afinidad a su receptor, los carbohidratos también
desempeña un papel importante en el mantenimiento de la molécula en circulación (Elliot y cols,
2004). Además de su efecto sobre la eliminación los carbohidratos también pueden aumentar la
solubilidad y disminuir las propiedades adhesivas de la proteína. Por lo tanto, el carbohidrato puede
proteger los residuos hidrófobos, reduciendo la agregación mientras protege las posibles superficies
inmunogénicas de la molécula (Zoltan y cols, 2010). Las cadenas de N-oligosacáridos tetraantenarios
impiden la depuración renal de la EPO, por lo que la relación de cadenas tetra- a diantenaria es
importante para la actividad in vivo de EPO (Jelkmann, 2003). Las cadenas de carbohidratos de la EPO
son responsables principalmente de su integridad y estabilidad, siendo el punto de partida de nuevos
desarrollos de análogos hiperglicosilados como la Darbepoetina alfa con vidas media sérica más larga
(Narhi y cols, 1991). La Darbepoetina alfa se catalogó como una EPO de segunda generación, ya que
se caracterizó por triplicar el tiempo de vida media en circulación sistémica debido a la adición de
cinco aminoácidos a la secuencia original de la EPO endógena teniendo así dos sitios de N-
glicosilación adicionales en la molécula lo cual dio como resultado un incremento significativo en el
tiempo de vida media (Macdougall, 2008). La tercera generación de EPOs se encuentra representada
por el Activador Continuo del receptor de EPO, cuyo nombre comercial es Mircera. Debido a la
adición de una cadena de metoxi-polietilenglicol a la secuencia de aminoácidos de la epoetina-beta
incrementando el tamaño de la molécula de 30kDa a 60kDa y un incremento del tiempo de vida media
a 130 horas (Thieme y Hemmersbach, 2010). Cuando se compararon las actividades in vitro e in vivo
(Darbepoetin y EPOhr), las formas de la curva dosis-respuesta, la estimulación máxima y la respuesta
hematológica fueron todas similares, lo que sugiere que el contenido diferente de carbohidratos puede
afectar la actividad específica pero no afecta la función biológica per se (Egrie y Browne, 2001). La
causa del aumento de la inmunogenicidad de EPREX®, por cambios en su formulación, todavía está en
discusión (Schellekens, 2004), aunque la agregación en la nueva formulación se considera la
explicación más probable, junto con la vía subcutánea de administración (Schellekens y Jiskoot, 2006).
En Tailandia, múltiples casos se han reportado de PRCA. También aquí, los agregados inducidos por
un almacenamiento inadecuado podrían haber contribuido al desarrollo de PRCA. Praditpornsilpa y sus
colegas (2009) mostraron una correlación entre el desarrollo de PRCA y el gen HLA-DRB1*09-
DQB1*0309, que es más abundante en la población tailandesa en comparación con la caucásica. La
calidad y el nivel de agregados en los biosimilares es un tema importante (Vera y cols, 2011).
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Conclusiones parciales:
- Se obtuvo el mismo perfil de estructuras propuestas para N-glicosilación entre EPREX®/ERYPO®
y el IFA difiriendo en el contenido relativo de algunas especies y grupo de N.
- No se observaron estructuras inusuales en el perfil de N-Glicosilación.
- Las diferencias encontradas no tienen impacto en la actividad biológica, afinidad por el receptor,
farmacocinética y agregación de ALVERITIN® en comparación con EPREX®/ERYPO®.
- Se establece que el uso de ALVERITIN® es seguro al no observarse estructuras glicosídicas
inusuales y bajo contenido de agregación de la molécula.
6.1.12 Perfil de isoformas por electroforesis capilar.
Verificación del sistema:
Se inyectó al capilar el estándar fisicoquímico de Eritropoyetina CRS cumpliendo con los parámetros
de verificación del sistema que se muestra en la tabla 46.
Tabla 46. Verificación del sistema.
Resultados:
En la Tabla 47 se presentan los porcentajes de isoformas obtenidos para el estandar CRS de la FE y los
criterios recomendados para cada una de las 8 isoformas de la EPOhr. En la tabla 48 se muestras los
resultados obtenidos por electroforesis capilar en cinco lotes del IFA evaluados.
Tabla 47. Resultados de electroforesis capilar.
Isoforma CRS FE %
1 0 0 a 15
2 0.508 0 a 15
3 3.330 1 a 20
4 17.087 10 a 35
5 28.670 15 a 40
6 30.106 10 a 35
7 18.32 5 a 25
8 1.979 0 a 15
Tabla 48. Resultados adicionales de electroforesis capilar.
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Isoform
a
Estánda
r
IFA de ALVERITIN® ERYPO
®
Especificació
n CRS 3342/P150
3
3342/P150
4
3342/P150
7
3342/P154
1
3342/P154
2
FBS4Z00 FE %
1 0 0.588 0.653 0 0 0.473 0 0 a 15
2 0.508 3.244 4.553 0.993 1.613 4.438 0.317 0 a 15
3 3.330 16.743 15.997 12.294 11.418 17.704 3.123 1 a 20
4 17.087 27.480 25.511 25.233 28.515 28.047 18.960 10 a 35
5 28.670 26.553 26.139 28.177 30.271 25.641 30.734 15 a 40
6 30.106 16.484 18.338 21.245 20.311 16.055 29.667 10 a 35
7 18.32 7.210 7.610 9.753 7.873 6.401 16.240 5 a 25
8 1.979 1,698 1.200 2.306 0 1.240 0.959 0 a 15
Como se observa en la tabla 48 todas las muestras analizadas de los cinco lotes del IFA, del lote de
ERYPO® y el estándar fisicoquímico CRS presentaron porcentajes de área de los picos
correspondientes a las 8 isoformas dentro del intervalo establecido en la monografía de la EPOhr en la
FE (FE 1316, 2016).
Se calcularon las medias de los porcientos para cada isoforma obtenidas para el IFA y se compararon
con los valores de porcientos obtenidos para el lote de ERYPO® y el estándar CRS (Tabla 49) donde
se observan claras diferencias entre los productos.
Tabla 49. Resultados de electroforesis capilar.
Isoforma Estándar IFA de ALVERITIN® ERYPO® Especificación
CRS Media±DE FBS4Z00 FE %
1 0 0.342 ±0.320 0 0 a 15
2 0.508 2,968 ±1.619 0.317 0 a 15
3 3.330 14.831 ±2.800 3.123 1 a 20
4 17.087 26.957 ±1.496 18.960 10 a 35
5 28.670 27.356 ±1.887 30.734 15 a 40
6 30.106 18.487 ±2.285 29.667 10 a 35
7 18.32 7.769 ±1.241 16.240 5 a 25
8 1.979 1.289 ±0.848 0.959 0 a 15
DE: Desviación estándar.
En ERYPO® fueron observadas 7 isoformas y en el IFA hasta 8 isoformas. Además, los productos
mostraron diferentes relaciones de isoformas. En ERYPO® fueron más abundantes las isoformas 5 y 6,
y en el IFA las isoformas 4 y 5. En nuestro estudio no se obtuvieron diferencias significativas entre los
resultados de actividad biológica in vivo e in vitro de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® por lo que
se sugiere que las diferencias obtenidas en la glicosilación y el perfil de isoformas de ALVERITIN®
no tiene un impacto significativo en la potencia del producto en relación a EPREX®/ERYPO®.
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Diferente número y relación de isoformas fueron encontradas al comparar por electroforesis capilar los
productos EPREX®, BINOCRIT®, RETACRIT®, DYNEPO® y NEORECORMON® observándose
que en EPREX® fueron más abundantes las isoformas 5 y 6, en BINOCRIT®, siendo biosimilar de
EPREX®, fue más abundante la isoforma 6 y en RETACRIT® fue más abundante la isoforma 5
(Figura 33) (Vera y cols, 2011) mientras que en el estudio realizado por Liem y cols (2016) se observó
que en EPREX® y BINOCRIT® fue más abundante la isoforma 5 y en RETACRIT® las isoformas 4 y
5, observándose en el RETACRIT® 7 isoformas, una más que en el estudio realizado por Vera y cols
(Figura 34). También puede observarse que en el presente estudio se obtuvieron 7 isoformas para
ERYPO® mientras que en el estudio realizado por Vera y cols (2011) y Liem y cols (2016) se
obtuvieron 6 isoformas para EPREX®, como también en nuestro estudio para el IFA se observaron
lotes que contenían entre 6 y 8 isoformas lo que puede explicarse por las diferencias en la glicosilación
lote a lote encontradas en otros estudios para la EPO (Schellekens, 2004).
Figura 33. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Vera y cols, 2011.
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Figura 34. Análisis de cuatro productos de EPOhr por EC. Fuente: Liem y cols, 2016.
Algunos autores plantean que la glicosilación puede afectar la potencia de la molécula de la EPO al
igual que los diferentes perfiles de isoformas (Vera y cols, 2011; Delorme y cols, 1992 y Takeuchi y
cols, 1989).
En estudios realizados se ha demostrado que la calidad de los biosimilares de EPO es alta,
independientemente que se han observado diferencias en el contenido, perfiles de isoformas, y potencia
entre el producto innovador y sus biosimilares. Las diferencias no solo han sido observadas entre los
productos de diferentes fabricantes sino también en diferentes lotes del mismo producto. Tales
variaciones en los atributos de calidad son inevitables porque la fabricación de la EPOhr requiere el uso
de células vivas, en línea con el paradigma “similar pero no idéntico”. Por lo tanto, el ser diferente del
innovador no implica necesariamente una calidad diferente del producto (Schiestl y cols, 2011;
Shellekens, 2004; Liem y cols, 2016 y Vera y cols, 2011).
Conclusiones parciales:
- Todas las muestras analizadas presentaron porcentajes de área de los picos dentro del intervalo
establecido en la monografía de la EPOhr en la FE (FE 1316, 2016).
- La diferencias obtenidas en el perfil y relación de las isoformas entre EPREX®/ERYPO® y el IFA
son esperadas por tener ambos productos diferente proporción de N-Glicanos.
- Las diferencias encontradas en el perfil y relación de isoformas entre EPREX®/ERYPO® y el IFA
no muestran impacto en la actividad biológica al no obtenerse diferencias estadísticas entre los
resultados biológicos in vivo, in vitro y por afinidad entre ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®.
6.1.13 Cromatografía en Gel filtración.
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Verificación del sistema:
Se aplicó el 2% de cada una de las muestras evaluadas, tomándose como criterio de adecuabilidad que
la relación entre el promedio de las áreas del pico del monómero de la EPOhr de la muestra al 2% y el
área del pico del monómero de la EPOhr pura resulte entre 1,5-2,5%. En la tabla 50 se pueden observar
que las relaciones obtenidas para cada muestra evaluada cumplen con este parámetro por la que la
verificación del sistema resultó conforme.
Tabla 50. Resumen de la verificación por HPLC-GF.
IFA EPREX®/ERYPO® Material de
Referencia
3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513 FAS
4800
FBS
4Z00
FDS
6Q01
MRT(QFB)rh-
EPO/0113
Relación 1.9 2.3 2.0 2.1 2.2 2.0 1.6
Resultados:
En la figura 35 se comparan los cromatogramas obtenidos por HPLC-FR para los tres lotes de
EPREX®/ERYPO®, los tres lotes de IFA y el MRT con código MRT (QFB)rh-EPO/0113 trazable al
BRP lote 3 de la FE.
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2
Los valores de porcientos de monómero, dímero y oligómeros obtenidos para cada muestra evaluada de
los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y los tres lotes del IFA se muestran en la Tabla 51.
1
Monómero
Oligómeros
Dímero
2 3
4 5 6
7
Figura 35. Cromatogramas obtenidos por el método de HPLC-GF
1- MRT: MRT(QFB)EPOhr/0113
2- Biofármaco Lote: 3342/P1511
3- Biofármaco Lote: 3342/P1512
4- Biofármaco Lote: 3342/P1513
5- Innovador ERYPO® Lote: FAS 4800
6- Innovador ERYPO® Lote: FBS 4Z00
7- Innovador EPREX® Lote: FDS 6Q01
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Tabla 51. Resumen de la comparación por HPLC-GF.
Especie
(%)
IFA EPREX®/ERYPO®
3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513 FAS
4800
FBS 4Z00 FDS 6Q01
Oligómeros 0.103 0.068 0.031 0.000 0.059 0.022
Dímero 1.080 0.217 0.173 1.284 0.288 0.000
Total de
especies de
alto peso
molecular
1.183 0.285 0.204 1.284 0.347 0.022
Monómero 98.817 99.715 99.796 98.716 99.653 99.978
Como se puede observar en la tabla 51 para todos los lotes incluidos en el estudio se obtuvieron valores
de pureza en relación a la especie monomérica > 98,00% y valores de especies de alto peso molecular ≤
2,00% por lo que todos los lotes cumplen con lo recomendado en la FE (FE 1316, 2016). Estos
resultados, por tratarse de un método más sensible, confirman los obtenidos por los métodos de
electroforesis y western Blot, realizados a los lotes de EPREX®/ERYPO®, IFA y ALVERITIN®, y
sugieren que el riesgo de respuesta inmune inducida por agregados en estos productos evaluados es
bajo (Vera y cols, 2011; Boven y cols, 2005; Hermeling y cols, 2003 y Hermeling y cols, 2006).
No se obtuvieron diferencias significativas (P=0,990) entre los valores medios del total de especies de
alto peso molecular y el % del monómero entre los lotes de EPREX®/ERYPO® y el IFA (Tabla 52).
Tabla 52. Resumen de la comparación de los resultados de HPLC-GF por medio de un ANOVA.
Conclusión parcial:
Todas las muestras analizadas poseen ≤ 2,00% de especies de alto peso molecular. No se encontró
diferencia significativa entre los lotes de EPREX®/ERYPO® y los lotes del IFA con un intervalo de
confianza de 95%.
ANOVA
Especie % total de especies de alto peso molecular % monómero
Valor P 0.990 0.990
¿Significativamente diferente? (P <
0.05)
NO NO
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6.1.14 Determinación del contenido de ácido siálico.
Verificación del sistema:
Se obtuvieron dos curvas estándar de ácido siálico acetilado debido a que el análisis se realizó en dos
días independientes. En la figura 36 se muestra la curva obtenida en el análisis realizado el día
04abr2015 y en la figura 37 la curva obtenida en el análisis realizado el día 21abri2015.
Figura 36. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).
Figura 37. Curva estándar del ácido siálico acetilado. El coeficiente de correlación (R2) tiene un valor de 0.999, el cual cumple con el criterio de aceptación (R2 ≥ 0.998).
Las curvas estándares obtenidas son adecuadas para realizar la cuantificación de las muestras al
obtenerse en ambas un coeficiente R2 ≥ 0.998, una pendiente (M) entre 0.0036-0,0040 y coeficientes
de variación (CV) ≤ 7,00%. Resultados:
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Los resultados de ácido siálico obtenidos para cada lote del IFA se observa en la tabla 53. No fue
posible hacer la determinación en lotes del producto innovador por falta de disponibilidad de muestra.
Tabla 53. Resultados del contenido de ácido siálico en las muestras del IFA.
IFA
3342/P1511 3342/P1512 3342/P1513
Contenido de ácido siálico
(moles/mol de proteína) 12.00 12.00 13.60
El contenido de ácido siálico de las muestras evaluadas de los tres lotes del IFA es mayor de 10 moles/
mol de proteína por lo que los tres lotes cumplen con lo establecido por la FE (FE 1316, 2016) para la
EPOhr.
Conclusión parcial: Los tres lotes del IFA poseen un contenido de ácido siálico conforme a lo recomendado en las
diferentes farmacopeas para la EPOhr. Al no existir diferencias estadísticas significativas entre
ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® en los resultados de los métodos funcionales in vitro e in vivo
evaluados en este estudio y conociendo la función biológica que desempeña el ácido siálico, se
establece que no hay deferencias en el contenido de ácido siálico entre ALVERITIN® y
EPREX®/ERYPO®.
6.1.15 Endotoxinas bacterianas.
Verificación del sistema:
Los valores de correlación de la curva estándar en el ensayo realizado fue ≥ 0.98, los coeficientes de
variación entre las réplicas fueron < 10% y los valores de recuperación de endotoxinas en los controles
positivos estuvieron en el 50- 200% (Tabla 54 y 55) indicando que los ensayos fueron válidos y el
sistema era adecuado para realizar las mediciones.
Tabla 54. Determinación de endotoxinas bacterianas por LAL.
Concentración de la curva estándar
(EU/mL)
CV% Coeficiente de regresión (%)
0.005 2.82
0.996
0.050 2.15
0.500 1.11
5.000 0.08
50.000 1.04
CV: Coeficiente de variación
Resultados:
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Los valores de endotoxinas obtenidos en los tres lotes de EPREX®/ERYPO y en los tres lotes de
ALVERITIN® evaluados estuvieron por debajo de 1.000 UE. Los valores, en su conjunto, estuvieron
muy por debajo del límite establecido de < 20 UE/ 10 000 UI de EPO según recomendaciones de la FB
(FB, 2016) (Tabla 55).
Tabla 55. Resultado de endotoxinas para los lotes de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®. EPREX®/ERYPO® ALVERITIN®
Lote
Nivel de
endotoxin
as
(UE/mL)
Nivel de
endotoxina
(UE/UI de
EPO)
Recuperación
del control
positivo
(%)
Lote
Nivel de
endotoxinas
(UE/mL)
Nivel de
endotoxinas
(UE/UI de
EPO)
Recuperación
del control
positivo
(%)
FAS 4800 <0.250 < 0.625 123 LP00415 <0.250 < 0.625 108
FBS 4Z00 <0.250 < 0.625 130 LP00515 <0.250 < 0.625 88
FDS 6Q01 <0.250 < 1.000 147 LP00615 <0.250 < 0.625 91
Conclusión:
Los resultados de endotoxinas de los lotes correspondientes a EPREX®/ERYPO® ALVERITIN®
cumplen con lo recomendado por diferentes farmacopeas y se encuentran por debajo del límite
aceptado lo cual garantiza la seguridad del producto para su uso en humanos.
6.1.16 Conteo de partículas subvisibles.
Verificación del sistema:
El conteo de las partículas de 10 µm en el blanco del ensayo (agua libre de partículas) fue de 9
partículas en 25 mL por lo que el sistema era adecuado para realizar las mediciones de las muestras
según la FE (FE 2.9.19, 2016).
Resultados:
Los valores obtenidos en los tres lotes de ALVERITIN® evaluados estuvieron por debajo de 100 para
las partículas iguales o mayores que 10 µm y por debajo de 0.5 para las partículas iguales o mayores
que 25 µm. Todos los valores estuvieron muy por debajo del límite establecido (Tabla 56).
Tabla 56. Resultados de conteo de partículas subvisibles para los lotes de ALVERITIN®.
ALVERITIN®
Lote
Partículas iguales o mayores
que 10 µm
≤6000 partículas/envase
Partículas iguales o mayores
que 25 µm
≤600 partículas/envase
Dictamen
LP00415 68.0 0.5 Cumple
LP00515 96.7 0.5 Cumple
LP00615 82.3 0.2 Cumple
Conclusión:
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Los resultados de partículas subvisibles de los lotes correspondientes a ALVERITIN® se encuentran
por debajo del límite aceptado por la FE (FE 2.9.19, 2016) y la FB (FB apéndice XIIIB, 2016) para este
parámetro, por lo que se concluye que el producto es seguro.
6.1.17 Partículas visibles.
Verificación del sistema:
Se verificó, antes de realizar la operación, la intensidad de la luz en la cabina de Inspección visual
utilizada según recomienda la FE (FE 20920, 2016).
Resultados:
Los resultados obtenidos en los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y en los tres lotes de ALVERITIN®
evaluados se muestran en la Tabla 57.
Tabla 57. Resultado de partículas visibles en los lotes de EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN®.
Resultados de la inspección EPREX®/ERYPO® ALVERITIN® Dictamen
Transparente Si Si Cumple
Incolora Si Si Cumple
Turbio No No Cumple
Coloreado No No Cumple
Cierre defecuoso No No Cumple
Ralladuras No No Cumple
Daños en la tapa o ratapa No No Cumple
Partículas extrañas
Vidrios No No Cumple
Escamas No No Cumple
Puntos negros No No Cumple
Fibras metálicas No No Cumple
Fibras coloreadas No No Cumple
Fibras de tejido No No Cumple
Partículas de goma No No Cumple
Partículas brillantes No No Cumple
Partículas en
suspensión en forma de
bastoncillos
No No Cumple
Conclusión parcial:
No se obtuvieron diferencias en los resultados de partículas visibles en los lotes correspondientes a
ALVERITIN® en comparación con los lotes correspondientes a EPREX®/ERYPO®, siendo
soluciones claras, incoloras y libres de partículas extrañas, cumpliendo con el criterio establecido para
este parámetro (FE 20920, 2016).
6.2 Resultados de la caracterización funcional.
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6.2.1 Actividad biológica in vitro.
Verificación del sistema:
El método para determinar la inducción de la proliferación de la EPOhr por medio del ensayo
colorimétrico fue validado, cumpliendo con los atributos establecidos en el plan de validación:
linealidad; precisión, exactitud y adecuabilidad para el medicamento de referencia empleado. En los
ensayos de biocomparabilidad realizados se obtuvo una curva dosis respuesta del medicamento de
referencia que corresponde con los resultados obtenidos en la validación del método.
Resultados:
Los ensayos in vitro realizados en células TF-1 estimuladas con muestras de los tres lotes de
ALVERITIN® y tres lotes de EPREX®/ERYPO® mostraron que la proliferación aumenta de forma
dependiente a la concentración de ambos medicamentos, como resultado de la unión de la EPOhr con
su receptor y la cascada de señalización que regula la proliferación. Mediante un análisis comparativo
entre las curvas de las regresiones no lineales obtenidas para los tres lotes de ALVERITIN® y los tres
lotes de EPREX®/ERYPO® no se observaron diferencias significativas (P=0.6950) (Figura 38).
Tampoco se observaron diferencias estadísticas significativas en los parámetros de la pendiente de Hill,
la respuesta máxima y log IC50 al realizar una t de “Student” no pareada (Tabla 58).
Figura 38. Comparación del efecto proliferativo in vitro del EPREX®/ERYPO® vs ALVERITIN®.
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Tabla 58. Resumen estadístico de la comparación entre el efecto del medicamento
EPREX®/ERYPO® y ALVERITIN® sobre la proliferación en células TF-1.
Ensayo
Log IC50 + EEM Pendiente de Hill + EEM Respuesta máxima
AL
VE
RIT
IN®
EP
RE
X®
/ER
YP
O®
P
AL
VE
RIT
IN®
EP
RE
X®
/ER
YP
O®
P
AL
VE
RIT
IN®
EP
RE
X®
/ER
YP
O®
P
Inducción de la
Proliferación
0.9890±
0.1989
0.7110±
0.1146
0.5228
0.7631±
0.2476
0.6859±
0.1118
0.1739
94.920±
6.024
101.000±
3.963
0.1036
Conclusión parcial:
El análisis estadístico no indica diferencias significativas entre las curvas de regresiones no lineales
generadas entre ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®, con respecto a los parámetros: pendiente de
Hill, la respuesta máxima y log IC50 de las curvas, sugiriendo que no deben encontrarse diferencias en
el potencial terapéutico entre ambos biomedicamentos.
6.2.2 Actividad biológica in vivo.
Verificación del sistema:
Se siguió la metodología establecida en la FE utilizando ratones normocitemicos de la línea B6D2F1.
Se observó que la administración de concentraciones de EPOhr incremento el conteo de reticulocitos
en sangre periférica después de aproximadamente 72 horas en comparación con el nivel basal. En los
ensayos realizados se cumplieron los parámetros de linealidad, paralelismo y regresión común.
Resultados:
Se determino la potencia en UI/mL de los tres lotes de ALVERITIN® y los tres lotes de
EPREX®/ERYPO® comparando su efecto proliferativo con el de un MRT con código: MRT (QFB)
EPOhr/0208 y trazable al BRP de la FE. La FE (FE 1316, 2016) y la FB (FB, 2016) recomiendan una
potencia hallada para la EPOhr entre 80 a 120% del valor supuesto con límites de confianza para un
95% de confianza entre 64 y 156%. En la figura 39 se observan las curvas dosis respuestas descritas en
dos ensayos realizados.
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Figura 39. Frecuencia de reticulocitos en respuesta a 67.5, 90 y 120 UI/ratón del medicamento de
prueba, referencia y Material de Referencia Interno, 72 horas después de su administración a ratones
B6D2F1. A los ratones B6D2F1 se les administró vía subcutánea uno de los tratamientos: medicamento
de prueba, medicamento de referencia, Material de Referencia Interno en concentración de 67.5, 90 y
120 UI/ratón o control negativo (SF). Después de 72 horas de la administración de los tratamientos se
obtuvo una muestra sanguínea de cada uno de los ratones y se tiño con azul de metileno) para evaluar
la frecuencia de reticulocitos por cámara de neubauer. La gráfica muestra la frecuencia media de
reticulocitos inducidos por las muestras en 6 ratones por grupo. Las barras corresponden a la desviación
estándar de cada media. Los valores medios de los ratones controles negativos estuvieron entre 10-15
reticulocitos (Datos no incluidos en las gráficas).
En la Figura 38, se observa que la frecuencia de reticulocitos aumenta significativamente en las
muestras de sangre que se obtuvieron de los ratones tratados con los medicamentos de prueba,
referencia o el MRT.
En la Tabla 59, se muestran los valores de potencia hallados y su porciento para los tres lotes de
ALVERITIN® y los tres lotes de EPREX®/ERYPO® y el rango de máximo-mínimo de la potencia
para cada producto. Todos los valores de potencia hallados en los tres lotes de ALVERITIN® y de
EPREX®/ERYPO® se encuentran entre 80 y 120% del valor supuesto y sus límites para un 95% de
confianza entre 64 y 156% por lo que cumplen con los criterios recomendados por la FE (FE 1316,
2016) y la FB (FB, 2016).
100
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
% d
e r
eti
cu
locit
os
Log Dosis
MRT(B)rh-EPO/0208
LP00415
LP00515
FAS 4800
FBS 4Z00
100
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
% d
e r
eti
cu
locit
os
Log Dosis
MRT(B)rh-EPO/0208
FDS 6Q01
LP00615
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Tabla 59. Resultados de potencia y rango mínimo- máximo para los lotes de ALVERITIN® y
EPREX®/ERYPO® determinados por ANOVA de líneas paralelas.
ALVERITIN® EPREX®/ERYPO®.
Lote
Potencia
hallada
(UI/mL)
Limites
confianza
(%)
(%) Dictamen Lote Potencia
(UI/mL)
Limites
confianza
(%)
(%) Dictamen
LP00415 3857 88-106 96 Cumple FAS4800 4391 101-120 110 Cumple
LP00515 4278 98-117 107 Cumple FBS4Z00 4046 94-108 101 Cumple
LP00615 4147 96-113 104 Cumple FDS6Q01 38506 90-103 96 Cumple
Rango 96-107 Rango 96-110
Se realizó un análisis estadístico tipo ANOVA entre los valores medios del % potencia obtenidos para
los medicamentos ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® y no se obtuvieron diferencias significativas
para un 95% de confianza (Tabla 60).
Tabla 60. Potencia: Resultados del ANOVA entre los valores de % potencia de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO®.
ANOVA
F 0.00
Valor P 1.000
Existe diferencias estadísticamente significativas entre las medias? (P<0.05) No
Los tres lotes de ALVERITIN® incluidos en el estudio de biocomparabilidad fueron producidos a
partir de tres lotes diferentes del IFA producidos en el CIM. La actividad específica en UI/mg de
proteína de los tres lotes de IFA se encuentra por encima de las 100 000 UI/mg, con una media de 105
887 UI/mg y un coeficiente de variación de 6,70% (Tabla 61). Estos datos reflejan, a pesar de que
provienen de ensayos biológicos en animales los cuales por su naturaleza son muy variables, una baja
variabilidad y alta consistencia del proceso y cumplen con lo establecido en la FE (FE 1316, 2016) y la
FB (FB, 2016).
Tabla 61. Resultados de actividad específica de los tres lotes de IFA de ALVERITIN® determinados
mediante el método in vivo de ratones normocitemicos.
IFA
Lote Actividad especifica
(UI/mg)
3342/P1511 103 797
3342/P1512 113 789
3342/P1513 100 074
Media 105 887
DE 7092
CV (%) 6.70
Rango 103 797-113 789
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En estudios realizados, algunos autores han demostrado diferencias inesperadas por la baja potencia
obtenida para DYNEPO (78%) en comparación con la alta potencia obtenida para EPREX® (129%)
según la declarada en el envase (Vera y cols, 2011) lo que pudiera tener implicaciones clínicas serias en
los pacientes (Cotter y cols, 2004; Bradbury y cols, 2009 y Brown y cols, 1993). En nuestro estudio no
se obtuvieron diferencias estadísticas entre la potencia de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® por lo
que el riesgo de los efectos de una sobredosis es bajo.
Conclusión parcial:
La evidencia experimental de la eficacia in vivo presentada y el análisis integral de toda la información
brindada en el estudio, muestra que ALVERITIN® tiene un comportamiento curva dosis respuesta
similar al Estándar Europeo al no obtenerse diferencias significativas entre sus pendientes y comparado
con EPREX®/ERYPO® tiene un efecto comparable sobre la inducción de reticulocitos y la potencia
determinada en el modelo de ratones B6D2F1 normocitémicos mediante un ANOVA de líneas
paralelas. Los valores de potencia de ALVERITIN® y EPREX®/ERYPO® no mostraron diferencias
significativas mediante un ANOVA para un 95% de confianza. Los resultados del bioensayo de
inducción de la eritropoyesis en ratones demuestran que no hay diferencias estadísticas entre ambos
productos.
6.2.3 Afinidad por Biacore.
Verificación del sistema: El método para la evaluación de la afinidad y reconocimiento específico mediante la determinación de
la constante de afinidad y disociación por el método de resonancia de plasmones superficiales fue
validado, cumpliendo con los atributos establecidos en el plan de validación: Ajuste al modelo de
regresión no lineal hipérbola, con una R2 de 0.9966, precisión, con un porcentaje del coeficiente de
variación (%CV) de RU de 20% para cada punto de la curva de afinidad, y un % CV de 11.41 para las
réplicas de la constante de afinidad (KD), especificidad, con una respuesta negativa de -7.915964 que
corresponde a la matriz empleada (HBS-EP, 0 nM) y una respuesta positiva de 225.979 que
corresponde a la concentración 250nM de eritropoyetina y adecuabilidad, con un intervalo de respuesta
(RU) de la curva de afinidad de 197.4 a 226.0. En los ensayos de biocomparabilidad realizados se
obtuvo un nivel de inmovilización del receptor de EPO que se encontraba dentro del nivel óptimo de
aceptabilidad del ensayo.
Resultados:
Las afinidades de unión entre la EPO y su receptor reflejan la integridad estructural de la molécula así
como la conformación tridimensional correcta generada por los residuos de aminoácidos dentro de las
regiones de unión diana. En consecuencia, la unión está directamente relacionada con la eficacia de la
EPO.
La afinidad de la EPO a su receptor se determinó por triplicado, evaluando las concentraciones entre
15.62 nm-250 nM de muestras de los tres lotes de ALVERITIN® y tres lotes de EPREX®/ERYPO®.
En las Figuras 40 y 41 se muestran los sensogramas obtenidos para cada medicamento.
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Se calcularon las medias (n=3 experimentos independientes para cada lote de medicamento) de los
parámetros cinéticos de la interacción molecular con el receptor para cada muestra evaluada. Después
de efectuar un análisis estadístico (t Student no pareada, α=0.05), los resultados indicaron que no hay
diferencias estadística significativa entre los medicamentos para los parámetros de ka, Kd, KD y Rmax
(Tabla 62).
Tabla 62. Biacore: Análisis t Student de los parámetros cinéticos entre ALVERITIN® y
EPREX®/ERYPO®.
Parámetros cinéticos
ALVERITIN®
n=3
EPREX®/ERYPO®
n=3 Valor estadístico (p)
MEDIA EEM MEDIA EEM
ka (1/Ms) 4929000 2317000 1702000 623897 0.2498
kd (1/s) 0.0008826 0.0002177 0.001047 0.0001852 0.5969
KD (M) 4.437e-010 3.227e-010 8.409e-010 3.083e-010 0.4238
Rmax (RU) 208.8 5.788 214.3 7.267 0.5857
Conclusión parcial:
Figura 41. Sensogramas obtenidos en los lotes de
ALVERITIN®. Tiempo vs Respuesta (RU).
Figura 40. Sensogramas obtenidos en los lotes de
EPREX®/ERYPO®. Tiempo vs Respuesta (RU).
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No se obtuvieron diferencias estadísticas significativas en los parámetros de ka (velocidad de asociación),
kd (velocidad de disociación), KD (constante de afinidad) y Rmax (respuesta máxima) en los ensayos de unión
a receptor entre de los tres lotes evaluados del medicamento ALVERITIN® y del EPREX®/ERYPO®.
6.3 Resultados de los estudios no clínicos.
En la tabla 63 se muestra los estudios no clínicos realizados y el año de realización.
Tabla 63. Listado de estudios no clínicos realizados.
Estudio Año de realización
Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en monos con el
producto de referencia EPREX®. 1997
Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en conejos con el
producto de referencia EPREX®. 1997
Toxicidad aguda endovenosa del ior®EPOCIM en primates 1998
Toxicidad aguda endovenosa del ior®EPOCIM en ratas 1999
Estudio comparativo de Toxicidad del ior®EPOCIM a dosis
intravenosas repetidas por 28 días en ratas Sprague Dawley con
EPREX® como producto de referencia seguido de un periodo de
recuperación de 14 días.
Pucaj et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 103:3432–3441,
2014
2014
6.3.1 Farmacocinética comparada en monos verdes: ior®EPOCIM vs EPREX®.
Resumen:
Se caracterizó la farmacocinética de la molécula del ior®EPOCIM y EPREX® mediante sus
parámetros específicos en monos verdes machos (entre 4-6 kg) de la raza Macaca fascícularis,
provenientes de CENPALAB, y se demostró la equivalencia farmacocinética entre ambas moléculas.
Antes de la administración del producto a los animales se les extrajo una muestra sanguínea para
valorar su concentración basal de EPO. A cada grupo de ensayo (2 animales por grupo) se le administró
la dosis correspondiente por la vena femoral, extrayéndosele por la vena femoral opuesta a los tiempos
de 0, 0.25, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, Y 18 horas, cuantificándose la EPOhr mediante un método de
ELISA (Boenhringer Mannheim cat. Num. 1693417). Los animales tratados con EPREX® recibieron
una dosis de 150 UI/kg y los animales tratados con ior®EPOCIM recibieron una dosis de 295 Ul/mL.
Los perfiles farmacocinéticos de cada animal se ajustaron a una modelación exponencial obteniéndose
un comportamiento regular de un modelo mamilar bicompartimental. Se determinaron los parámetros
característicos de α, β, t 1/2 α, t 1/2 β, AUC, CL, MRT, Vss, CL/kg y Vss/kg. Los animales fueron
mantenidos en ayuna desde la noche anterior a la administración del producto. El consumo de agua y
alimento fue ad libitum posterior a la administración del producto. Los animales fueron mantenidos
durante toda la etapa experimental en un régimen adecuado de luz/oscuridad, temperatura y una
humedad. Para su manipulación fueron sedados mediante anestesia con uretano (97/23, 1997).
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Resultados:
Los valores basales de EPO antes de la inoculación con las variantes de producto fueron despreciables
por lo que no se hizo necesario realizar un ajuste a los valores observados. En ambos casos, existió una
correspondencia lógica de un transcurso farmacocinético en relación a la vía de administración
empleada.
Los valores obtenidos en cada animal para los parámetros característicos estudiados (ajuste, AUC, CL,
Vss, MRT, t1/2α, t1/2β, CL/kg) fueron lógicos según el comportamiento reportado para la EPO en la
literatura, así como, en comparación a los resultados obtenidos en ensayo previo en conejos para ambos
productos (97/22, 1997).
Si analizamos los valores promedios, podemos observar que los t1/2α, t1/2β, alcanzan los valores
reportados previamente para estructuras similares, y por tanto ofrecen un criterio de confiabilidad en
cuanto a establecer un régimen de dosificación de ior®EPOCIM aceptado internacionalmente para el
tratamiento con EPOhr, de forma similar lo mismo es aplicable para el MRT. Los valores de CL y Vss
corregidos por el peso del individuo, también ofrecen valores correspondientes a una seguridad clínica
del producto ior®EPOCIM.
Conclusión parcial:
Se manifiesta similitud entre los productos ior®EPOCIM y EPREX® en relación a su comportamiento
farmacocinético, en particular a sus parámetros de velocidad, t1/2α, t1/2β y MRT, lo cual implica un efecto
terapéutico con semejante tiempo de duración.
6.3.2 Farmacocinética a dosis única intravenosa en conejos: ior®EPOCIM vs EPREX®.
Resumen:
Se caracterizó la farmacocinética de la molécula del ior®EPOCIM y EPREX® mediante sus
parámetros específicos en conejos machos F1 (entre 1,56-2,19 kg), provenientes de CENPALAB, y se
demostró la equivalencia farmacocinética entre ambas moléculas. Antes de la administración del
producto a los animales se les extrajo una muestra sanguínea para valorar su concentración basal de
EPO. A cada grupo de ensayo (4 animales por grupo) se le administró la dosis correspondiente por la
vena marginal de la oreja, extrayéndosele por las venas contralaterales al sitio de la administración a
los tiempos de 0, 0.25, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8 y 18 horas, cuantificándose la EPOhr mediante un
método de ELISA (Boenhringer Mannheim cat. Num. 1693417). Los animales tratados con EPREX® e
ior®EPOCIM recibieron una dosis de 150 UI/kg. Los perfiles farmacocinéticos de cada animal se
ajustaron a una modelación exponencial obteniéndose un comportamiento regular de un modelo
mamilar bicompartimental. Se determinaron los parámetros característicos de α, β, t 1/2 α, t 1/2 β, AUC,
CL, MRT, Vss, CL/kg y Vss/kg. Los animales fueron mantenidos en ayuna desde la noche anterior a la
administración del producto. El consumo de agua y alimento fue ad libitum posterior a la
administración del producto. Los animales fueron mantenidos durante toda la etapa experimental en un
régimen adecuado de luz/oscuridad, temperatura y una humedad. Para su manipulación fueron sedados
mediante anestesia con uretano (97/22, 1997).
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Resultados:
Los valores basales de EPO antes de la inoculación con las variantes de producto fueron despreciables
por lo que no se hizo necesario realizar un ajuste a los valores observados. En ambos casos, existió una
correspondencia lógica de un transcurso farmacocinético en relación a la vía de administración
empleada.
Los datos de cuantificación sérica fueron detectados por técnica ELlSA y se observa una secuencia de
concentraciones que disminuyen con respecto al tiempo, lo cual se corresponde lógicamente con una
administración bolus i.v. Al promediar los valores de concentración de cada tiempo, se obtuvo un
transcurso promediado ajustado a una lógica farmacocinética.
Es importante resaltar la similitud entre los valores numéricos de la fase de eliminación descrita por el
tiempo de vida media β con valores promedios de 2.55 y 3.03 horas para ior®EPOCIM y EPREX®
respectivamente, lo cual inclina la balanza hacia una duración óptima del efecto terapéutico,
encontrándose en el rango de variabilidad reportado por otros autores en la literatura científica,
empleando métodos diferentes de cuantificación: radiomarcaje y radioinmunoanálisis.
El ior®EPOCIM manifiesta un mayor valor del AUC que permite preconizar que la intensidad del
efecto terapéutico de dicho producto, se alcanzará sin grandes limitantes en su aplicación terapéutica, a
los niveles de dosis actualmente administrados.
Los valores de Cl y el Vss, para ambos productos, reflejan una diferencia lógica en la caracterización de
moléculas biotecnológicas, donde no se obtienen estructuras idénticas, sino semejantes. Estas
diferencias no desvirtúan su efecto biológico esperado, más bien responden a los procesos de
interacción con las entidades corporales no asociadas al sitio efector. Estos dos parámetros francamente
descritos con bases fisiológicas, logran en ambos casos un reajuste equilibrado de sus valores
particulares, ya que para ambos productos la relación Vss/CI, alcanzan un valor cercano, lo cual es
índice de una tendencia a manifestar un efecto integral semejante.
La comparación estadística, realizada utilizando una t-student, resalta los valores alcanzados de
diferencia significativa o no significativa en aquellos parámetros de interés. En cuanto a los valores
obtenidos de α, t1/2α, β, t1/2β y AUC no presentan diferencias significativas entre ambos productos, lo
cual responde a parámetros que inciden en cómo se manifiesta la respuesta farmacológica de la EPOhr.
La estimación de CL, Vss y el MRT presenta diferencia significativa, estando los dos primeros
estrechamente relacionados a los posibles cambios estructurales entre las dos EPOhr empleadas por
cada uno de los productos. Los cambios correspondientes a CI y Vss, denotan que el menor
aclaramiento en ior®EPOCIM se corresponde a una protección de carácter siálico en la molécula frente
a la biotransformación hepática, pero ese aumento de moléculas biodisponibles, se compensan frente al
mayor metabolismo posible de EPREX®, en cuanto a que se manifiesta para ior®EPOCIM un menor
valor de volumen de distribución y de hecho debe esperarse un efecto terapéutico semejante.
Conclusiones:
Existe similitud entre los productos ior®EPOCIM y EPREX® en cuanto a su comportamiento
farmacocinético, en particular a sus parámetros de velocidad y magnitud del efecto, lo cual implica un
efecto terapéutico con semejante tiempo de duración.
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6.3.3 Toxicidad aguda endovenosa en primate no humano.
Resumen:
Se evaluaron síntomas de toxicidad, modificaciones en el consumo de alimentos, agua y peso corporal,
evaluaciones del estado general, aspecto, comportamiento y los signos vitales como temperatura
corporal, frecuencia respiratoria y frecuencia cardiaca, y se monitorearon parámetros hematológicos en
los días 0, 7 y 14 y de química sanguínea a los días 0 y 14, luego de la administración del
ior®EPOCIM, vía endovenosa (vena safena), dosis única de 300 UI/kg en primates no humanos de la
especie Cercopithecus aethiops sabaeus hembras y machos entre 1.975-1,953 kg, entre 1-2 años de
edad, provenientes del CENPALAB. Se formaron 2 grupos de tratamientos (grupo control y 300
UI/kg), a razón de 6 animales por cada grupo distribuidos al azar (3 machos y 3 hembras). Se realizó un
estudio de cada órgano o tejido de los animales que mueran durante el ensayo, así como aquellos que se
le practique la eutanasia por manifestar signos severos de toxicidad que comprometan su salud. Los
animales fueron mantenidos 63 días en un periodo de cuarentena. Alojados individualmente en jaulas
de acero inoxidable con bandejas y dispositivos para la sujeción y protección en las manipulaciones.
Mantenidos durante toda la etapa experimental en un régimen monitoreado de luz/oscuridad de 12
horas, suministro ad libitum de agua y alimento excepto 12 horas antes de la extracción de sangre para
los exámenes de química sanguínea, una temperatura de 26.67±1.51oC y una humedad de 77.93±5,90%
(ERIT0497, 1998).
Resultados:
No se observó ninguna muerte animal durante el estudio. Se observaron diferencias significativas en el
peso para las hembras del grupo control en los días 0 y 7 y para los días 0 y 14.
Se observó en el animal 4(1) escasa secreción cristalina en el ojo izquierdo, se realizó un exudado
ocular aislándose Echerichia coli. El macho 4(3) presentó una secreción anal dando negativo por
análisis parasitológico. No se observó ningún otro signo clínico aparente en los animales durante el
estudio.
Todas las variables (signos clínicos) demostraron homogeneidad de varianza excepto la frecuencia
respiratoria para las hembras en el día 7 del ensayo. Se observaron diferencias significativas en la
temperatura corporal para las hembras del grupo tratado en los días 0 y 7.
Al analizar los valores de las variables hematológicas, teniendo en cuenta el rango establecido,
encontramos ligeros aumentos en las variables relacionadas con la serie roja (Hb, Hto, CHCM y
eritrocitos) para los animales de ambos sexos tratados con la EPOhr. Estos hallazgos son explicables
por el efecto biológico de la EPO. Se apreció además, reducciones del conteo de plaquetas, pero no son
imputables a la acción de la administración de la sustancia, pues también ocurrió en los animales no
tratados. Se produjo una disminución en el conteo de leucocitos de las hembras tratadas, pero de
manera transitoria que se recuperó en la segunda semana. No se encontró diferencias significativas
entre los grupos para el conteo total de leucocitos, monocitos y eosinófilos.
Entre los grupo tratados, las hembras del grupo tratado en el día 0 del ensayo para el parámetro
aspartato aminotransferasa se encontraron fuera del rango establecido como normal para el grupo
control. También se observaron diferencias significativas entre los grupos en la alanino aminotrasferasa
para los machos en el día 0 del ensayo así como también para los machos en el día 14 del ensayo. En el
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caso de las proteínas totales se observaron diferencias significativas en las hembras en el día 0, sin
embargo se comprueba que los valores del grupo tratado se encuentran dentro del rango establecido
como normal para el grupo control, lo cual carece de importancia desde el punto de vista biológico.
Se realizó el análisis entre los días 0 y 14 del ensayo, encontrándose diferencias significativas en el
parámetro fosfatasa alcalina en hembras y machos del grupo tratado.
Conclusión parcial:
Los resultados indican que bajo las condiciones experimentales utilizadas y con los resultados
obtenidos en cada uno de los parámetros evaluados, el ior®EPOCIM no provocó alteraciones ni
modificaciones en el sistema de prueba que pudieran ser interpretados como signos tóxicos.
6.3.4 Toxicidad aguda endovenosa en ratas.
Resumen:
Se evaluaron los síntomas de toxicidad, atendiendo además al comportamiento y hábitos a través de las
actividades de exploración, acicalamiento, reposo y termorregulación, modificaciones en el peso
corporal (en los días 0, 7 y 14), y se monitorearon algunos parámetros hematológicos en los días 7 y 14
luego de la administración del ior®EPOCIM, vía endovenosa (vena de la cola), dosis única de 300
UI/kg en ratas Sprague Dawley hembras y machos, adultos, provenientes del CENPALAB. Se
formaron 3 grupos de tratamientos (grupo control, tratado con EPOhr 4000UI/mL y EPOhr 2000
UI/mL), a razón de 10 animales por cada grupo distribuidos al azar (5 machos y 5 hembras nulíparas y
no grávidas). Se realizó un estudio de cada órgano o tejido de los animales que mueran durante el
ensayo, así como aquellos que se le practique la eutanasia por manifestar signos severos de toxicidad
que comprometan su salud. Se realizó la necropsia a todos los animales al final del estudio para hacer
observación macroscópica de todos los órganos, además del examen histopatológico de los órganos
afectados. Los animales fueron mantenidos 6 días en un periodo de adaptación. Alojados
individualmente en cajas T4 plásticas (Makrolon) ubicadas en estantes módulo Tecniplast. Mantenidos
durante toda la etapa experimental en un régimen monitoreado de luz/oscuridad de 12 horas, suministro
ad libitum de agua y alimento excepto los días 0 y 13 del ensayo que se retiró el alimento para la toma
de muestras de sangre para análisis hematológicos, una temperatura de 27.50±2.64oC y una humedad
de 50.77±12.63% (ERIT0799, 1999).
Resultados:
El estudio concluyó con un 100% de supervivencia. Los signos clínicos observados fueron ligera caída
de pelo, llegando en ocasiones a depilaciones en la región dorsal del tren posterior, ventral a nivel de
las axilas y pelviana, escasa secreción sanguinolenta en fosas nasales y escasas secreciones cristalinas y
sanguinolentas en uno u otro ojo de algunos animales. Estas dos últimas observaciones tienen como
causa, las manipulaciones realizadas con los animales durante la extracción de sangre. Todos los signos
anteriormente descritos se observaron tanto en animales del grupo control como en los tratados, por lo
que se consideran que nos son provocados por la sustancia de ensayo. En relación al peso no se
encontraron diferencias significativas entre grupos para ninguno de los sexos.
Para los machos no se observaron diferencias entre días ni entre grupos en los niveles de hemoglobina.
Las diferencias encontradas para las hembras, están dadas en el día 0 el grupo tratado, el cual difiere
con el grupo control, ya que los valores de hemoglobina de este último fueron inferiores a los del grupo
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tratado, estas diferencias no se relacionan con la administración de la sustancia de ensayo. El día 14 los
grupos tratados difieren con el grupo control lo que se corresponde con el efecto terapéutico esperado,
y en ambos casos los valores medios estuvieron dentro del rango normal referido en la literatura. En
relación al conteo de hematocrito no se observaron diferencias para los machos, entre días ni entre
grupos. En el día 14 los grupos tratados difieren significativamente del grupo control, presentando
valores superiores. El conteo diferencial de leucocitos arrojó diferencias significativas entre días para
los eosinófilos en los machos, y para los monocitos en las hembras. En el caso de los linfocitos y los
neutrófilos, las diferencias ocurrieron en ambos sexos entre días y grupos. En las constantes
corpusculares VCM, HCM y CHCM se encontraron diferencias significativas en ambos sexos entre
días. Las diferencias encontradas en las variables antes mencionadas, carecen de connotación
toxicológica. En el resto de las variables hematológicas como plaquetas, reticulocitos y conteo total de
leucocitos no se observaron diferencias significativas. No se observaron alteraciones anatomo-
patológicas en las superficies externas, cavidades y órganos parenquimatosos imputables al
ior®EPOCIM.
Conclusiones parciales:
- No se observaron muertes ni signos atribuibles al ior®EPOCIM.
- No se observaron modificaciones en el peso corporal de los animales en ensayo.
- Las variables hematológicas no sufrieron cambios que respondan a efectos tóxicos `provocados por
el ior®EPOCIM.
- La descripción de la necropsia no reportó alteraciones anatomopatológicas.
6.3.5 Toxicidad dosis intravenosas repetidas del ior®EPOCIM y EPREX® en ratas.
Resumen:
Se evaluó el efecto tóxico sistémico y sobre los órganos diana del producto ior®EPOCIM en
comparación con EPREX®, después de una administración de dosis intravenosa repetida de 28 días en
ratas Sprague-Dawley. Este estudio también evaluó la inmunogenicidad, la farmacodinamia (PD) y
Toxicocinética (TC) de ior®EPOCIM y EPREX®, así como la progresión o regresión de los efectos
observados después de un período de recuperación de 14 días. Los animales fueron dosificados con
ior®EPOCIM por vía intravenosa a los siguientes niveles de dosis: 30, 300 ó 600 UI / kg, que es
equivalente a 1x, 10x y 20x la dosis humana propuesta, respectivamente. Un cuarto grupo de animales
recibió EPREX® a 600 UI / kg, y un quinto grupo control fue dosificado sólo con el vehículo
(excipiente) que se usó para preparar las diluciones utilizadas de los medicamentos. Cada grupo de
ensayo principal y control consistió en 10 ratas macho y 10 hembras de la cepa Crl: CD® (SD) BR-
Sprague-Dawley provenientes de Charles River Canadá Inc. 4 ratas adicionales por sexo se asignaron a
los subgrupos de FD y 5 ratas por sexo se incluyeron en un periodo de recuperación por 14 días en el
control y las altas dosis de 600 UI/ kg de los grupos de ior®EPOCIM y EPREX®. 3 ratas por sexo
adicionales se usaron para la evaluación de TC en el día 1 y el día 28 en el grupo control. Las
respuestas clínicas a los tratamientos fueron monitoreadas así como la evaluación de los pesos
corporales, consumo de alimentos y oftalmología en todos los grupos. La sangre para FD se colectó en
el día 1 y luego las pre-dosis en los días 3, 7, 14 y 28. La patología clínica completa se evaluó en todos
los animales del estudio principal (Día 29 ó 30) y en todos los animales en recuperación (Día 43).
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También fue colectada la sangre para los ensayos de TC (Días 1 y 28) y la formación de los anticuerpos
antidroga ADA, tanto en pre estudio como al final de los períodos de recuperación y tratamiento. La
patología general completa se realizó en todas las ratas de todos los grupos (excluyendo los subgrupos
FD y TC), y la histopatología se realizó en un rango de órganos comprensivo de las ratas control y las
ratas dosificadas a 600UI/kg con ior®EPOCIM o EPREX®. Además el estómago, el bazo y el fémur
(médula ósea) fueron examinados de los grupos tratados con ior®EPOCIM a 30 y 300 UI/kg ya que los
mismos fueron identificados como potenciales órganos diana. Los animales fueron alojados
individualmente en cajas para ratas Nalgene® con aire filtrado y mantenidos por un período de 14 días
en etapa de aclimatación. Mantenidos durante toda la etapa experimental en un régimen monitoreado
de luz/oscuridad de 12 horas con más de 10 cambios de aire/ hora, suministro ad libitum de agua/
alimento, una temperatura entre 18-26oC y una humedad entre 30-70% (Study No. 270994, 2014).
Resultados:
Todos los animales sobrevivieron y llegaron a la fecha programada para la eutanasia y la necropsia.
Los hallazgos adversos de anatomía patológica y clínicos que se consideraron relativos al tratamiento y
de significancia toxicológica fueron:
- Lesiones de la piel ulcerativas medias y sin formación de postilla fueron observadas en 4,3%,
10,9%, 1,8% y 8,9% de las ratas de género combinado en grupos tratados con 30, 300 y 600
UI/kg de EPREX® respectivamente. Dichas lesiones no se observaron al final del período de
recuperación.
- Se observó también cojera de media a marcada en ratas de ambos grupos de altas dosis
(ior®EPOCIM y EPREX® dosificadas a 600 UI/kg). La cojera se presentó como un
enrojecimiento e inflamación de la articulación de la pata (articulación tarsal). Fueron afectadas
más ratas en el grupo del EPREX® (14,3 %) comparado con el grupo del ior®EPOCIM (5,4%).
Las ratas con esta afectación perdieron esta condición durante el período de 14 días de
recuperación.
- En la necropsia, al final del período de tratamiento, las úlceras/ micro úlceras estomacales se
hallaron en el 15%, 35% y 25 % de las ratas dosificadas con ior®EPOCIM a 300 y 600 UI/kg y
con EPREX® a 600 UI/kg respectivamente. Como solo fueron afectadas las hembras, esos
porcentajes fueron mayores para las hembras solamente: 30%, 70%, y 50 %. Al final del
período de recuperación, todavía había una de cada 5 ratas hembras (ior®EPOCIM) y 2 de cada
5 ratas machos (EPREX®) con úlceras/micro úlceras estomacales.
La reducción en la ganancia de peso corporal, enrojecimiento/edema en la articulación de la pata y las
úlceras estomacales son reacciones adversas conocidas para el mismo tipo de fármaco (EPOhr) y había
sido previamente descrita. El enrojecimiento/inflamación de las articulaciones de la pata y las úlceras
estomacales fueron consecuencias de efectos trombóticos. La patogénesis de las úlceras de la piel no
está clara pero una explicación plausible podría ser también la presencia de eventos trombóticos. Las
ratas tratadas con EPREX® parecieron ligeramente más afectadas que las tratadas con ior®EPOCIM lo
cual puede ser una consecuencia de una exposición sistémica ligeramente mayor a la EPOhr de las ratas
tratadas con EPREX® que de las tratadas con ior®EPOCIM. La AUC 0-∞ para ratas expuestas a
EPREX® fue ligeramente mayor que en las expuestas al ior®EPOCIM. Con la excepción de las
úlceras estomacales, el resto de los efectos adversos hallados fueron todos reversibles durante el
período de 14 días de recuperación.
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La patología clínica y los hallazgos patológicos relacionados con el tratamiento, pero que se
consideraron efectos patológicos exagerados para esta clase de compuesto, fueron los siguientes:
- Conteo total de reticulocitos incrementado, de forma marcada a moderada en machos y hembras
dosificados con el ior®EPOCIM 30-600 UI/kg y EPREX® 600 UI/kg. El incremento total fue
de 1,8x, 3,3x y 4,6x para machos y 2,3x, 3,8x 4,4x y 6,3x para hembras de grupos que
recibieron ior®EPOCIM y EPREX® respectivamente. Subsecuente al incremento en
reticulocitos, la masa de eritrocitos, Hb y Hto se incrementó también de forma moderada en los
grupos de tratamiento. El incremento promedio de la masa de eritrocitos estuvo entre el 31 y el
61% para los machos y entre 42% y 72 % para hembras dosificadas con ior®EPOCIM y 66%
para machos y 75 % para hembras dosificadas con EPREX®.
- Los parámetros de hematología al final del período de recuperación indicaron que la masa de
eritrocitos se mantuvo elevada en ambos grupos ior®EPOCIM y EPREX® (ambos géneros
dosificados a 600 UI/kg). En las ratas macho de ambos grupos los glóbulos rojos se
incrementaron en un 50% por encima de los valores del grupo de control, y en las hembras los
incrementos fueron de 67 y 74% para los grupos de altas dosis de ior®EPOCIM y EPREX®
respectivamente. El conteo de reticulocitos fue marcadamente reducido en las ratas de ambos
géneros dosificadas tanto con ior®EPOCIM como con EPREX® al final del período de
recuperación. En los machos el conteo de reticulocitos fue 10-11x reducido en comparación con
las ratas machos del grupo control, y en las hembras, fueron reducidos 12-16x cuando se
compararon a las ratas hembras del grupo control.
- El agrandamiento del bazo se detectó en 60%, 90% y 100% de las ratas en los grupos tratados
con ior®EPOCIM a 300 y 600 UI/kg y en ratas tratadas con EPREX® a 600 UI/kg
respectivamente. Estos incrementos fueron significativos (p<0.01) cuando se compararon con
las ratas del grupo control. Al final del período de recuperación los bazos se hallaban aun
aumentados en el 60% de las ratas tratadas con ior®EPOCIM y en el 80% de las ratas tratadas
con EPREX®.
Incrementos en las masas de reticulocitos y un incremento en el peso del bazo fueron respuestas
esperadas a la estimulación de la eritropoyesis por parte de la EPOhr. Las respuestas a la EPOhr en las
ratas, fueron ligeramente mayores en las ratas tratadas con EPREX® que en las tratadas con
ior®EPOCIM, similarmente a las acciones adversas tóxicas que fueron ligeramente más pronunciadas
en el grupo tratado con EPREX® que en el tratado con ior®EPOCIM.
Además hubo otros parámetros de la química hematológica/sérica que fueron afectados por el
tratamiento, pero fueron cambios menores en magnitud, y fueron similares o iguales entre los grupos
tratados con ior®EPOCIM y EPREX®. Esos hallazgos menores incluyeron: disminución del conteo de
plaquetas, e incremento del volumen medio de plaquetas en todos los grupos de tratamiento; los
conteos medios de glóbulos blancos y de linfocitos en particular fueron incrementados en todos los
grupos de tratamiento; fueron hallados ligeros incrementos en PT y APTT, BUN, CK, algunos
electrolitos, la bilirrubina total y el AST se incrementaron ligeramente. Esos pequeños cambios,
además de estar presentes en las ratas tratadas tanto con ior®EPOCIM como con EPREX®, también
estuvieron presentes y se reportaron con otros medicamentos del mismo tipo.
El análisis del suero en los grupos de ratas tratadas con elevadas dosis, tanto de ior®EPOCIM como de
EPREX® fue negativo para anticuerpos anti-EPO al final del tratamiento y del período de
recuperación.
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Ambos, el ior®EPOCIM y el EPREX®, produjeron un incremento dependiente del tiempo de los
parámetros finales (FD en ratas tanto hembras como machos). La respuesta máxima (Emax) para los
reticulocitos se presentó en el día 7 de la dosificación. Los valores de ED50 para el ior®EPOCIM en los
días 7, 14 y 28 fueron similares en los machos en un rango entre 71 y 80 UI/kg, mientras en las
hembras los valores estuvieron entre 52-106 UI/kg. Los valores de (Emax) disminuyeron en hembras y
machos desde el día 7 al día 28 en 26 y 53 % respectivamente. Para los glóbulos rojos, Hb y Hto, los
valores de ED50 y (Emax) (anotada en el día 28) y el E0 fueron similares en ratas hembras y machos. En
el día 28 los valores de ED50 en ratas machos y hembras para los glóbulos rojos, Hb y Hto oscilaron de
63-84 UI/kg, 19-27 UI/kg y 23 - 26 UI/kg respectivamente. La relación entre las respuestas a dosis de
600 UI/kg para ior®EPOCIM y EPREX® oscilaron de 0,84-1,09.
En el día 1 los niveles pre dosis de EPO estuvieron todos inferiores al límite de cuantificación. En el
día 28 de dosificación los niveles pre dosis de EPO fueron superiores al límite de cuantificación LOQ a
niveles de dosis altas y medias de ior®EPOCIM y EPREX® y oscilaron de 16- 96 mUI/kg, lo que
sugiere que no existió eliminación completa de la EPOhr dentro de las 24 horas. Para el ior®EPOCIM,
tanto en el día 1 como el 28 de dosificación el AUC0-∞ se incrementó en forma lineal y proporcional a
las dosis. Para el ior®EPOCIM y EPREX® el AUC0-∞ fue inferior en el día 28, oscilando entre 0,76-
0,94 veces el valor de AUC0-∞ en el día 1.
La vida media de eliminación (t1/2(e)), el aclaramiento total (CL), el volumen de distribución al punto
estabilizado (Vss) y el tiempo de residencia medio (MRT) de EPO (desde el ior®EPOCIM y EPREX®
en los días 1 y 28 de la dosificación) fueron generalmente similares oscilando entre 3.0 y 4.7 horas,
0.022-0.035 L/kg/hr. 0.09-0.15 L/kg y 3.2-5.6 horas respectivamente. La relación entre el AUC0-∞ de
ior®EPOCIM a EPREX® en altas dosis fue de 0.84 y 0.80 en el día 1 y día 28 de la dosificación
respectivamente dentro de los estándares de los límites requeridos para que exista bioequivalencia.
Valores similares para Vss, algo más bajo el CL (1.2-1.3 veces) y mayor t1/2(e) (1.0 a 1,6 veces se
observaron para el EPREX® comparado con el ior®EPOCIM en altas dosis.
Una comparación basada en la dosis de 600 UI/kg de ior®EPOCIM y EPREX® revelaron similares
parámetros de aclaramiento (t1/2(e), CL, Vss, y MRT) los cuales tienen tendencias similares para el
ior®EPOCIM y EPREX® en el análisis con géneros combinados. Los valores plasmáticos de AUC0-∞
y AUC0-T Last fueron similares entre ratas hembras y machos en el día 1 pero fueron 13.9-19.1 % más
pequeñas en las hembras comparadas a los machos en el día 28.
El ior®EPOCIM y el EPREX® produjeron incrementos dependientes del tiempo para los valores
finales de los parámetros (reticulocitos, glóbulos rojos, Hb y Hto) en ratas hembras y machos. La
relación de las respuestas para estos parámetros finales entre el ior®EPOCIM y el EPREX® osciló de
0.84-1.09 y la relación del AUC0-∞ del iorEPOCIM al EPREX fue de 0.84 y 0.80 en el día 1 y el día 28
de dosificación respectivamente. Los resultados de este estudio implican que las ratas hembras y
machos dosificadas a 600UI/kg con ior®EPOCIM y EPREX® tuvieron respuestas FD y perfiles de TC
que fueron similares (Figura 42).
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Figura 42. Respuesta a Altas dosis (600 UI/kg) de ior®EPOCIM y EPREX® para reticulocitos, RBC,
hemoglobina y Hematocritos. A y C (machos) y B y D (hembras).
El análisis de todos los datos generados, incluidas las observaciones clínicas, los pesos corporales, las
ganancias de peso corporal, el consumo de alimentos, la oftalmología, la patología clínica, la patología
general y la histopatología, revelaron que no existió toxicidad relacionada con el tratamiento en las
ratas que fueron tratadas con ior®EPOCIM a 30 UI/kg en un período de 28 días, el cual es equivalente
a las dosis propuestas en humanos. Los cambios relacionados con el tratamiento en los parámetros
hematológicos en este grupo (incremento de reticulocitos y masa de eritrocitos incrementada) fueron
esencialmente consistentes con lo anticipado para esta clase de producto. En los grupos dosificados a
300 y 600 UI/kg con ior®EPOCIM y 600 UI/kg con EPREX® tanto las reacciones adversas (reducción
del consumo de alimentos, y la ganancia de peso corporal, eventos trombóticos), y las reacciones
farmacológicas exageradas (reticulocitosis, incremento de la masa de eritrocitos, eritropoyesis extra
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medular en el bazo, engrosamiento del bazo) fueron respuestas también esperadas así como bien
documentadas para esta clase de fármaco. Tanto las reacciones adversas como las reacciones
farmacológicas exageradas, fueron algo más pronunciadas en las ratas tratadas con EPREX®, causadas
posiblemente por una exposición sistémica ligeramente mayor, como fue determinado por un mayor
incremento en el AUC0-∞ de las ratas tratadas con EPREX® (16-20 % aproximadamente).
Bajo las condiciones de este estudio, se consideraron niveles de efectos adversos no observados
(NOAEL) para el ior®EPOCIM en ratas los de 30UI/kg/día por 28 días.
Conclusión parcial:
Con base en estos hallazgos, así como un perfil toxicológico similar, se puede concluir que
ior®EPOCIM y EPREX® mostraron biosimilaridad cuando se dosificaron subcutáneamente en ratas a
600 UI/ kg durante 28 días (Pucaj y cols, 2014).
6.4 Resultados clínicos. Informe periódico de seguridad.
Resumen
El presente informe contiene la información de seguridad para el ior®EPOCIM, producida en el CIM,
Cuba. El reporte comprende el período desde el 1 enero de 2012 al 31 diciembre de 2016.
El ior®EPOCIM está registrado en 29 países. Las aprobaciones para su comercialización corresponden
a las indicaciones: tratamiento de la anemia asociada a la insuficiencia renal crónica incluyendo
pacientes en diálisis (insuficiencia renal crónica terminal) y en pacientes pre dialíticos, tratamiento de
la anemia en pacientes de SIDA en tratamiento con zidovudina, en el tratamiento de la anemia pos
quimioterapia en pacientes oncológicos (adultos y pediátricos) y en la profilaxis y tratamiento de la
anemia de la prematuridad.
Hasta el 31 diciembre de 2016 han concluido 14 ensayos clínicos con esta EPOhr. El total de pacientes
expuestos a esta EPOhr desde su aprobación sanitaria en Cuba en el año 1998 hasta el 31 diciembre de
2016 es de 1 505 941 pacientes (incluye pacientes tratados en ensayos clínicos y pacientes estimados
por las ventas nacionales e internacionales).
Este informe integrado de seguridad contiene la información de los eventos adversos recibidos por
reportes espontáneos del mercado y de ensayos clínicos, reportados a CIMAB en el período del 1 de
enero de 2012 al 31 de diciembre de 2016, directamente o a través de sus socios para la EPOhr
producida por el CIM con marca comercial ior®EPOCIM.
Durante el período analizado se recibieron 57 reportes espontáneos de eventos adversos, de ellos 19
fueron eventos adversos graves (EAG) y solo seis se relacionaron con la EPOhr referida. (Retinopatía
de la prematuridad (3), Anemia refractaria (1), Aplasia Pura de Células Rojas (APCR) (1) e
Hipertensión arterial (1).
En la Base de Datos Nacional de Farmacovigilancia del CECMED (período desde 1 enero de 2012 al
31 diciembre de 2016) se registraron 2 reportes de reacciones adversas al ior® EPOCIM 2000 UI, lo
cual representó el 0,001% del total de reportes para el período evaluado. Las reacciones notificadas
fueron: temblores (probable) y fiebre (definitiva), evaluadas como moderadas, ambas reacciones
adversas están descritas en la literatura. Se registraron 9 reportes de reacciones adversas al
ior®EPOCIM 4000UI, los cuales representaron el 0,009%del total de reportes para el período evaluado.
Las reacciones notificadas fueron: piel (41,7%): habones, prurito y flebitis; cardiovascular (33,3%):
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hipotensión arterial, taquicardia y dolor precordial; otras reacciones fueron: fiebre, vómitos y temblor.
Predominaron las reacciones moderadas (75%). La mayoría de los eventos fueron considerados
probables (83.3%) y de baja frecuencia de aparición (58.3%). Respecto al ior®EPOCIM 10 000UI, se
reportaron 4 reacciones adversas: escalofríos, mareos, fatiga y cefalea, evaluadas como moderadas,
probables y frecuentes.
La EPOhr producida en el CIM integró la lista de medicamentos a seguir por vigilancia intensiva en el
país desde el 2011 hasta el 2014. Adicionalmente en el 2015 se realizó una vigilancia activa por los
puntos focales de la Autoridad Reguladora en dos hospitales clínicos quirúrgicos universitarios sin
notificar reportes en este período. No ha sido objeto de alerta ni de comunicación de riesgo en el
territorio nacional ni en los países donde se comercializa.
El perfil de seguridad de ior® EPOCIM en el período analizado es coincidente con el reportado en la
Información Básica del producto (información administrativa y resumen de las características del
producto). No se aprecian cambios clínicamente significativos en la severidad o frecuencia de los
eventos adversos referenciados.
Se detectaron nuevas señales en la subpoblación de enfermos renales crónicos donde se reportaron 2
eventos adversos graves no referenciados como sospecha de APCR, específicamente en Tailandia,
pero solo una de ellas se confirmó por biopsia de médula ósea.
En concordancia con los datos de calidad, de seguridad y de eficacia descritos en este reporte se infiere
que el beneficio terapéutico de ior®EPOCIM supera los riesgos potenciales para todas las indicaciones
de uso aprobadas en condiciones de la práctica médica.
6.5 Registros sanitarios otorgados.
Al cierre del año 2016, la EPOhr producida en el CIM está aprobada para su comercialización
(registros sanitarios) en 29 países (Tabla 64).
Tabla 64. Registros sanitarios otorgados de la EPOhr producida en el CIM hasta el 31 diciembre 2016.
No. País Año Marca comercial/presentación
1 Cuba 1998
ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI 2004 ior®EPOCIM 10 000 UI
2 Chile 2001 EPOETINA ALFA HUMANA RECOMBINANTE
2000 UI
EPOETINA ALFA HUMANARECOMBINANTE
4000 UI 3 República Dominicana 2002
ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI
4 Jamaica 2002 ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI
5 Colombia 2002 ior®EPOCIM 2000 UI
2006 ior®EPOCIM 4000 UI
6 Brasil 2002
Alfaepoetina 2000 UI
Alfaepoetina 4000 UI
2014 Alfaepoetina 10 000 UI
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7 Ecuador 2013
ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI
ior®EPOCIM 10 000 UI
8 Perú
2003 ior®EPOCIM 2000 UI
2008 ior®EPOCIM 4000 UI
ior®EPOCIM 10000 UI
9
Honduras 2008 ior®EPOCIM 4000 UI
10 México 2008 ALVERITIN 2000UI
ALVERITIN 4000UI
11 Panamá 2003 ior®EPOCIM 2000 UI
12 EL Salvador 2002 ior®EPOCIM 4000 UI
2004 ior®EPOCIM 2000 UI
13 Guatemala 2005 ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI
14 Venezuela(SERTERE) 2005 ior®EPOCIM 2000 UI
2006 ior®EPOCIM 4000 UI
14a Venezuela(Espromed BIO) 2015 ior®EPOCIM 4000 UI
2016 ior®EPOCIM 2000 UI
15 Costa Rica 2006 ior®EPOCIM 2000 UI
16 India 2006
r-human-Erythropoietin Injection 2000 UI
r-human-Erythropoietin Injection 4000 UI
r-human-Erythropoietin Injection 10000 UI
17 Nicaragua 2007
ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI
2011 ior®EPOCIM 10000 UI
18 Bolivia 2007 ior®EPOCIM 10000 UI
2008 ior®EPOCIM 4000 UI
19 Vietnam 2006 ior®EPOCIM 2000 UI
No. País Año Marca comercial/presentación
20 Argentina 2009 ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI
21 Túnez 2010 ior®EPOCIM 2000 UI
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22 Filipinas 2010
Hemapo Epoetin alfa (Recombinant Human
Erythropoietin) 2000 IU/mL
HemapoEpoetin alfa (Recombinant Human
Erythropoietin) 4000 IU/mL
Hemapo Epoetin alfa (Recombinant Human
Erythropoietin) 10000 IU/mL
23 Bielorrusia 2012 ior®EPOCIM 2000 UI
24 Ucrania 2012
ior®EPOCIM 2000 UI
ior®EPOCIM 4000 UI
ior®EPOCIM 10000 UI
25 Tailandia 2012
Hemaplus® 2000 UI
Hemaplus® 4000 UI
Hemaplus® 10000 UI
26 Turquía 2013 EPOPLUS 2000 UI
2015 EPOPLUS 4000 UI
27 Nigeria 2012
Hemapo Epoetin alfa 2000 UI
Hemapo Epoetin alfa 4000 UI
Hemapo Epoetin alfa 10000 UI
28 Myanmar 2015 ior®EPOCIM 4000 UI
ior®EPOCIM 10000 UI
29 Paraguay
2015
ior®EPOCIM 4000 UI
ior®EPOCIM 10000 UI
6.6 Acciones tomadas por razones de seguridad.
El producto iorEPOCIM ha demostrado ser un medicamento de calidad, seguro y eficaz en todas las
indicaciones evaluadas tanto en los ensayos clínicos como en los mercados autorizados para su venta.
Actualmente su producción se realiza en 6 plantas productivas bajo las Buenas Prácticas de Manufactura
(GMP):
- Centro de Inmunología Molecular (CIM), Cuba: IFA, formulado y PT (iorEPOCIM).
- Centro Nacional de Biopreparados (BIOCEN), Cuba: PT (iorEPOCIM).
- Biocon Limited, India: formulado y PT (Erypo-safeTM).
- Biomanguinhos-Fio-Cruz, Brasil: PT (Epoetina alfa).
- ScianBioscence Co., Ltd., Tailandia: PT (jeringa pre llenada) (Hema-Plus).
- Alvartis Pharma, México: PT (Alveritin).
Este producto no ha sido objeto de acciones tomadas por las autoridades regulatorias o por los titulares de
los registros por razones de seguridad.
6.7 Cambios a la información de referencia del producto.
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En el período que cubre este informe no se describen cambios en el perfil de seguridad del
iorEPOCIM, por lo que no se ha modificado la información de referencia del producto sobre
seguridad, en relación con lo descrito anteriormente en la Monografía del producto.
6.8 Pacientes expuestos.
El número estimado de pacientes expuestos a ior EPOCIM se basa en la sumatoria del volumen
acumulado de ventas hasta el 31 diciembre de 2016 realizadas en el mundo, según consta en la
información recibida por la Dirección de Comercialización del CIM de sus socios comerciales y en el
número de pacientes incluidos en estudios clínicos en Cuba, Brasil e India. En la tabla 65 se muestran
los datos del número de pacientes expuestos durante la comercialización de iorEPOCIM por año. En
la tabla 66 se muestra el total de pacientes expuestos en ensayos clínicos concluidos y de pacientes
expuestos durante la comercialización hasta el 31 diciembre del 2016.
Tabla 65. Pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización por año.
Año No. Pacientes expuestos a ior®EPOCIM
2006 9 662
2007 8 229
2008 55 239
2009 108 062
2010 64 923
2011 176 618
Subtotal 422 733
2012 321 976
2013 226 371
2014 119 130
2015 223 123
2016 190 381
Subtotal 1 080 981
Total 1 503 714
Leyenda: Filas sombreadas corresponde al período de análisis de este IPS.
Tabla 66. Total de pacientes expuestos a ior® EPOCIM durante la comercialización y en ensayos
clínicos.
No. pacientes en ensayos clínicos
(acumulado entre 1997 hasta 31diciembre
2016)
No. pacientes tratados por venta del producto
(acumulado hasta 31 diciembre 2016 )
2 227 1 503 714
Total= 1 505 941 pacientes
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Total de pacientes expuestos: Se estima que aproximadamente 1 505 941 pacientes han sido expuestos
a ior®EPOCIM, de ellos, 1 081 648 (1 080 981 comercialización y 667 ensayos clínicos) corresponden
al período que cubre este informe.
6.9 Actualización de Ensayos Clínicos.
El ior® EPOCIM posee amplio perfil de seguridad comprobado en estudios clínicos controlados y en
estudios pos comercialización que incluye poblaciones vulnerables como ancianos y niños, donde el
perfil de seguridad manifiesto es idéntico al demostrado en el resto de la población.
Hasta el ano 2017 han concluido 15 estudios clínicos, en los cuales se ha evaluado la farmacocinética
comparada con el producto de referencia, la seguridad de ior® EPOCIM en las indicaciones de anemia
en pacientes sometidos a métodos dialíticos o no, en el tratamiento de la anemia inducida por
quimioterapia y radioterapia (pacientes adultos y niños), así como en el tratamiento y prevención de la
anemia en el recién nacido de muy bajo peso al nacer.
Adicionalmente 3 estudios han evaluado el perfil de seguridad de ior® EPOCIM en la prevención de
transfusiones de sangre por cirugías electivas con hemorragia (1); como agente neuroprotector en el
infarto cerebrovascular agudo (1) y como agente cardioprotector en la injuria cardíaca inducida por
antraciclinas (1).
Actualmente se encuentra un ensayo clínico en curso con ior® EPOCIM: Evaluación del efecto y
seguridad de la eritropoyetina humana recombinante (ior®EPOCIM) como agente cardioprotector en la
cirugía de la enfermedad valvular reumática (M9/CIMAB/AEC-02).
En la tabla 67 se presentan los ensayos clínicos terminados con ior® EPOCIM.
Tabla 67. Ensayos clínicos terminados con ior® EPOCIM hasta el 2017.
Ensayo clínico
Código/País/Año/Publicación
Fase No.
Pacientes
Exposición máxima
(semanas/meses)
Vía
admon
Grupo edad
(años/días)
Farmacocinetica clinica
A bioquivalence study of two-treatmen and two sequence
of Epoetin alfa 4000 IU injection pre-filled siringe 4000
IU relative to EPREX in healthy Thai volunteers under
fasting condition.
Report No. EPO-037-15/ Thai/2017
I 22 72 horas SC >18
Anemia por Insuficiencia Renal Crónica
Evaluación de la farmacocinética y el efecto terapéutico
de la hr-EPO en el tratamiento de la anemia.
NC/Cuba/ /1997
I/II
25 16 semanas IV >18
Efecto terapéutico del uso subcutáneo de la hr- EPO en el
tratamiento de la anemia.
NC/Cuba/ 1998
Pérez-Oliva Díaz Rev Habanera de Ciencias Médicas,
vol. 3, n.o 10, 2004
I/II 24 12 semanas SC >18
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Estudio abierto prospectivo para la evaluación de la
eficacia y la seguridad de hr-EPO (CIMAB, Cuba) en
pacientes en diálisis o pre diálisis en el manejo de la
anemia en la insuficiencia renal crónica.
CLG002/BIO002/CKD/EPO/2005/ India/2005.
III 42 12 semanas IV/SC >18
Equivalencia terapéutica entre la eritropoyetina humana
recombinante y la hr- EPO sin albúmina (EPO/ SA) en
pacientes con insuficiencia renal crónica en métodos
dialíticos (hemodiálisis o diálisis peritoneal).
IIC RD EC068/Cuba/2004
Pérez-Oliva y cols, Rev. Habanera Cienc. Médicas,
vol. 7, n.o 3, pp. 0-0, sep. 2008.
III
60 (30
pacientes en
cada grupo)
12 semanas SC >18
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana
recombinante en pacientes con insuficiencia renal crónica
en métodos dialíticos (hemodiálisis o diálisis peritoneal).
IIC RD EC091/Cuba/2006
IV 617 24 meses IV/SC >18
Estudio abierto prospectivo para la evaluación de la
eficacia y seguridad de Erypro-SafeTM (hr-EPO
inyección) en pacientes en diálisis o pre diálisis en el
manejo de la anemia en la insuficiencia renal crónica.
BN002/CKD/2007/India/2007
IV 151 12 semanas IV/SC >18
Comparación de eficacia de la eritropoyetina producida
por el Instituto de Tecnología de Inmunobiológicos de la
Fundación Oswaldo Cruz y una eritropoyetina biosimilar
en pacientes con insuficiencia renal crónica.
NCT01184495C/Brasil/2008
Paulo y cols. Clinics, vol. 69, n.o 8, pp. 547-553, ago.
2014.
IV 74 24 meses SC >18
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana
recombinante en pacientes con insuficiencia renal crónica
en pre-diálisis.
IIC RD EC112/Cuba/2011
Alicia y cols. Rev.Habanera de Cienc. Médicas, vol 15,
Núm.6 (2016).
IV 242 12 meses IV/SC >18
Anemia por Quimioterapia/Radioterapia
Impacto de la hr-EPO (eritropoyetina humana
recombinante) en pacientes oncológicos con anemia post
quimioterapia/radioterapia.
IIC RD EC092/Cuba/2004
IV 338 8 semanas SC >18
Impacto de la hr-EPO (eritropoyetina humana
recombinante) en pacientes pediátricos oncológicos con
anemia post quimioterapia/radioterapia
IIC RD EC099/Cuba/2004
Alicia V y cols. MEDICC Rev, vol 12, n.o 3, p. 28,
2010.
IV 157 8 semanas SC <18
Anemia del Recién Nacido Pretérmino
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana
recombinante en anemia del recién nacido.
IIC RD EC121/Cuba/2010
Sijo Y y cols. Rev. Cuba. Pediatría, vol. 85, n.o 2, pp.
202–212, 2013.
III 72 8 a 10 semanas SC > 7 días y
< 30 días
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 110/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Evaluación de la seguridad y efectividad de
ior®EPOCIM en el manejo de la anemia del recién
Nacido prematuro.
M9/CIMAB/AEC-2/ Cuba/2013
RPC. Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos».
[En línea]. Disponible en: http:
//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000149-Sp.
[Accedido: 07-dic-2015].
IV 131 8 a 10 semanas SC
> 15 días de
nacido.
Prevención de transfusiones de sangre en cirugías electivas con alto potencial de pérdida de sangre
Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana
recombinante en la disminución de los requerimientos de
transfusiones de sangre en pacientes con cirugías
electivas de hiperplasia prostática benigna.
IIC RD EC 096/Cuba/2009
Lamelas T y cols. Rev. Cuba. Urol., vol. 2, n.o 2, ene.
2014.
III 250 3 semanas SC >18 años
Cardio-protección en el esquema de tratamiento con antraciclinas
Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en pacientes con
linfoma No Hodgkin tratados con antraciclinas.
(IIC RD EC126) Cuba (2010)
RPC0096. Registro Público Cubano de Ensayos
Clínicos». [En línea]. Disponible en: http:
//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000096-Sp.
[Accedido: 07-dic-2015
II
44 (22
pacientes en
cada grupo)
8 meses IV >18 años
RCP: Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos/ Registro primario de la OMS: http://registroclinico.sld.cu.
Leyenda: IV: Intravenoso; SC: Subcutáneo
El estudio de farmacocinetica comparada con código Report No.EPO-037-015 fue abierto, balanceado,
dos tratamieto aleatorizados, dos secuencias, cruce de dos periodos diseñado bajo rapidas condiciones
en voluntarios tailandeses sanos para evaluar la bioequivalencia entre el producto de prueba de
eritropoyetiba alfa 4 000 UI Hema-Plus® jeringa prellenada producida por Siam Bioscience Co., Ltd
Tailandia y el producto de referencia EPREX® 4 000 UI producido por Cilag AG, Suiza e importado
por Janssen-Cilag Limites (Tailandia). El intervalo para un 90% de condianza (CI) del radio
geométrico de la media para el producto de prueba y de referencia de eritropoyetina para la Cmax y
AUC0-72 fueron 106.58-124.82% y 99.70- 109.45% con el estimador puntual 115.34% y 104.32%,
respectivamente los cuales muestran que ambos parámetros cumplen con el critrerio para
bioequivalencia del producto.
6.10 Presentación de casos individuales.
En este informe se describen los eventos adversos y eventos adversos graves independientemente de su
relación con ior® EPOCIM, recibidos en el período del 1 de enero de 2012 al 31 diciembre de 2016,
reportados de forma expedita o en los informes finales de los ensayos clínicos terminados.
Las fuentes documentales de información utilizadas para este reporte son:
a) Base de datos de Farmacovigilancia (Departamento comercialización, CIM).
b) Reporte final. Ensayo clínico: Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana
recombinante en pacientes con insuficiencia renal crónica en pre-diálisis. IIC RD EC112.
c) Reporte final. Ensayo clínico: Evaluación de la seguridad y efectividad de ior® EPOCIM en el
manejo de la anemia del recién nacido prematuro.M9/CIMAB/AEC-2.
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 111/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
d) Reporte final. Ensayo clínico: Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante
en la disminución de los requerimientos de transfusiones de sangre en pacientes con cirugías
electivas de hiperplasia prostática benigna. IIC RD EC 096.
Durante el período analizado se recibieron 57 reportes espontáneos de eventos adversos, de ellos 19 de
eventos adversos graves (EAG), solo 6 EAG fueron relacionados con ior® EPOCIM.
6.11 Reportes espontáneos de eventos adversos graves (EAG)
Tabla 68. Reportes espontáneos de EAG.
Evento adversos
graves
relacionados
(RAM)
Frecuencia
del RAM
Indicación de
uso
Relación con
hr-EPO
Fuente (País/mercado
o ensayos clínicos )
Retinopatía de la
Prematuridad
3 Prematuridad Posible Cuba /ensayo clínico
Fase IV
(M9/CIMAB/AEC-2/
Cuba/2013)
Anemia refractaria 1 ERC Posible Singapur/mercado
Aplasia Pura De
Células Rojas
1 ERC Posible Tailandia /mercado
Hipertensión
Arterial
1 ERC Definitiva Tailandia/mercado
6.11.1 Eventos adversos graves relacionados con eritropoyetina humana recombinante
En este punto se describen los eventos adversos graves relacionados con la EPOhr, con causalidad
posible, probable o definitiva, reportados en los ensayos clínicos y de forma expedita hasta el 31
diciembre de 2016.
En la tabla 69 se describen los eventos adversos graves por indicación, código del ensayo, código del
paciente, sistema anatómico, eventos adversos y relación de causalidad con la eritropoyetina humana
recombinante.
Tabla 69. Relación de EAG relacionados con ior®EPOCIM reportados hasta 31 diciembre de 2016.
Indicación/código ensayo clínico
Código
del
paciente
Sistema
anatómico EAG
Relación
con ior®
EPOCIM
Ensayos Clínicos
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 112/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Indicación/código ensayo clínico
Código
del
paciente
Sistema
anatómico EAG
Relación
con ior®
EPOCIM
Anemia IRC
Evaluación de la farmacocinética y el
efecto terapéutico de la hr-EPO en el
tratamiento de la anemia.NC/Cuba/
/1997
No se reportaron eventos adversos graves relacionados con
eritropoyetina humana recombinante.
Efecto terapéutico del uso subcutáneo
de la hr- EPO en el tratamiento de la
anemia. NC/Cuba/1998
No se reportaron eventos adversos graves relacionados con
eritropoyetina humana recombinante.
Estudio abierto prospectivo para la
evaluación de la eficacia y la seguridad
de hr-EPO (CIMAB, Cuba) en
pacientes en diálisis o pre diálisis en el
manejo de la anemia en la insuficiencia
renal crónica.
CLG002/BIO002/CKD/EPO/2005.India
/2005
YSD
Nervioso/
Neurología
Sangramient
o intra-
cerebral
Probable
ABS Cardiovascular Paro cardio-
respiratorio Posible
Equivalencia terapéutica entre la
eritropoyetina humana recombinante y
la hr- EPO sin albúmina (EPO/ SA) en
pacientes con insuficiencia renal crónica
en métodos dialíticos (hemodiálisis o
diálisis peritoneal). IIC RD EC068.
Cuba/2004
No se reportaron eventos adversos graves relacionados con
eritropoyetina humana recombinante.
Efectividad y seguridad de la
eritropoyetina humana recombinante en
pacientes con insuficiencia renal crónica
en métodos dialíticos (hemodiálisis o
diálisis peritoneal). IIC RD EC091.
Cuba/2006
SA 8 Nervioso/Neurolo
gía
Enfermedad
cerebrovascu
lar
hemorrágica
Probable
SA 13 Infecciones Bacteriemia Posible
LDS 20 Nervioso/Neurolo
gía
Enfermedad
cerebrovascu
lar
hemorrágica
Probable
Enfermedad
cerebrovascu
lar
hemorrágica
Posible
INNEF 78 Infecciones Sepsis
generalizada
Posible
Nervioso/Neurolo
gía
Accidente
vascular
encefálico
(isquemia)
Posible
INNEF 85 Infecciones Sepsis
generalizada
Posible
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 113/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Indicación/código ensayo clínico
Código
del
paciente
Sistema
anatómico EAG
Relación
con ior®
EPOCIM
INNEF 71 Cardiovascular Edema
agudo
pulmón
Posible
INNEF 62 Infecciones Sepsis
generalizada
Posible
INNEF 31 Cardiovascular Angina
inestable
aguda
Posible
INNEF 10 Nervioso/Neurolo
gía
Hemorragia
cerebral
Posible
HHA 2 Infecciones Endocarditis
(infecciosa)
Posible
HHA 14 Infecciones Sepsis
hematógena
Posible
GAL 50 Nervioso/Neurolo
gía
Enfermedad
cerebrovascu
lar
hemorrágica
Posible
GAL 24 Infecciones Sepsis
hematógena
Posible
CJF 47 Cardiovascular Infarto
miocardio
Posible
CJF 40 Vascular Trombosis
arterial
mesentérica
Probable
CJF 39 Cardiovascular Infarto
miocardio
agudo
Posible
CJF 3 Cardiovascular Miocarditis Posible
CJF 28 Cardiovascular Infarto
miocardio
agudo
Posible
CC 49 Nervioso/Neurolo
gía
Enfermedad
cerebrovascu
lar
hemorrágica
Posible
CC 37 Cardiovascular Infarto
miocardio
agudo
Posible
AS 41 Hepático/páncreas Insuficiencia
hepática
Posible
AS 38 Cardiovascular Shock mixto
infarto
Definitiva
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 114/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Indicación/código ensayo clínico
Código
del
paciente
Sistema
anatómico EAG
Relación
con ior®
EPOCIM
miocardio
agudo
AS 37 Cardiovascular Infarto
miocardio
agudo
Posible
AS 21 Cardiovascular Shock mixto
pericarditis
hemorrágico
Definitiva
Estudio abierto prospectivo para la
evaluación de la eficacia y seguridad de
Erypro-SafeTM (hr-EPO inyección) en
pacientes en diálisis o pre diálisis en el
manejo de la anemia en la insuficiencia
renal crónica. BN002/CKD/2007.
India/2007
6004 Cardiovascular Hipertensión
acelerada/ede
ma pulmonar
Posible
1. Comparación de eficacia de la
eritropoyetina producida por el Instituto
de Tecnología de Inmunobiológicos de
la Fundación Oswaldo Cruz y una
eritropoyetina biosimilar en pacientes
con insuficiencia renal crónica.
NCT01184495C. Brasil/2008
El reporte del estudio no refiere la relación de los eventos
adversos graves con la eritropoyetina humana recombinante o
la biosimilar utilizada en este estudio comparativo.
Efectividad y seguridad de la
eritropoyetina humana recombinante en
pacientes con insuficiencia renal crónica
en pre-diálisis. IIC RD
EC112.Cuba/2011
CC-11
Sistema inmune Síndrome
anafiláctico
Muy
Probable
2. Anemia por quimioterapia
3. Impacto de la hr-EPO
(eritropoyetina humana recombinante)
en pacientes oncológicos con anemia
post quimioterapia/radioterapia. IIC RD
EC092. Cuba/2004
No se reportaron eventos adversos graves relacionados con
eritropoyetina humana recombinante.
Impacto de la hr-EPO (eritropoyetina
humana recombinante) en pacientes
pediátricos oncológicos con anemia post
quimioterapia/radioterapia. IIC RD
EC099. Cuba/2004
JLM-10 Sangre/Sistema
Linfático
Equimosis y
hematomas
Posible
JLM-12 Sangre/Sistema
Linfático
Trombocitop
enia
Posible
JLM-29 Neutropenia Posible
JLM-30 Neutropenia Posible
JLM-32 Trombocitop
enia
Posible
JLM-37 Trombocitop
enia
Posible
JLM-08 Neutropenia Posible
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 115/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Indicación/código ensayo clínico
Código
del
paciente
Sistema
anatómico EAG
Relación
con ior®
EPOCIM
Tratamiento y prevención de la
anemia del Recién Nacido Pretérmino
Efectividad y seguridad de la
eritropoyetina humana recombinante en
anemia del recién nacido. IIC RD
EC121. Cuba/2010
M10-2 Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
Evaluación de la seguridad y
efectividad de ior® EPOCIM en el
manejo de la anemia del recién nacido
prematuro. M9/CIMAB/AEC-2.
Cuba/2013
10M-
DLM-19*
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
10M-
EVH-18*
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
10M-
EVH-21*
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
AB-AAS-
20
Ocular
Retinopatía
del
prematuro
Posible
AB-
ACJB-19
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
AB-KVF-
18
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
AB-
NCCC-17
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Probable
EH-DHF-
31
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
RGC-
KCO-17
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
RGC-
LAHM-7
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 116/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Indicación/código ensayo clínico
Código
del
paciente
Sistema
anatómico EAG
Relación
con ior®
EPOCIM
RGC-
LAHM-8
Ocular
Retinopatía
del
prematuro
Posible
RGC-
MVMV-9
Ocular Retinopatía
del
prematuro
Posible
RGC-
SSL-12
Ocular
Retinopatía
del
prematuro
Posible
Cardio-protección en el esquema de
tratamiento con antraciclinas
Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en
pacientes con linfoma No Hodgkin
tratados con antraciclinas.IIC RD
EC126. Cuba/2010.
No se reportaron eventos adversos graves relacionados con
eritropoyetina humana recombinante.
Prevención de transfusiones de
sangre en cirugías electivas con alto
potencial de pérdida de sangre
Eficacia y seguridad de la eritropoyetina
humana recombinante en la disminución
de los requerimientos de transfusiones
de sangre en pacientes con cirugías
electivas de hiperplasia prostática
benigna. IIC RD EC 096. Cuba/2009
CP-25 Renal/Trastornos
Urinarios
Hematuria Probable
AN-10 Cardiovascular Hipertensión
arterial
Posible
CG-03 Cardiovascular Hipertensión
arterial
Posible
Reportes expeditos
Fuente de procedencia del reporte
/País
Código
del
paciente
Sistema
anatómico
Evento
adverso
grave
(EAG)
Relación
con ior®
EPOCIM
Reporte espontáneo/Cuba EPO2011/
01
Dermatología/piel Eritema
multiforme
Posible
Reporte espontáneo/Cuba EPO2014/
06*
Ocular Retinopatía
prematuridad
Posible
Reporte espontáneo/Cuba EPO2014/
07*
Ocular Retinopatía
prematuridad
Posible
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 117/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Indicación/código ensayo clínico
Código
del
paciente
Sistema
anatómico EAG
Relación
con ior®
EPOCIM
Reporte espontáneo/Cuba EPO2014/
08*
Ocular Retinopatía
prematuridad
Posible
Reporte espontáneo/Singapur EPO2015/
01
Sangre/Sistema
Linfático
Anemia
refractaria
Posible
Reporte espontáneo/Tailandia EPO2015/
02
Sangre/Sistema
Linfático
Aplasia Pura
Células
Rojas
Posible
Reporte espontáneo/Tailandia EPO2016/
28
Cardiovascular Hipertensión
arterial
Definitiva
Leyenda: * Corresponde a EAG reportados también como reporte espontáneos durante el Ensayo
clínico.
6.12 Información relacionada con la eficacia.
6.12.1 Anemia en pacientes con Enfermedad Renal Crónica (ERC) sometidos a diálisis o en pre -
diálisis
En el período analizado de este reporte se obtuvo información de efectividad en la indicación de la
anemia por ERC en pacientes predialíticos del ensayo clínico IIC RD EC112. Efectividad y seguridad
de la EPOhr en pacientes con insuficiencia renal crónica en pre-diálisis.
El 31.0% (IC 95%, 25; 37) de los pacientes en el análisis por intención de tratamiento (AIT) y el 41.7%
(IC 95%, 31; 52) en el análisis por protocolo (APP) mantuvieron la Hb y el Hto en el rango previsto. El
23 % (AIT) y 31.3 % (APP) mantuvieron valores de Hb y el Hto por encima del valor establecido. La
media de la hemoglobina al inicio fue 10.0 g/dL y final 11.7 g/dL (p < 0.001). La media del Hto inicial
fue 31.57% y al final 37.26% (p < 0.001). La mediana del tiempo a la recuperación de la anemia fue 2
meses (IC 95%, 1.7; 2.2).
Requirieron transfusiones 7 pacientes, 2.9% (IC 95%, 1%; 5%), solamente en 2 pacientes la causa fue
no respuesta al tratamiento con ior® EPOCIM. Sobre el efecto de la corrección de la anemia en la
progresión de la ERC, no hubo cambios significativos en los valores medios de Filtrado Glomerular
Teórico (FGT) ni en la creatinina sérica. Al final del estudio se observó una reducción promedio de la
masa ventricular izquierda (29.9g) y del IMVI (Índice de Masa Ventrículo Izquierdo) que se redujo un
promedio de 51.8 g/m2 (IC 95%, 45; 99). El 40% (IC95%, 27; 52) de los pacientes redujo el IMVI en
12% o más respecto al valor basal.
La evaluación de calidad de vida (SF-36) al año de seguimiento, mostró mejoría para todas las
dimensiones de la escala, el mayor beneficio fue para las de rol físico y salud general. Se analizó la
seguridad en los 242 pacientes incluidos. Se reportaron 147 eventos adversos (EA) en 78 pacientes
(32.2% IC 95%, 26; 38), la mayoría fueron de intensidad leve (78 EA, 53.1%) y causalidad no
relacionada (71 EA, 48.3%). El EA más frecuente fue hipertensión arterial (66 EA, 44.9%), 20 (13.6%)
reportados con causalidad relacionada. Otros EA cardiovasculares y cerebrovasculares fueron Infarto
Agudo de Miocardio en 2 pacientes (1.4%), 2 pacientes con edema agudo del pulmón (1.4%), 2
pacientes con accidentes cerebrovasculares (1.4%) y uno con arritmia ventricular (0.7%), ninguno de
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 118/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
ellos con causalidad asociada al medicamento en estudio. ior® EPOCIM mostró resultados beneficiosos
en la corrección de la anemia y demostró ser seguro en la población estudiada.
6.12.2 Anemia inducida por quimioterapia en pacientes oncológicos
La anemia es frecuentemente un síntoma concomitante en pacientes con cáncer. El origen obedece a
una combinación de factores, donde los efectos tóxicos directos de los agentes quimioterapéuticos
utilizados y la radioterapia, juegan un rol importante en su aparición. Esta anemia afecta en ocasiones
gravemente a la calidad de vida, obliga con frecuencia a la práctica de transfusiones y empeora la
temida hipoxia tumoral asociada con la resistencia a la quimioterapia y radioterapia.
La utilización de EPOhr en pacientes con anemia inducida por quimioterapia, mejora los valores de
hemoglobina y hematocrito, la calidad de vida, la adherencia a los regímenes de quimioterapia
planificados, así también, disminuye los requerimientos transfusionales.
6.12.3 Anemia y prematuridad
En el período analizado de este reporte se obtuvo información de efectividad en la indicación de la
anemia de la prematuridad en el ensayo clínico M9/CIMAB/AEC-2. El promedio de peso de los
pacientes incluidos fue de 1275 g y la edad gestacional de 31 semanas. El 86.3 % (113 pacientes) no
requirió transfusión durante el estudio. Solo 13.7 % necesitaron transfusión (18 pacientes), de estos el
10.7 % requirió una sola transfusión (14 pacientes), 3 pacientes recibieron 2 transfusiones y 1 recibió 4
transfusiones. Durante el seguimiento, ningún paciente fue transfundido. La media de la hemoglobina
al inicio fue de 120.81 g/l (DS 24.5) y en la evaluación final de 107.8 g/l (DS 17.3) IC 95 % (7.3-17.5),
p=0.000; respecto al hematocrito las medias oscilaron entre 38.4 % (DS 8) y 35.5 % (DS 6.7) IC 95 %
(1.6-4.0), p=0.000, hasta las 40 semanas de EG, momento hasta el cual recibieron el tratamiento. Se
identificaron alteraciones ligeras del neurodesarrollo, sólo en 2 pacientes a los 18 meses de
seguimiento.
6.12.4 Anemia y VIH/SIDA
En el período del 1 de enero de 2012 al 31 de diciembre de 2016 no hay reportes relacionados con falta
de eficacia de la EPOhr.
6.12.5 Literatura
En el período que cubre este informe se publicaron 6 artículos científicos con la EPOhr producida en el
CIM. A continuación, se relacionan los trabajos publicados en este período.
A. Lámelas Testa, A. A. L. Testa, I. C. Cabezas, C. A. R. Orta, Y. Y. G. Portales, M. R. Ferro, y
D. R. R. Díaz, «Eficacia y seguridad del ior® EPOCIM en el tratamiento de pacientes con
hiperplasia prostática benigna», Rev. Cuba. Urol., vol. 2, n.o 2, ene. 2014.
ior®EPOCIM-Infarto cerebral agudo-Fase I | Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos». [En
línea]. Disponible en: http: //registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000136-Sp. [Accedido: 07-
dic-2015].
G10 INF-0089
VERSIÓN/ 00
PÁGINAS/ 119/133
ANTERIOR/ N/P
BIOCOMPARABILIDAD DEL ior® EPOCIM (ERITROPOYETINA HUMANA
RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
Efecto y seguridad del ior® EPOCIM en pacientes con Linfoma No Hodgkin tratados con
antraciclinas. | Registro Público Cubano de Ensayos Clínicos». [En línea]. Disponible en: http:
//registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000096-Sp. [Accedido: 07-dic-2015].
J. F. Pérez-Oliva Díaz, «15 años de Eritropoyetina Recombinante Humana cubana. Beneficios y
retos», Rev. Habanera Cienc. Médicas, vol. 12, n.o 3, pp. 464-471, sep. 2013.
Sijó Yero, G. Saurez Martínez, D. Velázquez Noda, L. Méndez Alarcón, A. Alfonso Dávila, A.
Vargas Batista, M. Robaina García, P. Piedra Sierra, A. Lorenzo Rodríguez, A. Campos
González, y others, «Eficacia y seguridad de la eritropoyetina en la anemia de la prematuridad»,
Rev. Cuba. Pediatría, vol. 85, n.o 2, pp. 202–212, 2013.
Alicia Vargas Batista, Jorge Pérez-Oliva Díaz, Maytée Robaina García, Patricia Piedra Sierra,
Ivis Mendoza Hernández, Yusnely Román Rodríguez, «Efectividad y seguridad del uso de ior®
EPOCIM en pacientes en prediálisis Ensayo clínico», Rev.Habanera de Cienc. Médicas, vol 15,
Núm.6 (2016).
6.13 Evaluación general de seguridad
6.13.1 Evaluación de los eventos adversos en pacientes tratados con ior®EPOCIM.
A continuación, se resumen y analizan los eventos adversos reportados para pacientes tratados con ior®
EPOCIM para cada ensayo clínico terminado independiente de su relación.
La información disponible está en término de número de eventos adversos, se reportan en esta
evaluación los eventos adversos con incidencia ≥ 5%.
Los eventos se presentan por indicación, sistema anatómico y tipo de información disponible (número
de eventos adversos).
Los eventos adversos se presentan de acuerdo a la clasificación “Common Terminology Criteria for
Adverse Events v4.0” (CTCAEv4).
6.13.2 Indicación: Cardio-protección en el esquema de tratamiento con antraciclinas
Efecto y seguridad de ior® EPOCIM en pacientes con linfoma No Hodgkin tratados con antraciclinas.
(IIC RD EC126)
Durante el estudio se presentaron 141 eventos adversos, 81 (57.4%) en el grupo que recibió tratamiento
con ior®EPOCIM (22 pacientes) y 60 (42.6%) en el grupo control (22 pacientes).
Los eventos adversos en término de número de eventos adversos (ver epígrafe 7.2.1, tabla 5) con
incidencia ≥ 5 %, independiente de su relación con ior®EPOCIM, fueron:
- Sangre /Sistema Linfático: Anemia (14.8%)
- Cardíaco: Taquicardia sinusal (12.3%)
- Vascular: Hipertensión arterial (9.9%)
- Gastrointestinal: Vómitos (6.2%)
6.13.3 Indicación: Prevención de transfusiones de sangre en cirugías electivas con alto potencial
de pérdida de sangre
Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en la disminución de los
requerimientos de transfusiones de sangre en pacientes con cirugías electivas de hiperplasia prostática
benigna. (IIC RD EC 096)
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Durante el estudio se presentaron 456 eventos adversos en 191 pacientes de los 250 incluidos en el
estudio, 93 (74.4%) pacientes en el grupo que recibió tratamiento con ior®EPOCIM presentaron 236
eventos adversos y 98 (78.4%) pacientes en el grupo control presentaron 220 eventos adversos.
Los eventos adversos en término de número de eventos adversos (ver epígrafe 7.2.2, tabla 6) con
incidencia ≥ 5 %, independiente de su relación con ior®EPOCIM, fueron:
- Renal/Urinario: Hematuria (31.8%)
- General/Sitio de Administración: Dolor en la herida quirúrgica (27.1%), sangrado por la herida
quirúrgica (6.4%), fiebre (5.9%)
6.13.4 Indicación: Anemia en Insuficiencia Renal Crónica
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en pacientes con insuficiencia renal
crónica en pre-diálisis. (IIC RD EC112)
Durante el estudio se presentaron 147 eventos adversos en 78 (32.2%) pacientes de los 242 incluidos en
el estudio.
El evento adverso en término de número de evento adverso (ver epígrafe 7.2.3, tabla 7) con incidencia
≥ 5 %, independiente de su relación con la eritropoyetina humana recombinante, fue:
- Vascular: Hipertensión arterial (44.9%)
6.13.5 Indicación: Anemia en recién nacidos pretérmino
Evaluación de la seguridad y efectividad de ior® EPOCIM en el manejo de la anemia del recién nacido
prematuro. (M9/CIMAB/AEC-2)
Durante el estudio se presentaron 62 eventos adversos en 35 (26.7%) pacientes de los 131 incluidos en
el estudio.
Los eventos adversos en término de número de eventos adversos (ver epígrafe 7.2.4, tabla 8) con
incidencia ≥ 5 %, independiente de su relación con ior®EPOCIM, fueron:
- Ocular: Retinopatía del prematuro (21.0%)
- Infecciones/Infestaciones: Infección respiratoria alta (17.7%), sepsis tardía (9.7%)
- Respiratorio /Tórax/Mediastino: Crisis de sibilancia (11.2%)
6.13.6 Evaluación de los EAG presentados en ensayos clínicos terminados con relación de
causalidad con ior®EPOCIM.
En los ensayos clínicos terminados en el período del informe se reportaron 17 eventos adversos graves
relacionados con ior®EPOCIM, con causalidad muy probable (1), probable (2), posible (14).
A continuación, se relacionan los ensayos clínicos donde fueron presentados estos EAG relacionados
con la EPOhr:
Eficacia y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en la disminución de los
requerimientos de transfusiones de sangre en pacientes con cirugías electivas de hiperplasia prostática
benigna. (IIC RD EC 096)
Del total de eventos adversos (456) presentados, se reportaron 27 (5.9%) EAG, 15(6.4%) en el grupo
ior® EPOCIM y 12 (5.5%) en el grupo control.
De los EAG presentados en el grupo ior® EPOCIM, se reportó 1 Hematuria y 2 Hipertensión Arterial.
La hematuria (código Paciente CP-25) fue de intensidad moderada, que no provocó cambios en el
tratamiento y el paciente se recuperó. Este evento fue clasificado con relación de causalidad probable
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con ior® EPOCIM y representó (0.2%) del total de eventos adversos (456) presentados en el estudio.
Los 2 eventos de hipertensión arterial con relación posible con ior®EPOCIM se describen como sigue:
Un caso (código Paciente AN-10) de intensidad moderada, que interrumpió definitivamente el
tratamiento y persistió el evento, sin otro detalle. El segundo caso (código Paciente CG-03) presentó
una HTA de intensidad severa, sin cambios en el tratamiento, que mejoró. Estos eventos representaron
el (0.4%) del total de eventos adversos presentados en el estudio.
- Renal/Urinario: Hematuria (0.2%), probable (1)
- Vascular: Hipertensión arterial (0.4%), posible (2)
Efectividad y seguridad de la eritropoyetina humana recombinante en pacientes con insuficiencia renal
crónica en pre-diálisis. (IIC RD EC112)
Del total de eventos adversos (147) presentados durante el estudio, se clasificaron EAG 19 (12.9%), se
presentó 1 evento adverso grave relacionado con la administración de ior®EPOCIM: síndrome
anafiláctico (código Paciente CC-11), de intensidad severa, que interrumpió definitivamente el
tratamiento y tuvo recuperación total. Este evento se clasificó con relación de causalidad muy probable
con la administración del tratamiento y representó (0.7%) del total de eventos adversos presentados en
el estudio.
- Sistema inmune: Síndrome anafiláctico (0.7%), muy probable (1)
Evaluación de la seguridad y efectividad de ior® EPOCIM en el manejo de la anemia del recién nacido
prematuro. (M9/CIMAB/AEC-2)
Del total de eventos adversos (62) presentados en 35(26.7 %) pacientes, se reportaron 27 (12.9%)
EAG, 13 (21.0%) retinopatía del prematuro (10M-DLM-19, 10M-EVH-18, 10M-EVH-21, AB-AAS-
20, AB-ACJB-19, AB-KVF-18, AB-NCCC-17, EH-DHF-31, RGC-KCO-17, RGC-LAHM-7, RGC-
LAHM-8, RGC-MVMV-9, RGC-SSL-12) con relación probable (1), posible (12). Según el resultado
del EA se clasificaron: recuperado (9), mejorado (2), con secuelas (2). Respecto a la actitud frente a los
EA no se modificó el tratamiento con ior® EPOCIM al surgir el EA.
- Ocular: Retinopatía del prematuro (21.0%), probable (1), posible (12)
En el transcurso del estudio ocurrieron 3 muertes, dos en la etapa de tratamiento y una en la etapa de
seguimiento. Todas estuvieron relacionadas con comorbilidades asociadas, no estuvieron relacionados
con ior® EPOCIM. A continuación un sumario de estos reportes.
Pretérmino CIUR (Código paciente MG-YPH-8), femenino de 33 semanas de EG y 900 g de peso, que
con 71 días de vida fallece a consecuencia de una sepsis con fallo multiórgano.
Pretérmino femenino (Código paciente 10M-DLM-22), de 1040 g de peso, primera trilliza de 28
semanas de EG, con antecedentes perinatales de Rotura prematura de membrana que desencadenó el
parto pretérmino. A los 30 días de vida fallece por un cuadro de enterocolitis necrotizante complicada
con hemorragia pulmonar.
Pretérmino masculino (Código paciente AB-AAS-20), de 26 semanas y 938 g de peso. A los 14.7
meses de egresado (446 días), en edad de lactante, y en etapa de seguimiento, presentó una infección
respiratoria baja (Neumonía) que provocó su fallecimiento.
6.13.7 Evaluación de los eventos adversos con incidencia ≥ 5 %
Los eventos adversos de mayor incidencia en las indicaciones aprobadas de anemia en la enfermedad
renal crónica, anemia post quimioterapia/radioterapia y anemia en recién nacidos pretérminos,
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independiente de su causalidad con ior® EPOCIM (acumulado PSUR 2005-2010, PSUR 2011, IPS-
2017) son los siguientes (Tabla 70):
Tabla 70. Relación de eventos adversos graves con incidencia ≥ 5 % en pacientes tratados con ior®
EPOCIM en las indicaciones aprobadas independientemente de su causalidad (acumulado PSUR 2005-
2010, PSUR 2011, IPS-2017).
INDICACIONES
APROBADAS
EVENTOS ADVERSOS INCIDENCIA ≥
5 % (ensayos clínicos con información en
término de número de eventos adversos)
EVENTOS ADVERSOS INCIDENCIA
≥ 10 % (ensayos clínicos con información
en término de número de pacientes por
eventos adversos)
Anemia en
pacientes con
Enfermedad Renal
Crónica
Hipotensión 9.76 % Hipertensión
arterial
22.45 %
Dolor de cabeza 7.84 %
Hipertensión 52.07 %
Anemia en
pacientes
oncológicos por
quimioterapia
Fiebre 13.81 % - -
Dolor sitio inyección 10.81 %
Dolor óseo 9.61 %
Síndrome pseudo-gripal 6.91 %
Pérdida de peso 6.91 %
Vómitos 5.10 %
Anemia del Recién
Nacido Pretérmino
Infección respiratoria alta 34.4% - -
Sepsis tardía 23.6%
Retinopatía del prematuro 21.0%
Intertrigo moniliásico 13.9%
Crisis de sibilancia 11.2%
Reflujo gastroesofágico 8.3%
El ior® EPOCIM posee amplio perfil de seguridad comprobado en estudios clínicos controlados y en
estudios post comercialización que incluye poblaciones vulnerables como ancianos y niños, donde el
perfil de seguridad manifiesto es idéntico al demostrado en el resto de la población.
6.14 Evaluación de la inmunogenicidad de ior® EPOCIM en pacientes con insuficiencia renal
crónica.
Para determinar la inmunogenicidad se evaluó la presencia de anticuerpos anti-EPO en el suero de 87
pacientes con insuficiencia renal crónica del Hospital Nefrológico de Ciudad de la Habana, Cuba,
sometidos a hemodiálisis y tratados con la EPOhr producida en el CIM durante al menos 1año. Estas
determinaciones se realizaron en el Laboratorio de Ensayos Clínicos del Centro de Ingeniería Genética
(CIGB) de Cuba, utilizando las Buenas Prácticas de Laboratorio.
6.14.1 Metodología utilizada para la determinación de la presencia de anticuerpos anti-EPO.
Se utilizó un ELISA para la determinación de la presencia de anticuerpos anti-EPO en el suero de los
pacientes tratados con EPOhr producida en el CIM. Esta metodología fue previamente validada por el
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Departamento de Aseguramiento de la Calidad del CIGB. Los resultados de la validación obtenidos en
el Laboratorio de Ensayos Clínicos del CIGB se muestran en el punto 5.4.11.2.
6.14.2 Resultados de la validación de la metodología utilizada.
La validación se realizó según las recomendaciones del Comité Europeo para Estándar de Laboratorio
Clínico y la Guía para evaluación de kits diagnósticos (CEELC, 1987).
Los parámetros evaluados fueron: Precisión (repetibilidad y reproducibilidad) del control positivo y del
control negativo, límite de detección, especificidad (analítica), interferencias, estabilidad y sensibilidad.
Se utilizaron como:
Control positivo: Suero de conejo inmunizado con EPOhr.
Control negativo: Suero de donantes sanos que cumplen con todos los requisitos de: edad,
antecedentes patológicos personales negativos, test de hepatitis B negativo, test de HIV negativo.
En la validación del sistema ELISA de detección de anticuerpos anti-EPO se obtuvieron los siguientes
resultados:
- Repetibilidad: Control positivo CV≤10% y control negativo CV≤20%.
- Reproducibilidad: Control positivo CV≤10% y control negativo CV≤20%.
- Valor de absorbancia mínima detectable por el sistema: 0.072.
- En todos los testajes del control positivo del sistema se cumplió que la disminución del valor de
absorbancia era mayor que 3 desviaciones estándar del control negativo demostrando que el
sistema es específico.
- Se demostró que ni la hemólisis, ni la presencia de suero normal o de conejo interferían en nuestro
sistema de detección del ELISA.
- Se demostró que tanto los controles positivos como los controles negativos usados eran estables
por un período de 5 meses en las condiciones de conservación habituales.
Con los resultados anteriormente obtenidos el Departamento de Ensayos Clínicos del CIGB concluyó
que el sistema ELISA para la detección cualitativa de anticuerpos anti-EPO recombinante es seguro,
confiable y específico para demostrar la presencia de dichos anticuerpos en suero.
6.14.3 Resultados de la determinación de anticuerpos anti-EPO en pacientes.
Verificación del sistema:
La verificación de los dos ensayos realizados fue conforme ya que se obtuvieron los siguientes
resultados:
- El valor de absorbancia del fondo fue menor que 0.1.
- El valor de absorbancia del control negativo fue menor que 0.12.
- El valor de absorbancia del control positivo fue mayor que 1.
Resultados:
Para la interpretación de los resultados fue considerado:
- Se consideró positivo al suero con valores de absorbancia superiores a 3 desviaciones estándar por
encima del promedio de la población de controles negativos estudiados (punto de corte). Además,
para ser positivos deben satisfacer la condición de que la diferencia entre los valores de extinción
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de la pre-incubación con EPOhr y los de sin pre-incubación con EPOhr debe ser mayor que el
valor del punto de corte, lo que confirmaría la especificidad de los anticuerpos.
- Se consideró negativo al suero con valores inferiores a dos desviaciones estándar del promedio de
los controles negativos.
Los resultados de las determinaciones de anticuerpos anti-EPO en dos ensayos realizados muestran que
ninguno de los pacientes tratados con la EPOhr producida en el CIM presenta niveles detectables de
anticuerpos en sangre (Tabla 71 y 72)
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Tabla 71. Resultados de la determinación de anticuerpos anti-EPO en pacientes a los que se les ha
suministrado la EPOhr producida en el CIM. Ensayo realizado el día 10nov2004.
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Tabla 72. Resultados de la determinación de anticuerpos anti-EPO en pacientes a los que se les ha
suministrado la EPOhr producida en el CIM. Ensayo realizado el día 27oct2004.
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Conclusiones parciales:
Los resultados obtenidos indican que la EPOhr producida en el CIM no es inmunogénica al menos
después del primer año de tratamiento de los pacientes.
- El producto ior® EPOCIM no ha sido objeto de alerta ni de comunicación de riesgo en el
territorio nacional ni en los países donde se comercializa en el período analizado.
- El perfil de seguridad de ior® EPOCIM en el período analizado es coincidente con el reportado en
la Información Básica del producto (IPP). No se aprecian cambios clínicamente significativos en
la severidad o frecuencia de los eventos adversos referenciados.
- Se detectaron nuevas señales en la subpoblación de enfermos renales crónicos como sospecha de
Aplasia Pura de Células Rojas, específicamente en Tailandia, pero solo una de ellas se confirmó
con relación posible.
- En concordancia con los datos de calidad, de seguridad y de eficacia descritos en este reporte se
infiere que el beneficio terapéutico de ior® EPOCIM supera los riesgos potenciales para todas las
indicaciones de uso aprobadas en condiciones de la práctica médica.
- Por todos los resultados anteriores se concluye que el producto es eficaz y seguro.
La evaluación beneficio-riesgo es favorable, en las condiciones de uso para la población (M9/IPS-
2017, 2017).
7. CONCLUSIONES
Calidad.
- El ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO® son similares en la calidad fisicoquímica y biológica y
no demuestran diferencias significativas en relación a su estructura primaria, estructura
secundaria y terciaria, impurezas, masa molecular, tamaño molecular, unión al receptor,
bioactividad in vitro e in vivo.
- Las diferencias obtenidas en la caracterización entre ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO® en
los estudios de N-Glicosilación y el perfil de isoformas por electroforesis capilar de zona no
muestran un impacto en los estudios preclínicos, al no obtenerse diferencias estadísticas
significativas en los resultados de actividad biológica in vitro (proliferación celular) e in vivo
(ratones normocitemicos) y afinidad (Biacore) entre ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO®.
Farmacología no clínica y toxicología.
Los productos ior®EPOCIM y EPREX®/ERYPO® son similares desde el punto de vista
farmacocinetico y toxixologico.
Farmacología clínica. Eficacia y seguridad.
- Los resultados clínicos realizados con ior®EPOCIM mostraron una farmacocinética similar a la
del producto de referencia.
- Los resultados clínicos realizados con ior®EPOCIM mostraron una eficacia y un perfil de
seguridad acorde a los parámetros aceptados internacionalmente.
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RECOMBINANTE) CON EL PRODUCTO DE REFERENCIA (EPREX®/ERYPO®)
- En concordancia con los datos de calidad, de seguridad y de eficacia descritos en este reporte se
establece que el beneficio terapéutico de ior®EPOCIM supera los riesgos potenciales para todas
las indicaciones de uso aprobadas en condiciones de la práctica médica.
Evaluación riesgo-beneficio.
El ior®EPOCIM ha demostrado ser un medicamento seguro y eficaz en todas las indicaciones
aprobadas y en los ensayos clínicos controlados y post comercialización realizados, evidencia efecto
terapéutico en la anemia por Insuficiencia Renal Crónica, anemia por quimioterapia/radioterapia,
anemia del Recién Nacido Pretérmino así como la prevención de transfusiones de sangre en cirugías
electivas con alto potencial de pérdida de sangre y cardio-protección en el esquema de tratamiento con
antraciclinas, lo que posibilita la continuación del ciclo de tratamiento planificado para afecciones
malignas. El uso clínico incluye poblaciones vulnerables como niños, con un favorable perfil de
seguridad manifiesto idéntico al demostrado en el resto de la población. No ha sido necesario realizar
acciones por las autoridades regulatorias o por los titulares de los registros aprobados por razones de
seguridad. No se han descrito cambios en el perfil de seguridad, por lo que no ha cambiado la
información de referencia sobre seguridad del producto (M9/IPS-2017, 2017).
Concentramos el objetivo de este estudio en la evaluación cualitativa y cuantitativa de la similitud del
medicamento biotecnológico de prueba y el producto de referencia. Basado en la totalidad de los
resultados obtenidos de ior®EPOCIM queda demostrada la biocomparabilidad a EPREX®/ERYPO®.
7. REFERENCIAS
- «ior® EPOCIM en la anemia del recién nacido prematuro.Fase IV. | Registro Público Cubano de
Ensayos Clínicos». [En línea]. Disponible en: http: //registroclinico.sld.cu/ensayos/RPCEC00000149-Sp.
[Accedido: 07-dic-2015].
- 050302-Informe de inmunogenicidad de la EPOhr producida en el CIM. 2004.
- 97/22. Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en conejos con el producto de referencia
EPREX®. 1997.
- 97/23. Farmacocinética comparada del ior®EPOCIM en monos con el producto de referencia EPREX®.
1997.
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- Alegre. A. Eritropoyetina en Hematología. Editorial Médica Panamericana. 2005.
- Alicia Vargas Batista, Jorge Pérez-Oliva Díaz, Maytée Robaina García, Patricia Piedra Sierra, Ivis
Mendoza Hernández, Yusnely Román Rodríguez, «Efectividad y seguridad del uso de ior® EPOCIM en
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8. REVISIÓN HISTÓRICA
Revisión Descripción de los cambios Elaborador Fecha
00 Se crea un nuevo documento. Alejandro Portillo 04/2018