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JANAÍNA SIQUEIRA BORDA

MAPEAMENTO DAS PROJEÇÕES RETINIANAS PARA O SISTEMA

ÓPTICO ACESSÓRIO, COLÍCULO SUPERIOR E COMPLEXO PRÉ-

TECTAL DO SAGUI (Callithrix jacchus).

Natal-RN

2015

Tese de Doutorado apresentada ao

programa de Pós-graduação em

Psicobiologia da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte

1


MAPEAMENTO DAS PROJEÇÕES RETINIANAS PARA O SISTEMA

ÓPTICO ACESSÓRIO, COLÍCULO SUPERIOR E COMPLEXO PRÉ-

TECTAL DO SAGUI (Callithrix jacchus).

Orientador: Jeferson de Souza Cavalcante

Natal-RN

2015

Tese de Doutorado apresentada ao

programa de Pós-graduação em

Psicobiologia da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte

2

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Borda, Janaína Siqueira.

Mapeamento das projeções retinianas para o sistema óptico acessório, colículo superior e complexo pré-

tectal do sagui (callithrix jacchus). / Janaína Siqueira Borda. – Natal, RN, 2015.

89 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-

Graduação em Psicobiologia.

1. Callithrix jacchus. – Tese. 2. Sistema motor visual. – Tese. 3. Botões sinápticos. – Tese. I. Cavalcante,

Jeferson de Souza. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 599.821

3

TÍTULO

MAPEAMENTO DAS PROJEÇÕES RETINIANAS PARA O SISTEMA ÓPTICO

ACESSÓRIO, COLÍCULO SUPERIOR E COMPLEXO PRÉ-TECTAL DO SAGUI

(Callithrix jachus)

AUTOR


DATA DA DEFESA

26/08/2015

BANDA EXAMINADORA

Profº. Francisco Gilberto de Oliveira

Universidade Regional do Cariri (URCA).

Profº. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN).

Profº. Expedito Siva do Nascimento Júnior

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Profº. Judney Cley Cavalcante

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Profº. Jeferson de Souza Cavalcante

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

4

“Saúde, obrigação e divertimento. Qualquer alteração nessa ordem pode comprometer a nossa

vida.”

(Abbas Hassan El-Aouar)

5

AGRADECIMENTOS

Por nunca ter perdido a minha fé e a Deus que, em sua bondade infinita, deu-me força,

paciência, resignação e compreensão para conseguir passar por momentos turbulentos e ainda

assim conseguir finalizar mais uma etapa de minha vida.

A minha amada mãe, que nunca me deixou desistir, sempre segurando em minha mão,

sonhando junto comigo e sendo a minha fortaleza, e a quem dedico inteiramente esse

trabalho. Obrigada minha mãe por tudo.

Ao meu esposo Jerônymo, por está sempre ao meu lado, pelas idas e vindas ao hospital, por

está ao meu lado nos momentos em que a dor era insuportável. Por, junto com minha mãe,

não ter me deixado desistir. Obrigada por todos os incentivos, apoios e principalmente por

caminhar de mãos dadas comigo.

A Dr. Hylas Ferreira, meu cirurgião torácico que devolveu minha qualidade de vida e sem o

qual eu não conseguiria hoje está terminando esse trabalho. Obrigada por seu

profissionalismo, competência e que por suas mãos outras pessoas possam ser curadas.

Aos que hoje não se encontram ao meu lado fisicamente, mas estarão sempre presentes em

meu coração: minha avó Alzira, meu avô Luís Siqueira, minha tia e madrinha Maria Luisa, ao

meu padrasto Otávio Lima e a minha sogra Cristina Leite. Obrigada a todos pelos

ensinamentos e exemplos de dignidade, amor, honestidade, mostrando-me que a perseverança

é um dom indispensável para a realização de qualquer projeto de vida.

A toda a minha família: irmãos, cunhadas, tios(as), primos(as) pelos incentivos, cuidados e

principalmente pelo grande amor que nos une.

Ao meu amigo e orientador, Jeferson De Souza Cavalcante por todo o incentivo, paciência,

dedicação e principalmente por sua compreensão em todos os momentos em que se foi

necessária.

6

Aos meus amigos-irmãos, André e Rovena, por todas as preocupações, amizade,

solidariedade, ajudas e principalmente por estarem ao meu lado em momentos importantes de

minha vida.

A todos que compõem o LENq e o LabNeuro da UFRN, em especial Kayo, Rodolfo, Eudes,

Felipe, Ruthnaldo, Paulo, Joacil, Gilberto, Miriam, Expedito, Judney e Regina. Cada um de

alguma forma contribuiu para a concretização desse trabalho, seja ajudando com palavras de

incentivo, apoios e principalmente com a ajuda na parte estatística e de utilização de

Software.

A toda a turma de alunos da Pós-graduação em Psicobiologia.

A todos os professores do programa de Pós-graduação em psicobiologia, em especial a Fívia

Lopes e Arrilton Araújo.

A todos os funcionários do Departamento de Morfologia, Fisiologia e Núcleo de

Primatologia da UFRN.

A CAPES, CNPq, REUNI pelo suporte financeiro indispensável.

7

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS 8

ABREVIATURAS 10

RESUMO 12

ABSTRACT 13

1. INTRODUÇÃO 14

1.1 – Sistema motor visual ou motor ocular 16

1.1.1 – Sistema óptico acessório

1.1.2 – Colículo Superior

1.1.3 – Complexo pré-tectal

17

21

22

1.2 – Sagui (Callithrix jachus): o modelo experimental 24

2. JUSTIFICATIVA 27

3. OBJETIVOS 28

3.1 – Objetivo geral

3.2 – Objetivos específicos

28

28

4. METODOLOGIA 29

4.1 – Injeção intraocular da subunidade b da toxina colérica

4.2 – Perfusão transcardiaca

4.3 – Remoção do encéfalo e microtomia

4.4 – Imunoistoquímica

4.5 – Análise dos resultados

4.6 – Medição de área e perímetro celular

29

30

31

31

33

33

5. RESULTADOS 34

5.1 – Sistema óptico acessório

5.2 – Colículo superior

5.3 – Complexo pré-tectal

34

34

35

6. DISCUSSÃO 52

6.1 - Sistema óptico acessório

6.2 – Colículo superior

6.3 – Complexo pré-tectal

54

57

59

7. CONCLUSÃO 64

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS 65

8

9. REFERÊNCIAS 66

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Callithrix jachus

Figura 2: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR nos

núcleos IFSP, NTL e NTM do SOA.

Figura 3: Fotomicrografias de secções do encéfalo do sagui mostrando CTb-IR no

núcleo IFSP e caracterização de seus botões sinápticos.


NTL e caracterização de seus botões sinápticos.

Figura 5: Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões

sinápticos dos núcleos IFSP e NTL do SOA.


CoS e caracterização de seus botões sinápticos,

Figura 7: Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões

sinápticos do CoS.


núcleos NTO, NPO, NPA e NPP do complexo pré-tectal e no NTD do

SOA e caracterização dos botões sinápticos do NTO e NPO.

Figura 9: Caracterização dos botões sinápticos do NTO.

Figura 10: Caracterização dos botões sinápticos do NTO e NPO ipsolateral.

Figura 11: Caracterização dos botões sinápticos do NPP.

Figura 12: Caracterização dos botões sinápticos do NTD do SOA.


núcleos NPO, NTO, NPA, NPP do complexo pré-tectal e NTD do SOA e

caracterização dos botões sinápticos do NTO e NPO.

Figura 14: Caracterização dos botões sinápticos do NPA

10

Figura 15: Caracterização dos botões sinápticos do NTD.

Figura 16: Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos núcleos do

complexo pré-tectal e d NTD do SOA.

Figura 17: Medição da área e perímetro dos botões sinápticos do complexo pré-tectal

e do NTD do SOA. Análise por Kruskal-Wallis e teste Post-hoc.

11

ABREVIATURAS

ABC Complexo avidina-biotina peroxidase

CoS Colículo superior

CTb Subunidade b da toxina colérica

DAB Diaminobenzidina

EW Edinger-Westphal

FIG Folheto intergeniculado

HRP Horseradish peroxidase

IFSP Núcleo intersticial do fascículo superior

IFSPm Núcleo intersticial do fascículo superior, fibras mediais

NPA Núcleo pré-tectal anterior

NPAd Núcleo pré-tectal anterior dorsal

NPAv Núcleo pré-tectal anterior ventral

NPM Núcleo pré-tectal medial

NPO Núcleo pré-tectal olivar

NPP Núcleo pré-tectal posterior

NROB Núcleo da raiz óptica basal

NSQ Núcleo supraquiasmático

NTD Núcleo terminal dorsal

NTL Núcleo terminal lateral

NTM Núcleo terminal medial

NTMd Núcleo terminal medial dorsal

NTMv Núcleo terminal medial ventral

NTO Núcleo do trato óptico

12

PLi Núcleo limitante posterior

ROB Raiz óptica basal

SOA Sistema óptico acessório

TRH Trato retinohipotalâmico

WGA-HRP HRP conjugado com aglutinina de germe de trigo

13

RESUMO

O sistema óptico acessório, o Complexo pré-tectal, e o colículo superior são

importantes centros de controle de uma variedade de movimentos oculares, sendo

extremamente necessários para a formação de imagem, consequentemente para a percepção

visual. O sistema óptico acessório é constituído pelos núcleos: núcleo terminal dorsal, núcleo

terminal lateral, núcleo terminal medial e núcleo intersticial do fascículo superior posterior.

Do ponto de vista funcional eles contribuem para a estabilização da imagem, participando da

atividade visuomotora onde todas as células do sistema respondem a movimentos lentos dos

olhos e a estímulos visuais, o que é importante para o próprio funcionamento dos outros

sistemas visuais. O complexo pré-tectal compreende um conjunto de núcleos situados na

transição mesodiencefálica, são eles: núcleo pré-tectal anterior, núcleo pré-tectal posterior,

núcleo pré-tectal medial, núcleo pré-tectal olivar e o núcleo do trato óptico, sendo todos

recipientes de projeção retiniana e funcionalmente estão relacionados com a via do reflexo

pupilar a luz e o nistagmo optocinético. O colículo superior é uma importante estação visual

subcortical formado por camadas e, apresenta um papel funcional importante no controle dos

movimentos dos olhos e da cabeça em resposta a estímulos multissensoriais. Nosso objetivo

foi fazer um mapeamento das projeções retinianas que incidem sobre o sistema óptico

acessório, os núcleos do complexo pré-tectal e os do colículo superior, buscando

principalmente, no caso do complexo pré-tectal, uma melhor delimitação dessas estruturas,

por meio do rastreamento anterógrado com a subunidade B da toxina colérica (CTb) seguido

de técnica imunoistoquímica e, caracterizar (medir área e diâmetro) os botões sinápticos

presentes nas fibras/terminais dos núcleos do complexo pré-tectal. Em nossos resultados o

sistema óptico acessório, incluindo uma região que parece ser o núcleo terminal medial, e o

colículo superior apresentaram-se fortemente marcados por fibras/terminais imunorreativos a

CTb, bem como o complexo pré-tectal nos núcleos: núcleo trato óptico, núcleo pré-tectal

olivar, núcleo pré-tectal anterior e núcleo pré-tectal posterior. De acordo com a caracterização

dos botões foi possível fazer uma melhor delimitação desses núcleos.

Palavras-chave: Sistema motor visual, CTb, Callithrix jacchus, botões sinápticos

14

ABSTRACT

The accessory optical system, the pretectal complex, and superior colliculus are

important control centers in a variety of eye movement, being extremely necessary for image

formation, consequently to visual perception. The accessory optical system is constituted by

the nuclei: dorsal terminal nucleus, lateral terminal nucleus, medial terminal nucleus and

interstitial nucleus of the posterior superior fasciculus. From a functional point of view they

contribute to the image stabilization, participating in the visuomotor activity where all system

cells respond to slow eye movements and visual stimuli, which is important for the proper

functioning of other visual systems. The pretectal complex comprises a group of nuclei

situated in mesodiencephalic transition, they are: anterior pretectal nucleus, posterior pretectal

nucleus, medial pretectal nucleus, olivary pretectal nucleus and the nucleus of the optic tract,

all retinal projection recipients and functionally are related to the route of the pupillary light

reflex and the optokinetic nystagmus. The superior colliculus is an important subcortical

visual station formed by layers and has an important functional role in the control of eye

movements and head in response to multisensory stimuli. Our aim was to make a mapping of

retinal projections that focus on accessory optical system, the nuclei of pretectal complex and

the superior colliculus, searching mainly for pretectal complex, better delineation of these

structures through the anterograde tracing with the B subunit of cholera toxin (CTb) followed

by immunohistochemistry and characterized (measured diameter) synaptic buttons present on

the fibers / terminals of the nucleus complex pré-tectal. In our results accessory optical

system, including a region which appears to be medial terminal nucleus and superior

colliculus, were strongly marked by fibers / terminals immunoreactive CTb as well as

pretectal complex in the nucleus: optic tract, olivary pretectal nucleus, anterior pretectal

nucleus and posterior pretectal nucleus. According to the characterization of the buttons it was

possible to make a better definition of these nucleus.

Keywords: Visual motor system, CTb, Callithrix jacchus, synaptic buttons

15

1. INTRODUÇÃO

Em grande parte dos vertebrados, principalmente na ordem primata, a visão é uma

forma de sensibilidade fundamental para a adaptação ao meio ambiente uma vez que a

sensibilidade a luz capacita os animais, entre eles os humanos, a detectar presas, predadores e

parceiros sexuais. Considerando que o conhecimento animal é adquirido por meio dos

sentidos podemos afirmar que a visão, de longe, é a fonte de conhecimento mais importante

para esses animais (Gengenfurtner e Kiper, 2003; Nassi e Callaway, 2009).

Na maioria dos animais, o olho é uma estrutura especializada em captação de sinais

luminosos que, em sua grande parte, são destinados a “formação de imagem”, uma definição

clássica da função visual. O processamento da informação visual começa no olho, mais

precisamente na sua túnica interna chamada retina, onde uma camada de células

fotorreceptoras capta informação luminosa, chegam às células ganglionares da retina e estas a

transmite até áreas do diencéfalo e mesencéfalo e daí para o córtex visual primário, local em

que a percepção visual começa a ser formada (Gengenfurtner e Kiper, 2003; Nassi e

Callaway, 2009).

As células fotorreceptoras da retina envolvidas com a “formação de imagens” são os

cones e bastonetes. Essas células são assim chamadas em virtude de suas formas distintas. Os

bastonetes respondem em níveis extremamente baixos de iluminação e são primariamente

responsáveis pela visão noturna. Os cones, em contraste, são menos sensíveis a baixos níveis

de luz. Eles são primariamente responsáveis pela visão sob alta iluminação e para cor e

detalhes, portanto os bastonetes são responsáveis pela visão noturna e os cones pela diurna. A

captação do sinal luminoso é apenas o começo do processamento visual, axônios das células

ganglionares da retina reúnem-se em feixes nos nervos ópticos, que distribuem a informação

visual na forma de potenciais de ação, a diversas estruturas encefálicas. O nervo óptico

carrega a informação luminosa para o cérebro, onde alguns alvos desse nervo estão

envolvidos na regulação dos ritmos biológicos, sincronizados com o ciclo diário claro-escuro;

outros estão envolvidos no controle da posição e da óptica do olho, neste trajeto esses nervos

se cruzam na altura do hipotálamo formando o quiasma óptico. Deste quiasma saem os tratos

ópticos que vão a caminho do tálamo lateral, mais precisamente o complexo geniculado

lateral, que por sua vez recebe esta informação e envia para o córtex visual primário

(Gengenfurtner e Kiper, 2003; Nassi e Callaway, 2009).

16

Podemos chamar os terminais axônicos das células ganglionares da retina de:

projeções retinianas. De acordo com estudos que descrevem as projeções retinianas

publicadas nas últimas décadas, podemos classifica-las em dois grandes sistemas: o sistema

formador de imagem e o sistema não-formador de imagem (Martinet et al., 1992; Qu et al.,

1996; Fite e Janusonis, 2001; Fite e Janusonis, 2002; Matteu et al., 2003; Cavalcante et al.,

2005; Engelberth et al., 2008).

O sistema formador de imagem é composto basicamente pelo sistema visual primário

que compreende uma série de estruturas que vão desde a retina até o córtex visual, passando

por vários conjuntos neuronais localizados no diencéfalo e mesencéfalo. Entre eles se

encontram o complexo geniculado lateral do tálamo, principal estação de processamento e

retransmissão do sinal visual clássico (Kaas e Huerta, 1988); o sistema óptico acessório

(SOA), o qual esta envolvido no controle da posição e da óptica do olho, contribuindo para

estabilizar imagens na retina durante o movimento da cabeça (Simpson, 1984; Weber, 1985;

Cooper e Magnin, 1986; Giolli et al., 2006); o colículo superior (CoS), responsável por

integração de vários sinais visuo-motores; e pelos núcleos do complexo pré-tectal,

responsáveis pelo controle do reflexo pupilar a luz (constrição da pupila induzida por um

aumento da iluminação na retina) (Kaas e Huerta, 1988),

O sistema não-formador de imagem é composto pelo sistema de temporização

circadiano que apresenta em sua composição um conjunto de estruturas neurais, incluindo um

marca-passo encarregado da geração de ritmo, vias sincronizadoras e vias de saída aos

comportamentos (Ruzak e Zucker, 1979; Moore-Ede et al., 1982; Meijer e Rietveld, 1989;

Moore, 1992; 1994; Turek, 1994; Morin e Allen, 2006; Cavalcante et al., 2006). O núcleo

supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo é o principal marca-passo desse sistema de

temporização circadiano, e tem sido objeto de extensa pesquisa nas últimas décadas, logo

depois da confirmação da projeção da retina para essa área (Hendrickson et al., 1972; Moore e

Lenn, 1972; Moore, 1973). Tanto o NSQ quanto o folheto intergeniculado do tálamo de

roedores (FIG), outro componente desse sistema, recebem projeção da retina apresentando

como função a geração, sincronização e modulação dos ritmos biológicos (Moore-Ede et al.,

1982; Rusak, 1989; Reuss, 1996; Miller et al., 1996; Costa et al., 1998; Morin e Allen, 2006;

Cavalcante et al., 2006; Lima et al., 2012). Estudos de projeção retiniana usando traçadores

mais sensíveis têm mostrado outras áreas reconhecidamente “não-formadoras de imagem” ou

ditas não visuais, descritas como retino-recipientes, tais como o núcleo habenular (Qu et al.,

1996), o núcleo dorsal da rafe (Foote et al., 1978; Shen e Semba, 1994; Fite et al., 1999; Fite

17

e Janusonis, 2001), o núcleo parabraquial (Fite e Janusonis, 2002; Engelberth, 2008), os

núcleos talâmicos intralaminares e da linha média (Cavalcante et al., 2005) e a zona incerta

(Lima, 2008; Morais, 2014) e alguns núcleos hipotalâmicos (Costa et al., 1999; Canteras et

al., 2011).

Esse trabalho é focado em algumas estruturas que desempenham a função visuomotora

e que recebem projeção direta da retina, mas especificamente no SOA, no CoS e no complexo

pré-tectal, em que essa atividade visuomotora é amplamente definida por incluir todos os

tipos de movimentos intraocular e extraocular, incluindo aqueles da pupila e da pálpebra

(Morin e Blanchard, 2005), e também exercendo um controle para manter a imagem estável

na retina (Chilton e Guthrie, 2004).

1.1. Sistema motor visual ou sistema motor ocular

Sempre se acreditou que a função básica dos músculos extraoculares seria a de mover

os olhos de modo a posicionar a imagem na região retiniana de maior precisão sensorial. Os

músculos extraoculares não apenas otimizam a percepção: são verdadeiramente essenciais

para que ela ocorra, pois a paralisação completa deles, ou a utilização de truques

experimentais que fixam a imagem em um mesmo ponto da retina resultam no rápido

desaparecimento da percepção por que os receptores se adaptam e param de enviar sinais para

os neurônios seguintes. Por isso, em condições normais, mesmo que os olhos estejam fixando

firmemente algum objeto, ocorrem pequenos movimentos oculares que deslocam a imagem

para um ponto e outro da retina, impedindo a adaptação (Hubel e Wiesel, 1979; Gregory,

1997).

Há muitos tipos de movimentos oculares, que servem a diferentes funções. Quanto a

coordenação binocular, podem ser conjugados, se os dois olhos se movem na mesma direção

e com a mesma velocidade; ou disjuntivos se se movem em direções diferentes (convergentes

e divergentes). Quanto à velocidade, podem ser sacádicos, se forem muito rápidos e

independentes do movimento dos objetos externos; ou de seguimento, se forem lentos e

“presos”, relacionados ao deslocamento de algum objeto. Finalmente, quanto à trajetória

podem ser radiais, quando o eixo visual se desloca angularmente para qualquer direção; ou

torsionais, quando o eixo permanece fixo, movendo-se o olho em rotação à sua volta (Hubel e

Wiesel, 1979; Gregory, 1997).

18

Os movimentos oculares podem ser reunidos em dois grupos, segundo a sua função:

aqueles destinados a estabilizar o olhar e aqueles que objetivam desviar o olhar (Hubel e

Wiesel, 1979; Gregory, 1997).

Os movimentos de estabilização do olhar são involuntários e de natureza

essencialmente reflexa: visam manter estável a imagem na retina, apesar dos movimentos dos

objetos e do próprio individuo. Os movimentos de desvio de olhar são diferentes porque

podem ter um significativo componente voluntário, consciente (Hubel e Wiesel, 1979;

Gregory, 1997).

Acredita-se que os movimentos de desvio do olhar tenham se originado, durante a

evolução, a partir dos movimentos de estabilização, já que estes existem em todos os

vertebrados, enquanto aqueles só apareceram nos animais que possuem fóveas ou regiões

similares de maior acuidade. Coerentemente, os movimentos de estabilização envolvem

circuitos reflexos mesodiencefálicos cuja origem está nos fotorreceptores do olho e nos

mecanorreceptores do labirinto vestibular, enquanto os movimentos de desvio do olhar

acrescentam aos circuitos subcorticais fortes influências do córtex cerebral veiculadas através

de fibras que terminam no colículo superior e regiões próximas. Em ambos os casos, o

ambiente visual funciona como um poderoso imã que atrai os olhos e a cabeça para ponto do

espaço que contém o estímulo relevante (Hubel e Wiesel, 1979; Gregory, 1997).

Assim, o SOA, o CoS e o complexo pré-tectal são importantes centros de controle de

uma variedade de movimentos oculares (Lui et al., 1995) e nas próximas seções os

componentes deste “sistema motor visual” serão discutidos detalhadamente.

1.1.1. Sistema óptico acessório

Embora o SOA tenha sido reconhecido anatomicamente a mais de cem anos e está

presente em todas as classes dos vertebrados (Mai, 1978), os primeiros estudos fisiológicos só

foram registrados a partir de 1959 (Marg et al., 1959). Em 1908, Bochenek descreveu em

coelhos uma coleção de fibras ópticas que ele chamou de “fascículo acessório anterior” do

qual se originou o nome atual “sistema ótico acessório”, proposto por Hayhow no final da

década de 50 (Hayhow, 1959). Segundo ele, o sistema era constituído de dois feixes de fibras

ópticas que se originam na retina contralateral, os fascículos ópticos medial e superior, e três

núcleos alvos do mesencéfalo: Núcleo terminal dorsal (NTD), o núcleo terminal lateral (NTL)

e o núcleo terminal medial (NTM) (Hayhow et al., 1960; Giolli, 1961, 1963; Simpson, 1984;

19

Cooper e Magnin, 1986; kaas e Huerta, 1988). Os neurônios encontrados imersos nas fibras

posteriores do fascículo superior foram posteriormente agrupados sob a denominação de

núcleo intersticial do fascículo superior posterior (IFSP) (Giolli et al., 1984; Benassi et al.,

1989; Blanks et al., 1995), localizado mais rostralmente (Blanks et al., 1995), um quinto

grupo nuclear, o núcleo intersticial do fascículo superior, fibras mediais (IFSPm) foi

identificado em Macaca fascicularis por Cooper et al (1990) (Lui et al., 1995). Os neurônios

dos distintos núcleos parecem estar envolvidos com movimentos direcionais complementares

em algumas espécies: NTD, horizontal têmporo-nasal; NTL, vertical superior-inferior; NTM,

vertical inferior e superior (Cooper e Magnin, 1986). Esta organização é conservada através

dos mamíferos, incluindo os principais grupos primatas (Cooper e Magnin, 1986) e esses

núcleos são em geral de fácil delimitação nos mamíferos, mas o NTM embora bastante

evidente em roedores é, na maioria das vezes, muito difícil de delimitar em primatas (Cooper

e Magnin, 1986; Cooper et al., 1990).

Como resultado de estudos anatômicos e fisiológicos desenvolvidos principalmente a

partir da década de 50 e intensificados nas décadas de 70 e 80, sabe-se que as células

ganglionares da retina fornecem uma importante entrada para estes núcleos e, do ponto de

vista funcional eles contribuem fundamentalmente para a estabilização da imagem,

participando da atividade visuomotora onde todas as células do sistema respondem a

movimentos lentos dos olhos e a estímulos visuais, o que é importante para o próprio

funcionamento dos outros sistemas visuais. Portanto, pode-se dizer que apesar do nome, o

SOA pode ser considerado parte do sistema visual primário (Simpson, 1984), no que diz

respeito ao seu funcionamento.

O NTM se localiza no tegmento mesencefálico, medialmente ao pedúnculo cerebral

sobre o nível imediatamente rostral à saída do nervo oculomotor (Weber e Giolli, 1986), e tem

como principal referência em primatas ser exatamente medial ao NTL. A projeção da retina

para o NTM é geralmente contralateral e esparsa em primatas, sendo bastante densa em

roedores (Itaya e Van Hoesen, 1983), como no caso de um estudo com esquilos terrestres da

Califórnia (Spermophilus beecheyi) onde foi demonstrado que o NTM é densamente e

completamente inervado por fibras da retina contralateral e recebe uma escassa e difusa

inervação ipsilateral (Major et al., 2003). O NTL fica entre o braço do colículo inferior e o

núcleo geniculado medial, ao aspecto ventromedial, sobre a junção mesodiencefálica (ver

Kaas e Huerta, 1988). Lin e Giolli (1979) mostraram que o NTL recebe uma projeção

retiniana bilateral com predominância contralateral, mesmo mostrando um componente

20

ipsolateral significativo. O NTD de primatas se localiza lateralmente ao teto do mesencéfalo,

caudalmente ao núcleo geniculado medial e ventrolateralmente ao braço do colículo superior

(ver Kaas e Huerta, 1988), recebe uma inervação retiniana basicamente contralateral, mas em

Rhesus (Lin e Giolli, 1979) este núcleo recebe tanto projeção contralateral como um pequeno

componente ipsolateral, destacando, dessa forma, um padrão muito semelhante ao encontrado

no sagüi (Cavalcante, 2002).

O fascículo inferior do trato óptico acessório é formado por um grupo de fibras

provenientes da retina que vêm através do nervo ótico, cruzam posteriormente no quiasma

óptico, são deslocadas medialmente a partir do trato óptico principal pelas fibras que

compõem as comissuras supraópticas de Gudden e Meynert. Na borda medial do pedúnculo

cerebral, as fibras do fascículo inferior divergem do curso do trato óptico principal e

prosseguem posteriormente, algumas fibras passando através das regiões hipotalâmica lateral

e subtalâmica adjacentes, enquanto outras permanecem em relação à borda medial do

pedúnculo cerebral, para terminarem no NTM, um núcleo proeminente no tegmento

mesencefálico ventral. Este núcleo é limitado lateralmente pelo pedúnculo cerebral e a

substância negra, e medialmente pelo pedúnculo mamilar e o lemnisco medial. Enquanto isso,

o fascículo superior é formado por um grupo de fibras ópticas que se destacam da margem

posterior do trato óptico e margem ventral do braço do colículo superior para caminhar

suficientemente através do pedúnculo cerebral para sua borda medial e finalmente para o

NTM. O fascículo superior foi dividido formalmente em três componentes de fibras

denominadas anterior, médio e posterior (Hayhow, 1966). As fibras anteriores partem da

margem ventroposterior do trato óptico principal, anteriormente a um ponto onde esta linha de

separação coloca-o em estreita relação com o corpo geniculado lateral. Essas fibras caminham

superficialmente em direção posteromedial para a borda medial do pedúnculo cerebral e então

prosseguem posteriormente para atingirem o NTM ventralmente. As fibras médias do

fascículo superior deixam o trato óptico principal no ponto relacionado ao corpo geniculado

lateral, ventroposteriormente. Elas descem superficialmente, através da superfície

anterolateral do corpo geniculado medial e algumas delas provenientes enviam para o NTL,

que forma uma proeminência imediatamente ventral ao corpo geniculado medial, justaposto à

base dorsolateral do pedúnculo cerebral. Outras fibras prosseguem pela superfície do

pedúnculo cerebral para o NTM. As fibras posteriores do fascículo superior originam-se em

grande parte da margem ventrolateral do braço do colículo superior, algumas fazendo sinapses

no NTD, localizado no sulco entre a borda ventral do braço do colículo superior e a borda

21

dorsoposterior do corpo geniculado medial. Outras fibras prosseguem mais adiante,

relacionando-se ventralmente com a superfície posterolateral do corpo geniculado medial,

atingindo o NTL e o NTM. Alguns neurônios também estão situados fora destes núcleos, ou

seja, dentro de fibras posteriores do fascículo superior (Hayhow et al., 1960; Simpson, 1984).

Estudos pioneiros com técnicas de degeneração e mesmo autorradiografia, mostravam

um SOA incompleto em primatas, uma vez que, embora apresentando um NTL proeminente e

um NTD, não se evidenciava uma projeção direta da retina para a região tegmentar ventral,

onde o NTM é habitualmente encontrado em outros mamíferos (Giolli, 1963; Campos-Ortega

e Gleis, 1967; Campos-Ortega e Cluver, 1968; Campbel, 1969; Hendrickson et al., 1970;

Tigges e O’Steen, 1974; Tigges et al., 1977; Lin e Giolli, 1979). Mais uma vez, o

aperfeiçoamento das técnicas de traçador neural veio permitir o delineamento completo desse

sistema em primatas. Assim, com HRP intraocular, fibras retinofugais marcadas, ainda que

raras, puderam ser traçadas para uma pequena área contralateral entre a parte mais caudal do

corpo mamilar e a borda medial do pedúnculo cerebral de um macaco do Velho Mundo,

sugerindo a presença de uma divisão ventral do NTM (Terubayashi e Fujisawa, 1988). Além

disso, foram descritas projeções retinianas para um grupo de neurônios na formação reticular

mesencefálica, considerados o homólogo da divisão dorsal do NTM (Weber e Giolli, 1986;

Cooper e Magnin, 1986; 1987; Cooper et al., 1990). As projeções retinianas no macaco

japonês (Macaca fuscata) foram revisadas com a subunidade B da toxina colérica (CTb), a

projeção retiniana permitiu delinear as divisões dorsal e ventral do NTM (Nakagawa et al.,

1998). Blanks et al. 1995 consideram a existência no cérebro do sagüi (Callithrix jacchus), o

NTD, NTL, NTM e o IFSP, o que é corroborado por Cavalcante, 2002.

Em aves, anfíbios e répteis o SOA consiste de um único fascículo, que se separa do

trato óptico principal imediatamente após o cruzamento no quiasma óptico, e um único núcleo

terminal localizado à margem ventral do tegmento mesencefálico, ligeiramente rostral à saída

do nervo oculomotor (III par). Este fascículo e seu núcleo terminal receberam muitos nomes,

mas os nomes mais amplamente aceitos são raiz óptica basal (ROB) para o fascículo e núcleo

da raiz óptica basal (NROB) para o núcleo. Em pássaros, o ROB parte dorsal, os quais juntos

compõem o complexo ROB (Brecha et al, 1980; Simpson, 1984). Também em peixes o SOA

foi delineado com o método autorradiográfico, constatando-se evidentes diferenças

interespecíficas com respeito a local, tamanho e número dos núcleos presumidos do SOA

(Simpson, 1984).

22

1.1.2. Colículo superior

O CoS é uma importante estação visual subcortical. Em mamíferos, o CoS forma a

metade rostral do teto do mesencéfalo e aparece como uma saliência de cada lado da linha

média, abaixo da parte posterior do córtex cerebral (Parent, 1996). Em outros vertebrados, a

estrutura equivalente é conhecida como teto óptico. Devido a extensa evolução do neocórtex

em mamíferos, acredita-se que o teto óptico das aves retém um papel ainda mais efetivo na

integração sensório-motora do que o CoS de mamíferos (Shimizu e Karten, 1993). O CoS é

formado na maioria dos mamíferos por sete camadas, classificadas do sentido da periferia

para a substância cinzenta periaquedutal em superficiais, intermediárias e profundas, Segundo

Huerta e Harting (1984), as superficiais vão da I a III, as intermediárias são as camadas IV e

V e profundas VI e VII (ver Kaas e Huerta, 1988), porém, alguns autores costumam

classificar as intermediárias junto com as superficiais (Parent, 1996). Em primatas, fibras da

retina se projetam bilateralmente para as camadas superficiais do CoS, através do braço do

CoS. Fibras oriundas do córtex visual primário também chegam às suas camadas superficiais.

Pelas suas camadas profundas, o CoS recebe fibras de uma variedade de regiões, tais como

medula espinal, colículo inferior, tegmento mesencefálico, pars reticulata da substância

negra, substância cinzenta central e quase toda a extensão do neocórtex, incluindo as áreas

sômato-sensoriais, motoras e pré-motoras, e campo ocular frontal. Sua principal via de saída é

o trato teto-espinal, através do qual indiretamente alcança os neurônios motores dos músculos

extra-oculares e os músculos axiais do pescoço. O CoS tem saída também para a porção mais

anterior do núcleo pulvinar, que por sua vez se projeta para o córtex (Benevento e Fallon,

1975; Partlow et al., 1977; Benevento e Standage, 1983; Kaas e Huerta, 1988).

Estudos realizados em sagüi demonstraram uma densa inervação da retina sobre as

camadas mais superficiais do CoS (Cavalcante, 2002), assim como demonstrado

anteriormente em outros primatas (ver Kaas e Huerta, 1988) e em outros vertebrados (Itaya e

Van Hoesen, 1982; Paloff et al., 1985).

Assim, pelas suas conexões, o CoS tem um papel importante no controle dos

movimentos dos olhos e da cabeça em resposta não somente a estímulos visuais, mas a

estímulos multissensoriais, particularmente pelos impulsos que envia para a parte cervical da

medula espinal por meio do trato teto-espinal, com a finalidade de fazer girar a cabeça, e para

o “centro de fixação do olhar” da formação reticular paramediana da ponte, com a finalidade

de controlar os movimentos sacádicos do olho (Kaas e Huerta, 1988). Um estudo de lesão no

23

pré-tecto e CoS mostrou que essas duas áreas medeiam o efeito direto da luz sobre o sono

(Miller et al., 1998).

1.1.3. Complexo pré-tectal

Baseado em estudos em mamíferos não primatas e vertebrados não mamíferos, certas

estruturas mesencefálicas visuais estão implicadas na detecção do movimento no campo

visual e a geração do movimento ocular.

O complexo pré-tectal compreende um conjunto de núcleos situados na transição

mesodiencefálica, funcionalmente relacionado com a via do reflexo pupilar a luz e o nistagmo

optocinético (Hutchins e Weber, 1985). Este complexo foi estudado anatomicamente em um

primata do Novo Mundo, o macaco-de-cheiro (Saimiri scilereus) (Weber, 1985), no qual

foram definidos cinco núcleos: pré-tectal anterior (NPA), pré-tectal posterior (NPP), pré-tectal

medial (NPM), pré-tectal olivar (NPO) e o núcleo do trato óptico (NTO), sendo todos

recipientes de projeção retiniana (Hutchins e Weber, 1985). Esta organização geral do pré-

tectal é similar aos relatados em outras espécies, incluindo camudongo (Pak et al., 1987), rato

(Scalia e Arango, 1979), furão (Zhang e Hoffmann, 1993), gato (Kaneseki e Sprague, 1974), e

humanos (Borostyankoi-Baldauf e Herczeg, 2002). Alguns autores consideram esta zona

medial como sendo parte do NTO e, no mapeamento, o NTO é uma fina faixa interposta entre

o aspecto ventromedial do NPO e o aspecto dorsomedial do NPP, em primatas (Lui et al.,

1995). Estudos de lesão em Macaca fascicularis sugerem que o NTO do complexo pré-tectal

participa da via do nistagmo optocinético horizontal (Kato et al., 1986), considerando o NTO

como sendo uma estrutura fundamental para manter a estabilidade do olhar durante o

movimento da cabeça (Yakushin et al., 2000). Estudos demonstraram que o NPA pode estar

associado com o sistema somatossensorial, tendo sido implicado no processamento da

informação de dor (Rees e Roberts, 1987; 1993; Rees et al., 1995). Além disso, estudos

pioneiros indicaram a presença de uma entrada retiniana apenas esparsa para uma porção

restrita do NPA em roedores (Hayhow et al., 1962; Scalia e Arango, 1979), embora modestas

projeções retino-NPA tenham sido referidas em outros mamíferos, como gatos (Weber e

Hutchins, 1982; Willians e Chalupa, 1983; Hutchins, 1991); e coelhos (Giolli e Guthrie, 1969;

Takahashi et al., 1977). O NPM, por sua vez, parece estar envolvidos em processamento de

informação relacionada a modalidades auditivas (Kudo et al., 1983) e visuais (Itaya, 1980;

Itaya e Itaya, 1985).

24

Além da projeção retiniana, outra importante aferência para o complexo pré-tectal,

porém, é a das camadas superficiais do CoS, que se projetam densamente para o NTO e NPP

e esparsamente para o NPA (Harting et al., 1980). As camadas profundas do CoS enviam uma

moderada projeção para o NPM. A maioria das aferências corticais para o complexo pré-tectal

incidem sobre o NPA, NPP e NTO e são provenientes das áreas visuais (Graham et al., 1979).

As conexões eferentes do complexo pré-tectal têm sido pouco estudadas. Sabe-se que

o NPO projeta-se para o complexo de Edinger-Westphal (EW), do qual neurônios pré-

ganglionares parassimpáticos inervam o gânglio ciliar do olho, fornecendo dessa forma o

substrato anatômico para o reflexo pupilar a luz (Clarke et al., 2003), ou seja, a via de

mediação da constrição da pupila é executado através do núcleo EW e do gânglio ciliar

(Klooster et al., 1993). O NPO também se projeta para o NPO contralateral, o pulvinar medial

e os núcleos do sistema óptico acessório (Carpenter e Pierson, 1973), e inerva o núcleo da

comissura posterior e os pré-tectais anterior e posterior. O NTO, NPA e NPP mandam fibras

para o núcleo da comissura posterior, os núcleos pulvinar inferior e medial, núcleo pré-

geniculado e o núcleo geniculado lateral dorsal em Macaque monkeys (Carpenter e Pierson,

1973).

Assim, junto com o NTO, o NPO é o núcleo pré-tectal mais intensamente estudado por

sua contribuição essencial ao reflexo pupilar a luz (Gaillard et al., 2013).

Dados de Benevento e Standage (1983) revelam que o complexo pré-tectal também

inerva o pulvinar lateral e que no complexo pulvinar as áreas que recebem aferências do

colículo superior também recebem aferências pré-tectais. Os núcleos pré-tectais também

inervam núcleos relés pré-cerebelares, como o núcleo reticular lateral, zona incerta e núcleos

intralaminares do tálamo (Weber e Harting, 1980). Uma descrição em ratos de uma projeção

dos núcleos NPO e NPP para o núcleo supraquiasmático (Mikelsen e Vrang, 1994) sugere que

esses núcleos também possam desempenhar um papel no sistema de temporização circadiana.

25

1.2. Sagui (Callithrix jacchus): O modelo experimental

Figura 1- Callithrix jacchus

O sagüi (Callithrix jacchus), um macaco do Novo Mundo, é um primata do gênero

Callithrix pertencente ao filo Chordata, classe Mammalia, superordem Archonta, ordem

Primates, família Callithricidae e subfamília Callitrichinae.

É um primata neotropical, e sua ocorrência é nos estados brasileiros do Maranhão,

Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, norte e litoral da

Bahia, até o Recôncavo Baiano (Vivo, 1991). A distribuição da espécie Callithrix jacchus

abrange dois domínios morfoclimáticos, o das caatingas e o das florestas pluviais atlânticas,

bem como a área de transição entre ambos (nomenclatura segundo Ab’Saber, 1977).

É um animal de pequeno porte, medindo cerca de 30 cm de corpo e mais 17 cm de

cauda, o que confere equilíbrio ao animal. O seu peso varia entre 230 a 420g. Como

características diagnósticas da espécie apresentam tufos circum-auriculares brancos, mancha

branca mediana presente na testa; manto distinto estendendo-se até os ombros, terço posterior

do dorso apresentando padrão estriado de coloração; ventre castanho escuro agrisalhado;

cauda anelada, anéis cinza-claro estreitos e anéis negros-agrisalhados mais largos (Vivo,

1991). Costumam se alimentar de frutos, pequenos insetos, ovos de aves, aranhas, pequenos

répteis, brotos de folhas, sementes e da goma de árvores.

Os sagüis apresentam o hábito diurno. São territoriais e demarcam seus territórios

utilizando substâncias odoríferas produzidas por órgãos especializados, as glândulas cutâneas

de cheiro, e a urina em alguns processos (Alonso, 1984). Os primatas em geral são animais de

26

orientação essencialmente visual, apresentando um sistema visual bem desenvolvido. São

animais sociais, formando pequenos grupos familiares (Erkert et al., 1986; Erkert, 2008) e são

facilmente adaptáveis à vida em cativeiro (Menezes et al., 1993).

Entre os primatas, os macacos da família Callithrichidae exibem uma alta taxa

reprodutiva. O período gestacional é de aproximadamente 5 meses, com 1 a 3 filhotes por

parto. O nascimento de gêmeos é normal em cativeiro e no ambiente selvagem e as fêmeas

são capazes de conceber uma nova cria de 10 a 30 dias após o parto. A maturidade sexual é

alcançada em torno de 18 meses, e a média de vida em cativeiro é em cerca de 13 anos

(McNeilly et al., 1981; Ziegler et al., 1990; Chandolia et al., 2006; Nishijima et al., 2012).

Nessa espécie, embora não ocorram diferenças morfológicas entre os sexos, são encontradas

diferenças expressivas de estratégia reprodutiva entre machos e fêmeas (Abbot et al., 1998;

Saltzman et al., 1997a, 1997b, Silva e Souza, 1997).

Apesar dos avanços nas técnicas não invasivas para estudo do cérebro humano vivo,

estudos com animais ainda são necessários para a abordagem e compreensão do sistema

nervoso (Solomon e Rosa, 2014). Assim, esta espécie é um sujeito experimental interessante

como modelo para a visão primata por apresentar uma boa acuidade visual (capacidade de

discriminar detalhes espaciais, perceber forma e contorno dos objetos), talvez esta seja a

característica mais marcante da visão primata (Mitchell e Leopold, 2015), são dicromatas, e

tanto a retina como a via visual subcortical são muito semelhantes aos dos macacos do Velho

Mundo e humanos. E também devido ao seu tamanho pequeno, reprodução rápida e pronta

disponibilidade (Spartz, 1978; Krubitzer e Kaas, 1990; Dick et al., 1991; Williams et al.,

1992; Troilo et al., 1993; Ghosh et al., 1996). Além disso, as áreas corticais e sub-corticais

que controlam os movimentos dos olhos têm sido identificados no sagui (Mitchell e Leopold,

2015), fator de bastante relevância para este trabalho. Além do interesse crescente no sagui

como uma espécie modelo para complementar o macaco Rhesus e o rato de laboratório (Mus

musculus), que são comumente usados para estudar os circuitos neurais que apoiam a visão

humana.

O ancestral comum mais recente dos seres humanos com o sagui viveu

aproximadamente 35-40 milhões de anos atrás, antes do nosso antepassado mais recente com

o macaco (25-30 milhões de anos atrás) e muito tempo depois de seu antepassado mais

recente com o rato (80-90 milhões de anos atrás) (Janecka et al., 2007; Springer et al., 2011).

Assim, de um ponto de vista puramente filogenético, o sagui oferece um ponto intermédio da

comparação entre as duas espécies (Mitchell e Leopold, 2015). Para neurociência visual, o

27

sagui também oferece uma série de vantagens experimentais distintas sobre cada um desses

sistemas-modelo, e aponta para áreas onde um este modelo animal promete lançar uma nova

luz sobre os mecanismos de cognição visual no cérebro humano (Mitchell e Leopold, 2015).

A neurociência visual tem se beneficiado com décadas de estudos comparativos, como

a paralaxe (alteração, mudança, diferenças) proporcionada pelo estudo de várias espécies

ajudando a identificar traços que são características fundamentais do cérebro de mamíferos e

outras características que são únicas para os primatas, incluindo humanos (Mitchell e

Leopold, 2015).

28

2. JUSTIFICATIVA

Considerando a visão uma forma de sensibilidade fundamental para a adaptação dos

primatas ao meio ambiente é importante que se conheça os aspectos envolvidos no

processamento dessa informação visual. Em estudos prévios para a dissertação de mestrado

foi realizada a identificação da projeção retiniana, caracterização citoarquitetônica e

neuroquímica da principal estação visual primária, o núcleo geniculado lateral dorsal,

estrutura envolvida na formação da imagem. Além desta estação visual primária para a

formação de imagem, é fundamental que se faça um mapeamento mais detalhado das

projeções retinianas que incidem sobre aquelas estações subcorticais envolvidas nos

movimentos oculares ou “sistema óptico motor”, ou seja, sobre o sistema óptico acessório, o

colículo superior, e os núcleos do complexo pré-tectal, buscando principalmente, no caso do

complexo pré-tectal, uma melhor delimitação dessas estruturas. Servindo como base para

trabalhos futuros em que se deve fazer uma identificação neuroquímica dessas estruturas. Essa

caracterização pode nos fornecer aspectos morfológicos importantes para a função visual.

A proximidade filogenética entre o ser humano e os primatas não humanos, nos

proporciona estudos comparativos entre estas espécies. O sagui como um primata do Novo

Mundo, de pequeno porte e encontrado abundantemente em nossa região, é bastante utilizado

em estudos morfológicos e adquiriu um status importante em pesquisas biomédicas em

diversas partes do mundo, em especial, aquelas relacionadas com o aspecto visual por

apresentar uma boa acuidade visual e, tanto a retina como a via visual subcortical são muito

semelhantes aos dos macacos do Velho Mundo e humanos. Portanto ele representa um sujeito

experimental interessante para o nosso estudo.

29

3. OBJETIVOS

3.1 – Objetivo geral:

Fazer um mapeamento das projeções retinianas que incidem sobre o sistema óptico

acessório, o colículo superior, e os núcleos do complexo pré-tectal, buscando

principalmente, no caso do complexo pré-tectal, uma melhor delimitação dessas

estruturas.

3.2 – Objetivos específicos

Mapear a projeção retiniana para os núcleos que formam o sistema óptico acessório

através da injeção intraocular unilateral da subunidade b da toxina colérica, e revelar

as fibras/terminais coradas com esta substância, através da técnica de

imunoistoquímica.

Mapear a projeção retiniana para as camadas superficiais do colículo superior através

da injeção intraocular unilateral da subunidade b da toxina colérica, e revelar as

fibras/terminais coradas com esta substância, através da técnica de imunoistoquímica.

Mapear a projeção retiniana para os núcleos que formam o complexo pré-tectal

através da injeção intraocular unilateral da subunidade b da toxina colérica, e revelar

as fibras/terminais corados com esta substância através da técnica de

imunoistoquímica.

Caracterizar (medir área e diâmetro) os botões sinápticos presentes nas

fibras/terminais imunorreativos a subunidade b da toxina colérica que inervam os

núcleos do complexo pré-tectal, considerando que os núcleos que formam este

complexo são de difícil delimitação.

30

4. METODOLOGIA

Foram utilizados três sagüis adultos jovens machos, pesando entre 230-390g, em boas

condições de saúde. Todos provenientes do Núcleo de primatologia da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte. Neste local, os animais foram mantidos em gaiolas de alvenaria e

tela de arame, medindo 2,0 x 1,0 x 2,0m, estando expostos a condições de temperatura,

umidade e iluminação naturais, com alimentação e água continuamente a disposição. Todos

os cuidados foram tomados durante o manuseio dos animais, buscando sempre seu bem-estar,

assim como minimizar ao máximo qualquer possível estresse e/ou sofrimento, recebendo

também acompanhamento de um médico veterinário durante todos os procedimentos.

Importante inferir que esses animais também foram utilizados em outros projetos realizados

no laboratório de Neuroanatomia da UFRN. Os procedimentos experimentais seguiram

estritamente as normas estipuladas através da Lei Arouca (Lei nº 11,798) que regulamenta o

uso de animais para a pesquisa cientifica. Todos os experimentos foram aprovados pelo

Comitê de Ética em uso de animais da UFRN (CEUA-UFRN nº 001/2012).

4.1. Injeção intraocular da subunidade b da toxina colérica.

A fim de investigar as projeções retinianas para os possíveis alvos do sistema motor

visual fizemos inicialmente um rastreamento anterógrado com a subunidade b da toxina

colérica (CTb). Esse traçador é captado pelo corpo neuronal e transportado via fluxo

axoplasmático aos terminais, não possuindo propriedade transináptica. Os animais

receberam como medicação pré-anestésica o cloridrato de tramadol e xilazina, ambos na

dose de 5mg/Kg administrados por via intramuscular. O tramadol é um opióide necessário

para potencializar o efeito da analgesia adequada ao procedimento, enquanto que a

xilazina é um relaxante muscular. Passados 15 minutos após o pré-anestesico, os animais

foram do Núcleo de Primatologia para a sala de procedimentos cirurgicos do laboratório

de Neuroanatomia, onde foram induzidos e mantidos em anestesia inalatória com

isoflurano e oxigênio 100% administrado através de máscara, até atingir o plano

anestésico. Evidenciado a completa anestesia do animal, eles foram submetidos a uma

injeção intra-ocular unilateral de 80 µl de uma solução aquosa do traçador neuronal

anterógrado, a CTb (CTb, List Biological Laboratories, Inc., Campbell, CA) a 0,1%,

contendo dimetilsulfóxido a 10 % para aumentar a permeabilidade e consequentemente,

31

melhorar a captação dessa substância pelas células ganglionares da retina. A injeção foi

realizada no olho esquerdo, seguindo o protocolo do laboratório, utilizando-se uma agulha

calibre 30 (8,00mm x 0,3mm), lentamente, sob pressão, com auxilio de uma micro-bomba

propulsora, que impulsiona a solução num fluxo de 1µl/minuto. Essa agulha foi

introduzida na junção esclera-corneal, atingindo o corpo vítreo, em um ângulo de

aproximadamente 45º. Após o término do fluxo da solução, a agulha permaneceu no local

por mais 15 minutos, visando diminuir um possível refluxo da solução. Após a retirada da

agulha foi colocada terramicina, que é uma pomada oftálmica cicatrizante, no olho do

animal. Encerrado o procedimento da injeção intra-ocular, os animais retornaram à uma

gaiola da sala de recuperação do Núcleo de Primatologia, permanecendo em observação

pelo período de sobrevida de 5 dias, tempo ideal para o transporte do traçador, da retina

para toda a parte do sistema nervoso. Passado esse período de sobrevida os animais

passaram pelos procedimentos de perfusão e microtomia.

4.2. Perfusão transcardiaca.

Após um período de sobrevida de 5 dias, o animal foi novamente anestesiado seguindo

o mesmo procedimento do tópico anterior e em seguida colocado em decúbito dorsal sobre

uma grade numa capela de perfusão. A grade encontrava-se inclinada num ângulo de

aproximadamente 45 graus, para favorecer a fixação do tecido nervoso. Uma vez certificado

de que o animal estava profundamente anestesiado, iniciou-se o procedimento cirúrgico.

Com o auxilio de uma pinça de Allis o processo xifoide do animal foi preso

tracionando-o para cima, enquanto lhe foi seccionada a pele, partes moles e as costelas pelas

bordas inferiores do gradil costal, sendo a incisão prolongada pelas paredes laterais do tórax

até que o coração ficou exposto dentro da cavidade torácica. Uma agulha conectada a uma

bomba de perfusão foi introduzida no ventrículo esquerdo através do ápice do coração na

direção da aorta ascendente e posteriormente, realizando-se uma pequena incisão no átrio

direito, com a finalidade de escoar as soluções de perfusão, foi então ligada a bomba

peristáltica para a impulsão de 300ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH

7,4 com heparina (Liquemine, 2 ml/1000ml de solução salina) com o objetivo de lavar o

sistema circulatório do animal prevenindo a formação de coágulos e possibilitando a melhor

penetração do fixador nos tecidos. Em seguida foi introduzido 700ml de solução fixadora

(paraformaldeído a 4%, Vetec Química Fina) em duas velocidades. Na primeira metade, numa

32

velocidade de 90ml/min e na segunda metade a uma velocidade e de 25ml/min

aproximadamente, de modo que todo o fluxo de soluções durou em torno de 30 minutos.

4.3. Remoção do encéfalo e microtomia.

O encéfalo foi removido da cavidade craniana através da secção de tecidos moles e

ostectomia dos ossos da calota craniana, passadas pelo menos duas horas após a perfusão. em

seguida pós-fixados na mesma solução fixadora, acrescida de sacarose a 30% por 4 horas e

então colocados em outra solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 até

serem submetidos a microtomia.

Para a microtomia, o encéfalo foi congelado em gelo seco e seccionado em micrótomo

de deslizamento, obtendo-se secções coronais de 30µm, coletadas seriadamene em seis

compartimentos em um meio liquido contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Cada um desses

compartimentos teve uma das seis secções, de maneira que a distância entre uma secção e a

seguinte fosse de aproximadamente 180µm. Estes cortes ficaram armazenados em uma

solução anti-congelante contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.

4.4. Imunoistoquímica.

A reação foi feita pelo método ABC (protocolo avidina-biotina complexo peroxidase;

ABC, kit Elite, Vector labs, Burlingame, CA, USA) para marcação simples com

imunoperoxidase. A concentração do anticorpo utilizado seguiu a especificação técnica do

fabricante. Nesta análise, anticorpo específico foi usado para identificar a expressão da

substância neuroativa, a CTb injetada, nos terminais.

O protocolo ABC utilizado seguiu as seguintes etapas:

1. Os cortes foram submetidos a cinco lavagens de cinco minutos cada, em

solução tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, em agitador orbital;

2. As secções foram pré-tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,3% em

tampão fosfato por 20 minutos para inativação da peroxidase endógena.

Este pré-tratamento visa retirar o excesso de aldeídos e recuperar a

antigenicidade;

3. As secções foram colocadas em contato com o anticorpo específico

primário obtido em cabra (List Biological [1:1000]) diluído em tampão

33

fosfato contendo Triton-X 100 a (ICN Biomedicals) 0,4% e soro normal

(Sigma Chemical Company [1:50]) do animal em que foi obtido o

anticorpo secundário durante 18 a 24 horas (20ºC);

4. Em seguida, as secções foram colocadas em contato com o anticorpo

secundário biotinilado obtido em jumento (Jackson Immunoresearch

Laboratories; [1:1000]), diluído em Triton-X 100 a 0,4%, por 90 minutos;

5. Após esta etapa, incubamos os cortes em uma solução contendo avidina e

biotina previamente diluída (30 minutos antes) em Triton X-100 contendo

NaCl, por 90 minutos;

6. Para visualizar a reação, os cortes foram colocados em contato com um

cromógeno, a diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St Louis, MO, USA) a

2,5% diluída em tampão fosfato (0,1M / pH 7,4);

7. Entre cada uma das etapas foram realizadas cinco lavagens do tecido, de

cinco minutos cada, com tampão fosfato a 0,1 M e pH 7,4, em um agitador

orbital;

8. Os cortes foram montados em lâminas de vidro (Specimen) previamente

gelatinizadas com gelatina-alúmem-cromo (Vetec Química Fina) e postas

para secar a temperatura ambiente;

9. Após a secagem, as lâminas foram mergulhadas em uma solução de

tetróxido de ósmio a 0,05%, por 30 segundos, para intensificação da reação.

Posteriormente, as lâminas passaram pelo processo de desidratação em

álcoois (Cromato Produtos Químicos) de concentrações gradativamente

maiores (70, 90 e 100%), 5 minutos cada, e deslipidificados com xilol

(Cromato Produtos Químicos), mergulhados em dois recipientes por 5

minutos cada, em seguida foram cobertas com lamínulas usando-se DPX

(Aldrich Milwaukee, WI). Após montadas estavam prontas para serem

examinadas ao microscópio óptico.

34

4.5. Análise dos resultados

A avaliação do resultado imunoistoquímico foi realizada com o auxílio de um

microscópio óptico (Olympus, BX-41) utilizando campo claro. As imagens foram

digitalizadas utilizando uma câmera (Nikon, DXM-1200) acoplada ao microscópio e

conectada a um computador, sendo subsequentemente operacionalizadas para ajuste de brilho

e contraste com o programa Adobe Photoshop CS2.

4.6. Medição de área e perímetro celular

Dos animais que foram processados para CTb foram feitas imagens em objetivas de

10x e 20x, dos núcleos a serem trabalhados, do qual das imagens em objetiva de 20x foi

selecionada e recortada uma área, utilizando o programa Adobe Photoshop CS2, melhor

evidenciando o núcleo a ser trabalhado dos quais podíamos ver em detalhes os critérios

estabelecidos para a medição dos diâmetros de área e perímetro das células.

Após esse passo, as imagens passaram a ser trabalhadas utilizando o software Canvas

X para análise das fibras e terminais retinianos, onde foi possível medir parâmetros de área e

perímetro dos botões. Em cada foto, com aumento de 20x, foi realizada a medição de 80

células por núcleo e cada núcleo foi analisado com uma média total de 240 células medidas

(nº de casos x 80 células). Dessa forma, representamos com estatística descritiva a

distribuição desses dados não paramétricos por Box-plots do SOA, CoS e os núcleos do

complexo pré-tectal. Além disso, analisamos por kruskal-wallis, seguido do teste de post-hoc

de Dunn, possíveis diferenças significativas nesses parâmetros dos núcleos do complexo pré-

tectal. Os dados foram expressos como mediana (Q3-Q1).

35

5. RESULTADOS

Foram processados encéfalos de três animais, número que foi satisfatório para os

nossos propósitos, os quais foram retirados da cavidade craniana após perfusão transcardiaca,

submetidos à microtomia de congelação e os cortes submetidos à imunoistoquímica para

revelação da CTb injetada intraocularmente.

5.1. Sistema Óptico Acessório

O SOA apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais imunorreativos a CTb

(CTb-IR) em todos os seus núcleos, incluindo uma região que parece ser o NTM (Figura 2).

Os botões terminais apresentaram uma pequena variabilidade da forma nos dois núcleos do

SOA analisados conjuntamente, o IFSP (Figura 3) e o NTL (Figura 4), a maioria apresentou-

se de uma maneira ovalada, mas também foi possível observar muitos botões terminais

arredondados e poucos num modelo mais alongado. Presença de fibras, tanto curtas como

umas mais alongadas, algumas delas chegando a conter mais de um botão terminal. Os

valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões desses núcleos podem ser

vistos, em conjunto, na figura 5. A caracterização dos botões do NTD bem como os valores

descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões desse núcleo foram analisados em

conjunto com os núcleos do complexo pré-tectal.

5.2. Colículo Superior

O CoS apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais CTb-IR principalmente

em sua camada superficial (Figura 6). Os botões terminais apresentaram uma variabilidade da

forma nos casos estudados. Em sua grande maioria apresentaram-se em forma ovalada, mas

podendo-se também observar botões em formatos arredondados, alongadas e triangulares,

esses em menores números. Presença de fibras e estas podendo conter mais de um botão

(Figura 6). Os valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões desse núcleo

podem ser vistos na figura 7.

36

5.3. Complexo Pré-Tectal

O complexo pré-tectal apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais CTb-IR

principalmente nos núcleos: NTO, NPO, NPA, NPP (Figuras 8 e 13), incluindo o NTD do

SOA, analisado em conjunto com esse complexo. O NTO contralateral apresentou botões

arredondados e ovalado, havendo uma maior aglomeração dos mesmos; presença de fibras,

algumas delas podendo conter mais de um botão terminal em sua extensão (Figuras 8, 9 e 10).

O mesmo padrão foi seguido pelo NTO ipsolateral (Figura 13). Nesse núcleo, a mediana da

área dos botões terminais foi de 0,46 (0,56-0,38), enquanto a média do perímetro foi de 2,50

(2,76-2,22) (Figura 16). O NPO contralateral foi caracterizado pela presença de botões

terminais nas formas ovaladas e arredondadas, presença de fibras, algumas contendo mais de

um botão terminal em sua extensão (Figuras 8 e 10). O mesmo padrão foi seguido pelo NPO

ipsolateral (Figura 13), porém, com botões terminais um pouco mais agrupados, aglomerados.

Nesse núcleo, a mediana da área dos botões terminais foi de 0,47 (0,60-0,37), enquanto a

média do perímetro foi de 2,52 (2,83-2,28) (Figura 16). O NPP, tanto o contralateral como o

ipsilateral, apresentaram botões terminais arredondados, mas em sua grande maioria

apresentaram-se na forma ovalada, botões espaçados, sem aglomeração, presença de fibras,

algumas contendo mais de um botão terminal em sua extensão (Figura 11). Nesse núcleo, a

mediana da área dos botões terminais foi de 0,54 (0,67-0,43), enquanto a média do perímetro

foi de 2,71 (3,03-2,43) (Figura 16). O NPA, tanto o contralateral como o ipsilateral, foram

caracterizados por botões terminais nas formas arredondadas e ovaladas, presença de fibras,

algumas delas contendo mais de um botão em sua extensão, a apresentando-se em uma forma

mais espaçada (Figura 14). Nesse núcleo, a mediana da área dos botões terminais foi de 0,46

(0,59-0,37), enquanto a média do perímetro foi de 2,50 (2,83-2,24) (Figura 16). O NTD

contralateral foi caracterizado com a presença de fibras, algumas delas podendo conter mais

de um botão terminal em sua extensão (Figura 12). Os botões apareceram nas formas

arredondadas e ovaladas. Esse mesmo padrão foi seguido pelo NTD ipsolateral. (Figura 13 e

15). Nesse núcleo, a mediana da área dos botões terminais foi de 0,46 (0,60-0,36), enquanto a

média do perímetro foi de 2,49 (2,84-2,23) (Figura 16). A análise por kruskal-wallis mostra

que há diferença significativa das medianas tanto no parâmetro de área (H=40,25; p=0,0001)

quanto de perímetro dos botões (H=43,11; p=0,0001). O teste post-hoc para comparações

múltiplas revela que essas diferenças se dão na comparação do NPP com os demais núcleos

(Figura 17)

37

Figura 2 – Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui

mostrando imunorreatividade contra subunidade b da toxina colérica nos núcleos: intersticial

do fascículo superior posterior (A), núcleo terminal lateral (B) e núcleo terminal medial (B’).

IFSP, núcleo intersticial do fascículo superior posterior; NTL, núcleo terminal lateral; NTM,

núcleo terminal medial. Barra: 300 µm em A e B’; 200 µm em B; 100 µm em C.

IFSP

A B

NTL

C

NTM

B’ TM

38


mostrando imunorreatividade contra subunidade b da toxina colérica no núcleo intersticial do

fascículo superior posterior (A, B e C). Em detalhe a área que foi submetida a medição dos

diâmetros de área e perímetro das células neurais (botões) do núcleo intersticial do fascículo

superior posterior (B). C representa a caixa delimitada em B. D mostra os botões após serem

trabalhados no Software Canvas X. IFSP, núcleo intersticial do fascículo superior posterior;

GLD, núcleo geniculado lateral dorsal. Barra: 300 µm em A; 100 µm em B; 100 µm em C.

D

B

IFSP

C

IFSP

IFSP

A

39


mostrando imunorreatividade contra subunidade b da toxina colérica no núcleo terminal

lateral (A, B e C). Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e

perímetro das células neurais (botões) do núcleo terminal lateral (B). C representa a caixa

delimitada em B. D mostra os botões após serem trabalhados no software Canvas X. NTL,

núcleo terminal lateral; GLD, núcleo geniculado lateral dorsal. Barra: 300 µm em A; 100 µm

em B; 100 µm em C.

C

NTL

B

NTL

A

NTL

GLD

D

40

Figura 5 – Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões do núcleo

intersticial do fascículo superior posterior e do núcleo terminal lateral do sistema óptico

acessório (A). Medição da área e perímetro dos botões do núcleo intersticial do fascículo

superior posterior e do núcleo terminal lateral do sistema óptico acessório (B).

A

B

41


mostrando imunorreatividade contra a subunidade b da toxina colérica no colículo superior (A

e A’). Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro das

células neurais (botões) do colículo superior (B). C representa a caixa delimitada em B. D

mostra os botões após serem trabalhados no software Canvas X. Aq, aqueduto mesencefálico;

CoI, colículo inferior; CoS, colículo superior; PAG, substância cinzenta pariarquedutal. Barra:

300 µm em A; 200 µm em A’; 100 µm em B; 100 µm em C.

A’

CoS

A

Aq

CoS

CoI

PAG

B C

D

42

Figura 7 – Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro dos botões do colículo

superior (A). Medição da área e perímetro dos botões do colículo superior (B).

A

B

43


mostrando imunorreatividade contra a subunidade b da toxina colérica nos núcleos: núcleo do

trato óptico, núcleo pré-tectal olivar, núcleo pré-tectal posterior, do complexo pré-tectal,

núcleo terminal dorsal, do sistema óptico acessório (A’). Em detalhe a área que foi submetida

a medição dos diâmetros de área e perímetro das células neurais (botões) do núcleo do trato

óptico e núcleo pré-tectal olivar do complexo pré-tectal (B’). C’ representa a caixa delimitada

em B’. D’ mostra os botões do núcleo do trato óptico (A) e núcleo pré-tectal olivar (B) após

serem trabalhados no software Canvas X. NTO, núcleo do trato óptico; NPO, núcleo pré-

tectal olivar; NPP, núcleo pré-tectal posterior; NTD, núcleo terminal dorsal. Barra: 300 µm

em A’; 100 µm em B’; 100 µm em C’.

NPO

NTO

NTD

A’ NTO

NPO

B’

D’ A

B

C’

NTO

NPO

NPP

44

Figura 9 – Em detalhe a área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro

das células neurais (botões) do núcleo do trato óptico (A). B representa a caixa delimitada em

A. C mostra os botões do núcleo do trato óptico após serem trabalhados no software Canvas

X. NTO, núcleo do trato óptico. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.

NTO

B

C

NTO

A

45


das células neurais (botões) do núcleo do trato óptico e núcleo pré-tectal olivar (A’). B’

representa a caixa delimitada em A’. C’ mostra os botões do núcleo do trato óptico (A) e

núcleo pré-tectal olivar (B) após serem trabalhados no software Canvas X. NTO, núcleo trato

ótico; NPO, núcleo pré-tectal olivar. Barra: 100 µm em A’; 100 µm em B’.

C’

NTO

NPO

A’

A

B

NTO

NPO

B’

46


das células neurais (botões) do núcleo do pré-tectal posterior (A). B representa a caixa

delimitada em A. C mostra os botões do núcleo pré-tectal posterior após serem trabalhados no

software Canvas X. NPP, núcleo pré-tectal posterior. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.

C

B

NPP

A

NPP

47


das células neurais (botões) do núcleo terminal dorsal (A). B representa a caixa delimitada

em A. C mostra os botões do núcleo terminal dorsal após serem trabalhados no Software

Canvas X. NTO, núcleo do trato óptico. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.

NTD

B

C

NTD

A

48


mostrando imunorreatividade contra a subunidade b da toxina colérica nos núcleos: núcleo do

trato óptico, núcleo pré-tectal olivar, núcleo pré-tectal anterior, núcleo pré-tectal posterior, do

complexo pré-tectal, núcleo terminal dorsal, do sistema óptico acessório (A’). Em detalhe a

área que foi submetida a medição dos diâmetros de área e perímetro das células neurais

(botões) do núcleo do trato óptico e núcleo pré-tectal olivar do complexo pré-tectal (B’). C’

representa a caixa delimitada em B. D’ mostra os botões do núcleo do trato óptico (A) e

núcleo pré-tectal olivar (B) após serem trabalhados no Software Canvas X. NTO, núcleo do

trato óptico; NPO, núcleo pré-tectal olivar; NPA, núcleo pré-tectal anterior; NPP, núcleo pré-

tectal posterior; NTD, núcleo terminal dorsal. Barra: 300 µm em A’; 100 µm em B’; 100 µm

em C’.

NTO

NPO NPA

NTD

NTO

NPO

B’

A

B

A’

NPP

NTO

NPO

C’ D’

49


das células neurais (botões) do núcleo pré-tectal anterior (A). B representa a caixa delimitada

em A. C mostra os botões do núcleo pré-tectal anterior após serem trabalhados no software

Canvas X. NPA, núcleo pré-tectal anterior. Barra: 100 µm em A; 100 µm em B.

A’

NPP

A B

C

NPA NPA

50


das células neurais (botões) do núcleo terminal dorsal do sistema óptico acessório (A). B

representa a caixa delimitada em A. C mostra os botões do núcleo terminal dorsal após serem

trabalhados no software Canvas X. NTD, núcleo terminal dorsal. Barra: 100 µm em A; 100

µm em B.

NPA

A

NTD

B

NTD

A

C

51

Figura 16 – Valores descritivos dos parâmetros de área e perímetro (Per.) dos núcleos do

complexo pré-tectal em conjunto com o núcleo terminal dorsal do sistema óptico acessório.

NPO, núcleo pré-tectal olivar; NTO, núcleo do trato óptico; NPA, núcleo pré-tectal anterior;

NTD, núcleo terminal dorsal; NPP, núcleo pré-tectal dorsal.

NPO NTO NPA NTD NPP

Área

(µm²)

Per.

(µm)

Área

(µm²)

Per.

(µm)

Área

(µm²)

Per.

(µm)

Área

(µm²)

Per.

(µm)

Área

(µm²)

Per.

(µm)

Mínimo 0,1900 1,640 0,2100 1,700 0,1600 1,530 0,1400 1,440 0,2000 1,770

Quartil

1 0,3700 2,283 0,3800 2,270 0,3700 2,243 0,3600 2,223 0,4325 2,430

Mediana 0,4700 2,520 0,4650 2,500 0,4600 2,500 0,4600 2,490 0,5450 2,715

Quartil

3 0,6000 2,838 0,5675 2,760 0,5900 2,838 0,6000 2,840 0,6700 3,038

Máximo 1,250 4,250 1,600 4,980 1,220 3,990 2,860 6,120 1,850 5,050

52

Figura 17 – Medição da área e perímetro dos botões do complexo pré-tectal e do núcleo

terminal dorsal do sistema óptico acessório. A análise por Kruskal-wallis mostra que há

diferença significativa das medianas tanto no parâmetro de área (H=40,25; p=0,0001) quanto

de perímetro dos botões (H=43,11; p=0,0001). O teste post-hoc para comparações múltiplas

se dão na comparação do NPP com os demais núcleos.

53

6. DISCUSSÃO

Os estudos sobre projeções retinianas possibilita uma melhor visualização dos

terminais axonais e um pouco sobre seu trajeto. Algo fundamental para compreensão do

funcionamento de diversos sistemas que utilizam a informação visual (Rouiller e Welker,

2000). A CTb, a subunidade B da toxina colérica, que foi introduzida como um traçador

neuroanatômico por Stoeckel e colaboradores em 1977, é um traçador axonal, altamente

sensível, que atua tanto retrogradamente como anterogradamente (Angelucci et al, 1996;

Gaillard et al, 2013), revelando detalhes morfológicos de arborizações terminais aferentes,

além de identificar alguns novos alvos da retina (Mikkelsen, 1992; Reiner et al., 1996; Ling et

al., 1998; Derobert et al., 1999; Lima, 2008; Engelberth et al., 2008; Morais et al., 2014). Sua

utilização como traçador das vias retinianas tem sido amplamente empregada em diversos

animais, como pombo (Shimizu et al, 1994), primatas (Nakagawa et al, 1998; Costa et al,

1999; Mitrofanis et al, 2004; Cavalcante et al, 2005; Engelberth et al, 2008; Lima et al, 2012)

e roedores (Youngstrom et al., 1991; Abrahamson e Moore, 2001; Mitrofanis, 2005; Gaillard

et al, 2013). No mocó, um roedor pertencente à família caviidae, vários alvos retinianos já

foram detectados utilizando CTb, como o NSQ e FIG (Nascimento Jr et al, 2010a), núcleo

médio dorsal do tálamo (Sousa, 2013; Nascimento Jr et al, 2010b) e núcleo paraventricular do

tálamo (Nascimento Jr et al, 2008), trabalhos estes que comprovam a eficácia da CTb para

estudos de traçados axonais nesta espécie. Como também a CTb tem sido usada

frequentemente para demonstrar a morfologia da arborização retiniana no mesencéfalo de

animais adultos como em ratos (Mikkelsen, 1992), hamster (Johnson et al., 1988; Ling et al.,

1997a,b, 1998), Camudongo (Miura et al., 1997), furão (Angelucci et al., 1996) e macacos

(Nakagawa et al., 1998).

No contexto das características sobre como as informações aferentes chegam em seus

alvos, diversos estudos demonstraram que a morfologia das fibras axonais e dos terminais

sinápticos apresentam diferenças importantes, e que estas também refletem em variações

funcionais, sobre como as informações são transportadas e processadas (Sherman e Guillery,

2011).

A informação visual é segregada em modalidades como cor, forma e movimento a

nível da retina (Livingstone e Hubel, 1988). Células ganglionares da retina compreendem

mais de uma dúzia de variados tipos, estruturas e funções (Masland, 2001; Wässle, 2004), e

diversas modalidades são transmitidas paralelas à distintas zonas do cérebro pelos seus

54

axônios (Rodieck, 1998). E para o sucesso do processo virtual requer que a luz refletida por

objetos distantes seja localizada com relação ao individuo que vê e ao ambiente que o cerca;

que ocorra algum tipo de identificação dos objetos com base em seus tamanhos, formas, cores

e na experiência prévia, que os movimentos dos objetos sejam detectados e, por fim, que o

reconhecimento dos objetos seja possível em toda a gama de condições de iluminação

normalmente experimentada pelo individuo em seu habitat. (Bear et al., 2008). Desta forma,

podemos afirmar que a visão é um processo ativo no qual movemos nossos olhos para

explorar o mundo. E os movimentos oculares apresenta um problema complexo para a

percepção: ocorrem cerca de três vezes por segundo e com cada movimento do olho uma nova

imagem inside sobre a retina. Mesmo assim, percebe-se um mundo visual estável. O

remapeamento da informação visual é um mecanismo neural que pode contribuir para a

estabilidade visual (para revisão, ver Berman e Colby, 2009)

As projeções retinianas também são importantes por enviarem informações para

estruturas do sistema de temporização circadiana, responsável pela geração e modulação dos

ritmos circadianos. Como já citado anteriormente, este sistema é composto por osciladores,

vias de entrada sincronizadoras e vias para efetores comportamentais (Rusak e Zucker, 1979;

Meijer e Rietveld, 1989; Morin, 1994; Turek, 1994, Cavalcante et al., 2006).

A existência da principal via sincronizadora desde sistema, o trato retinohipotalâmico

(TRH), foi confirmada em estudos realizados em várias espécies de mamíferos, incluindo

primatas do Velho e do Novo Mundo (Hendricson et al., 1972; Moore e Lenn, 1972; Moore,

1973; 1993; Costa et al., 1999; Canteras et al., 2011).

Projeções ópticas adicionais para estruturas usualmente não consideradas como parte

do sistema visual também foram descritas em várias espécies de mamíferos, tais como, o

núcleo pericentral do colículo inferior em gatos, ratos e macaco Rhesus (Itaya e Van Hoesen,

1982; Paloff et al., 1985), núcleo ântero dorsal do tálamo no mussaranho das árvores (Conrad

e Stumpf, 1975), núcleos da rafe em gatos e ratos (Foote et al., 1978; Shen e Semba, 1994) e

até mesmo estruturas telencefálicas, tais como o tubérculo olfatório e núcleo da banda

diagonal de Broca, em hamster, ratos, coelhos, ouriços, preguiças, morcegos, tamanduás,

Spalax ehrenberghi e Macaca fascicularis (Cooper et al., 1989; Levine et al., 1991;

Youngstrom et al., 1991).

O significado funcional das projeções da retina em núcleos fora do núcleo geniculado

lateral, CoS, complexo pré-tectal, SOA e NSQ continua a ser estabelecido. Está provado que

estes alvos principais, citados acima, estão associado com o sistema “formador de imagem”,

55

vias visuomotoras e sistema “não-formador de imagem”. É improvável que pequenas entradas

da retina identificadas em algumas outras estruturas desempenhem um significativo papel na

formação de imagem (Matteau et al., 2003).

Em relação aos núcleos aqui estudados, detectamos a presença de fibras e terminais

CTb-IR nos núcleos: NTL, NTD, IFSP incluindo uma região que se supõe ser o NTM, todos

do SOA; camada superficial do CoS e os núcleos: NTO, NPO, NPA e NPP do complexo pré-

tectal. Esses núcleos são importantes centros de controle de uma variedade de movimentos

oculares (Lui et al., 1995). Demonstrando assim a importância que se conheça anatômica e

fisiologicamente essas estruturas. Muito interesse tem sido demonstrado na via neuro-

anatômica envolvendo o controle dos movimentos dos olhos (Clarke et al., 1987).

O presente estudo é um passo preliminar na investigação sobre os caminhos neurais

subservindo o movimento ocular em sagui (Callithrix jachus), primatas do Novo Mundo em

que a anatomia dos núcleos envolvidos é similar a de outros macacos (Reis e Machado, 1981).

Além disso, estudar as diferenças entre os botões é importante para entender a fisiologia da

integração multissensória – podendo ter propriedades fisiológicas distintas.

6.1. Sistema Óptico Acessório

Fluxo óptico é a principal fonte de informação sobre o auto movimento e a

composição tridimensional do ambiente durante a locomoção. É processado pelo SOA em

todos os vertebrados (Eckmeier e Bischof, 2008).

Em nossos resultados, o SOA apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais

CTb-IR em todos os seus núcleos, inclusive em uma região que acreditamos ser o NTM. Os

botões terminais apresentaram uma pequena variabilidade da forma de dois núcleos do SOA

analisados conjuntamente, o NTL e o IFSP, a maioria apresentou-se em uma maneira ovalada,

mas também foi possível observar muitos botões terminais arredondados e poucos num

formato mais alongado. Presença de fibras, tanto curtas como algumas mais alongadas,

algumas delas chegando a conter mais de um botão terminal por toda sua extensão.

O SOA de mamíferos acredita-se ser constituído de dois pequenos feixes de fibras

óticas, o fascículo inferior e superior do trato óptico acessório, e três núcleos retino-

recipientes no mesencéfalo anterior, o NTM, NTL, NTD (Hayhow, 1959; Hayhow et al.,

1960). O NTM está ainda dividido em setores dorsal (NTMd) e ventral (NTMv) baseado em

critérios citoarquitetonicos e conectividade de fibras nervosas (Hayhow et al., 1960; Giolli et

56

al., 1984). O NTM, o principal núcleo do SOA de roedor, tem sido descrito como uma

estrutura alongada localizada na porção ventral do tegmentum mesencéfalico, medial ao

pedúnculo cerebral e substancia nigra, caudal ao núcleo subtalâmico, lateral ao corpo mamilar

o ao núcleo interpeduncular e, especialmente no porquinho-da-india (Cavia porcellus), rostral

ao inicio do nervo oculomotor (Laatsch 1969). No entanto, em Macacos do Velho Mundo,

tem havido alguns relatos conflitantes sobre a presença e localização do NTM, enquanto que a

localização do NTL e NTD é bem caracterizada (Nakagawa et al., 1998). Em mamíferos, este

núcleo, tipicamente o mais conspícuos dos três núcleos terminal originalmente descrito por

Hayhow (1959 e 1966) e Hayhow et al (1960) foi considerado tanto vestigial ou ausente em

primatas (ver Weber, 1985). Cooper et al, 1990, Cooper e Magnin, 1986 e Lui et al.,1995

relataram que uma divisão ventral do NTM não foi observada no macaco, entretanto Itaya e

Van Hoesen, 1983 e Terubayashi e Fujisawa, 1988, apontaram que algumas fibras retinofugal

marcadas poderia ser traçada para uma pequena área contralateral localizada entre a parte

mais caudal do corpo mamilar e a borda medial do pedúnculo cerebelar do macaco do Velho

Mundo, o que sugere a presença de uma divisão ventral do NTM (Nakagawa et al., 1998).

Além disso, Cooper et al., 1990 e Cooper e Magnin, 1986;1987, descreveram a projeção

retiniana para um grupo de neurônios na formação reticular mesencefálica, que consideravam

ser homologo a divisão dorsal do NTM; Nakagawa et al., 1988, discordou dessa opinião

(Nakagawa et al., 1998). Devido a essa controvérsia, o grupo re-analisou a localização dos

terminais retinofugal no NTM do macaco japonês, Macaca fuscata, usando a CTb como

traçador anterógrado (Nakagawa et al., 1998). O estudo de Nakagawa et al., 1998 confirmou e

ampliou resultados anteriores sobre as projeções retinianas a divisão ventral e dorsal do NTM

do SOA em macacos do Velho Mundo (Nakagawa et al., 1998). A existência da via

retinofugal para a divisão ventral do NTM foi incerto em estudos anteriores sobre projeções

retinianas para Macacos do Velho Mundo (Giolli, 1963; Hendrickson et al., 1970; Lin e

Giolli, 1979; Weber e Giolli, 1986; Kaas e Huerta, 1988; Zhang e Hoffmann, 1993), com

exceção de três relatos positivos (Gillilan, 1941; Itaya e Van Hoesen, 1983; Terubayashi e

Fujisawa, 1988). Dois registros (Itaya e Van Hoesen, 1983; Terubayashi e Fujisawa, 1988)

confirmaram a conclusão de Gillilan (Gillilan, 1941), e indicou uma via retiniana para a

divisão ventral do NTM do “Macaco Monkey” com traçadores HRP (Horseradish peroxidase)

ou WGA-HRP (HRP conjugado com aglutinina de germe de trigo) (Nakagawa et al., 1998).

No entanto, Cooper et al, 1990 e Cooper e Magnin, 1986 relataram uma ausência da entrada

retiniana para a divisão ventral do NTM em macaco Rhesus após a injeção intraocular de

57

aminoácido radioativo (Nakagawa et al., 1998). Ao contrário dos registros em “macaco

Monkey” (Cooper et al., 1990; Cooper e Magnin, 1986), Nakagawa et al., 1998 demonstrou

em seus estudos a projeção retinofugal para a divisão ventral do NTM e a organização

citoarquitetonica destes núcleos no macaco japonês (Nakagawa et al., 1998). A localização

desses núcleos mostrado nesse estudo é similar as do esquilo, tupaia e macaco esquilo (ver

Simpson, 1984); esta região foi localizada perto da superfície ventral da região tegmental

apenas medial à borda do pedúnculo cerebral ao nível da parte caudal do corpo mamilar

(Nakagawa et al., 1998). Em nosso estudo não foi possível localizar com precisão o NTM,

apenas identificamos uma região que acreditamos ser o NTM. No entanto, seria preciso mais

estudos para essa confirmação.

O significado funcional desta estrutura visual permaneceu obscuro e praticamente

desconhecido para um longo período de tempo (Lui et al., 1990). Depois as hipóteses de que

estava envolvido na regulação dos ritmos circadiano e discriminação a sensibilidade luminosa

tinham sido avançadas (ver revisão por Simpson, 1984), o papel da NTM e seu homólogo em

não-mamíferos, o núcleo da ROB, na mediação da reflexo optocinético vertical foi descoberto

com base em estudos eletrofisiológicos e de lesão (Walley, 1967; Lazar, 1983; Fite et al.,

1979; Simpson et al., 1979; Grasse e Cynader, 1982; Clement e Magnin, 1984) e

posteriormente através de investigações metabólicas usando o método de autorradiografia d

14C-2-desoxiglucose (McKenna e Wallman, 1981,em pombos; Biral et al., 1987, em ratos;

Lui et al., 1987; Benassi et al., 1989, em porcos-da-índia).

Em nossos resultados podemos observar que a inervação para o SOA é bilateral, com

predominância contralateral, idêntico ao que foi encontrado em um estudo realizado no

Esquilo terrestre da Califórnia (Spermophilus beecheyi), que tem um SOA bem desenvolvido

(Major et al., 2003). Nesse trabalho também foi demonstrado que o hipotálamo, o SOA, o

pré-tecto, o complexo geniculado lateral, o pulvinar e o CoS todos recebem uma significativa

inervação contralateral e uma menor inervação ipsilateral (Major et al., 2003). A organização

do SOA é altamente conservada entre os vertebrados (Major et al., 2003). Um padrão similar

também foi encontrado no rato-da-relva do Nilo, onde mostrou que os principais núcleos

terminais do SOA contralateral para o olho injetado são substancialmente marcados e

nenhuma entrada ipsilateral foi encontrada no NTD e no IFSP (Gaillard et al, 2013). Lin e

Giolli (1979) mostraram que o NTL recebe uma projeção bilateral com predominância

contralateral, mesmo mostrando um componente ipsolateral significativo.

58

O SOA no mesencéfalo de mamíferos é uma importante estrutura subcortical e sugere-

se ser a primeira estação primária de retransmissão pós-retiniana na via de mediação do

reflexo optocinético vertical e horizontal, uma classe de compensação dos movimentos

oculares que serve ao proposito funcional de estabilização de imagens na retina durante o

auto-movimento e/ou do movimento em volta (Simpson, 1984). O SOA, portanto, é

necessário para uma boa acuidade visual (Westheimer e Mckee, 1975) e também para a

velocidade de discriminação (Nakayama, 1981), ou seja, os neurônios do SOA mostram

seletividade a velocidade e direção (Simpson et al., 1979) e respondem bem a objetos

brilhantes que se movem a velocidade lenta, e suas direções preferenciais correspondem

aproximadamente para cima, para baixo, ou temporo-nasal movimento no campo visual

(Simpson et al., 1979). Portanto os núcleos do SOA estão recebendo muita atenção

atualmente porque eles são importantes para o controle do olhar e interação visual – vestibular

(Simpson et al., 1988) .

Podemos chegar a conclusão que o SOA em primatas repete a organização básica do

SOA visto em espécies não-primatas com poucas modificações, ou seja, o NTL torna de

longe, o seu núcleo mais evidente (mais visível), enquanto o NTMd é nitidamente de tamanho

reduzido e o NTMv é praticamente ausente. (ver Simpson et al., 1988).

6.2. Colículo Superior

Há uma extensa literatura sobre a organização estrutural e funcional do colículo

superior em mamífero (Sprague et al., 1972; Goldberg e Robinson, 1978; Gordon, 1975). O

CoS é uma estrutura laminada que forma duas eminências achatadas localizadas no teto

rostral do mesencéfalo e que desempenha um papel importante integrando informações de

vários sistemas sensoriais (ou seja, visão, audição e somatossensação), bem como na geração

de sinais que resultam em movimentos dos olhos, orelhas, cabeça e do corpo (ver Stein e

Meredith, 1993), portanto, estudos comprovam que a manutenção da integridade do CoS é

essencial para manter no animal a capacidade de integrar sinais visuais e auditivos no controle

do comportamento de orientação (Burnett et al., 2004), constituindo assim um modelo de

estrutura favorável para os estudos de processos de transformação sensório-motora (Grantyn e

Grantyn, 1982). Em resumo, os sistemas auditivos e visuais inicialmente codificam a

informação espacial em quadros de referência distintos. No CoS, no entanto, ambas as

modalidades convergem para formar mapas topograficamente alinhados de espaço sensorial

59

(Stein e Meredith, 1993). Uma questão interessante refere-se ao processo pelo qual a visão

influencia o desenvolvimento do mapa auditivo. Animais privados de pistas visuais normais

durante a infância desenvolver representações auditivas anormais (Withington-Wray et al,

1990; Knudsen et al, 1991; Withington, 1992; King e Carlile, 1993). Em aves e répteis o teto

óptico é a estrutura homóloga ao CoS dos mamíferos e de modo geral constitui uma estação

primária das vias ópticas. Iniciando-se com os répteis, à medida que um número maior de

fibras provenientes da retina fazem uma conexão mais forte com o tálamo e

consequentemente com o córtex visual, o papel funcional do CoS na discriminação visual vai

diminuindo progressivamente (Parent, 1996). O CoS é formado na maioria dos mamíferos por

sete camadas, classificadas do sentido da periferia para a substância cinzenta periaquedutal

em superficiais, intermediárias e profundas. Segundo Huerta e Harting (1984), as superficiais

vão da I a III, as intermediárias são as camadas IV e V e profundas VI e VII (ver Kaas e

Huerta, 1988). Alguns autores costumam classificar as intermediárias junto com as

superficiais (Parent, 1996). Essa divisão é bastante interessante do ponto de vista funcional, já

que as camadas superficiais detêm função visual e as profundas são polimodais.

As células das camadas superficiais respondem a estímulos de movimentação no

campo visual (Sterling e Wickelgren, 1969), facilitando desta forma a orientação e busca

visual. Já as células das camadas profundas respondem a estímulos auditivos, somáticos e

mesmo visuais, às vezes separados e às vezes em diversas combinações (Gordon, 1972). Cada

colículo é interconectado via comissura intercolicular, a qual tem sido proposta participar do

papel de orientação do olhar. Essa interconexão tem sido demonstrada em várias espécies,

incluindo primatas não-humanos e humanos (Tardif e Clarke, 2002).

Em nossos resultados, o CoS se apresentou fortemente marcado por fibras/terminais

CTb-IR principalmente em sua camada superficial assim como demonstrado anteriormente

em outros primatas (ver Kaas e Huerta, 1988) e em outros vertebrados (Itaya e Van Hoesen,

1982; Paloff et al., 1985), mostrando uma inervação mais densa nas camadas mais

superficiais e à medida que vamos chegando às camadas intermediarias essa densidade vai

diminuindo. Os botões terminais apresentaram uma variabilidade da forma nos casos

estudados. Em sua grande maioria apresentaram-se em forma ovalada, mas podendo-se

também observar botões nas formas arredondadas, alongadas e triangulares, esses em menores

números. A característica dos botões podem influenciar na atividade multissensorial do CoS

(Fuentes-Santamaria et al., 2008). O CoS apresenta diversas funções multissensoriais como

por exemplo, em algumas espécies, os sinais coliculares podem também ser usados para

60

direcionar a boca ou na direção da comida ou para defesa (Rato: Redgrave et al., 1996).

Porém a ênfase desse trabalho é no controle colicular do olhar, no entanto, não se deve

esquecer que existe especializações, e que a função do núcleo colicular não é apenas uma e

sim possuindo várias vertentes como: controlar o comportamento, direcionar o animal para os

objetos de interesse e afastar de objetos que podem representar ameaça (May, 2006). Mesmo

um exame superficial do CoS de diferentes mamíferos, foi demonstrado que há variações

entre as espécies de mamíferos e dentre a mais notável é que a camada superficial varia

consideravelmente de tamanho (May, 2006).

A distribuição dos terminais retinianos foi descrita em diversas espécies de primatas

(Tigges e Tigges, 1981; Perry e Cowey, 1984). Em trabalho com macacos-prego (Cebus

apella), assim como em outros primatas já estudados, o CoS recebe projeção bilateralmente,

sendo que, a distribuição ipsilateral difere da distribuição contralateral. As projeções

ipsilaterais terminam profundamente, de forma mais esparsa e descontínua em relação às

projeções contralaterais (Frazão, 2008). O que vai de encontro a nossos resultados, onde

demonstramos no sagui um padrão de projeção bilateral, em que não encontramos diferenças

entre projeções contralateral e ipsolateral em sua porção mais rostral, porém, em sua porção

mais caudal, encontramos uma maior projeção contralateral.

O CoS do rato-da-relva do Nilo exibe uma proeminente forma de camadas em secções

coronais (Gaillard et al, 2013). As sete camadas clássicas podem ser razoavelmente

distinguidas pelo método de Nissl.

Neurônios que compõem o CoS formam camadas que refletem suas projeções

aferentes e eferentes e características fisiológicas (Albano et al.,1978; Moschovakis et al.,

1988; Bourne e Rosa, 2003). Estudos anteriores também tem demostrado que estas diferenças

funcionais e conectivas são refletidas no corpo celular e morfologia dendritica (Rhoades et al.,

1991).

6.3. Complexo Pré-Tectal

Diferentemente do SOA e do CoS em que foi feita uma analise descritiva, no

complexo pré-tectal foi realizada uma analise comparativa entre os núcleos, com a finalidade

de melhor delimitar este complexo. Por esse motivo foi analisado o NTD do SOA em

conjunto com os núcleos do complexo pré-tectal. Devido a grande diversidade celular do

61

complexo pré-tectal e algumas dificuldades em delimitar claramente suas subdivisões, o

núcleo e localização destas varia de autor para autor.

Nos mamíferos, o complexo pré-tectal foi subdividido em cinco núcleos: o NTO,

NPO, NPP, NPA e NPM (Berman, 1977; Hutchins, 1991). Alguns estudos ampliaram, no

entanto, as projeções da retina tanto para o NPA como para NPM, pelo fato de ser uma

questão de debate a existência ou não de projeção retiniana para esses núcleos em mamíferos

(Hutchins e Weber, 1985; Hutchins, 1991; Zhang e Hoffmann, 1993). Os autores em geral

concordam que a projeção da retina para as zonas do pré-tecto são difíceis de distinguir em

secções coronais (Matteau et al., 2003).

O complexo pré-tectal apresentou-se fortemente marcado por fibras/terminais CTb-IR

principalmente nos núcleos: NTO, NPO, NPA, NPP. Padrão similar encontrado em gatos,

onde um trabalho também usando a CTb, observou densa marcação em grande parte do NTO,

do NPO e do NPP, porém, apresentou uma escassa marcação dos terminais no NPA e NPM

(Matteau et al., 2003); e também encontrado em roedores, como por exemplo no rato-da-

relva-do Nilo, em que o trato óptico principal atinge mais de seis núcleos pré-tectal, isto é, o

NPA, o núcleo limitante posterior (PLi), NPO, NPM, NPP e o NTO. Todos os núcleos

recebem entrada visual bilateral, com predominância contralateral (Gaillard et al., 2013).

Ainda neste trabalho, o núcleo NPA pode ser dividido em dorsal (NPAd) e uma divisão

ventral (NPAv) de acordo com diferenças de densidades celulares (Gaillard et al., 2013).

Terminais derivados ipsilateralmente se assemelham as do olho contralateral (Gaillard et al.,

2013). Padrão semelhante ao encontrado em nossos resultados, com exceção da divisão dorsal

e ventral do NPA.

O NTD contralateral foi caracterizado com a presença de fibras, algumas delas

podendo conter mais de um botão terminal em sua extensão. Observamos que há uma

projeção bilateral da retina para este núcleo, porém, com uma predominação contralateral. Em

Reshus (Lin e Giolli, 1979), este núcleo recebe tanto projeção contralateral com um pequeno

componente ipsolateral, destacando, dessa forma, um padrão muito semelhante ao que

encontramos no sagui. Os botões apareceram nas formas arredondadas e ovaladas, com um

mesmo padrão sendo seguido pelo NTD ipsolateral. O NTO contralateral apresentou botões

arredondados e ovalado, havendo uma maior aglomeração dos mesmos; presença de fibras,

algumas delas podendo conter mais de um botão terminal em sua extensão. O mesmo padrão

foi seguido pelo NTO ipsolateral. Concluímos que há uma projeção bilateral da retina para

esse núcleo, diferente ao que já foi encontrado em roedores murinos (Kato et al., 1992;

62

Aarnouste et al., 1995; Bai et al., 2001; Hannibal e Fahrenkrug, 2004), hamsters (Morin e

Blanchard, 1997; Muscat et al., 2003) e esquilo terrestre (Major et al., 2003) onde uma

esparsa entrada derivada ipsilateralmente para o NPO foi observado. Esta entrada está bem

definida no rato-da-relva-do Nilo (Gaillard et al, 2013).

O NTD e o NTO são centros visuais primários apresentando um papel essencial na

geração dos movimentos oculares de fase lenta durante nistagmo optocinético horizontal

(Telkes et al., 2001).

O NPO contralateral foi caracterizado pela presença de botões terminais nas formas

ovaladas e arredondadas, presença de fibras, algumas contendo mais de um botão terminal em

sua extensão. O mesmo padrão foi seguido pelo NPO ipsolateral, porém, com botões

terminais um pouco mais agrupados, aglomerados. O NPA contralateral foi caracterizado por

botões terminais nas formas arredondadas e ovaladas, presença de fibras, algumas delas

contendo mais de um botão em sua extensão, a apresentando-se em uma forma mais espaçada.

O NPA ipsolateral seguiu o mesmo padrão, com uma predominação de botões terminais na

forma ovalada. Padrão idêntico ao encontrado no rato-da-relva-do Nilo, em que o NPA é

composto por células de tamanho médio (13.2 ± 1.6µm, n=118) ovoide ou piriforme (Gaillard

et al, 2013). A divisão dorsal, principalmente em sua borda, é limitada por fibras fortemente

marcadas de grande calibre inicialmente ocorre dentro do braço do colículo superior. A

maioria dessas fibras vira para baixo e termina quase que imediatamente, enquanto que a

maioria espalha mais profundamente no centro do NPAd. O NPAv é desprovido de entrada

retiniana significativa. A maioria dos terminais tem um diâmetro muito pequeno e exibe uma

característica de configuração tipo cordão que engloba pequenas varicosidades alongadas

(2.41± 0.39µm, n=44) e botões terminais esféricos (2.07 ± 0.44 µm em diâmetro, n=47).

(Gaillard et al., 2013).

O NPP contralateral apresentou botões terminais arredondados, mas em sua grande

maioria apresentaram-se na forma ovalada, botões espaçados, sem aglomeração, presença de

fibras, algumas contendo mais de um botão terminal em sua extensão. O NPP ipsolateral

seguiu o mesmo padrão, porém com botões terminais e fibras mais aglomerados. Há uma

diferença no que por exemplo, foi encontrado no rato-da-relva-do Nilo em que a projeção para

o NPP é visivelmente maior que aqueles encontrados em camundongos, ratos e esquilos

terrestres (Scalia, 1972; Perry e Cowey, 1979; Major et al., 2003). O impacto funcional destas

diferenças topográficas entre as espécies é atualmente desconhecida (Gaillard et al, 2013). Por

63

isso a necessidade de se estudar em um maior número de espécies possíveis, incluindo os

primatas, como o sagui.

Em uma analise comparativa daqueles núcleos do complexo pré-tectal, o NPP foi o

único que apresentou uma diferença em relação a área e perímetro.

Com base na morfologia neuronal, neurônios CTb-IR do pré-tectal são provavelmente

células de projeção, devido a pericários retrogradamente marcados a partir do GLD,

mostrando tamanhos similares e distribuição característica destes neurônios (Clarke et al.,

1987).

O NTO e o NPO recebem uma extensa entrada primária da retina (Simpson et al.,

1988), dado também encontrado em nossos resultados e além disso, observamos que há uma

integração entre eles, dificultando um pouco suas delimitações, o que corrobora com o

trabalho de Büttner-Ennever e colaboradores, 1996, no qual demonstrou que em primatas, o

NPO é completamente incorporado dentro do NTO, de modo que investigações

neuroanatômicas sobre o NTO sempre envolve o NPO também. Mas com base em

estimulação, lesão e estudos anatômicos, a função do NPO é considerada completamente

diferente do NTO (Büttner-Ennever et al., 1996). Ambos os núcleos são envolvido em

reflexos visuo-motores; o NTO no nistagmo optocinético horizontal (Simpson et al., 1988), e

o NPO no reflexo pupilar a luz (Trejo e Cicerone, 1984). O NTO foi estudado com grande

detalhe no nível ultraestrutural, por meio de coloração Golgi (Nunes Cardozo e van der Want,

1987), por traçadores (Nunes Cardozo e van der Want, 1990) e por imunoistoquímica (Nunes

Cardoso et al., 1991; 1994; van der Want e Nunes Cardozo, 1988).

Segundo um trabalho com lesões em macacos, realizado por Yakushin et al, 2000,

podemos inferir a importância do NTO no acompanhamento (rastreamento) de objetos

durante a perseguição e na manutenção da estabilidade do olhar durante o movimento da

cabeça que produz movimento campo completo do visual que o cercam. Podemos inferir que

o NTO é uma estrutura fundamental para manter a estabilidade do olhar durante o movimento

da cabeça em um ambiente iluminado (Yakushin et al., 2000)

O NTO e os núcleos do SOA participam da geração do nistagmo optocinético, este

processo é gerado em resposta ao movimento contínuo do campo visual, sendo que, as

características do nistagmo optocinético dependem de vários fatores, por exemplo, estado

atencional, distância do objeto, fixação no campo visual ou movimento sacádico do objeto de

interesse (Pola e Wyatt, 1993).

64

O NPO contém neurônios sensíveis à luminosidade, que auxilia o reflexo pupilar à luz,

mostrando um aumento no padrão de disparo após a exposição à luminosidade crescente

(Clarke e Ikeda, 1985a,b), ou seja, o reflexo pupilar a luz basicamente é a constrição do

músculo da íris, em resposta à iluminação da retina (Young e Lund, 1998).

O reflexo pupilar a luz é uma parte importante no exame neurológico de vitimas de

traumas. Depois do gerenciamento das vias aéreas, respiração e circulação, uma avaliação

mais concisa completa do sistema nervoso central é necessária para identificar as vítimas com

potencial lesão cerebral ou medular. O reflexo pupilar à luz é uma ferramenta de triagem

rápida no diagnóstico de lesões de massa intracraniana e danos ao hipotálamo, mesencéfalo,

ou ponte (Plum e Posner, 1980). Quanto melhor se conhecer as regiões envolvidas mais

rápido e melhor será o diagnóstico. E também tem provado ser um excelente indicador não

invasivo de doenças neurológicas e função visual (Young e Lund, 1998). Este teste

relativamente simples também foi utilizado para testar a eficácia de transplantes da retina

(Klassen e Lund, 1987; 1988) como também de transplantes de fotorreceptores intraretiniano

(del Cerro et al., 1991; Silverman et al., 1992; Whitely et al., 1996), bem como para o estudo

do impacto funcional da degeneração de fotorreceptores em doenças degenerativas da retina

herdadas (Trejo et al., 1989; Whiteley et al., 1993; 1994).

As vias neurais centrais subjacentes a esse reflexo foi completamente definido. A íris é

inervada por nervos ciliares curtos cujos corpos celulares estão no gânglio ciliar, o qual é

inervada pelo núcleo EW (Warwick, 1954; Sillito e Zbrozyna, 1970). Os aferentes do EW tem

sido assunto de muitos debates, e parecem diferir entre as espécies, mas há evidências que em

ratos se defende uma projeção direta do NPO (Young e Lund, 1998).

Baseado em nossas observações morfológicas, sugere-se que neurônios contendo CTb

pode apresentar um papel nas várias funções pré-tectais como o nistagmo optocinético,

reflexo pupilar e modular a atividade do núcleo transmissão subcortical visual

65

7. CONCLUSÃO

I. Nesse estudo foi possível fazer o mapeamento da projeção retiniana para os

núcleos que formam o sistema óptico acessório, para as camadas superficiais do

colículo superior e para os núcleos do complexo pré-tectal através da injeção

intraocular da CTb.

II. Através da projeção retiniana encontramos uma região que acreditamos ser o

núcleo terminal medial do sistema óptico acessório.

III. A caracterização (medição da área e do diâmetro) dos botões sinápticos presentes

nas fibras/terminais imunorreativos a CTb que inervam os núcleos do complexo

pré-tectal nos possibilitou fazer uma melhor delimitação desses núcleos.

66

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo é um passo preliminar na investigação sobro os caminhos neurais

subservindo o movimento ocular em sagui (Callithrix jachus), primata do Novo Mundo em

que a anatomia dos núcleos envolvidos é similar a de outros macacos, representando assim,

um sujeito experimental interessante para nosso estudo e objetivos. Os estudos sobre

projeções retinianas possibilita uma melhor visualização dos terminais axonais e um pouco

sobre seu trajeto. Além disso, estudar as diferenças entre os botões é importante para entender

a fisiologia da integração multissensória. Demonstrando assim a importância que se conheça

anatômica e fisiologicamente essas estruturas. Muito interesse tem sido demonstrado na via

neuro-anatômica envolvendo o controle dos movimentos dos olhos

Neste trabalho conseguimos concluir todos os objetivos propostos e desta forma, temos

uma ferramenta importante que pode nos servir com base para trabalhos futuros em que se

deve fazer uma identificação neuroquímica das estruturas aqui estudas.

67

9. REFERÊNCIAS*

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