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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPALaboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MGDivisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BHMétodo de Ensaio – MET

Código: MET/LACQSA/BH/009 - V.1Fase: VigenteAprovado em: 24/06/14

Determinação de ocratoxina A em suco de uva e vinho por cromatografia líquida de alta eficiência e detecção por fluorescência

Aprovado por: Eugênia Azevedo VargasNilson César Castanheira Guimarães

Verificado por: Roseane Brandão de Brito

Elaborado/Revisado por: Ana Cristina Andrade Carvalho

1.0 Objetivos e alcance

O MET “Determinação de ocratoxina A em suco de uva e vinho por cromatografia líquida de alta eficiência e

detecção por fluorescência” objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação

de ocratoxina A e no registro dos dados relacionados às análises, para que estes possam ser corretamente

seguidos.

1.1 Abreviações

CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência

DPR = desvio padrão relativo

IAC = coluna de imunoafinidade

LD = limite de detecção

LQ = limite de quantificação

OTA = ocratoxina A

PBS = solução tampão fosfato salina

PEG = Polyetilenoglicol

R = recuperação

Rf = fator de retenção

r2 = coeficiente de correlação

U = incerteza expandida.

URPA = Unidade de recebimento e preparo de amostras;

UPM = Unidade de Preparo de Material;

Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Página 1/29Cópia não controlada







2.0 FundamentosEsta metodologia fundamenta-se na diluição da amostra em solução de 1% de polietilenoglicol: 5% de

bicarbonato de sódio seguido de purificação do extrato utilizando coluna de imunoafinidade contendo anticorpos

específicos para OTA; separação, detecção e quantificação da OTA por CLAE.

2.1 Características do método

Este método foi validado e otimizado pelo Lacqsa, conforme PE 080 “Determinação de ocratoxina A em suco de

uva e vinho por cromatografia líquida de alta eficiência”, baseado nos procedimentos descritos pela AOAC -

Immunoaffinity column cleanup/liquid chromatography analysis (Official Method 2001.01 Ochratoxin A in Wine

and Beer), baseado ainda nos procedimentos para análise de ocratoxina A em vinho e cerveja descritos na

apostila do treinamento JICA, 2011: “Immunoaffinity column method for Ochratoxin A in beer and wine” e nos

procedimentos descritos no MET/LACQSA/BH/005 “Determinação de ocratoxina A (OTA) por cromatografia

líquida de alta eficiência e camada delgada”.

Na validação do método por CLAE foram determinadas as seguintes características: limite de quantificação,

linearidade, linearidade, veracidade (em termos de recuperação, R%), precisão – repetitividade e precisão

intermediária (em termos de desvio padrão relativo, DPR%) obtidas por ensaios com amostras fortificadas com

solução padrão de ocratoxina A.

Tabela 1. Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de revalidação.

Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação

Veracidade

Ensaios de recuperação

< 1 µg/kg: 50 a 120%

1 a 10 µg/kg: 70 a 110(%)

Valores obtidos dentro dos critérios de aceitabilidade para recuperação obtidos

durante o processo de validação

< 1 µg/kg R% 72 a 94, MÉDIA =84

1 a 3 µg/kg R % 74 a 102 MÉDIA = 89

Sim








Precisão

(repetitividade)

< 1 µg/kg: DPRr ≤ 40%

1 a 10 µg/kg: DPRr ≤ 40%



< 1 µg/kg DPRr Máxima Determinada =10

1 a 3 µg/kg Máxima Determinada =12

Sim

Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação

Precisão intermediaria

(reprodutibilidade intralaboratorial )

< 1 µg/kg: DPRR ≤ 60%

1 a 10 µg/kg: DPRR ≤ 30%



< 1 µg/kg DPRr Máximo Determinado = 7

1 a 3 µg/kg Máxima Determinada = 7

Sim

Horrat Precisão adequada evidenciada por Horrat <1 Todos os valores <1 Sim

Seletividade/

especificidade

Ausência de interferentes no tempo de retenção (Rt) de

OTA - uso de IACSem interferentes Sim

Faixa ótima de trabalho Amostras de vinho e suco de uva entre 0,20 a 3µg/L

Faixa da curva de calibração

Injeção de 50µL

Curva de calibração: 0,0005 a 0,025 µg/mL

Amostras: 90,10 a 5 µg/L quando o volume de retomada for 1000µL

Amostra que exceda uma concentração maior que a faixa da curva deverá ser diluída de forma que a concentração esteja dentro da faixa de trabalho

Aplicabilidade

(matriz e faixa de concentração)

Vinho tinto: suave e seco

Vinho branco: suave e seco

Suco de uva tinto

- Sim

Limite de detecção

(g/kg)- 0,10 Sim

Limite de quantificação

(g/kg)- 0,20 ± 0,07 Sim.

Incerteza de medição - 0,20 ± 0,07 µg/kg Sim








2.2 Aplicabilidade

O método validado utilizando CLAE é aplicável à determinação de ocratoxina A (OTA) em vinho tinto suave e

seco, em vinho branco suave e seco e em suco de uva, conforme os resultados obtidos nos ensaios de

recuperação utilizando amostras fortificadas com solução padrão de ocratoxina A.

3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumosO material crítico (cuja qualidade afeta o resultado analítico) está identificado pelas iniciais MC.

Os reagentes, solventes e materiais necessários à análise deverão ser solicitados à Unidade Operacional pelo

preenchimento do formulário “FOR/LACQSA/BH/021 - Solicitação de material de consumo”.

As quantidades das soluções necessárias para as análises deverão ser verificadas antes do início das

atividades.

O material de uso da rotina necessário à análise deverá ser solicitado à Unidade de Preparo de Material (UPM)

pelo preenchimento do formulário “FOR/LACQSA/BH/025 - Solicitação de material ao preparo”.

Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como

das soluções padrão, incluindo “vials” novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada em ácido sulfúrico

2M.

A especificação detalhada dos materiais, reagentes e solventes necessários para realização dos procedimentos

descritos neste MET, em particular os Materiais críticos (MC), encontram-se na planilha PLN/DLAB/PL/007 -

Lista de Materiais de Consumo por Método de Ensaio/Procedimento Operacional Padrão/Instrução de

Serviço/Instrução de Preparo/Instrumento de Medição/Plano de Estudo.

Nota 1: As vidrarias descritas na PLN/DLAB/PL/007 acima referenciada apresentam especificações completas compatível com a vidraria desejável e em processo de aquisição. Por uma questão de disponibilidade e adequação, enquanto não se adquire o material desejado, as análises serão realizadas com as vidrarias disponíveis.

3.1 Vidrarias em geral

conjunto (aparato) para filtração a vácuo com reservatório e base do funil com filtro poroso para

membrana filtrante de 47 mm de diâmetro, com rolha para conexão ao kitasato.








balões volumétricos âmbar ou provetas graduadas de 100 mL.

béqueres de 50, 100 e 600 mL ou equivalentes.

frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1,5 mL com tampa snap-cap, tipo Alltech ou

equivalente.

frascos apropriados para utilização no Aspec (compatível com o rack a ser utilizado).

kitasatos de 500 e 1000 mL.

membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, tipo Whatman GF/B, 1 µm ou equivalente (MC).

provetas graduadas de 10 mL com tolerância de ± 0,1 mL.

provetas graduadas de 250 mL, com tolerância de ± 2 mL.

pipetas de Pasteur.

pipetas graduadas ou volumétrica com capacidade de medição de 10 mL – podem ser substituídas por

micropipetas com mesma capacidade de medição.

seringas de polipropileno de 50 mL, tipo luer ou equivalente.

seringas de vidro de 10 mL, tipo luer ou equivalente.

tubo de centrífuga em polipropileno, capacidade de 50 mL, fundo cônico, com tampa de rosca.

tubos de ensaio de 5-15 mL ou tubo de vidro, 5 mL, 12 x 75mm, específica para Aspec, com respectiva

tampa.

3.2 Colunas e unidades filtrantes

colunas de imunoafinidade tipo Ochratest ou equivalente (MC).

Nota 2: O armazenamento das colunas de imunoafinidade devem atender às condições estabelecidas pela empresa fornecedora: Colunas VICAM – temperatura ambiente, inferior a 30°C e para colunas R-Biopharm – temperatura entre 2 e 8 °C.








membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, 1 µm, tipo Whatman GF/B ou equivalente (MC).

membrana filtrante HA em éster de celulose, de 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa, para

filtração de água.

membrana filtrante de poliamida; Porosidade: 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa para

filtração de solventes orgânicos.

3.3 Padrões e materiais de referência

materiais de referência certificados e padrão analítico de ocratoxina A (MC).

3.4 Materiais de suporte

adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 mL, tipo Bond – elut, Varian ou equivalente.

barra magnética.

barrilhete de polipropileno, capacidade de 5 litros.

bastão, em vidro borossilicato.

bulbos conta-gotas.

cuba para recolher materiais limpos e utilizados.

dispensete (dispensador).

espátulas.

fita parafinada.

gás hélio, 5.0 analítico.

gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco.

garra com 3 hastes.








garra para conexão das partes do aparato de filtração.

grades para tubos.

hélice de aço inoxidável.

papel toalha ou guardanapo.

parafilme.

pêra de borracha ou pipetador automático ou equivalente.

pinça dupla.

papel alumínio.

pissetas.

ponteiras para micropipetas automáticas para as faixas de volumes de 20 a 100, 50 a 250, 100 a 1000 e

200 a 1000, 500 a 5000, 500 a 2500 e 1000 a 10000 µL.

torneiras de polipropileno ou teflon, tipo bond-elut, Varian ou equivalente.

3.5 Material para quantificação por CLAE

coluna de C18, 250 x 4,6 mm, partículas de 5 µm que apresente perfil característico para o sinal de

ocratoxina A e que atenda ao perfil cromatográfico previsto neste MET (MC).

frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 1,8 mL (compatível com o rack do

cromatógrafo), com tampa snap-cap, tipo Alltech ou septo.

pré-coluna de C18 com partículas de 5 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC).

3.6 Reagentes, solventes e soluções

Os reagentes, solventes e materiais devem ser avaliados e validados segundo a IS/LACQSA/BH/002 “Preparo e

controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)” que deverá estar de acordo com os critérios de








aceitabilidade do MET, conforme Tabela 1. Avaliar também a existência de interferentes. A avaliação feita deve

ser registrada no Formulário FOR/LACQSA/BH/005 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises

de micotoxinas”.

As quantidades das soluções necessárias para as análises deverão ser verificadas. Preparar as soluções,

seguindo os procedimentos descritos neste MET.

3.6.1 Reagentes e solventes

acetonitrila grau p.a.r. ou HPLC (MC).

ácido acético – 99% grau HPLC ou p.a.r.

água tipo I é recomendada. Em caso da não disponibilidade de água tipo I usar tipo II ou água

deionizada, filtrada em membrana de 0,45 m.

bicarbonato de sódio grau p.a.

cloreto de potássio grau p.a.

cloreto de sódio grau p.a.

dihidrogênio fosfato de potássio grau p.a.

hidrogênio fosfato disódio anidro grau p.a.

metanol grau HPLC ou p.a.r. (MC).

metanol grau p.a.

fita medidora de pH.

polyetilenoglicol (PEG) M: 8000 ou 6000.

tolueno p.a.r. ou HPLC.

3.6.2 Soluções

1% de PEG e 5% de bicarbonato de sódio – Solução de diluição.








2,5% NaCl + 0,5% bicarbonato de sódio – Solução de lavagem.

água deionizada:ácido acético (29:1, v/v), filtrada em membrana de 0,45 m.

solução tampão PBS.

soluções padrão trabalho de OTA em tolueno:ácido acético (99:1, v/v) (MC).

tolueno:ácido acético (99:1, v/v).

3.6.3 Reagentes e soluções para cromatografia líquida metanol:acetonitrila:água:ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v).

BF3 14% em metanol anidro.

soluções para curva de calibração de OTA em metanol:acetonitrila:água deionizada:ácido acético

(35:35:29:1, v/v/v/v).

4.0 Equipamentos

Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT),

no plano de equipamentos anual, na DS/LACQSA/BH/003 “Requisitos para calibração, qualificação e verificação

de equipamentos” e no POP/LACQSA/BH/002 “Controle de equipamentos”, considerando a adequação dos

instrumentos aos requisitos e especificações necessárias a adequada execução deste MET.

Verificar o desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise. Para

micropipetas, balanças, banho de agitação, processador automático de amostras – Aspec, proceder à

verificação diária e registrar nos devidos formulários e planilhas (para a verificação do Aspec utilizar o

FOR/LACQSA/BH/143 “Verificação diária do Aspec”).

4.1 Equipamentos críticos

balança de 2 casas decimais, com resolução 0,01g, calibrada.

balança de 4 casas decimais, com resolução 0,0001g, calibrada.








cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de fluorescência.

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com

menor divisão de escala de 2 µL.

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de

escala de 2 µL.

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a

100µL com menor divisão de escala de 0,2 µL.

micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de

escala de 2 µL.

processador automático de amostras – Aspec, com capacidade de medição de volumes de 100 µL a 10

mL e que apresente variações máxima de 1% nas medições realizadas.

sistema de purificação com controle individual de vácuo, com capacidade de manter um fluxo de

2mL/min.

termômetro ou termopar calibrados.

4.2 Equipamentos de suporte

agitador de tubos.

aparelho de ultrassom.

banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 40°C ±10%.

capelas de exaustão.

cronômetro temporizador digital.

freezer – capacidade de atingir temperaturas ≤ -15°C.

geladeira – capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 °C.








homogeneizador de amostras com capacidade de atingir 800 rpm.

sistema de filtração a vácuo.

5.0 Precauções analíticas

Ocratoxina A é uma substância considerada como um potente agente nefrotóxico e carcinogênico. Seus padrões

sólidos e suas respectivas soluções devem ser manipulados como substâncias tóxicas. Os padrões sólidos

devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua natureza eletrostática e à sua tendência de se

dispersar no ambiente. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções

particulares como o uso de equipamentos de proteção individual, evitando qualquer contato de padrões e

soluções com a pele e/ou olhos. Em caso de contato com a pele, lavar imediatamente com solução de

hipoclorito de sódio 1%, lavar com sabão e água em abundância e procurar a assistência médica.

Utilizar vidraria limpa, livres de detergente e resíduos. Ao final da análise, o material utilizado deverá ser

descontaminado, conforme IP/LACQSA/BH/001 - Descontaminação e preparo de material”.

Em caso de se derramar solução de micotoxina, extrato das amostras e/ou controles, na bancada,

descontaminar o local com solução de hipoclorito de sódio 1%, deixar em contato por 10 minutos e então

adicionar solução a 5% de acetona.

Resíduos de soluções padrão a serem descartados devem ser descontaminados com solução de hipoclorito de

sódio a 1%. Após contato de 2 horas, adicionar quantidade de acetona correspondente a 5% do volume. Após

contato de 30 minutos, enxaguar completamente em água corrente e deionizada.

A manipulação de solventes e/ou reagentes utilizados nas análises deve ser realizada com cuidado,

considerando a natureza de cada um (SHOEMAKER, 1998):

Acetonitrila – líquido tóxico. Evitar contato com a pele e os olhos. Manuseá-lo sob exaustão.

Metanol – líquido inflamável e tóxico. Evitar contato com os olhos. Evitar respirar vapores deste reagente.

Manuseá-lo sob exaustão. Pode reagir “vigorosamente” com:

a mistura de hidróxido de sódio (NaOH) e clorofórmio (CHCl3);








a mistura de hidróxido de potássio (KOH) e clorofórmio (CHCl3) ou ácido perclórico (HClO4).

Ácido acético – reage explosivamente com óxido de cromo III e outros oxidantes fortes. Usar luvas de borracha

grossas e máscara facial quando manusear este reagente. Manuseá-lo sob exaustão.

Ácido sulfúrico - sempre adicionar ácido à água. Usar luvas grossas e protetor facial. Não o misture com ácido

clorídrico. Manuseá-lo sob exaustão.

6.0 Procedimentos

O analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de

qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009 “Garantia da qualidade analítica”, em acordo com

o Responsável.

As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024 “Comunicado de

recebimento e solicitação de amostras”. Estas serão entregues acompanhadas dos respectivos formulários de

acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012 “Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas”.

O FOR/LACQSA/BH/010 “Acompanhamento de análises de micotoxinas” deverá ser preenchido com os dados

pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser

rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de

folhas e número da folha.

Utilizar, preferencialmente, equipamentos e materiais listados neste MET, sendo que outros podem ser utilizados

desde que sua aplicabilidade tenha sido comprovada e o seu uso devidamente registrado nos formulários de

análise. Na medição de massas, volumes finais de extratos de amostras, soluções padrão ou qualquer medida

que impacte significativamente a incerteza de medição deve ser usados vidrarias e equipamentos de medições

calibradas. Devem ser utilizados equipamentos cujos valores das resoluções estejam de acordo com a

especificação.

A vidraria e o material utilizados nas análises deverão ser identificados, na medida do possível, evitando a troca

de frascos de reagentes e amostras.

Ao final da análise:








Os resíduos de análise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados, devidamente

identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme POP/LACQSA/BH/004

“Gerenciamento de Resíduos no laboratório”.

Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais pequenos e

ou frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as

soluções e materiais utilizados na análise.

Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003 -

Ambiente e Segurança”.

6.1 Preparo de soluções

Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as

necessidades das análises respeitando as devidas proporções

As soluções utilizadas como fases móveis utilizadas nos cromatógrafos podem ter as proporções preparadas

utilizando as bombas ou linhas dos equipamentos.

Antes de serem transferidas para os cromatógrafos as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom

por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções.

Etiquetar as soluções preparadas utilizando rótulo próprio, preenchendo adequadamente os campos com os

dados do solvente/solução, data do preparo, nome do analista, validade e lote, conforme validado no

FOR/LACQSA/BH/005 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas”.

Solução 1% de PEG e 5% de bicarbonato de sódio – Solução de diluição.

Pesar 10 g de PEG (8000 - preferencial ou 6000) e 50 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3). Dissolver em

1000mL de água e homogeneizar. Verificar o pH 8,3.

2,5% NaCl + 0,5% bicarbonato de sódio – Solução de lavagem.

Pesar 25 g de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3). Dissolver em 950 mL de água e

completar o volume em um balão de 1000mL e homogeneizar. Verificar o pH 8,1.








Água deionizada:ácido acético (29:1, v/v)

- adicionar 10 mL ácido acético à 290 mL de água deionizada, homogeneizar e filtrar em membrana de 0,45 m.

Solução tampão PBS

- dissolver individualmente 0,20 g de dihidrogênio fosfato de potássio; 1,20 g de hidrogênio fosfato de disódio

anidro; 8,0 g de cloreto de sódio e 0,2 g de cloreto de potássio em água deionizada e transferir para um balão

volumétrico de 1000 mL, completar o volume e homogeneizar.

Metanol:acetonitrila:água:ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v) – fase móvel

- adicionar 300 mL da solução água:ácido acético (29:1, v/v) à mistura de 350 mL de metanol grau HPLC e 350

mL de acetonitrila grau HPLC e homogeneizar.

Tolueno: ácido acético (99:1, v/v) – solvente de preparo da solução padrão de trabalho

- adicionar 1 mL de ácido acético a 99 mL de tolueno e homogeneizar.

As soluções deverão ser descartadas quando observadas alterações indicativas de deterioração (como turbidez,

separação de fases, alteração de cor, etc.) ou estiverem com o prazo de validade vencido, desde que

comprovado estar impróprio para uso.

6.1.1 Preparo da solução padrão de ocratoxina A

As soluções padrão de OTA (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme procedimentos

descritos no IP/LACQSA/BH/003 “Preparo e padronização de soluções padrão de micotoxinas”.

Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013 – “Preparo de

Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas” a qual deve ser impressa para que registros e informações,

referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados.·

Após preenchimento arquivar juntamente com o formulário FOR/LACQSA/BH/010 “Acompanhamento de

análises de micotoxinas”.

Utilizar frascos tratados com ácido sulfúrico ou silanizados de volume adequado para preparo das soluções

padrão. Os frascos devem ser âmbar ou devem ser protegidos contra a luz fluorescente e solar. Após o preparo,








a solução trabalho deve ser selada com parafilme e armazenada em freezer a Temperatura < - 15°C. Durante a

manipulação das soluções padrões:

- retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, colocá-los em suportes adequados e em

ambiente protegidos da luz;

- homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada;

- ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a

guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada;

- após retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para

armazenamento no freezer.

Nota 3: Observar a temperatura de recomendação de armazenamento de padrão fornecido pelo fabricante no certificado do padrão.

6.1.2 Solução Padrão para a curva de calibração – CLAE

A partir da solução trabalho de aproximadamente (0,5 a 1 µg/mL), preparar uma curva padrão de calibração de

OTA em metanol:acetonitrila:água:ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v) com no mínimo cinco concentrações

diferentes aproximadamente iguais àquelas apresentadas na Tabela 2.

- Pipetar utilizando micropipeta um volume conhecido da solução trabalho e transferir para um frasco apropriado

para o preparo da primeira solução (P1) da curva de calibração;

- Evaporar o padrão sob fluxo de N2 ou ar comprimido seco, cuidando para que o solvente não seque

completamente;

- Retomar o extrato com a fase móvel metanol:acetonitrila:água:ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v) com agitação

por aproximadamente 5 minutos em agitador de tubos, seguido de um minuto no ultra-som.

Os demais padrões da curva de calibração serão preparados pela diluição do primeiro, conforme Tabela 2, após

aprovação de P1.

6.1.2.1 Aprovação da primeira solução (P1) da curva de calibração








Definição de P1 – Padrão de maior concentração da curva de calibração utilizado para preparar, por diluição, as

demais soluções da curva de calibração conforme volumes e concentrações da Tabela 2.

Antes de avaliar P1 proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais (system suitability).

Estabilizar o equipamento com a fase móvel prevista no procedimento e avaliar pressão, estabilidade da linha de

base, tempo de retenção, resolução e repetitividade pela injeção em triplicata de 01 ponto da ultima curva de

calibração dentro da validade. Caso não haja disponibilidade de curva de calibração anterior, usar o próprio P1.

Esta avaliação pode ser realizada visualmente a partir da comparação de cromatogramas e de dados fornecidos

pelo software.

Após a avaliação das condições instrumentais avaliar P1 conforme IT/LACQSA/BH/001.

Nota 4 : Verificar o solvente do frasco de lavagem do auto injetor que deve ser preferencialmente a fase móvel ou solvente de composição e polaridade similar.

Após o preparo do nível de maior concentração da curva de calibração proceder conforme IT/LACQSA/BH/001.

Em caso de resultados não previstos no processo de aprovação da curva de calibração: Caso as áreas das duas soluções padrão de P1 dêem estatisticamente diferentes conferir os cálculos, a

integração dos picos e possíveis falhas durante a injeção das soluções, caso nenhuma anomalia seja

identificada, preparar outra solução padrão e re-injetar.

Verificar o histórico do equipamento para avaliar possíveis intervenções de manutenção que possam ter

alterado o desempenho do equipamento.

Se a diferença persistir, injetar o padrão em outro equipamento, para verificar se o problema é oriundo do

equipamento (coluna e pré coluna, bolha, sensibilidade (lâmpada). O laboratório aceitará (assumirá) o novo

valor de área desde que esse não comprometa os resultados obtidos e os demais critérios de aceitação

para curva.

Em caso de decaimento de área devido à perda de sensibilidade, a causa do decaimento deverá ser avaliado.

Os novos valores deverão ser avaliados, juntamente com a Responsável do laboratório, ou o analista

responsável pelo processo, principalmente no valor correspondente ao LQ.

Caso haja aumento de sensibilidade, injetar em triplicata, nas mesmas condições cromatográficas, o P1 da atual

curva a aprovar e o da curva de calibração anteriormente aprovada. Caso as áreas das duas soluções de P1








sejam estatisticamente iguais proceder a diluição do mesmo para preparo das demais soluções da curva de

calibração, conforme Tabela 2.

Injetar as soluções preparadas, em triplicata ou duplicata para aprovação dos demais parâmetros da curva.

Caso as áreas continuem diferentes, preparar e avaliar a curva verificando os outros parâmetros conforme

6.1.2.2. Caso os resultados para a curva estejam conforme com os requisitos, aprovar a curva, registrar a

ocorrência no FOR/LACQSA/BH/071 – “Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC)”.

Nota 5: Caso a alteração da sensibilidade afete os resultados, comunicar ao Responsável para devidas providências em relação à solicitação da manutenção corretiva do equipamento.

Nota 6: Usar frascos de padrão de volume apropriado para garantir o armazenamento adequado dos padrões.

Tabela 2: Faixas de concentrações aproximadas para o preparo da curva de calibração de OTA-CLAE,

considerando os processos de purificação MANUAL e por ASPEC.

Identificação da Solução Padrão

Concentração da solução preparada (µg/mL)

Concentração (µg/L) na amostra considerando 5 mL de amostra passado pela coluna e retomado com 1000 µL

P1 0.025 5.00

P2 0.017 3.40P3 0.0085 1.70P4 0.005 1.00P5 0.0035 0.70P6 0.002 0.40P7 0.0015 0.30P8 0.001 0.20P9 0.0005 0.10

Nota 7: a faixa de contaminação de OTA apresentada na Tabela 2 é atendida se as amostras foram processadas exatamente como descrito no Fluxograma 1.

As concentrações apresentadas na Tabela 2 devem ser utilizadas como orientação para o preparo das soluções

padrão da curva de calibração, sendo que na prática variações ocorrerão.

6.1.2.2 Critério para aceitabilidade e aprovação da curva de calibração – procedimento para o dia do preparo das soluções da curva de calibração








Após a aprovação da solução padrão que dá origem ao preparo de todas as soluções da curva de calibração

(P1), proceder ao preparo das demais soluções da curva de calibração. Fazer a injeção em triplicata ou

duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a

IT/LACQSA/BH/001. Esta avaliação deve ser realizada no mesmo dia de aprovação de P1.

Resíduo: o valor residual não poderá exceder o valor de 15%, principalmente para o ponto padrão

correspondente ou próximo ao LQ (Limite de Quantificação).

Coeficiente de linearidade (CL): O coeficiente de linearidade deverá ser igual ou superior a 95%

Avaliação do coeficiente de linearidade (CL): O coeficiente de linearidade deverá ser igual ou superior a

95%. O valor será calculado pela equação a seguir:

Equação 11001

bs

CL b

Esse parâmetro avaliará a inclinação e seu respectivo desvio.

Linearidade: a faixa de trabalho da curva de calibração deverá ser linear.

Observar se todos os campos das planilhas estão preenchidos corretamente e se todos os critérios estão

aprovados. Imprimir a planilha com os resultados da avaliação da curva e anexar aos registros do preparo da

curva de calibração.

A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de 01 mês para uso nas análises da

rotina. Se no período de 1 mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão TP deve-se preparar

também uma nova curva de calibração.

Nota 8: Usar frascos de padrão de volume apropriado para garantir o armazenamento adequado dos padrões.

Caso algum critério de aceitabilidade da curva não seja atendido proceder conforme 6.1.2.1.

6.1.2.3 Critério para aceitabilidade e aprovação e da curva de calibração (rotina analítica)

Antes da injeção da curva de calibração proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais

(system suitability). Estabilizar o equipamento com a fase móvel prevista no procedimento e avaliar pressão,








estabilidade da linha de base, tempo de retenção, resolução e repetitividade pela injeção em triplicata de 01 da

curva de calibração aprovada anteriormente. Esta avaliação pode ser realizada visualmente a partir da

comparação de cromatogramas e de dados fornecidos pelo software.

Após a avaliação das condições instrumentais, proceder à injeção da curva de calibração conforme

IT/LACQSA/BH/001. Nesta etapa, a curva de calibração pode ser injetada aleatoriamente em duplicata ou

triplicata com os extratos das amostras sem previa aprovação desde que os resultados da avaliação das

condições instrumentais estejam adequados.

Durante as análises de rotina a curva de calibração cujo preparo foi anteriormente aprovado deve ser avaliada

conforme a IT/LACQSA/BH/001 sob os mesmos critérios estabelecidos em 6.1.2.2 à exceção da aprovação de

P1.

6.2 Determinação da ocratoxina A

As etapas para a análise de OTA estão descritas de forma resumida no Fluxograma 1.

6.2.1 Diluição da amostra

Agitar cuidadosamente o frasco da amostra para garantir a sua homogeneidade.

Retirar uma alíquota de exatamente 10 mL da amostra e diluir com 10 mL da solução 1% de PEG: 5% de

bicarbonato de sódio e agitar vigorosamente.

Se após diluição a amostra apresentar turbidez ou partículas suspensas filtrar utilizando papel de filtro GF/A ou

equivalente.

6.2.2 Purificação

6.2.2.1 utilizando coluna de imunoafinidade – processo manual

Adaptar um reservatório à coluna de imunoafinidade e na seqüência fixá-la ao sistema de vácuo (vac-

elut ou licrolut) tomando cuidado para evitar o vazamento da solução existente na coluna e subseqüente

secagem da coluna.

Quantitativamente, transferir uma alíquota de 10 mL da amostra diluída para o reservatório acoplado à coluna

de imunoafinidade - etapa crítica.








Passar o filtrado pela coluna, mantendo um fluxo regular de 1 gota/segundo (~2 mL\min) utilizando gravidade

ou um sistema de vácuo para controlar o fluxo. Evitar que a coluna seque durante essa etapa - etapa crítica.

Lavar a coluna com 10 mL da solução 2,5% NaCl + 0.5% bicarbonato de sódio, mantendo o fluxo, sem deixar

a coluna secar - etapa crítica.

Lavar a coluna com 10 mL de água deionizada mantendo o fluxo regular de 1-2 gotas/segundo. Passar ar

pela coluna para garantir que esta se seque completamente.

Adicionar 3 mL de metanol HPLC à coluna de imunoafinidade, aguardar 3min e fazer a eluição da OTA

mantendo o fluxo de 1 gota/segundo.

Coletar o eluato em frasco apropriado, podendo ser utilizado um tubo cônico.

6.2.2.2 Processo utilizando o processador automático de amostras – ASPEC XL

Retirar volume conhecido de aproximadamente 15 mL da amostra diluída e colocar em frascos apropriados

do ASPEC - recomendado o uso do Rack 33.

Programar o ASPEC para processamento das etapas:

- purificação do extrato diluído da amostra utilizando coluna de imunoafinidade e fluxo de 2 mL\min,

- lavagem da coluna com 10 mL da solução 2,5% NaCl + 5% bicarbonato de sódio e com 10 mL de água

deionizada mantendo o fluxo, sem deixar a coluna secar - etapa crítica.;

-passagem de ar pela coluna e eluição da ocratoxina A com 3 mL de metanol HPLC coletando o em

frasco apropriado.

6.2.3 Evaporação

Evaporar o eluato à temperatura máxima de 50 oC (ver nota 9), sob fluxo de nitrogênio ou ar comprimido seco

- etapa crítica.

Nota 9: Cuidados devem ser tomados para evitar evaporação do extrato até a secura, para garantir uma re-suspensão eficiente do resíduo no solvente de retomada.








Nota 10: os frascos onde serão acondicionados os extratos de amostras devem ser âmbar ou estarem protegidos da luz e devidamente identificados com etiqueta da cor correspondente à micotoxina em questão (amarelo para OTA), com as letras “EP”, seguidas da abreviação da toxina analisada (OTA), do código da amostra, data de início da análise e do nome do analista. Na ausência da etiqueta da cor amarela pode-se utilizar etiqueta da cor branca.

6.2.4 Separação, detecção e quantificação

6.2.4.1 Quantificação utilizando CLAE

Adicionar ao resíduo obtido após evaporação, 1000µL da fase móvel e homogeneizar vigorosamente por 1

minuto em agitador de tubos. Se necessário sonicar por 3 minutos - etapa crítica;

Transferir o extrato purificado para frascos apropriados, observando o tipo de amostrador/rack do

cromatógrafo a ser utilizado.

Injetar 50 µL do extrato da amostra e das soluções padrões da curva de calibração no cromatógrafo líquido

de alta eficiência utilizando, considerando os parâmetros:

- modo fluorescência, ex=332 nm e em=476 nm,

- fase móvel – acetonitrila:metanol:água:ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v)

- fluxo de 0,8 mL/min,

- coluna C18, 25 cm de comprimento com partículas de 5 µm e 4,6 µm de diâmetro interno,

- pré coluna de C18, compatível com a coluna.

- loop de 50µL com volume de injeção de 50µL;

- armazenar os extratos brutos e os purificados, em freezer;

- integrar o sinal cromatográfico presente nas amostras e padrões (tempo de retenção aproximadamente de 10

minutos).

- caso a área determinada para a amostra não esteja inserida na curva, diluir quantitativamente o extrato e

reinjetar.

6.2.4.2 Procedimentos para uso de colunas cromatográficas

Ao abrir uma nova coluna para utilização nos cromatógrafos líquidos o Técnico deve:








a) proceder conforme especificações do fabricante para instalação, utilização e lavagem da coluna;

b) preencher a FOR/LACQSA/BH/ 054 – “Controle de colunas cromatográficas- CLAE” com todas as

características de identificação da coluna em questão (tipo de coluna: marca, lote, número, comprimento,

diâmetro interno e tamanho da partícula);

c) arquivar a ficha operacional na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada;

A instalação da coluna deve ser feita utilizando um fluxo de 0,2 mL/min da fase móvel. Para evitar a entrada de

bolhas de ar nos detectores, inicialmente conecta-se somente a entrada da coluna e deixa passando um fluxo de

0,2 mL/min. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao cessar a saída das bolhas e que a

coluna pode ser conectada ao detector.

A FOR/ LACQSA/BH/ 054 deve ser utilizada para registro diário das informações referentes ao uso da coluna

com preenchimentos de todos os campos. O campo de observações pode ser utilizado para registro de

informações referentes ao desempenho da coluna em relação à simetria de picos e pressão.

Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C18), usar pré colunas de C18. Ao

término das análises lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila. Quando

se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão avaliar a

possibilidade da troca inicial da pré coluna. Senão avaliar outros parâmetros cromatográficos. Caso necessário

trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observado levando-se em consideração os

parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos, tempo de retenção devem ser periodicamente

observados.

Importante: Proceder a avaliação da adequação e manutenção das condições cromatográficas após a troca da

coluna, antes da injeção da curva de calibração e amostras conforme item 6.2.4.2.

6.2.5 Confirmação

6.2.5.1 Confirmação para análise por CLAE








Evaporar 300 µL de uma ou mais solução de calibração e evaporar o extrato da amostra que se deseja

confirmar, adicionar 300 µL de solução metanólica de BF3 (14%) e injetar no CLAE. Haverá aumento no tempo

de retenção da OTA, aproximadamente 17 min.

As fases móveis acetonitrila:água:ácido acético (96:2:2 v/v/v) e 55% acetonitrila:45% acetato de sódio

4mM:ácido acético (19:1 v/v) podem ser utilizadas na etapa de separação, detecção e quantificação por CLAE,

nas mesmas condições acima descritas, com os tempos de retenção de OTA de aproximadamente 15 e 18

minutos, respectivamente.

Fluxograma 1. Metodologia para análise de OTA.








7.0 Resultados

7.1 Cálculos

Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg\L.

Os cálculos da contaminação de OTA nas amostras analisadas deverão ser realizados utilizando a planilha

PLN/LACQSA/BH/060- v.1 – “Resultado de ocratoxina A em Vinho e Suco de Uva por CLAE- Incerteza” a qual

considerou a equação 2:

RIRD

stASPECSADFA

RSDAOTA CFCFC

VVVbVVVaAPCALµgC

Re

)(/ Equação 2

Em que:

ACPA é a área cromatográfica do pico da amostra;

a é o intercepto da curva de calibração (µg/mL);

b é a inclinação da curva de calibração (µg/mL);

VA é o volume da amostra usado para determinação de OTA (mL);

VSD é o volume de solução de PEG/NAHCO3 usado para diluir a amostra (µL);

VSAD = VA + VSD é o volume total da solução da amostra diluída (mL);

VR é o volume usado para retomar o extrato evaporado (µL);

VSADF é o volume da solução da amostra diluída e filtrada levada para ASPEC (mL);

VRestASPEC é o volume restante do ASPEC (mL);

VAC é o volume da amostra “pura” passada pela coluna (mL).

Alterações nos procedimentos descritos neste POP poderão ser efetuadas, desde que não comprometam o

resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas na ficha de acompanhamento de

análise.








7.2 Reportagem de resultados

Os resultados da análise da rotina devem ser emitidos com duas casas decimais corrigidos pela recuperação.

Considerar como NQ (não quantificável) resultados inferiores ao limite de quantificação do método. Conforme

apresentado na Tabela 1 – Parâmetros de desempenho do método”.

Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente

contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência nas planilhas PLN/LACQSA/BH/014 -

Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadas e PLN/LACQSA/BH/015 “Carta de controle - amostras

fortificadas.

Em caso de amostras cegas, preencher a ficha operacional FOR/LACQSA/BH/032- “Controle intralaboratorial -

Análise de amostras cegas” e remetê-la ao responsável.

Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle

intralaboratorial atenderem aos critérios estabelecidos como aceitáveis conforme POP/LACQSA/BH/009

“Garantia da qualidade analítica” e Tabela 1: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de

validação.

Após liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no

FOR/LACQSA/BH/012 “Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas” que deverá ter todos os campos

não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhadas à URPA.

Amostra que apresentar resultado maior que o limite da legislação (considerando o destino da amostra) deve ser

re-analisada para confirmação. Caso os resultados dêem diferentes (considerando a incerteza) repetir a análise

e avaliar o processo do preparo da amostra.

8.0 Responsabilidades

As Atribuições e Responsabilidades estão definidas na DS/LACQSA/BH/005 – Descrição de Função e na

DS/LACQSA/BH/001 – Atribuições e Responsabilidades.








9.0 Referências

CEE 401/2006. Regulamento (CE) 401/2006 da Comissão de 23.02.2006. Jornal Oficial da União Européia, L70, pp 12-34, 09.03.2006.

IARC (1993) IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, v. 56, Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, Lyon, pp. 145-156.

SHOEMAKER, D. and TORCHIA, M. Appendix B: Laboratory Safety, AOAC, CD-Rom, 1998.

AOAC International, 2000. Natural Toxins. Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th ed (Gaithersburg, MD: AOAC International), Chapter 49, pp. 1-64.

ISO/IEC 17025:2005. Requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração. Setembro, 2005.

[ANVISA-2011] RESOLUÇÃO RDC N° 07 de 18-02-11 Limites Micotoxinas Alimentos.

[MAPA-2012] - Manual de Garantia da Qualidade Analítica – Resíduos e Contaminantes em Produtos de Origem Animal e Vegetal - Brasília - 2012 - Ministério da Agricultura, Pecuária e abastecimento.

[INMETRO-2007]. Orientações sobre validação de métodos de ensaios químicos. DOQ-CGCRE-008, revisão 02, junho/2007.

MET/LACQSA/BH/005 “Determinação de ocratoxina A (OTA) por Cromatografia Liquida de alta eficiência e

camada delgada”

SANTOS, E. A. and VARGAS, E. A., 2002. Immunoaffinity column clean-up and thin layer chromatography for determination of ochratoxin A in green coffee. Food Additives and Contaminats, v.19, n.5, 447-458.

VARGAS, E. A., SANTOS, E. A., PITTET, A. Determination of ochratoxin A in green coffee by immunoaffinity column clenup and liquid chromatography: collaborative study. Journal of AOAC International. , v.88, 2005.

WHO FOOD ADDITIVES SERIES 47. 2001- Safety evaluation of certain mycotoxins in food. IPCS International Programme on Chemical Safety – World Health Organization – Geneve. FAO Food and Nutrition, paper 74.

10.0 Documentos referenciadosIP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de materialIP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinasIS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)IT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análise








POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentosPOP/LACQSA/BH/003-Ambiente e SegurançaPOP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratórioPOP/LACQSA/BH/009-Garantia da qualidade analítica

11.0 Anexos referenciadosDS/LACQSA/BH/001-Atribuições e responsabilidadesDS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentosDS/LACQSA/BH/005-Descrição de FunçãoFOR/LACQSA/BH/005-Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/021-Solicitação de material de consumoFOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostrasFOR/LACQSA/BH/025-Soliciação de material ao preparoFOR/LACQSA/BH/032-Controle Intralaboratorial - Análise de amostras cegas para micotoxinasFOR/LACQSA/BH/054-Controle de colunas cromatográficas - CLAEFOR/LACQSA/BH/071-Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC)FOR/LACQSA/BH/143-Verificação diária do ASPECPLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de MicotoxinasPLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadasPLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadasPLN/LACQSA/BH/060-Resultado analítico ocratoxina A em vinho e suco de uva CLAE - Incerteza de medição

12.0 Informações de registroAcompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010)Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061)Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015)Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014)Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024)Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054)Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/005)Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC) (FOR/LACQSA/BH/071)Controle Intralaboratorial - Análise de amostras cegas para micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/032)DS/LACQSA/BH/001DS/LACQSA/BH/003DS/LACQSA/BH/005Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013)Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012)Resultado analítico ocratoxina A em vinho e suco de uva CLAE - Incerteza de medição (PLN/LACQSA/BH/060)








Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025)Solicitação de material de consumo (FOR/LACQSA/BH/021)Verificação diária do ASPEC (FOR/LACQSA/BH/143)

13.0 Arquivos anexadosNão aplicável

14.0 Controle de alterações

Este MET teve origem no POP 111 conforme sistema de gestão da qualidade do LACQSA/BH em vigor na época e histórico a seguir:

Revisão Data Responsável Descrição

00 10.10.2012 Eliene A. Santos

Eugênia A Vargas

Elaboração do POP

Controle de alterações do MET/LACQSA/BH/009Versão Data Responsável Descrição

01 20/03/2014 Ana Cristina A.C.

- Documento inserido no sistema Docnix, módulo Maxdoc.


ministério da agricultura, pecuária e abastecimento - mapa ... · controle de qualidade e...

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