BIOTECNOLOGIA Alimentos e Nutracêuticos

APLICAÇÕES DA TRANSGLUTAMINASE DE ORIGEM MICROBIANA (MTgase) EM ALIMENTOS

LÁCTEOS

Ronaldo Montezuma

Consultor em Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação

São Paulo, Outubro de 2013

APRESENTAÇÃO PROFISSIONAL

Médico Veterinário e Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos pela Universidade Estadual

Paulista (UNESP). Pesquisador e empreendedor em projetos de

inovação do agronegócio. Experiência de 20 anos como executivo em

unidades de negócios e áreas corporativas na Sadia, Sonae e JBS.

Atua como consultor no desenvolvimento de novos produtos e aplicação de produtos biotecnológicos

em indústrias alimentícias, no Brasil e America Latina.

IMPORTÂNCIA

Indústrias alimentícias de todo o mundo estão em busca do desenvolvimento de ingredientes ou produtos lácteos com novas características físicas e funcionais

Um dos objetivos é a alteração das propriedades dos produtos lácteos pela modificação das proteínas do leite utilizando a transglutaminase

(RODRIGUEZ-NOGALES, 2006; SHARMA, LORENZEN e QVIST, 2001)

CARACTERÍSTICAS

Independente do cálcio para ativação

Dependente de baixa tenção O2 para ativação

Massa molar 38.000 Kd

Ponto isoelétrico (pl) = 8,9

331 aminoácidos em uma única cadeia peptídica

1 resíduo de cistina

proteína monométrica simples

FONTES

Purificação da enzima dos fluidos dos tecidos dos animais abatidos para consumo: bovinos, suínos e pescados

Vegetais

Produção microbiana iniciou em 1980

Streptoverticilium mobaraense sp, linhagem S-8112

LEGISLAÇÃO

ANVISA (2003), RDC no. 348 complementa a RDC no. 24 e aprova a aplicação da transglutaminase de origem microbiana em alimentos

A resolução RDC no. 278 dispensa de registro as enzimas e preparações enzimáticas

MAPA (1986): Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade Portaria nº 146, de 07 de março de 1996 coadjuvante opcional de tecnologia/elaboração: Enzima transglutaminase quantum satis

LEGISLAÇÃO

USDA FSIS (2001)

aprova sua utilização juntamente com a gelatina suína para utilização como ligante de produtos de carne formados e em presuntos curados e embutidos cozidos

FDA

A transglutaminase foi Genericamente Reconhecida Como Segura (GRAS)

FISIOLOGIA

Fator de coagulação presente no plasma: XIIIa transglutaminase e XIIIb proteína carreadora

Dependende de Ca++ e trombina

Aumento da estabilidade do coágulo da fibrina pela formação de ligações covalentes entre os polímeros de fibrina

Estabilização do tecido de cicatrização pela formação de ligações cruzadas entre as moléculas de fibrina

Favorece a migração dos fibroblastos

(BAER et. all, 1980; TAKAHASHI et. All; 1986 FOLK, 1980; BRUHN et. all, 1981)

FISIOLOGIA

Função quimiotática

Formação do tecido de granulação através das ligações cruzadas das proteínas adesivas: fibronectina, vitronectina, actina, miosina e colágeno

Prolongamento da estabilidade das ligações cruzadas pelo aumento da resistência a fribrinólise (BARRY et. all, 1988)

FISIOLOGIA

Fator XIII da coagulação sanguinea nos mamíferos

Formação do citoesqueleto e parede celular das Plantas

Formação da membrana de células esporulares

DE JONG; KOPPELMAN, (2002)

INIBIDORES

Metais pesados se ligam ao único grupo tiol do resíduo de cisteína: sítio ativo da MTG

Cu++ Zn++ Pb2+ Li+

Substâncias organicas específicas: Indício de um grupo SH participando da reação

Inibidor natural no soro do leite crú ainda não indentificado presume-se que se liga ao resíduo de cistéina

Presente em leite aquecido a temperatura até 62 a 65 °C por 30 minutos

Peso molecular 200 Da, não é um íon metálico livre

(DE JONG, BOUMANS & WIJNGAARDS, 2009)

REAÇÃO

Fonte: SHARMA, LORENZEN e QVIST, 2001 (adaptado).

AÇÃO

Catalização das reações das ligações cruzadas entre proteínas

Incorporação de uma amina livre

Hidrólise do resíduo glutamina

(GERRARD et al., 2001)

Propriedades de Textura e Análise do Perfil de

Textura (PTA) Curva típica do texturômetro GF (adaptada de BOURNE, 1982).

VANTAGENS Melhoria do Perfil de Textura:

Dureza

Coesividade

Elasticidade

Fraturabilidade (redução)

Melhoria da fatiabilidade

da viscosidade

Redução da sinérese

Melhoria do rendimento:

Maior agregação das globulinas ao coalho

Aumento da retenção de líquido

ATIVIDADE

Atividade ótima a 50°C por 10 minutos no em pH=6

Mantém a atividade por 10 minutos a 40°C

Perde a atividade a 70°C em poucos minutos

É ativada a 10°C e retém alguma atividade próximo do ponto de congelamento

ATIVIDADE

Temperatura (°C) Tempo (min)

5 240

15 105

20 70

30 35

40 20

FONTE: Adaptado de ANDO et al, 1989.

Relação entre a temperatura e o tempo de reação.

ATIVIDADE

FONTE: Adaptado de ANDO et al, 1989.

0

20

40

60

80

100

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Ati

vid

ade

(%)

Temperatura (oC)

ATIVIDADE

FONTE: Adaptado de ANDO et al, 1989.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Ati

vid

ade

(%)

Temperatura (oC)

REATIVIDADE FOOD PROTEIN REACTIVITY

Milk Casein +++

Sodium caseinate +++

A-Lactoglobulin +

B- Lactoglobulin +

Egg Egg white protein (egg albumin) +

egg yolk protein ++

Meat Myoglobin +

Collagen ++

Gelatin +++

Myofibril: Myosin +++

Myofibril: Actin X X

Soybean 11S Globulin +++

7S globulin +++

Wheat Gliadin ++

Glutenin ++

+++ reacts very well, ++reacts well, + reacts depending of conditions, X in general do not react. (SAKAMOTO et al., 2006)

Reactivity of microbial transglutaminase for several proteins

APLICAÇÕES E DOSAGEM APLICAÇÃO PREPARAÇÃO CONCENTRAÇÃO U/g DOSAGEM g/Kg

Carnes e peixes TG BIONOV 100 100 8-10

Presunto cru TG BIONOV 100 100 10

Salames, presuntos TG BIONOV 100 100 1,5-2

Surumi, derivados peixe

TG BIONOV 100 100 1-3

Presuntos, salsichas TG BIONOV 100 100 3

Linguiças frescas, salsichas, presuntos,

mortadelas TG BIONOV 100 100 1

Queijos mussarela antes de pasteurizar

TG BIONOV 70 70 5

Iogurte e queijo fresco

TG BIONOV 70 70 0,3

Queijos mussarela TG BIONOV 70 70 0,5

Queijo duro amarelo TG BIONOV 70 70 0,3-1

Leite fluido crú TG BIONOV 70 70 0,4

PROTEÍNAS DO LEITE

PROTEÍNAS DO LEITE

BIOQÚIMICA

Efeito das ligações cruzadas mais pronunciado na κ-caseína

A maior reatividad das κ-caseínas deve-se a sua localização na superfície da micela

Os macropeptídios das κ-caseínas são muito acessíveis ao ataque da transglutaminase

(KRUIF et al., 2002; RODRIGUEZ-NOGALES, 2005)

BIOQÚIMICA

Dentre as proteínas do leite destacam-se as caseínas

Bons substratos para a transglutaminase

A incubação de soluções de β- e κ- caseínas com transglutaminase leva a formação de ligações intramoleculares nas micelas de caseína

(COZZOLINO et al., 2003; O´CONNELL e KRUIF, 2003)

BIOQÚIMICA

A polimerização das formas monoméricas das proteínas aumenta após o tratamento térmico do leite a 85°C por 15 minutos, sendo menos intensa para a αs-caseína

O pré-aquecimento do leite causa a desnaturação das proteínas do soro e sua interação com as micelas de caseína, aumentando a susceptibilidade das proteínas à reação com a transglutaminase

(SHARMA, LORENZEN e QVIST, 2001)

BIOQÚIMICA

Em geral, o aumento progressivo da temperatura desorganiza o sistema proteína-água quebrando as ligações de hidrogênio que estabilizam a estrutura protéica

Isso causa o desdobramento e provoca a interação proteína-proteína, aproximando as proteínas do sítio ativo da transglutaminase e levando à subseqüente formação dos polímeros

(NIEUWENHUIZEN et al., 2003)

BIOQÚIMICA

A incorporação de ligações intra ou intermoleculares em alimentos protéicos parece viável

para o melhoramento das propriedades físicas e de textura de muitos produtos. Existem procedimentos químicos e enzimáticos para introduzir ligações cruzadas covalentes em proteínas

BIOQÚIMICA

Essas reações causam alterações nas propriedades funcionais de proteínas vegetais e animais, possibilitando a formação de produtos com melhores propriedades reológicas e sensoriais

(NIELSEN, PETERSEN e MOLER, 1995).

BIOQÚIMICA A incorporação de ligações intra ou

intermoleculares em alimentos protéicos parece viável para o melhoramento das propriedades físicas e de textura de muitos produtos

Devido à origem natural da enzima e sua alta especificidade pelo substrato, o procedimento enzimático tornou-se mais aceito por autoridades regulatórias e pelo consumidor (NONAKA et al., 1989).

BIOQÚIMICA

O aspecto da segurança na ingestão da molécula ε-(γ-glutamina)lisina formada pela reação catalisada pela transglutaminase está relacionado com a ingestão dessa molécula em alimentos cozidos, já que a transglutaminase está presente na maioria dos tecidos e órgãos de vegetais e animais.

BIOQÚIMICA

Durante o cozimento ou processamento dos alimentos, o aumento da temperatura é freqüentemente lento e as transglutaminases endógenas podem exercer sua atividade enzimática por algum tempo

(MOTOKI e SEGURO, 1998).

IOGURTE NATURAL

(mL.100g-1) expressa volume de exudato coletado após 2 horas de refrigeração a 6°C

IOGURTE NATURAL

Fonte BONISCH et al, 2006. Iogurte consistente com adição de caseinato de sódio: 6 semanas de estocagem sob refrigeração a

4°C Sem TG (a), (c) e (e) com TG (b), (d) e (f).

Redução da sinérese durante a vida útil de iogurte natural sem estabilizantes

PROCESSO IOGURTE

Resfriamento

43 º C

Adição

Transglutaminase

0,06%

Adição

sólidos

Incubação

6 h

Inoculação

Cultivo

Aquecimento

45 - 50 º C

Pasteurizacão

85 °C / 15 min

Estocagem

5 º C

Embalagem

Resfriamento

20 º C

Resfriamento

15 º C

Adição do sabor

Rompimento do gel

pH = 6,4

QUEIJOS PARA ASSAR

Coalho (Brasil)/Assadero (México)

Pasteurizacão

75 °C / 15 a 20 s

Adição coalho

quimosina

Incubação

30 min

Adição

Transglutaminase

0,045%

Adição bactérias láticas

Adição CaCl2

20 g / 100 L

Estiramento

75 - 80 ºC

Fermentação pH= 5 - 5,2 / 2 h

Prensagem e

sinérese parciais

Agitação 30 - 45 min

Aquecimento 44 ºC

Corte e agitação 15 min

Coagulação

30 - 40 min

Estocagem 2 - 4 ºC

Embalagem

Secagem

10 ºC / 70% UR

24 - 48 h

Salga salmoura

20º Baumé

Resfriamento água

10 ºC / 30 min

Moldagem 0,5 - 4 kg

Resfriamento

34 - 37 ºC

PROCESSO MUSSARELA

QUEIJOS FRESCOS

Minas (Brasil)/ Campesino (Colombia)/Panela (México)

Adição

Transglutaminase

0,03%

Coagulação

30 - 40 min

Adição coalho

quimosina

Incubação

30 min

Adição CaCl2

20 g / 100 L

Refrigeracão

36 - 38 º C

Pasteurizacão

75 °C / 15 a 20 s

Expedição

Embalagem

Resfriamento

7 º C / 12 h

Salga a sêco

2 horas

Moldagem

0,250 kg - 3,0 kg

Sinérese parcial

Corte e Agitação

30 min

PROCESSO FRESCAIS

PONTO DE VENDA

PONTO DE VENDA

PONTO DE VENDA

PONTO DE VENDA

PONTO DE VENDA

PONTO DE VENDA

PONTO DE VENDA

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