UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

ISAMIRE SILVA ANDRADE

MAPEAMENTO DA AUTOINCOMPATIBILIDADE SEXUAL DO CACAU E CERTIFICAÇÃO GENÉTICA DOS CLONES TSH-1188 E CCN-51 POR MEIO DE

MARCADORES MICROSSATÉLIES

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Julho de 2009

ii

ISAMIRE SILVA ANDRADE

MAPEAMENTO DA AUTOINCOMPATIBILIDADE SEXUAL DO CACAU E CERTIFICAÇÃO GENÉTICA DOS CLONES TSH-1188 E CCN-51 POR MEIO DE

MARCADORES MICROSSATÉLIES Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, para a obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal. Área de concentração: Melhoramento de Plantas e Biotecnologia Orientador: Prof. Ronan Xavier Corrêa

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Julho de 2009

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ISAMIRE SILVA ANDRADE

MAPEAMENTO DA AUTOINCOMPATIBILIDADE SEXUAL DO CACAU E CERTIFICAÇÃO GENÉTICA DOS CLONES TSH-1188 E CCN-51 POR MEIO DE

MARCADORES MICROSSATÉLIES

Ilhéus, BA, 14 de julho de 2009

Ioná Santos Araújo - DS UFERSA

Dário Anhert - PhD UESC

Ronan Xavier Corrêa - DS UESC

(Orientador)

iv

DEDICATÓRIA

A minha amada Erika, “luz da minha vida”, pelo o amor e incentivo.

Aos meus pais, Ezaú e Maria, incansáveis lutadores pela minha educação, e a toda

minha família, pela paciência e compreensão pela minha ausência em tantos

momentos, e a todos aqueles que como eu, acreditam que com Fé, perseverança,

capacidade e dedicação é possível chegar lá.

v

AGRADECIMENTO

A Deus, pela infinita bondade, constante proteção e por mais esta graça

concedida.

Ao Prof. Ronan Xavier Corrêa, meu orientador, pessoa singular que tive o

prazer de conhecer, pela confiança depositada e amizade durante toda minha vida

acadêmica.

A Profa. Ioná Santos Araújo, uma das principais responsáveis pela realização

deste trabalho, pela atenção, comprometimento e cuidado.

Ao Prof. Dário Ahnert, pelo planejamento e implantação do experimento de

campo, e pelos ensinamentos que me foram prestados.

A Dra. Regina Celle Rebouças Machado, pela implantação e manutenção do

experimento em campo e pela ajuda na obtenção dos dados fenotípicos.

Ao Dr. Uilson Vanderlei Lopes, pela ajuda e pela colaboração

À Universidade Estadual de Santa Cruz, pela oportunidade e realização do

curso e pela disponibilidade da infraestrutura laboratorial.

À Almirante Cacau, M&M Mars, pela infraestrutura de campo, disponibilidade

de pessoal para condução dos experimentos em campo.

À FAPESB, pela concessão da minha bolsa de estudos e pelo financiamento

do projeto.

Aos colegas do laboratório Mariana, Claudine, Bruna, Jeiza, Willian, Daniela e

Samuel pelo companheirismo e pela ajuda.

vi

A amiga Márcia Cristina da Silva Branco, pela sua dedicação e ajuda nos

trabalhos iniciais desta Dissertação.

Aos colegas mestrandos, pela amizade e colaboração, em especial ao amigo

Lúcio Mauro, pelo companheirismo e incentivo em todo o andamento do curso.

Aos meus amigos, Carlos Augusto, Lucas, Lúcio Mauro, Francisca, Ittana,

pela companhia e convivência, e companeirismo.

Aos queridos amigos de Itajú do Colônia, Jailson, César, Roberto, Marleide,

José Antônio, pelo incentivo e força.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal, Curso

de Mestrado, pelos ensinamentos.

À coordenação e aos funcionários do Colegiado do Programa de Pós-

graduação em Produção Vegetal, pelo imprescindível apoio.

Aos funcionários da Fazenda Almirante, Babito, Nêgo, Ressurreição, Goiano e

em especial Valdevino, pela ajuda incondicional nos trabalhos em campo.

A minha família e a família de minha esposa, pelo apoio durante todo o curso,

pela segurança e pela força nos momentos difíceis.

Enfim, a todas as pessoas que tiveram participação direta ou indireta na

realização deste trabalho.

Obrigado.

vii

ÍNDICE

EXTRATO ............................................................................................................... ix

ABSTRACT ............................................................................................................ xi 1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 4

2.1 Origem e dispersão do cacaueiro .................................................................. 4

2.2 Divergência em populações naturais e autoincompatibilidade ...................... 5

2.3 Panorama geral da cacauicultura .................................................................. 8

2.3.1 Distribuição geográfica ........................................................................ 8

2.3.2 Importância sócio-econômica .............................................................. 9

2.3.4 A cacauicultura baiana e a vassoura-de-bruxa ................................. 10

2.4 Aspectos genéticos e botânicos do cacau ................................................... 11

2.5 Biologia floral e sistemas de cruzamento .................................................... 13

2.6 Incompatibilidade genética em plantas ........................................................ 16

2.6.1 Autoincompatibilidade gametofítica ................................................... 18

2.6.2 Autoincompatibilidade esporofítica .................................................... 18

2.7 Sistema de incompatibilidade sexual em cacaueiro .................................... 20

2.7.1 Determinação da compatibilidade sexual .......................................... 24

2.8 Bancos de germoplasma e certificação genética ......................................... 26

2.9 Marcadores moleculares e desenvolvimento de mapas de ligação ............. 28

3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 35

3.1 Material vegetal ........................................................................................... 35

3.2 Caracterização da população quanto à compatibilidade sexual .................. 36

3.3 Caracterização morfo-fisiológica dos frutos ................................................. 37

3.4 Obtenção de dados moleculares ................................................................. 38

3.4.1 Extração de DNA dos genitores e progênies F1 ................................ 38

3.4.2 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 .................... 39

3.4.2.1 Reações RAPD ......................................................................................... 39

viii

3.4.2.2 Reações microssatélites ........................................................................... 40

3.4.3 Genotipagem da população segregante ........................................... 41

3.4.4 Avaliação do polimorfismo da população segregante e de ligação entre

marcadores e características ........................................................... 41

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 43

4.1 Determinação da compatibilidade sexual .................................................... 43

4.2. Caracterização morfo-fisiológica dos frutos ................................................ 46

4.2.1 Cor do fruto ....................................................................................... 46

4.2.2 Número de sementes por fruto .......................................................... 48

4.3 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 ............................... 51

4.4 Segregação e ligação genética .................................................................... 57

5 CONCLUSÕES.................................................................................................. 63

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 64

ix

EXTRATO

Andrade, Isamire Silva, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, julho de 2009. Mapeamento da autoincompatibilidade sexual do cacau e certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 por meio de marcadores microssatélies. Orientador: Ronan Xavier Corrêa.

Os diferentes níveis de compatibilidade sexual apresentado pelo cacaueiro podem

ser responsáveis por grandes alterações dos níveis de produção, pois os cacaueiros

autocompatíveis tendem a apresentar maior produção de frutos que os

autoincompatíveis. O estudo de caracteres relacionados com produção (número de

sementes por fruto), e de características qualitativas poucos influenciadas pelo

ambiente e com alto poder de diferenciar genótipos (cor do fruto), torna-se uma

ferramenta indispensável para o sucesso do programa de melhoramento do

cacaueiro. Nesse sentido, este estudo objetivou caracterizar a progênie de plantas

F1(TSH-1188xCCN-51) quanto à pureza clonal de seus genitores, compatibilidade sexual,

cor do fruto e número de sementes por fruto, visando identificar marcadores

microssatélites ligados as essas características. A natureza segregante destas

características foi comprovada nesta população. Amostras de DNA dos dois grupos

de acessos da coleção de germoplasma do Centro de Ciências do Cacau M&MMars

que foram utilizados como genitores da população foram amplificados com quinze

primers microssatélites. Esses acessos de cada grupo mostram-se indistinguíveis

entre si pela genotipagem em 15 locos SSR, confirmando a pureza genética desses

acessos. Uma amostra de 250 plantas tomadas ao acaso foram submetidas a

polinizações artificiais. O uso de um índice de pegamento ajustado ao número de

polinizações artificiais possibilitou a realização de testes de compatibilidade com a

utilização de no mínimo de 15 autopolinizações por planta. As características cor do

x

fruto maduro e compatibilidade sexual segregaram na proporção de 1:1 e de forma

independente nesta população. A característica número de sementes por fruto

distribui-se de forma contínua na população de acordo com um padrão multigênico e

com segregação transgressiva. Os marcadores microssatélites P23(217) e P10(108)

estão ligados à característica de compatibilidade sexual. A característica cor de fruto

não apresentou ligação genética significativa a nenhum dos microssatélites testados.

A existência da segregação da característica compatibilidade sexual e cor do fruto,

possibilita que esta população seja utilizada em estudos de mapeamento genético

para essas características.

Palavras-chave: Theobroma cacao, compatibilidade sexual, marcadores

moleculares, mapeamento genético, número de sementes por fruto, cor do fruto,

polinização artificial.

xi

ABSTRACT

Andrade, Isamire Silva, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, July, 2009. Mapping of the sexual self-incompatible of the cocoa and genetic certification of the clones TSH-1188 and CCN-51 by microssatélies markers. Advisor: Ronan Xavier Corrêa.

The different levels of sexual compatibility made by the cocoa may be responsible for

major changes in production levels, because the self compatibility cocoa tend to have

higher fruit production that self-incompatible. The study of traits related to production

(number of seeds per fruit), and few qualitative characteristics influenced by the

environment and with high power to differentiate genotypes (fruit color), it becomes

an indispensable tool for successful breeding program of cocoa. Thus, this study

aimed to characterize the progeny of F1 plants (TSH-1188xCCN-51) on the clonal

purity of their parents, sexual compatibility, fruit color and number of seeds in order to

identify microsatellite markers linked to these characteristics. The segregating nature

of these features was demonstrated in this population. DNA samples from two groups

of accessions of germplasm collection of the Science Center Cocoa (M&MMars) that

were used as parents of the population were amplified with fifteen microsatellite

primers. These accesses of each group appear to be indistinguishable by genotyping

in 15 SSR loci, confirming the genetic purity of these accesses. A sample of 250

plants taken at random were subjected to artificial pollination. Using a rate of success

set the number of artificial pollination were the basis for compatibility testing with the

use of at least 15 per plant pollination. The characteristics of the ripe fruit color and

sexual compatibility segregated in a 1:1 ratio and independently in this population.

The characteristic number of seeds per fruit is distributed continuously in the

population according to a standard multigenic and transgressive segregation. The

xii

microsatellite markers P23 (217) and P10 (108) are linked to the characteristic of sexual

compatibility. The characteristic color of fruit did not show significant linkage to any of

the microsatellites tested. The existence of segregation of the trait sexual

compatibility and color of fruit means that this population to be used in genetic

mapping studies for these characteristics.

Key-words: Theobroma cacao, sexual compatibility, molecular markers, genetic

linkage, number of seeds by fruit, fruit color, artificial pollination.

1

1 INTRODUÇÃO

A cacauicultura tem uma grande importância econômica, social e

ambiental nos mais de 50 países produtores, envolvendo aproximadamente

dois milhões de agricultores (KNIGHT, 2000). A produção mundial de cacau na

safra 2007/2008 foi de 3,6 milhões de toneladas, sendo 70% desta produção

oriunda de países do continente Africano, 19% dos países do Sudoeste da Ásia

e Oceania, e 11% provenientes das Américas do Sul e Central (ICCO, 2009). O

Brasil hoje é o sexto principal produtor, participando com 4,4% da produção

mundial de cacau (ICCO, 2009) e tem duas zonas principais de produção: o Sul

da Bahia e a Amazônia (ICCO, 2005).

A Bahia se destaca por ser responsável por 70% da produção de

amêndoas de cacau do Brasil, enquanto que os outros 30% são produzidos

principalmente nos estados do Pará, Espírito Santo e Rondônia (ANUÁRIO

ESTATÍSTICO DO BRASIL, 2003). A cultura do cacau possui um papel

fundamental no desenvolvimento da região sulbaiana, gerando empregos e

destacando o país no cenário econômico internacional, além de representar

uma importante fonte de renda para os produtores, possuindo ainda um caráter

conservacionista, em função de seu plantio ser realizado sob as sombras das

árvores nativas da Mata Atlântica.

Um dos maiores entraves na produção de cacau no Brasil é a vassoura-

de-bruxa, doença causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa (AIME &

PHILLIPS-MORA, 2005). Em 1989, com a chegada do fungo nas lavouras da

Bahia, houve uma grande mudança no cenário social da população local.

Nesse estado, os danos causados pela doença, fizeram com que muitos

agricultores abandonassem seus cultivos, provocando demissões em massa de

2

trabalhadores rurais e migrações de pessoas da zona rural para a zona urbana

(TREVIZAN, 1996).

Atualmente, vários esforços integrados estão sendo feitos na tentativa

de recuperar a região cacaueira baiana. A estratégia de piramidização de

genes é uma ferramenta muito promissora e possibilita a obtenção de novas

cultivares com diferentes fontes de resistência a M. perniciosa associada a

características de produtividade, que tem sido um dos principais objetivos dos

programas de melhoramento do cacaueiro nos países da América do Sul

(BARTLEY, 2005).

Os diferentes níveis de compatibilidade sexual apresentados pelo

cacaueiro podem ser responsáveis por grandes alterações dos níveis de

produção (CANTALINO, 2006), e se manifestam de forma acentuada,

influenciando diretamente na quantidade de frutos por planta, bem como no

tamanho e número de sementes por fruto (BARTLEY, 2005). O número de

sementes por fruto de cacau tem influência direta na produtividade,

participando diretamente na determinação de diferentes componente de

produção (DIAS, 2001). A coloração dos frutos tem grande importância na

discriminação dos grupos raciais, além de apresentar a possibilidade de ser

utilizado como um ótimo marcador morfológico relacionado a características

relevantes ao melhoramento.

Nesta perspectiva, foi plantada uma progênie oriunda do cruzamento

interclonal entre TSH-1188 e CCN-51, que segrega para diversas

características, dentre elas a compatibilidade sexual e a cor do fruto. Com base

nesta população e no mapa genético a ser construído, espera-se identificar não

só QTLs relacionados a essas características, mas também para

características de resistência à vassoura-de-bruxa, podridão parda e outras

características agronômicas de interesse.

No presente trabalho, objetivou-se avaliar diferentes características na

população segregante de cacaueiros e identificar marcadores microssatélites

para essas características. Os objetivos específicos consistiram em: (i) Avaliar

as características compatibilidade sexual, cor de frutos e numero de sementes

por fruto em uma amostra de plantas F1 derivadas dos clones TSH-1188 e

CCN-51; (ii) Certificar a identidade genética dos acessos de TSH-1188 e CCN-

51 utilizados na obtenção da população segregante e oriundos da coleção de

3

germoplasma da Fazenda Almirante Cacau, com base em 15 marcadores

microssatélites; (iii) Identificar marcadores microssatélites potencialmente

ligados a genes de cor do fruto e autoincompatibilidade sexual em cacau.

4

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Origem e dispersão do cacaueiro

O cacaueiro é uma planta neotropical inicialmente descrita como Cacao

fotos por Charles de L´Écluse. Em 1737, foi descrito por Linneu como

Theobroma fructus, sendo que essa classificação permaneceu até 1753,

quando foi definitivamente designado como Theobroma cacao L.

Segundo Hardi (1960) o gênero Theobroma se originou na América do

Sul, possivelmente na bacia amazônica. Para Cheesman (1944), o centro de

origem do T. cacao esta localizado no Alto Amazonas, na região de confluência

dos rios Solimões, Putamaio e Caquetá. Esta área da América do Sul parece

admitir a mais ampla variabilidade, como reportado por Pound (1938), na sua

expedição de coleta de germoplasma de cacau.

O cacau se espalhou em duas principais direções, dando origem a

grupos raciais distintos (CHEESMAN, 1944; CUATRECASAS, 1964; SORIA,

1966; BRAUDEAU, 1969): O grupo dos Crioulos se disseminou em direção à

América Central e sul do México, sendo considerado o primeiro cacau

domesticado; produz frutos grandes, verdes ou vermelhos quando imaturos,

passando a roxos ou amarelos maduros, com casca enrugada, suas sementes

são grandes e arredondadas e de cotilédones brancos ou violeta claro sendo

que produzem o chocolate de melhor qualidade (BARTLEY, 2005). O grupo

dos Forasteiros ou Amazônicos se disseminou subdividindo-se em Forasteros

do Baixo e Alto Amazonas. É responsável por 85% da produção mundial de

cacau e caracterizam-se por possuir frutos ovóides, com casca lisa e coloração

verde quando imaturos, apresenta sementes intensamente pigmentado, e com

5

o seu interior violeta escuro (SOUZA; DIAS, 2001; MOTAMAYOR et al., 2002).

Nesse grupo se apresenta maior diversidade genética e melhor desempenho

agronômico (BARTLEY, 1967; LOCKWOOD, 1976; MARITA, et al. 2001). Um

terceiro grupo, denominado grupo dos Trinitários, é constituído de híbridos

naturais entre Forasteiros e Crioulos (SORIA, 1966; MOTAMAYOR et al.,

2001), encontrados em plantações devastadas por doenças em Trinidade

(CHEESMAN, 1944). Este grupo apresenta uma ampla variação de

características morfológicas dos dois anteriores. Suas sementes apresentam

coloração interna que varia do amarelo até o roxo e o seu produto final é de

qualidade intermediária (BRAUDEAU, 1969).

2.2 Divergência em populações naturais e autoincompatibilidade

As populações naturais de cacau constituem parte do repositório da

variabilidade genética potencial para programas de melhoramento da espécie.

Essas populações representam recursos genéticos com possibilidade de uso

para se obterem variedades mais produtivas, adaptadas às regiões de cultivo e

mais resistentes a pragas e doenças (DIAS, 2001).

Pesquisas sobre avaliação e caracterização morfoagronômica dessas

populações têm evidenciado ampla variabilidade de diversos caracteres

relacionados a frutos, sementes, folhas e flores, além de porte, arquitetura da

planta e autoincompatibilidade (CASTRO; BARTLEY, 1983, 1985; CASTRO et

al., 1989; BARTLEY, 2005; ALMEIDA, et al., 2009), produção e resistência a

doenças (FONSECA; ALBUQUERQUE, 1999; PIRES, 2003; ALMEIDA, et al.,

2009). O conhecimento da variabilidade dessa espécie tem sido ampliado com

a utilização de marcadores moleculares (FALEIRO et al., 2001; MARITA et al.,

2001; PLOETZ et al., 2005; SERENO et al., 2006;), mostrado a importância

dessas populações para coleta de recursos genéticos. Essas pesquisas têm

disponibilizado informações importantes para os melhoristas (BARTLEY, 2005).

E cacau, a presença de sistemas multialélicos de autoincompatibilidade

(KNIGHT; ROGERS, 1955; COPE, 1962), podem acelerar a divergência

genética em populações naturais, pois sabe-se que a estrutura genética de

6

uma população é controlada, em grande parte, pelo modo de reprodução de

seus indivíduos (STEBINS, 1957).

Em populações naturais, admiti-se que cacaueiros autoincompatíveis

predominam no centro de origem da espécie, enquanto os autocompatíveis

estão dispersos nas áreas marginais da distribuição (POSNETTE, 1945;

COPE, 1962; 1976). O que foi contestado devido à presença de cacaueiros

autoincompatíveis encontrados também nas áreas marginais (SORIA, 1978).

Contudo, essa hipótese especulativa apresenta alguma sustentação, na

medida em que a escassez de polinizadores e a redução na densidade da

população cacaueira nas áreas marginais da distribuição podem ter exercido

forte pressão de seleção em favor da autocompatibilidade. Sabe-se que o

sistema de cruzamento em plantas está sob o controle de poucos genes, os

quais, quando mutados, promovem a necessária flexibilidade capaz de

assegurar a reprodução da espécie. A autocompatibilidade teria, então, grande

valor adaptativo nessa situação (DIAS, 2001).

A predominância da autoincompatibilidade no centro de origem e da

autocompatibilidade nas áreas marginais comporta ainda outra explicação

(COPE, 1962). Assumindo que grande número de diferentes alelos de

autoincompatibilidade estivesse presente na população original de cacau, se

somente alguns poucos frutos tivessem sido transportados no período das

migrações humanas através dos Andes, então o número de alelos de

incompatibilidade seria reduzido a cada estágio. Uma vez que o cacaueiro

fosse plantado em grupos de árvores, a autoincompatibilidade não impediria a

frutificação, desde que árvores de compatibilidade cruzada fossem incluídas

como polinizadoras. Finalmente, um estágio ocorreria em que poucos alelos

diferentes de incompatibilidade restariam na população.

Embora o sistema de incompatibilidade possa, em teoria, ser mantido

em populações com apenas dois indivíduos, De Nettancourt (1977), afirma que

a perda de alelos por deriva genética ou por seleção reduzirá o número de

alelos em populações pequenas a valores abaixo do mínimo requerido para o

adequado funcionamento do sistema. Neste sentido, quando Astecas e Maias

selecionaram os Crioulos com base em suas amêndoas despigmentadas para

um melhor chocolate, eles estavam selecionando indiretamente para

autocompatibilidade (DIAS, 2001). Em outras palavras, a seleção consciente do

7

cacau de sementes brancas resultou em seleção automática, inconsciente para

autocompatibilidade (HARLAN et al., 1973).

Essa pode ter sido a outra razão para o predomínio das populações

autocompatíveis de Crioulos na América Central. Essa idéia encontra suporte

no estudo teórico de populações mistas compostas de cacaueiros

autoincompatíveis e autocompatíveis (COPE, 1962), assumindo ausência de

depressão endogâmica. No estudo, os autocompatíveis tenderam ao

predomínio devido à maior frutificação, enquanto os autoincompatíveis

tenderam à eliminação, demonstrando que genótipos autocompatíveis e

autoincompatíveis de cacau não podem coexistir em equilíbrio em população

isolada. Contrariamente, observações de campo feitas em população

abandonada desde 1950, contendo ambos os cacaueiros Trinitários

autocompatíveis e autoincompatíveis, pareceram indicar que a freqüência das

árvores autoincompatíveis aumentou em uma única geração (WARREN;

KALAI, 1995). Contudo, esse resultado pode também estar indicando que a

redução dos cacaueiros autocompatíveis na população mista seja devido à

depressão por endogamia, expressa como estabelecimento comprometido de

plântulas. Esta é uma questão complexa e que demanda mais pesquisas

(DIAS, 2001).

Sabe-se que nos centros de origem são encontrados numerosos

caracteres varietais endêmicos (VAVILOV, 1951). Seguramente alguns

caracteres encontrados em alta expressão nas populações dos Alto

Amazônicos das regiões do alto Amazonas, em comparação aos das

populações dos outros grupos raciais, como a marcante autoincompatibilidade

(POSNETTE, 1945), o mais alto conteúdo de manteiga (PIRES et al., 1998), a

germinação precoce da semente dentro do fruto tão logo a maturação do fruto

ocorra (SANCHEZ; JAFFÉ, 1992) e a mais alta concentração de genes para

resistência à vassoura-de-bruxa (POUND, 1938; CHEESMAN, 1944) são

alguns dos caracteres ancestrais endêmicos que reforçam a origem do

cacaueiro naquelas regiões e que, conseqüentemente, podem ser utilizados na

identificação de populações silvestres.

8

2.3 Panorama geral da cacauicultura

2.3.1 Distribuição geográfica

O cacaueiro é uma típica planta tropical americana, e em condições

espontâneas é encontrado no estrato inferior das florestas, em clareiras e

beirando os grandes rios, onde predominam condições de temperatura e

umidades elevadas, típicas das regiões tropicais que vão da bacia amazônica,

à zona do Caribe e à do Pacífico (CHEESMAN, 1944; CUATRECASAS, 1964;

BARTLEY, 2005). Era uma árvore conhecida e cultivada pelos nativos

americanos, principalmente Maias e Astecas. Do México, onde a propagação

da espécie feita pelos nativos em tempos anteriores ao descobrimento dificulta

especificar se as árvores são de ocorrência espontânea ou não (NOSTI, 1953),

os espanhóis levaram o cacau para outras terras conquistadas, dentre elas, os

países da América Central, a Colômbia, a Venezuela e as ilhas do Caribe. Na

América do Sul, a Venezuela foi um dos primeiros países a cultivar cacau. O

México permaneceu como maior produtor de cacau do mundo até o século

XVII. Com a crescente demanda do produto, o cultivo se estendeu,

rapidamente, para outras regiões, inclusive no Brasil, de onde foi levado para o

Oeste da África por portugueses, se expandindo em Gana, Nigéria, Camarões

e Costa do Marfim, (PAULIN; ESKES, 1995). Atualmente encontram-se

plantações de cacau em diversos países do sudoeste asiático, como a

Indonésia, Malásia, Vietnã, Cingapura, Madagascar entre outoros (WCF, 2009).

As principais regiões produtoras de cacau no mundo situam-se entre 15o

N e 20o S de latitude, uma faixa bastante estreita ao longo do Equador e dentre

os principais países produtores destaca-se o Brasil, onde existem pequenas

áreas de produção em latitudes subtropical (23o S), como é o caso do Estado

de São Paulo. No entanto, a maior concentração de plantios está localizada

entre as latitudes de 10o acima e abaixo do equador. Em verdade, os maiores

plantios se concentram em regiões onde a temperatura média gira em torno de

22 a 25o C e a precipitação pluvial é elevada e bem distribuída ao longo do

ano, algo em torno de 1200 a 2000 mm, com um mínimo mensal variando entre

100 a 130 mm.

A base geográfica da produção mundial compreende três áreas bem

distintas, uma em cada continente. Na América, com ênfase para o Brasil, mais

9

precisamente para o Estado da Bahia; na costa oeste africana, destacando-se

Costa do Marfim, Nigéria, Gana, Libéria e Camarões; e, ultimamente, no

sudeste asiático, uma nova região produtora liderada pela Indonésia, Vietnã e

Filipinas (WCF, 2009).

2.3.2 Importância sócio-econômica

A cadeia produtiva do cacau envolve produtores de amêndoas,

compradores de amêndoas, indústrias e moageiras, empresas de importação e

exportação, indústria chocolateira e de cosméticos, além de várias empresas

fabricantes e distribuidoras de insumos e equipamentos envolvidos em toda a

cadeia de produção (ICCO, 2009). No Brasil, essa cadeia produtiva envolve

investimentos da ordem de 2,3 bilhões de reais, sendo 1,7 bilhões no setor

primário (terra, árvores e benfeitorias). A cultura é responsável por

aproximadamente 300 mil empregos diretos, mas, do cacau, dependem mais

de três milhões de pessoas (DIAS, 2001).

A produção mundial de cacau na safra 2007/2008 foi de 3,6 milhões de

toneladas, sendo 70% desta produção oriunda de países do continente

Africano, 19% dos países do Sudoeste da Ásia e Oceania, e 11% provenientes

das Américas do Sul e Central (ICCO, 2009). A Costa do Marfim lidera, desde a

década de 60, a produção mundial de cacau em amêndoas secas, seguida, na

ordem, por Gana, Indonésia, Nigéria, Camarões, Brasil e Equador. Este rol de

oito países concentra mais de 90% da oferta mundial. Países como o Vietnã,

Libéria e Filipinas aparecem com uma produção emergente, se despontando

como importantes países produtores de cacau. Até a década de 80, o Brasil,

ocupava o 2º lugar desse ranking, hoje aparece em 6º lugar, respondendo por

4,4%, atrás da Costa do Marfim (39,1%), Gana (19,92%), Indonésia (13,65%),

Nigéria (5,46%) e Camarões (5,13%) (ICCO, 2009).

O Brasil, que vinha com sua produção em declínio, entrou em um

processo de recuperação nos últimos anos. O país foi o maior produtor mundial

até meados de 1920 e, entre 1970 e 1980, gerou 3,618 bilhões de dólares em

divisas com as exportações, alcançando sua safra recorde de mais de 400 mil

toneladas logo em seguida, em 1984/85 (DIAS, 2001). Hoje, a produção

10

brasileira ocorre basicamente nos estados da Bahia, Pará, Rondônia, Espírito

Santo e Amazonas, com pequena participação em Mato Grosso e São Paulo.

O principal produtor é a Bahia, com 136.155 toneladas de amêndoa, o que

equivale a 69,41% do total produzido no país, seguido do Pará, com 32.804

toneladas (16,73%), Rondônia com 18.592 (9,48%) e Espírito Santo com 6.944

t (3,54%) (ICCO, 2009).

Além de ser um dos principais componentes econômicos nas regiões

onde é cultivada, a cultura do cacaueiro exerce também um papel importante

na preservação ambiental. Seu cultivo associado com árvores nativas tem

auxiliado na preservação de biomas ameaçados, como a Mata Atlântica e a

Floresta Amazônica. Na Bahia, os fragmentos florestais da mata Atlântica não

se restringem apenas às áreas de declividade acentuada, pelo contrário,

atingem boa parte do litoral sulbaiano. Nessa região, a mata possui os seus

mais significativos remanescentes, os quais fornecem sombra à grande maioria

dos 700 mil ha de cacaueiros, preservando o solo e a água (DIAS, 2001). O

cultivo do cacaueiro nessa região foi, na sua maioria, implantado sob mata

raleada, no sistema cabruca, e sua preservação devem ser perseguidas a

qualquer custo (SILVA, 1997).

2.3.4 A cacauicultura baiana e a vassoura-de-bruxa

Desde 1746, quando o cacau foi introduzido na Bahia, a cacauicultura se

tornou dos principais cultivos nesse estado, levando à Bahia a se destacar no

cenário mundial como uma das principais regiões produtora de cacau (DIAS,

2001). Nesse estado, praticamente 100 municípios têm suas economias

baseadas no cacau, o qual é cultivado principalmente no sistema cabruca, em

aproximadamente 29 mil propriedades, em área equivalente a 700 mil ha

(DIAS, 2001).

Entre as safras de 1980/81 e 1999/00, a cacauicultura brasileira

vivenciou uma queda abrupta de 68% na produção, atingindo o menor volume

dos últimos anos, em torno de 96 mil toneladas, resultado da progressiva

redução da área plantada, queda dos preços internacionais e do padrão

tecnológico adotado como resposta ao alastramento da doença vassoura-de-

bruxa nos cacauais da Bahia. A vassoura-de-bruxa é uma doença causada

11

pelo fungo Moniliophtora (=Crinipellis) perniciosa (Stahel) (AIME e PHILLIPS-

MORA, 2005), e se caracteriza por infectar lançamentos foliares novos, frutos

em desenvolvimento e almofadas florais, podendo até provocar a morte da

planta quando afetada por sucessivos ciclos do patógeno associados a fatores

bióticos (ANDEBRHAN, 1984; QUEIROZ et al, 2003). Na Bahia, foi detectada

pela primeira vez em 1989 (PEREIRA et al., 1989) onde tomou proporções

devastadoras, devido à susceptibilidade do hospedeiro e condições climáticas

altamente propícias à introdução do patógeno (LUZ et al., 1997). Plantações

comerciais chegaram a perder 100 % da produção causando um dramático

impacto econômico, ecológico e social na região cacaueira baiana

(ANDEBRHAN, 1998; RIOS-RUIZ et al., 2001), o que resultou na falência de

inúmeros produtores, no desemprego de milhares de trabalhadores rurais que

migraram para outras regiões, na erradicação de lavouras em declínio para

substituição por pastagens e café, na depreciação da infra-estrutura e

desvalorização das propriedades rurais e, ainda mais, na exploração

descontrolada de espécies arbóreas de valor ecológico e econômico como

alternativa de complementação da renda dos produtores descapitalizados pela

crise, o que transformando o Brasil em importador cacau em amêndoas na

década de 1990 (DIAS, 2001).

O melhoramento do cacaueiro no Brasil teve início na década de 50

(VELLO, 1972), e atualmente vários esforços integrados estão sendo feitos na

tentativa de recuperar a região cacaueira baiana (DIAS, 2001). O uso de novas

fontes de resistência a M. perniciosa associada a características de

produtividade é uma das prioridades dos programas de melhoramento genético

do cacaueiro nos países da América do Sul (BARTLEY, 2005). No Brasil, por

exemplo, a sobrevivência da lavoura cacaueira na Bahia está, em grande parte,

na dependência do lançamento de cultivares resistente (DIAS, 2001).

2.4 Aspectos genéticos e botânicos do cacau

O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta umbrófila de porte

arbóreo e perene pertencente à família Malvaceae, gênero Theobroma

(ALVERSON et al., 1999; APG II, 2003). Chega a atingir 20 m de altura em

12

condições silvestres, mas em condições de cultivo normalmente alcançam ao

redor de 5 metros. Das 22 espécies que compõem o gênero, apenas o cacau e

o cupuaçu (Theobroma grandiflorum) são explorados comercialmente no Brasil

(BARTLEY, 2005). É uma planta diplóide (2n = 20), com tamanho do genoma

estimado em 0,43 ou 0,415 X 109 picogramas (FIGUEIRA et al., 1994), e

pertence a classe das dicotiledôneas e, assim sendo, as sementes apresentam

dois cotilédones que representam a parte economicamente aproveitável, sendo

descartados a casca e o gérmen (BARTLEY, 2005).

Ainda segundo Bartley (2005), o cacau possui ampla variabilidade

genética para a maioria dos caracteres, especialmente para o tamanho, forma

e cor dos frutos e das sementes, resistência a doenças e pragas, vigor e

tamanho da árvore, etc. A forma dos frutos pode variar de arredondada a

alongada com diversidade no comprimento e peso que varia de 100 a 2000 g.

A cor do fruto vai de verde a vermelho quando jovens e amarelos a

alaranjados quando maduros. A coloração do fruto imaturo tem grande

importância na discriminação dos grupos raciais, além de se apresentar como

um ótimo descritor para diferenciar genótipos, podendo ser utilizado como um

marcador morfológico, uma vez que é pouco influenciada pelo ambiente (DIAS,

2001). Essa característica é descrita como monogênica, sobre o controle do

gene R, com dois alelos (R e r); e em frutos imaturos a pigmentação vermelha

(RR e Rr) é dominante sobre a verde (rr) (SORIA, 1964). O controle

monogênico, contudo, pode ser complementado pela ação de genes

modificadores, uma vez que ocorrem gradações de cores entre o verde e o

vermelho (DIAS, 2001).

A cor das sementes varia de branca ao roxo intenso, passando por

gradientes de coloração conforme a intensidade de antocianina, e seu peso

pode variar de 0,5 a 5,0 gramas, quando secas (BARTLEY, 2005). O número

de sementes por fruto pode chegar até 50, sendo uma característica importante

na determinação de diversos componentes relacionados com a produção

(DIAS, 2001). É um componente muito variável, e depende diretamente do

número de óvulos e do percentual de fertilização destes (ENGELS, 1983).

A incompatibilidade gamética é um mecanismo genético evolutivo, de

certo modo complexo, que favorece a alogamia ou fecundação cruzada (DE

NETTANCOURT, 2000). Desta forma, existem na população de cacaueiros

13

tanto genótipos autocompatíveis (capazes de se autofertilizar com pólen da

própria planta), como genótipos autoincompatíveis, ou seja, incapazes de se

autofertilizar e, por isso, necessitam pólen de flores de outras plantas com as

quais são compatíveis. Esta característica é responsável por grandes

alterações dos níveis de produção, e considerado como um gargalo tecnológico

da cadeia produtiva do cacau no Sul da Bahia, devido em diversas áreas os

clones autoincompatíveis não estão produzindo de acordo com o preconizado

quando foram liberados (CANTALINO, 2006). Estudos indicam que a baixa

produtividade em algumas plantações comerciais de cacau se deve a uma

polinização pouco efetiva (LEAL, 2005), e que esta característica depende de

condições ambientais favoráveis para o seu sucesso (MARTÍN, 1982).

Considerando a genealogia do material híbrido cultivado no sul da Bahia,

que tem como seus progenitores os clones Sca-6, Sca-12 e IMC-67 e outros

acessos Alto Amazônicos que são materiais autoincompatíveis e não possuem

alelos para autocompatibilidade, esperava-se que muitos desses híbridos

selecionados nas fazendas da região sul baiana fossem autoincompatíveis.

Porém um número considerável de seleções com genótipos autocompatíveis

foi identificado nesses cultivos (YAMADA, 2005). A maioria das variedades

clonais em uso pelos produtores é autoincompatível, e testes de

intercompatibilidade necessitam ser realizados para avaliar o grau de

compatibilidade entre elas (BARTLEY, 2005). Mesmo em plantios policlonais, é

necessário que os clones utilizados apresentem um alto grau de

compatibilidade entre eles, caso contrário, os efeitos da incompatibilidade

gamética sobre a produção irão se manifestar de forma acentuada, traduzindo-

se em desuniformidade em tamanho e número de sementes por fruto, como

também na quantidade de frutos por planta. A inclusão de clones

autocompatíveis certamente reduz os efeitos negativos da incompatibilidade

(BARTLEY, 2005).

2.5 Biologia floral e sistemas de cruzamento

O cacaueiro é uma espécie monóica, tipicamente cauliflora, pois as

inflorescências se formam ao longo do tronco e ramificações secundárias e

terciárias mais desenvolvidas, em estruturas denominadas almofadas florais.

14

As almofadas florais não sendo danificadas por tratos culturais ou doenças

podem produzir frutos por vários anos. As flores são hermafroditas e

pentâmeras, apresentando pétalas, sépalas, estames e estaminódios ou falsos

estames. No pistilo, o ovário apresenta de 30 a 70 óvulos. Os órgãos

reprodutivos (estame e pistilo) encontram-se isolados na flor por duas barreiras

físicas: a coroa de estaminódios e as próprias pétalas que envolvem as

anteras. A presença dessas barreiras favorece a polinização cruzada, mesmo

em cacaueiros autocompatíveis, embora nesses a taxa de autofecundação seja

relativamente alta. Quando a planta é jovem, as flores são produzidas

principalmente no tronco. Em plantas adultas, elas surgem por toda planta, em

maior quantidade nos ramos com mais de 1 cm de diâmetro. Plantas

autocompatíveis apresentam uma menor quantidade de flores que as plantas

autoincompatíveis, porém a porcentagem de frutos nestas plantas é maior e

esses frutos (COPE, 1939). Um cacaueiro adulto pode produzir mais de 100 a

150 mil flores por ano, das quais menos de 5% é polinizada, e somente 0,5 a

5% resulta na produção de frutos (COPE, 1976; ANEJA, et al., 1999). Isto é em

parte devido ao fato de que a taxa efetiva de autofertilização em árvores

autoincompatíveis é baixa, enquanto que árvores autocompativeis pode

alcançar até 43% (YAMADA; GURIES, 1998).

O pólen é pegajoso, formando pequenos grumos o que favorece a sua

aderência à superfície de insetos, que comumente são os agentes

polinizadores das flores. A flor não polinizada nas primeiras 8 a 10 horas após

a emergência cai; esse aborto ocorre normalmente nas 24 a 36 horas

subseqüentes (ANEJA et al., 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001). O tempo

que transcorre entre a germinação do pólen no estigma e a fecundação é de

aproximadamente seis horas (CHEESMAN, 1938). Se a polinização é realizada

e a fecundação ocorre, o ovário e o pedicelo aumentam de tamanho, e a coroa

murcha e se deteriora (ANEJA et al, 1999).

Em cacaueiros, a abscisão floral pode ser uma conseqüência da reação

de rejeição com o reconhecimento precedendo as primeiras mudanças

detectáveis no ambiente hormonal que pode conduzir à abscisão floral (ANEJA

et al., 1994; BAKER, et al., 1997). A abscisão é um processo de regulação

hormonal que envolve o órgão da planta e a zona de abscisão. O etileno e o

acido indol acético (AIA), uma auxina, têm um papel primário no controle da

15

abscisão. O primeiro é o principal promotor da abscisão e o segundo pode inibir

ou aumentar a produção do primeiro e prevenir ou acelerar a reação de

abscisão (ANEJA et al, 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001). O acido

abscísico aumenta nos tecidos em abscisão e participa do processo.

O sistema de reprodução é componente importante da estrutura

genética de populações. A distribuição da variação genética dentro de

progênie, entre indivíduos da população e entre subdivisões da população, é

regulada pelo sistema de reprodução da espécie (HAMRICK, 1982). Apesar de

o cacaueiro apresentar flores hermafroditas e homógamas, sua polinização se

limita quase que exclusivamente ao concurso de algumas espécies de

micromoscas forcipomyia, pois só elas conseguem depositar de 35 a 40 grãos

de pólen viáveis, quantidade mínima para a formação de um fruto

desenvolvido, embora insetos, tais como trips, formigas e afídeos possam

promover polinização acidental (CHAPMAN; SORIA, 1983). Segundo

Kaufmann, (1975) tais micromoscas são supostamente atraídas pelas partes

coloridas da flor, especialmente pelas linhas guias das pétalas e pelos

estaminódios, o que diverge da opinião de Soria et al, (1982), que acreditam

que o comportamento desses insetos independa da coloração das flores. As

anteras das flores dos cacaueiros encontram-se revestidas por um

prolongamento das pétalas, em forma côncava, denominado "cógula" ou

"cuculo" e o ovário é envolvido por um círculo de estaminódios inférteis. Essa

estrutura complexa de flor exige a participação de insetos para proceder à

polinização e representa uma adaptação de T. cacao a atividade de seu

principal agente polinizador (SORIA et al., 1975).

O cacaueiro é considerado uma planta alógama (95% fecundação

cruzada), apesar de que também ocorre uma taxa de autogamia

(autofecundação) relativamente alta. A ocorrência desse elevado grau de

fecundação cruzada é característico dessa espécie, cujas taxas de cruzamento

natural variam de 50 a 100%. Esse fato contribui para que as populações

formadas a partir de sementes obtidas sem controle de polinização apresentem

elevada heterogeneidade (VELLO; NASCIMENTO, 1971; TOXOPEUS, 1972)

ou para que as populações locais, mesmo que tenham evoluído em condição

de isolamento, representem um grupo mais ou menos heterogêneo formado

por indivíduos heterozigóticos (CHEESMAN, 1944). O modo de polinização em

16

cacau contribui para que ocorra, freqüentemente, a deposição da mistura de

pólen da própria planta e das plantas vizinhas sobre o estigma (VOELCKER,

1940). No entanto, a presença de sistemas de incompatibilidade na população

pode limitar a fecundação natural e restringir o fluxo de genes, bem como o

rendimento de plantas autoincompatíveis, embora tais plantas apresentem,

freqüentemente, cruzamento compatível entre si. Esse mecanismo de

incompatibilidade é exclusivo de T. cacao, pois associa durante a

microsporogênese, fatores gametofíticos e esporofíticos no controle do fenótipo

de incompatibilidade do pólen (BARTLEY, 2005).

2.6 Incompatibilidade genética em plantas

O fenômeno da autoincompatibilidade (AI) tem sido definido de diversas

maneiras ao longo do tempo e tem sido um assunto de grande interesse para

geneticistas e melhoristas de plantas (DE NETTANCOURT, 2000). O conceito

de maior consenso atualmente é o de Lundqvist (1964), referendado por De

Nettancourt (1977; 2000). Para os autores, AI é a incapacidade de uma planta

fértil hermafrodita produzir zigotos após a autopolinização. Resulta do fracasso

dos grãos de pólen da mesma planta de aderirem ou germinarem no estigma

ou no fracasso dos tubos polínicos de penetrarem ou crescerem através do

estigma. Esta definição elimina os fracassos devidos a diversas formas de

esterilidade (genética, fisiológica etc.), ou outras barreiras reprodutivas, assim

como os efeitos causados pela endogamia (DE NETTANCOURT, 1977; 2000).

É um mecanismo fisiológico, com base genética, que favorece a

alogamia, promovendo, desta forma, a manutenção da variabilidade genética.

Por isto é considerada como um dos fatores mais importantes para o sucesso

evolutivo das fanerógamas (BREWBAKER, 1957; HESLOP-HARRISON, 1983).

Por outro lado, a AI pode, em alguns casos, levar a uma certa ineficiência

reprodutiva. Sutherland & Delph (1984), comparando 316 espécies, verificaram

que a média de formação de frutos em espécies autocompatíveis era de 72,5%

contra 22,1% em espécies autoincompatíveis. Da mesma forma, em Lótus, o

desenvolvimento dos óvulos é mais uniforme nas espécies autocompatíveis do

que nas autoincompatíveis (BUBAR, 1958). E, sabe-se ainda, por exemplo, que

os cacaueiros autocompatíveis tendem a apresentar maior produção de frutos

17

e de amêndoas secas que os auto-incompatíveis (LOCKWOOD, 1977 e

MORERA et al., 1994).

A autoincompatibilidade ocorre em uma ampla gama de famílias e

gêneros de angiospermas, inclusive em várias plantas de interesse econômico

(BREWBAKER, 1957) como em espécies de Nicotiana, Brassica, Medicago,

Trifolium, Secale, Lotus, Helianthus e Theobroma. Os trabalhos publicados

sobre o assunto abrangem desde aspectos morfológicos, fisiológicos, aplicação

no melhoramento até a biologia molecular e genética da autoincompatibilidade

(BREWBAKER, 1957; DE NETTANCOURT, 2000).

Existem dois tipos principais de AI, a gametofítica (AIG), em que a

especificidade do pólen é gerada pelo alelo S do genoma haplóide do grão do

pólen (gametófito), e a esporofítica (AIE), em que a especificidade é gerada

pelo genótipo diplóide da planta adulta (esporófito) que deu origem ao grão de

pólen. A reação da AI engloba desde o impedimento da germinação do pólen

até o rompimento do tubo polínico (HESLOP-HARRISON, 1983; DE

NETTANCOURT, 1977; 2000).

Devido à sua ampla distribuição entre as angiospermas, a AI teria

surgido precocemente, antes que houvesse divergência evolutiva

(WHITEHOUSE, 1951), ou teria havido um surgimento recorrente durante a

evolução (BATEMAN, 1952). A AIG é o sistema mais comum entre as plantas,

e supõe-se que seja o mais primitivo. (HESLOP-HARRISON, 1983; NEWBIGIN

et al., 1993; DE NETTANCOURT, 1997; 2000). Estudos de seqüenciamento

gênico indicam que os locos para AI evoluíram a partir de origens

independentes, diversas vezes, na evolução das plantas com flores

(CHARLESWORTH; AWADALLA, 1998).

Além da AI, existe também o que se chama de pseudo-compatibilidade,

que é a ocorrência de autocompatibilidade em espécies normalmente auto-

incompatíveis. Nesse caso, ocorre formação de sementes sob algumas

condições fisiológicas e ambientais especiais. Sabe-se que está sob controle

genético, mas tem sido pouco estudada (DE NETTANCOURT, 1977; 2000).

18

2.6.1 Autoincompatibilidade gametofítica

Na AIG, os tubos polínicos só irão crescer e só irá ocorrer fecundação se

o alelo presente no grão de pólen não estiver presente no tecido diplóide do

estilete. Por exemplo, nos seguintes cruzamentos, envolvendo progenitores

com diversos genótipos para os alelos S (alelos da AI):

a) S1S2 (feminino) x S1S2 (masculino) � grãos de pólen serão S1 e S2 �

tubos polínicos não irão crescer � não haverá progênie;

b) S1S2 (feminino) x S1S3 (masculino) � grãos de pólen serão S1 e S3 �

apenas tubos polínicos S3 irão crescer � progênie será S1S3 e S2S3;

c) S1S2 (feminino) x S3S4 (masculino) � grãos de pólen serão S3 e S4 �

todos os tubos polínicos irão crescer � progênie será S1S3, S1S4, S2S3 e

S2S4; portanto, os cruzamentos compatíveis só ocorrerão quando o alelo

S do pólen for diferente de qualquer alelo presente no estilete diplóide.

Nesse processo, o grão de pólen germina e a reação de

incompatibilidade ocorre entre o tubo polínico e o estilete. Supõe-se que a ação

dos genes S seja ativada após a meiose. Há envolvimento de RNAses e

glicoproteínas (NEWBIGIN et al., 1993).

Muito ainda precisa ser estudado em relação à genética da reação da

AIG. Sabe-se que os tubos polínicos compatíveis apresentam estrutura normal,

com deposição reticulada de calose, e os auto-incompatíveis desenvolvem um

depósito irregular de calose, mas ainda não está claro o que é causa e o que é

conseqüência (DE NETTANCOURT, 2000).

A herança da AIG é em geral monofatorial, ou seja, regulada por um só

loco com número variável de alelos (BURGOS et al., 1997). A estrutura do

loco-S é bastante complexa, provavelmente envolvendo genes separados,

controlando as funções do pólen e do pistilo (MC CUBBIN; KAO, 1999; DE

NETTANCOURT, 2000).

2.6.2 Autoincompatibilidade esporofítica

Na AIE, a especificidade do pólen é determinada pelo genótipo diplóide

do esporofíto, isto é, da planta mãe. Portanto, o que determinará a ocorrência

19

ou não de AI não será o alelo que o pólen carrega, mas sim os alelos presentes

no tecido diplóide da planta. Por exemplo, nos seguintes cruzamentos,

envolvendo progenitores com diversos genótipos para os alelos S,

considerando S1 dominante em relação a S2 e S3 e S3 dominante em relação a

S4:

a) S1S2 (feminino) x S1S2 (masculino) � grãos de pólen portarão alelos

S1 ou S2, mas expressarão sempre o S1 � tubos polínicos não irão

crescer � não haverá progênie;

b) S1S2 (feminino) x S1S3 (masculino) � grãos de pólen portarão alelos

S1 ou S3, mas expressarão sempre o S1 � tubos polínicos não irão

crescer � não haverá progênie;

c) S1S2 (feminino) x S3S4 (masculino) � grãos de pólen portarão alelos

S3 ou S4, mas expressarão sempre o S3 � todos os tubos polínicos irão

crescer � progênie será S1S3, S1S4, S2S3 e S2S4.

A reação de AIE ocorre no estigma e as espécies que a apresentam são

aquelas do tipo em que o pólen é liberado na forma trinucleada. Os alelos S

têm como sítio de ação as células das papilas do estigma. A reação de

incompatibilidade é rápida e precoce e a capacidade de discriminar entre o

pólen da mesma planta e um pólen diferente é afetada pelo estádio de

desenvolvimento do estigma. A síntese dos produtos dos alelos-S ocorre

supostamente antes do fim da meiose (NEWBIGIN et al., 1993; DE

NETTANCOURT, 2000).

A AIE pode, às vezes, estar associada a polimorfismos florais. Quando

isto não ocorre, diz-se que a AIE é homomórfica, ou seja, plantas com

diferentes genótipos para incompatibilidade são morfologicamente idênticas.

Quando há ligação entre polimorfismos florais e genótipos para

incompatibilidade, diz-se que a AIE é heteromórfica. Neste caso, as diferenças

na morfologia floral estão associadas a tipos de incompatibilidade. Em geral,

estas diferenças envolvem diferentes comprimentos de estiletes e estames.

Espécies distílicas são aquelas em que uma das formas florais tem estiletes

longos e anteras curtas e a outra forma tem estilete curto e anteras longas. As

polinizações compatíveis ocorrem apenas entre anteras e estigmas do mesmo

comprimento, ou seja, entre diferentes formas florais (DE NETTANCOURT,

1977; 2000; RICHARDS, 1997).

20

A herança da AIE é variável, podendo ser controlada tanto por um único

loco ou até por muitos locos (GOODWILLIE, 1997). A AIE é considerada um

sistema bastante complexo e que pode abranger diversos tipos de mecanismos

fisiológicos e genéticos (HESLOP-HARRISON, 1983; DE NETTANCOURT,

1977; 1997; 2000; RICHARDS, 1997). Os genes-S do sistema de AIE são

superfamílias de genes. O grande polimorfismo existente para o número de

alelos S tanto nos sistemas de AIG e AIE, bem como a manutenção deste

polimorfismo, é explicado pela ação da seleção que favoreceria diferentes

alelos, assegurando a fertilidade da população. Alelos raros teriam uma

vantagem de fertilidade, pois os grãos de pólen que os portassem não seriam

rejeitados pelas plantas receptoras e estes alelos tenderiam a aumentar em

freqüência (CHARLESWORTH; GUTTMAN, 1997).

Muitas questões ainda estão para serem resolvidas, porém os estudos

envolvendo o processo de autoincompatibilidade ao nível molecular em plantas

contribuíram grandemente para o entendimento atual sobre o processo de

reconhecimento e rejeição dos grãos incompatíveis pelo estigma. Apesar de

alguns detalhes ainda serem desconhecidos, o volume de conhecimentos

acumulados para as diferentes espécies, nos permite uma visão bastante

ampla do processo.

A utilização da AI no melhoramento de plantas é feita há bastante

tempo, mas existe uma lacuna entre o conhecimento teórico da AI e a

aplicação destes conhecimentos no melhoramento genético (DE

NETTANCOURT, 1997). A ocorrência de AI em espécies de interesse

econômico pode ter uma importância muito grande, sendo muito positiva em

alguns casos e um empecilho em outros, dependendo da parte da planta que é

colhida e do tipo de reprodução da mesma (DE NETTANCOURT, 1977).

2.7 Sistema de incompatibilidade sexual em cacaueiro

O sistema de autoincompatibilidade do cacaueiro é considerado único

porque a expressão do gene S (gene de reconhecimento) aparentemente

ocorre apenas no ovário, quando o tubo polínico e o óvulo entram em contato e

a reação de rejeição resulta na abscisão da flor e não na deposição de calose

21

no tubo polínico (DE NETTANCOURT, 1977). O tipo de controle genético é

polifatorial gameto-esporofítico e, apesar de este ser o exemplo mais marcante,

existem referências à inibição ovariana em outras espécies (DE

NETTANCOURT, 2000). A auto-incompatibilidade em plantas que produzem

flores, a exemplo do cacau, nada mais é que um processo bioquímico de

reconhecimento e rejeição que impede a autofertilização (singamia). Estão

envolvidas as interações entre o grão de pólen e o pistilo (estigma ou estilete).

E o tubo polínico, que se origina com a germinação do pólen, pode ser inibido

tanto no estigma quanto no estilete.

A primeira vez que se mencionou a existência de incompatibilidade em

cacaueiros foi em 1925, quando Harland, em Trinidad, observando cacaueiros

sadios e de mesmo desenvolvimento vegetativo, notou que havia uma

acentuada diferença entre eles quanto ao número de frutos, e que alguns deles

nem chegavam a produzir. Porém, coube a Pound (1932), realizar os primeiros

estudos sobre a incompatibilidade do cacaueiro, o qual verificou que

determinadas plantas não se autofecundavam, ou seja, eram

autoincompatíveis. Observou ainda que flores de árvores incompatíveis tinham

também a característica de seu pólen não fecundar outras plantas

incompatíveis (POUND, 1935a) e que, o pólen proveniente de uma planta

autocompatível é viável sobre qualquer estigma, porém quando provém de

plantas autoincompatíveis sua viabilidade se restringe aos estigmas de

cacaueiros autocompatíveis (POUND, 1935b).

Cheesman (1938) confirmou a existência de incompatibilidade em

plantações de Trinidad e classificou as plantas em: 1) Plantas autocompatíveis,

que frutificam ao serem polinizadas por pólen de outras plantas

autocompatíveis; 2) plantas autocompatíveis que podem frutificar quando

polinizadas com pólen de plantas autoincompatíveis; 3) plantas

autoincompatíveis que frutificam ao serem polinizadas com pólen de outras

árvores autoincompatíveis; 4) Plantas autoincompatíveis que não frutificam ao

serem polinizadas por pólen de outras plantas autoincompatíveis.

Outros investigadores vieram, posteriormente, a estudar este

mecanismo (KNIGHT; ROGERS 1953; 1955; COPE 1958; 1959; 1962) e

mostraram que uma polinização incompatível não resulta da inibição da

germinação do pólen ou do crescimento do tubo polínico, como foi postulado

22

por Posnette (1938), eles demonstraram que isso ocorre devido a uma falha na

fusão do núcleo espermático do grão-de-pólen com a oosfera numa

percentagem de óvulos após uma polinização incompatível, tendo como

conseqüência o aborto das flores.

Knight & Rogers (1955), propuseram uma hipótese genética para

explicar as incompatibilidades do cacaueiro baseados no fato de que a

fertilização estaria sendo controlada por uma série de alelos múltiplos S, de

natureza esporofítica, em número de cinco com a seguinte ordem: S1 > S2 = S3

> S4 > S5, e que a incompatibilidade ocorre depois que o tubo polínico penetra

no óvulo, sendo a reação esporofítica e determinada pela constituição diplóide

dos genitores.

Cope (1962), demonstrou que as incompatibilidades em T. cacao estaria

controlada pelo sistema genético da fusão e não fusão dos óvulos, repousando

nisto o sucesso ou o fracasso da singamia. Sugeriu ainda que a hipótese

formulada por Knight & Rogers (1955), na qual uma série de alelos “S” de ação

esporofítica estaria governando as incompatibilidades seria inadequada para

explicar os resultados obtidos em seu trabalho. Cope postulou ainda a

existência de um novo alelo S6 na série de alelos múltiplos de

incompatibilidades e de dois locos complementares A e B, independentes,

porém complementares aos genes S. Estes acessórios teriam a função de

produzir um substrato, que ausente, impediria as incompatibilidades de se

manifestarem. Os locos A e B atuariam antes da meiose expressando ação de

dominância e produzindo um precursor inespecífico para os alelos S após a

meiose. Se presentes na forma dominante concorrem para que os alelos atuem

em base esporofítica, porém, se tais locos estivessem na forma recessiva,

todas as formas de S seriam autocompatíveis. Neste mesmo trabalho, Cope

(1962), propôs fórmulas genotípicas de incompatibilidades para a série de

cultivares por ele estudado e estabeleceu que os alelos S teriam a seguinte

ordem de dominância: Sa = Sb = Sc > Sd > Sf. O padrão de segregação dos

locos A, B e S e a distribuição dos fenótipos após cruzamentos entre

cacaueiros auto-incompatíveis e autocompatíveis, em todas as possibilidades,

foram apresentados por Bartley & Cope, (1973).

O crescimento do tubo polínico em polinização incompatível é

comparável ao da polinização compatível normal, com os anterozóides

23

atingindo normalmente o saco embrionário. Entretanto, a anormalidade surge

no saco embrionário e se processa por impedimento da singamia: a fusão dos

gametas masculinos com os femininos carregando o mesmo alelo dominante.

De modo que, em polinizações incompatíveis, podem ocorrer 25%, 50% e até

100% de abortos (Cope, 1958 e 1962), demonstrando que o fenômeno exibe

gradações em sua expressão. Essa gradação na expressão da auto-

incompatibilidade tem sido também confirmada com marcadores bioquímicos.

Lanaud et al., (1987), por exemplo, utilizando marcadores isoenzimáticos,

observaram que a percentagem de sementes autofecundadas, em clones auto-

incompatíveis, variou de 0 a 89%, enquanto Yamada (1991), verificou taxas de

endogamia, em clones autoincompatíveis, que variaram apenas de 3 a 8%.

Levando em consideração resultados encontrados em autofecundações

de clones autocompatíveis, Coral (1970) propôs a hipótese da existência de

clones com diferentes graus de autocompatibilidade, e que tal fenômeno

poderia ser explicado pela introdução de dois pares de genes independentes, X

e Z, complementares e modificadores do gene S de incompatibilidade.

Adicionalmente, o cruzamento entre determinados clones autocompatíveis

pode gerar progênies parcialmente ou totalmente autoincompatíveis. Estudos

mostraram que algumas progênies de clones como PA-150 (YAMADA et al.,

1988), UF-613 (BARTLEY; YAMADA, 1982) e TSH (ICS-1x Sca-6) podem

segregar para autocompatibilidade (DIAS, 2001; YAMADA et al., 2005).

Pandey, 1960, reconheceu a natureza genética do sistema de

incompatibilidade em cacau, porém criticou a interpretação genética

desnecessariamente complexa dada a ele. Para justificar a ocorrência de

híbridos auto-incompatíveis gerados de genitores autocompatíveis, este autor

utilizou-se da interação alélica competitiva, descartando a postulação dos locos

independentes A e B proposta por Cope (1958, 1962). A interação competitiva

entre alelos S, ao impedir a expressão completa de qualquer deles

isoladamente, explicaria o evento. Um cacaueiro tendo dois alelos S

interagindo competitivamente, não produziria a substância específica de

incompatibilidade em quantidade suficiente para crescimento de pólen, para

qualquer dos dois alelos e seria completamente autocompatível. Não obstante,

a progênie do cruzamento entre dois desses cacaueiros poderia ser então

auto-incompatível. De modo que as árvores autocompatíveis e auto-

24

incompatíveis na progênie poderiam surgir nas proporções de 3:1, 1:1 e 1:3 e

esta hipótese de Pandey explicaria bem o evento com base somente nos alelos

S. A ação de dominância de um alelo sobre o outro e a ação de independência

de ambos os alelos já haviam sido adequadamente utilizadas na teoria de

Knight & Rogers (1953, 1955) para explicar o funcionamento dos alelos do loco

S. E, realmente, os estudos de incompatibilidade (CORAL, 1970; CARLETTO;

SORIA, 1973) têm demonstrado que o fenômeno em T. cacao é melhor

explicado pela teoria do loco S de Knight & Rogers (1953, 1955), do que pela

teoria dos locos independentes A, B e S de Cope (1958, 1962).

Existem também estudos mostrando que o reconhecimento da

autocompatibilidade ocorre antes do contato do pólen com óvulo. Aneja et al.,

(1994), verificaram que no clone IMC 30, auto-incompatível, o seu pólen não

germinou. Entretanto, com a aplicação de CO2 a reação de

autoincompatibilidade foi inibida em flores autopolinizadas, indicando que o

sistema de autoincompatibilidade em cacaueiros pode ser um resultado de dois

processos: Primeiramente com um aumento na quantidade de ácido abscísico

em resposta à interação pólen-estigma. A segunda resposta afeta os níveis de

AIA e etileno, após o contato do tubo polínico com o óvulo, estabelecendo as

condições hormonais que determinam o aborto da flor (ANEJA et al., 1994;.

ANEJA et al., 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001) Assim, a abscisão parece

ocorrer se altos níveis de etileno e de ácido abscísico estão presentes, o que é

observado em flores incompatíveis polinizadas. Por outro lado, é possível

retardar ou até mesmo inibir a abscisão com a aplicação tanto de CO2 quanto

de auxinas sintéticas ou de outros compostos que aumentem os níveis de

auxinas ou diminuam os níveis de acido abscísico e, ou etileno (ALMEIDA;

VALLE, 2007).

2.7.1 Determinação da compatibilidade sexual

Os estudos da reação de compatibilidade são realizados por meio de

autopolinizações controladas. Ressalte-se que uma única polinização gera

entre 40 e 45 sementes e que, em polinizações incompatíveis, as flores são

abortadas dentro de 3 a 4 dias, e as avaliações são feitas geralmente no

25

terceiro, sétimo e 15º dias após as polinizações (TERREROS et al., 1982;

YAMADA et al., 1982; YAMADA; BARTLEY, 1984; PINTO et al., 1998).

Dois critérios são comumente empregados para se testar a reação de

incompatibilidade de dado genótipo. Pelo primeiro, o número mínimo de flores

retidas nas autopolinizações e nos cruzamentos, com uma ou mais

testemunhas para declarar a compatibilidade, é estimado empregando-se o

qui-quadrado para testar a proporção de 1:1, a 5% de probabilidade com 1 grau

de liberdade (TERREROS et al., 1982). Pelo segundo critério, a

compatibilidade sexual de um material é determinada pela retenção de flores

(índice de pegamento) no 15º dia após as polinizações. López (1982) considera

que um material é autocompatível se este apresentar um índice de pegamento

de no mínimo 2%. Já autores como Bartley & Cope (1973), Terreros et al.,

(1982), Lopes & Carletto (1995) e León (2000), consideram que esse índice de

pegamento deva ser superior a 5%, enquanto que para Pinto et al., (1998) é

necessário um índice de pegamento de pelo menos 10%, pois ocasionalmente

plantas autoincompatíveis podem produzir um ou outro fruto nas polinizações.

Alguns autores ainda recomendam valores como, 14% (LEAL 2005) e até 40%

(CASTILHO, 2005), acreditando que em polinizações artificiais o pólen

colocado diretamente no estigma da flor facilite o pegamento das polinizações.

Segundo Lopes & Carletto (1995), este segundo critério parece superestimar a

autocompatibilidade mais que o primeiro, pois o tamanho amostral reduzido

influencia grandemente os resultados comprometendo assim as inferências.

Os resultados confusos e contraditórios obtidos nos estudos da reação

de incompatibilidade mostram claramente a deficiência dos procedimentos

adotados na abordagem do fenômeno. A abscisão das flores, por exemplo,

pode ser causada tanto pela ineficiência na mecânica de polinização quanto

por reações fisiológicas e sazonais ocorridas no órgão reprodutor. Também os

critérios adotados para declaração de incompatibilidade são discutíveis.

Existem variações, desde oito (LEAL, 2005), 10 e (CARLETTO, 1972) até 15

dias (PINTO et al., 1998), no período pós-polinização para tal declaração, o

que impede a comparação de resultados obtidos por diferentes autores. O

tamanho amostral utilizado nestes estudos é também altamente variável, com

alguns autores realizando apenas 15 (BARTLEY; COPE 1973)

autopolinizações e polinizações cruzadas, enquanto outros empregam até 40

26

(PINTO et al., 1998). Segundo Lopes & Carletto (1995), para cada cacaueiro,

utiliza-se entre 15 e 40 flores para autopolinização e polinizações cruzadas,

sendo 26 o número médio ótimo. Como se não bastasse, as várias teorias

propostas para a reação são complexas, particularizadas por genótipos, e,

portanto, não se aplicam a todas as situações (DIAS, 2001).

2.8 Bancos de germoplasma e certificação genética

Segundo IBPGR (1983), atual Bioversity International, germoplasma é o

material que constitui a base física da herança e se transmite de uma geração

para outra através de células reprodutivas. Numa visão mais ampla,

germoplasma pode ser considerado a soma total dos materiais hereditários de

uma espécie. Os bancos de germoplasma (BAG) têm como objetivos evitar a

perda de recursos genéticos, conservar fontes genéticas para futuro uso em

melhoramento e colecionar, identificar e caracterizar genótipos para uso no

melhoramento (BARBIERI, 2003). Devido à recalcitrância das sementes, que

são pouco adaptadas para armazenamento em longo prazo, os recursos

genéticos de cacaueiros devem ser mantidos em coleções de campo de

plantas vivas (DIAS, 2001). Usualmente, coleções de germoplasma de

Theobroma cacao são muito grandes e ocupam áreas muito extensas,

tornando-se onerosas e difíceis para o manejo apropriado, demandando muito

trabalho com várias práticas culturais.

No Brasil, a CEPLAC possui dois grandes bancos de germoplasma de

cacau. O maior deles encontra-se estabelecido na região norte, no município

de Marituba, no Estado do Pará. O outro está localizado em Ilhéus, Bahia,

sendo considerado como mais diversificado geneticamente (BARTLEY, 2005).

Em conjunto, os dois bancos de germoplasma possuem cerca de 3.000 tipos

diferentes de acessos clonais e 17.000 acessos seminais com ampla

variabilidade para a maioria dos caracteres de importância genética e

agronômica como produção, resistência a doenças, compatibilidade gamética,

forma e tamanho de frutos e sementes, porte, arquitetura, flor, etc (BARTLEY,

2005). Ainda na Bahia, na cidade de Barro Preto, outro BAG com cerca de 600

acessos clonais encontra-se localizado na Fazenda Almirante Cacau, atual

27

Centro de Ciências do Cacau (Regina Celle Rebouças Machado, informação

pessoal).

Nestas coleções, cada tipo de cacaueiro (acesso clonal ou seminal) é

individualmente representado por várias plantas (normalmente 10) que são

repetições do mesmo genótipo, o que garante e facilita a sua manutenção,

caracterização e avaliação. Esses bancos nada mais são que depósitos

naturais de genes, representando a variabilidade natural da espécie

Theobroma cacao.

É de fundamental importância à realização da caracterização molecular

e morfológica dos acessos que compõem as coleções visando conhecer as

potencialidades das mesmas, identificando assim a variabilidade entre e dentre

as populações. Essas são as ferramentas indispensáveis aos fitomelhoradores

do programa de melhoramento do cacaueiro, que através de cruzamentos

apropriados, possam explorar a variabilidade genética e promover a criação de

cultivares com características superiores para uso comercial (BARTLEY, 2005).

A presença de erros na identificação de acessos em vários bancos de

germoplasma parece ser mais comum do que se espera e, nesse sentido, visto

a grande importância dos bancos de germoplasma, um esforço internacional é

necessário para a caracterização de todas as coleções de germoplasma de

cacaueiro do mundo (FALEIRO et al., 2002). Dentro do escopo do projeto

Internacional “Conservação e Utilização de Germoplasma de Cacaueiro”,

financiado pela parceria CFC/ICCO/IPGRI, Risterucci et al (2000b) avaliaram

148 indivíduos de 28 clones, amostrados em várias coleções nacionais,

empregando 10 locos de microssatélites, e identificaram cerca de 30% dos

indivíduos com erros de identificação. Figueira (1998) demonstrou por meio de

marcadores RAPD, diferenças na identificação de acessos de cacau entre os

bancos de germoplasma do Brasil e da Malásia. De um estudo com 20

genótipos avaliados com 19 SSRs, Risterucci et al (2001) sugeriu que 15 locos

microssatélites são suficientes para verificação da identidade e Swanson et al

(2003) sugeriu que 11 SSRs podem ser suficientes para a genotipagem de

acessos de cacau. A identificação de acessos por genotipagem molecular, ao

contrário da caracterização morfo-agronômica, independe da idade da planta,

do estádio de desenvolvimento em que ela se encontra e mesmo do ambiente

em que é cultivada.

28

2.9 Marcadores moleculares e desenvolvimento de mapas de ligação

Os polimorfismos genéticos em nível do DNA são abundantes nos

genomas vegetais e podem ser detectados por diferentes técnicas de biologia

molécular, gerando marcadores moleculares informativos. Marcadores

moleculares baseados na amplificação de fragmentos de DNA pela reação em

cadeia da polimerase (PCR) têm sido largamente empregados nos programas

de melhoramento de plantas, como na caracterização de populações,

construções de mapas de ligação e detecção de QTL entre outras aplicações

(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).

Na construção de mapas de ligação normalmente são empregados

grande número de marcadores moleculares, sejam eles loco-específicos

dominantes (como RAPD – DNA polimórfico amplificado ao acaso; AFLP –

polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados) ou loco co-

dominante (como microssatélites; RFLP – polimorfismo de comprimento de

fragmentos de restrição obtidos por cortes aleatórios da fita dupla de DNA).

Presentes na maioria dos genomas dos organismos eucariotos, os

marcadores moleculares do tipo microssatélites (Simple Sequence Repeats -

SSR) consistem de seqüências curtas de 2-5 nucleotídeos repetidas em

tandem, flanqueadas por seqüências únicas não repetidas, sendo os elementos

repetidos mais comuns os di-nucleotídeos AT e CA. A variação alélica em locos

de microsatélites pode ser facilmente detectada por PCR usando primers

flanqueadores específicos. O polimorfismo baseado na variação do número de

seqüências repetidas dos microssatélites é provavelmente ocasionado por

escorregamento da DNA polimerase na replicação do DNA ou por troca de

partes desigual entre os cromossomos (HANCOCK, 2000).

Os marcadores microssatélites tornaram-se rapidamente os mais

utilizados pelos geneticistas de humanos, para o desenvolvimento de mapas de

ligação e para a identificação de indivíduos. Em plantas, os microssatélites são

muito freqüentes e distribuídos ao acaso ao longo do genoma, também sendo

amplamente utilizados nos estudos de diversidade genética, caracterização de

germoplasma, construção de mapas genéticos e localização de QTLs. Esses

29

marcadores têm sido amplamente utilizados em muitas espécies de plantas por

serem abundantes, com freqüência média de um a cada 50 mil pares de bases,

possuírem alto grau de polimorfismo, serem loco-específicos, apresentarem

reprodutibilidade dos resultados, baixa quantidade de DNA requerida nas

análises, serem detectados facilmente utilizando gel de agarose, poliacrilamida

ou através de sequenciamento automático (PUGH et al., 2004). Atualmente

existem mapeados muitos locos de microssatélites para o cacaueiro

distribuídos ao longo dos 10 cromossomos (LANAUD et al., 1995; PUGH et al.,

2004; BROWN et al., 2005; SCHNELL et al., 2007).

O mapeamento genético teve início após o reconhecimento do

fenômeno da ligação genética (MORGAN, 1910). Ele toma como base a

hipótese de que a co-segregação de dois marcadores indica proximidade entre

eles, e que a probabilidade de ocorrer permutas genéticas entre esses dois

marcadores é menor, quanto menor for à distância entre eles. Dessa forma, é

possível ordenar linearmente a informação genética ao longo dos

cromossomos. A grande disponibilidade de marcadores moleculares e

metodologias estatísticas eficientes fizeram com que, atualmente, estejam

disponíveis mapas genéticos saturados para a maioria das espécies cultivadas,

dentre elas a soja (CORRÊA, 1995), o café (PEARL et al., 2004), o milho

(BRUNELLI et al., 2002), o eucalipto (GRATTAPAGLIA; SEDEROFF, 1994), o

feijão (FALEIRO et al., 2003), além do cacaueiro, onde os diferentes mapas

construídos (LANAUD et al., 1995; CROUZILLAT et al., 1996; RISTERUCCI et

al., 2000; CROUZILLAT et al., 2000; FLAMENT et al., 2001; QUEIROZ et al.,

2003; CLÉMENT, 2003; RISTERUCCI et al., 2003; LANAUD et al., 2004),

culminou com o estabelecimento do primeiro mapa consenso para o cacau

(PUGH et al., 2004), além disso diversos outros mapas foram construídos

visando obter informações relevantes aos diversos programas de

melhoramento do cacaueiro desenvolvidos em todo o mundo (LANAUD et al.,

1995; MOTIAL et al., 2000; ARAÚJO, 2002; BROWN et al., 2005; FALEIRO et

al., 2006; SCHNELL et al., 2007), e pelo menos 13 outros mapas de ligação já

foram desenvolvidos e utilizados principalmente para identificar regiões

genômicas associadas com componentes de produção, vigor e resistência a

várias espécies e isolados de Phytophthora que atacam o cacaueiro em todas

30

as partes do mundo e também para resistência a M. perniciosa (FIGUEIRA;

CASCARDO, 2001; FIGUEIRA; ALLEMANO, 2005).

Segundo Ahnert (2000), a construção de mapa genético saturado é

relevante para obter informações importantes sobre estrutura genética da

espécie, desde a associação com caracteres qualitativos, localização dos

mesmos grupos de ligação e identificação de regiões genômicas associadas a

caracteres quantitativos. A utilização desses mapas favorece um maior estudo

da cultura, pois a cobertura e análise completa de genomas; a decomposição

de características genéticas complexas nos seus componentes mendelianos; a

localização das regiões genômicas que controlam caracteres de importância; a

quantificação do efeito destas regiões genômicas que controlam caracteres de

importância; facilitar o melhoramento assistido por marcadores e clonagem

baseada em mapa (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).

Os mapas genéticos são construídos pela análise de co-segregação dos

marcadores genéticos nos produtos da meiose, em progênies originadas de

cruzamentos entre genitores contrastantes para um determinado caráter (LIU,

1998). Os marcadores localizados em diferentes cromossomos devem

segregar independentemente e os marcadores localizados no mesmo

cromossomo são transmitidos conjuntamente, a menos que esta ligação seja

quebrada por uma recombinação no gameta genitor. A construção de mapas

genéticos e posterior localização de QTLs associados a características de

interesse agronômico baseia-se em diferentes metodologias estatísticas que

possibilitam associar as informações da segregação de marcas moleculares às

características fenotípicas que se desejam mapear (LIU, 1998).

O desenvolvimento de mapas genômicos envolve a seleção da

população mais apropriada para mapear; o cálculo das freqüências de

recombinação em pares, usando esta população; o estabelecimento de grupos

de ligação; a estimativa das distâncias no mapa entre marcas e a determinação

da ordem linear por marcadores, de forma a minimizar os eventos de

recombinação (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). A escolha de genitores

para desenvolvimento de mapas genômicos é crítica em plantas perenes

arbóreas e o tipo de marcador a ser utilizado deve ser considerado. Os

genitores devem ser importantes no programa de melhoramento, apresentar

nível satisfatório de polimorfismo para o tipo de marcador a ser usado, além de

31

segregar para várias características qualitativas e quantitativas de importância

(componentes de produção e resistência à doença, etc.) e de qualidade do

produto, para maximizar a obtenção de informações (FIGUEIRA; CASCARDO,

2001).

Em geral, os mapas genéticos do cacaueiro vêm sendo gerados a partir

de progênies F1, F2, ou pseudo test cross, derivadas de cruzamentos entre

genitores heterozigotos (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1988). Para

construções destes mapas utilizam-se marcadores dominantes, explorando a

configuração de pseudo-testcross e marcadores co-dominantes (LANAUD et

al., 1995; RISTERUCCI et al., 2000; FLAMENT et al., 2001; CLÉMENT et al.,

2003; PUGH et al., 2004; BROWN et al., 2005). São construídos dois mapas,

sendo um para cada genitor, baseado na segregação de marcadores co-

dominantes, como RFLPs, microssatélites e isoenzimas, que permitem a fusão

dos diversos mapas, ou ainda a comparação direta com o mapa de referência

estabelecido para o cacaueiro (PUGH et al., 2004). Os marcadores dominantes

(RAPDs e AFLPs), mais abundantes, foram usados para saturar esses mapas

genéticos. Para o cacaueiro, comumente um genótipo altamente heterozigótico

é cruzado com um genótipo mais homozigoto, tal como o mutante albino

‘Catongo’. Alternativamente, já foi utilizada para mapeamento uma população

de retrocruzamento, derivada de uma única planta F1 retrocruzada com o

genitor mais homozigoto (CROUZILLAT et al., 1996), enquanto que em outros

casos específicos, populações F2 foram especialmente geradas e usadas para

a identificação de regiões genômicas associadas com sabor de chocolate e

qualidade da semente (CROUZILLAT et al., 2001; ARAÚJO, 2002) e

resistência à M. perniciosa (QUEIROZ et al., 2003; BROWN et al., 2005;

FALEIRO et al., 2006).

O primeiro mapa de ligação do cacaueiro foi desenvolvido para a

população F1 de 100 indivíduos do cruzamento entre os clones UPA 402 x UF

676 (LANAUD et al., 1995). Foram formados dez grupos de ligação, cobrindo

759 cM e contendo 193 locos, incluindo cinco de isoenzimas, 160 de RFLPs,

sendo 101 de cDNA, 55 de sondas genômicas e quatro de genes de funções

conhecidas e 28 locos de RAPD. Este mapa foi posteriormente saturado com

marcadores adicionais, tendo sido incluídos mais 18 locos de RFLP (três

sondas de cDNA, dez genômicos, dois genes de funções conhecidas, e três

32

sondas teloméricas); dois locos de RAPD; 191 locos de AFLP e 20 de

microssatélites, totalizando 424 marcadores, englobando 885,4 cM com

espaçamento médio entre marcadores de 2,1 cM (RISTERUCCI et al., 2000).

Pugh et al., (2004) realizaram a mais recente saturação do mapa consensual

do cacaueiro acrescentando mais 35 indivíduos à população F1 originalmente

utilizada por Lanaud et al., (1995). A versão mais atualizada do mapa

consensual do cacaueiro conta com dez grupos de ligação, cobrindo 782,8 cM

e contendo 465 locos, dos quais 268 são de microssatélites, 176 de RFLPs,

cinco de isoenzimas e 16 de Rgenes-RFLP. A média de distância entre cada

marcador é de 1,7 cM.

Para identificação de regiões genômicas associadas à resistência a M.

perniciosa, um mapa genético foi desenvolvido no Brasil para uma população

de 82 indivíduos F2 derivados da autofecundação do genótipo ‘TSH-516’, um

híbrido selecionado do cruzamento de ‘ICS1‘ x ‘Scavina 6’ (QUEIROZ et al.,

2003). O mapa genético continha 124 marcadores RAPD e 69 AFLP em 25

grupos de ligação, cobrindo 1.713 cM, e permitiu a identificação de um loco

principal de QTL, responsável por cerca de 35% da variância fenotípica para

resistência a M. perniciosa, avaliada sob condições de campo por dois anos.

Esse mapa genético foi recentemente saturado para um total de 343

marcadores (232 RAPD; 77 AFLP; e 33 microssatélites), perfazendo 16 grupos

de ligação com um total de 670 cM (FALEIRO et al., 2006). Novas avaliações

de resistência foram conduzidas num período de seis anos, permitindo a

confirmação do QTL descrito por Queiroz et al, (2003). Na saturação do mapa,

três locos de microssatélites (P02, P01 e L09) foram mapeados nessa mesma

região do QTL sendo que esses locos já haviam sido mapeados no

cromossomo 9 do mapa consensual (RISTERUCCI et al., 2000; KUHN et al.,

2003). Um novo mapa para a população F2 de autofecundação de ‘TSH-516’ foi

recentemente construído por Brown et al., (2005). Neste mapa 146 indivíduos

foram genotipados com 182 marcadores sendo 170 microssatélites, oito genes

homólogos de resistência (RGH) e quatro genes candidatos relacionados a

estresse (WRKY). O comprimento total do mapa foi estabelecido em 671,9 cM.

Dois QTLs foram encontrados, um no grupo de ligação 9, como já descrito por

Queiroz et al. (2003) e Faleiro et al. (2006), e outro no grupo I, com

porcentagem de variação fenotípica de 51% e 6%, respectivamente. O QTL do

33

grupo de ligação I foi localizado próximo das marcas mTcCIR22, mTcCIR264 e

RGH11, enquanto que o QTL do grupo IX foi próximo das mTcCIR24,

mTcCIR35 e mTcCIR157. Ambos os QTLs tiveram efeito de dominância para

resistência a M. perniciosa, sendo que o QTL de maior efeito do grupo IX foi

originário do ‘SCA 6’ e o de menor efeito do grupo I foi herdado de ‘ICS 1’.

Clement et al. (2003a) encontrou um conjuntos de QTLs relacionados ao

número de óvulos por ovário, identificados em diversos cromossomos (1, 2, 4,

5 e 6). Três QTLs foram encontrados no grupo de ligação 4 do mapa consenso

(PUGH, et al., 2004) associados aos clones DR 1 (Trinitário), S 52 (Trinitário) e

IMC 78 (Forasteiro) e explicou 23,5%, 15,0% e 24,2% respectivamente, da

variação fenotípica para essa característica. Os QTLs associados aos clones

DR 1 e IMC 78 estão situados em uma mesma região cromossômica do grupo

de ligação 4, enquanto que o associado ao clone S 52 encontra-se na marca

mTcCIR18.

Albuquerque (2006) detectou três QTLs associados à resistência à

vassoura-de-bruxa, um no grupo de ligação 8 de ICS 39 x CAB 0208 e dois no

mapa de ICS 39 x CAB 0214, sendo um no grupo de ligação 4 e outro no grupo

9. A relação genética entre os dois clones CAB genitores das populações

contrastantes e 81 genótipos de cacaueiro utilizados como fontes de

resistência a M. perniciosa foram baseadas nas freqüências alélicas de 20

locos de microssatélites. A não existência de relação de parentesco e a alta

dissimilaridade genética encontrada entre o clone Sca 6 e os CAB 0208 e CAB

0214 reforça a possibilidade destes acessos possuírem diferentes genes de

resistência a M. perniciosa. Três QTLs associados à resistência do cacaueiro a

P. palmivora foram encontrados também no grupo de ligação 4, em regiões

muito próximas de onde foi localizado o QTL associado à resistência M.

perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006). Um

destes QTLs foi encontrado por Crouzilat et al. (2000) e foi capaz de explicar

13,2% da variação fenotípica da resistência de frutos de ‘Catongo’ (Forasteiro).

Dois QTLs foram encontrados por Clement et al. (2003b) associados aos

clones IMC 78 e DR1. Estes QTLs foram capazes de explicar 22,6% e 10,1%

respectivamente, da variação fenotípica da resistência à podridão em frutos

com base em dados de campo acumulados por mais de seis anos.

34

No mapeamento de genes homólogos de resistência (RGH) realizado

por Lanaud et al. (2004) utilizando as mesmas progênies F1 do mapa de

referência do cacaueiro (PUGH et al., 2004), foram localizados quatro genes

alinhados em seqüência no grupo de ligação 4. Estes genes estavam próximos

dos locos de microssatélites mTcCIR17 e mTcCIR18 na mesma região onde

foram detectados os QTLs associados à resistência a P. palmivora (CLEMENT

et al., 2003b), à M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’

(ALBUQUERQUE, 2006) associados ao número de óvulos por ovário

(CLEMENT et al., 2003a) em cacaueiros.

35

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

As amostras utilizadas neste trabalho foram obtidas numa progênie de

600 plantas de origem interclonal oriunda do cruzamento de TSH-1188 x CCN-

51 foi utilizada para obtenção das amostras utilizadas neste trabalho. As

plantas encontram-se na Fazenda Almirante Cacau, localizada no município de

Barro Preto, BA, plantadas no ano 2000. O cruzamento, os tratos culturais e as

avaliações agronômicas e fitopatológicas encontram-se descritas por Santos

(2007) e Bahia (2007). O clone TSH-1188 ("Trinidad Selected Hybrids")

originou-se de cruzamentos envolvendo os clones IMC-67, ICS-1, Sca 6 e P-

18. Produz frutos vermelhos e com rugosidade áspera (CEPEC, 1987), é

autoincompatível e apresenta resistência à vassoura-de-bruxa (LUZ et al.,

1997). O CCN-51 ("Colección Castro Naranjal") é oriundo de uma planta F1 do

cruzamento entre ICS-95 x IMC-67, cruzada com um clone nativo do oriente

equatoriano denominado "Canelos" (BARTLEY, 1986). O CCN-51 produz frutos

vermelho-arroxeados quando imaturos, passando a amarelo-alaranjados

quando maduros, com casca levemente enrugada e sementes com coloração

interna púrpura clara. Ele é autocompatível, possui resistência mediana à

vassoura-de-bruxa e apresenta alta produtividade (CAMPO; ANDÍA, 1997).

Quando comparado com outras variedades locais do Equador, tem

demonstrado ser resistente à vassoura-de-bruxa. A sua suscetibilidade à

podridão-parda é menor quando comparada à outra enfermidade comum no

Equador, a monilíase (CAMPO; ANDÍA, 1997). No Brasil, a resistência do CCN-

51 à vassoura-de-bruxa foi confirmada por Pires (2003).

36

3.2 Caracterização da população quanto à compatibilidade sexual

As autopolinizações artificiais foram realizadas em 250 plantas da

progênie e nos seus genitores entre janeiro de 2007 a maio de 2009, de acordo

com a disponibilidade de flores nas plantas. As polinizações artificiais

propriamente ditas foram feitas segundo as recomendações de Pinto et al.,

(1998), seguindo os procedimentos descritos a seguir, modificando-se

frequência de verificações: a) Os botões florais entumecidos, prestes a abrir no

dia seguinte, foram analisados sempre no dia anterior da polinização artificial, e

protegidos com um pequeno tubo de vidro transparente (1,4 cm de diâmetro

por 7 cm de comprimento) com uma de suas extremidades cobertas por uma

tela fina (para evitar a passagem de insetos), e a outra extremidade aberta era

fixada na planta por finas borrachas, a fim de proteger os botões. b) Na manhã

do dia seguinte, entre 6 e 12 horas, as flores protegidas foram polinizadas

artificialmente apenas as flores que se abriam durante a noite. Depois da

retirada do tubo, realizava-se o corte dos estaminóides da flor receptora, com a

pinça, para facilitar a polinização e a identificação da flor polinizada; Algumas

flores da mesma planta foram selecionadas como doadoras, desde que suas

anteras estivessem soltando pólen. Com a pinça, esfregava-se o pólen

diretamente no estigma da flor receptora, a qual foi novamente protegida,

datada e identificadas por fitas. As proteções foram retiradas três dias após a

polinização, quando foi realizada a primeira verificação para tomada de dados.

Outras verificações foram feitas aos 5, 8, 15 e 30 dias após as polinizações. As

verificações complementares foram realizadas no 30º apenas para confirmação

do índice de pegamento.

A caracterização da compatibilidade sexual foi feita com base na

retenção de flores, observada no 15º dia após as polinizações e determinadas

pelo índice de pegamento (IP), que é a razão entre do número de flores

vingadas (FV) e o número de flores polinizadas (FP) numa planta (IP =

(FV/FP)100). Neste trabalho, utilizou-se um IP de pelo menos 10% como

referência para determinar a autocompatibilidade das plantas que atingiram o

tamanho amostral de 26 polinizações artificiais. Esse número de polinizações é

37

considerado como ótimo, podendo ser reduzido a 15 polinizações (LOPES;

CARLETTO, 1995). As plantas que alcançaram um tamanho amostral mínimo a

partir de 15 autopolinizações também foram avaliadas quanto à compatibilidade

sexual e a determinação da autocompatibilidade foi feita baseado num IP (%)

ajustado em função do número de flores polinizadas. Desta forma, foram

consideradas autocompatíveis as progênies que apresentaram esse índice

maior ou igual a 20% em plantas com o mínimo de 15 autopolinizações, IP

igual a 15% em plantas que atingiram de 20 a 25 autopolinizações e IP igual a

10% para as plantas com o mínimo de 26 autopolinizações.

A distribuição da freqüência para o número de flores polinizadas foi

analisada em uma amostra de 250 plantas polinizadas. Os coeficientes de

correlação de Pearson foram determinados para as variáveis flores polinizadas

(FP) e índice de pegamento (IP) a partir das 60 plantas que apresentaram

acima de 15 flores polinizadas. A análise de segregação da característica

compatibilidade sexual na amostra de 60 plantas da população foi realizada

com base no teste qui-quadrado a 5% de significância. Todas as análise

estatísticas foram realizadas com o software Bioestat 5.0 (AYRES et al., 2007).

3.3 Caracterização morfo-fisiológica dos frutos

A cor do fruto foi determinada em observações realizadas durante as

colheitas dos anos de 2007, 2008 e 2009, em frutos em estágio de completa

maturação e classificados em roxos (R) e amarelos (A). A segregação da

característica da cor do fruto na amostra de 60 plantas foi testada com base no

teste qui-quadrado a 5% de significância.

A caracterização dos frutos quanto ao número médio de sementes foi

realizada de acordo com dados obtidos nas colheitas realizadas nos anos de

2007, 2008 e 2009, onde os frutos sadios de 60 árvores individuais foram

colhidos e suas sementes contadas. O número médio de sementes por fruto e

o número médio de sementes chochas por fruto foram determinados,

possibilitando demonstrar a distribuição de freqüências para essas

características em uma amostra de 60 indivíduos dessa população.

38

As medidas de correlação de Pearson foram calculadas entre a

característica de compatibilidade sexual e as características morfo-fisiológicas

dos frutos para uma amostra de 60 plantas da progênie.

3.4 Obtenção de dados moleculares

3.4.1 Extração de DNA dos genitores e progênies F1

Amostras de DNA de oito indivíduos CCN-51 e 24 indivíduos TSH-1188,

que foram utilizados nos cruzamentos, e de 44 plantas F1 foram extraídas pelo

método de CTAB modificado (DOYLE; DOYLE, 1990; CORRÊA et al., 1999;

ARAÚJO et al., 2007). Dentre as 44 plantas F1, 20 foram avaliadas em campo

como autocompatíveis e 24 como autoincompatíveis. Amostras de

aproximadamente 300 mg de tecido de folha de cada indivíduo foram

maceradas em presença de nitrogênio líquido e polivinilpirrolidona (PVP),

sendo posteriormente transferidas para tubos Ependorff® de 2 mL,

adicionando-se aos mesmos 800 µL de tampão [tris-HCl 100 mmol.L-1, pH 8,0;

EDTA 20 mmol.L-1, pH 8,0; NaCl 1,4 mol.L-1; 0,2% (v/v) β- mercaptoetanol, 2%

CTAB, e 0,1 mg de proteinase K]. Após 60 min em banho-maria a 65 oC, os

tubos foram centrifugados a 14.000 g por 7 min e os sobrenadantes

transferidos para novos tubos. Aos sobrenadantes adicionaram-se 800 µL de

24:1 clorofórmio: álcool isoamílico, agitando por cinco min, seguindo de

centrifugação a 14.000 g por 7 min. Esta etapa foi repetida por duas vezes. Os

sobrenadantes transferidos para novos tubos receberam isopropanol gelado,

na proporção de 1:1 (isopropanol: sobrenadante), e centrifugados a 14.000 g

por cinco min. Descartaram-se os sobrenadantes e os precipitados foram

lavados com 1 mL de solução 70% de etanol por 2 vezes. Após as lavagens, os

precipitados foram secos ao ar por 12 h e ressuspensos em solução de TE (10

mmol.L-1, Tris-HCl, EDTA 1 mmol.L-1, pH 8,0) contendo RNAse na

concentração final de 40 µg e incubados em banho-maria a 37º C por 60 min.

Para verificar a integridade do DNA extraído, uma alíquota de 3 µL de cada

amostra, adicionada de 3 µL do corante tipo IV (Bromofenol Blue a 0,25%,

sacarose 40%) aplicada em gel de agarose a 0,8%, utilizando como tampão de

corrida o TBE 1X (EDTA 2 mol.L-1; Tris-borato 9 mol.L-1).

39

A corrida eletroforética foi realizada com 80 V, durante 1 hora. Os géis

foram corados com brometo de etídio a 10 mg.mL-1, fotodocumentados sob luz

ultra violeta (UV). A concentração do DNA de cada amostra dos genitores foi

estimada pelo espectrofotômetro a 260 nm Cary Winv 50, utilizando-se o

software RNA&DNA (SAMBROOK et al., 1989) e, em seguida diluída para 10

ng.µL-1. A qualidade do DNA foi avaliada tanto por gel de agarose 1% como por

espectrofotometria, considerando a razão A260/A280.

3.4.2 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51

3.4.2.1 Reações RAPD

Amostras de DNA dos genitores foram amplificadas pela técnica de

RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA (WILLIAMS et al., 1990). Nas

amplificações foram empregados dois primers decâmeros, identificados como:

AX15 e D20. As reações de amplificação foram feitas em um volume total de

25 µL, contendo 3,0 µL de DNA a 10 ng.µL-1 de DNA genômico, 2,0 µL de

dNTP’s a 2,5 µmol.L-1, 3,0 µL de MgCl2 a 50 mmol.L-1, 0,2 µL de Taq DNA

polimerase a 5 U.µL-1, 3,0 µL de primer a 10 µmol.L-1, 2,5 µL tampão 10X e

11,3 µL de H2O mili-Q autoclavada. As amplificações foram realizadas em um

termociclador, programado para 40 ciclos, cada um com a seguinte seqüência:

2 min a 92 °C; 40 ciclos (1 min a 94 °C; 1 min a 35 °C; 1 min a 72 °C); uma

extensão final de 5 min a 72 °C e finalmente, a temperatura foi reduzida para

15°C. Após a amplificação foram adicionadas, a cada amostra, 3 µl de uma

mistura de azul de bromofenol (0,25%), glicerol (60%) em água. Essas

amostras foram aplicadas em gel de agarose 1,2% submerso em tampão TBE

1X (Tris-Base, Ácido Bórico, EDTA). A separação eletroforética foi de

aproximadamente duas horas, a 100 volts, em gel de agarose a 3%, corado

com brometo de etídio e fotografado sob luz ultravioleta.

40

3.4.2.2 Reações microssatélites

As amostras de DNA de cada planta foram amplificadas pela técnica de

PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando 15 primers microssatélites ou

simple sequence repeats – SSR. As sequências dos primers microssatélites

utilizados foram isolados e caracterizados previamente por: (i) Araújo et al.

(2007) – UENF/CEPLAC 16; UENF/CEPLAC 66; UENF/CEPLAC 69;

UENF/CEPLAC102; UENF/CEPLAC110; UENF/CEPLAC118;

UENF/CEPLAC121; UENF/CEPLAC129; (ii) Lanaud et al., (1999), Pugh (2004)

– mTcCIR10; mTcCIR18; mTcCIR21; mTcCIR24; mTcCIR30; mTcCIR129;

mTcCIR131. As temperaturas de anelamento empregadas foram aquelas

recomendadas na caracterização dos primers microssatélites (LANAUD et al.,

1999; PUGH et al., 2004; ARAUJO et al., 2007)

As reações de amplificação foram feitas em um volume total de 20 µL

contendo 10 ng de DNA genômico por passo, cada um dos desoxinucleotídeos

(dATP, dTTP, dGTP e dCTP) a 2,5 mmol.L-1, MgCl2 50 mmol.L -1, tampão para

PCR 1X (Tris-HCl a 10 mmol.L-1, KCl a 50 mmol.L-1, MgCl2 a 1,5 mmol.L-1, pH

8,3), 2,5 µL de DNA, cada par de primer (forward e reverse) a 0,2 µmol.L-1 e 1

unidade da enzima Taq DNA polimerase (Fermentas). As amplificações foram

realizadas em termociclador (Gene AMP PCR System 9700 – PERKIN ELMER)

programado de acordo com o seguinte programa: 2 min a 96 ºC + 30 ciclos (1

min a 94 ºC + temperatura de anelamento específica de cada par de primers

por 1 min + 72 ºC por 1 min), finalizando com um passo a 72 ºC por 7 min.

Após as amplificações, a separação dos fragmentos foi realizada por

eletroforese em gel de agarose a 3,0%. Foram adicionadas, a cada amostra, 3

µL de uma mistura de azul de bromofenol (0,25 %) e glicerol (60 %) em água.

O gel foi submerso em tampão TBE 1X (Tris-Base, Ácido Bórico, EDTA) e a

separação eletroforética foi de, aproximadamente, duas horas a 100 volts em

gel de agarose a 3%, corado com brometo de etídio e fotografado sob luz

ultravioleta. Para determinar o comprimento dos fragmentos utilizou-se o

padrão de peso molecular conhecido, DNA do fago lambda digerido com

enzima de restrição em fragmentos múltiplos de 100 pb. Após a obtenção dos

géis de agarose, foi observada a presença ou ausência de polimorfismo entre

os clones de cada genitor.

41

3.4.3 Genotipagem da população segregante

Os 39 primers microssatélites utilizados para amplificar o DNA das 44

plantas da progênie e de dois genitores foram desenvolvidos previamente

(LANAUD et al., 1999; PUGH et al, 2004), porém, por motivo de sigilo

provisório, serão apresentados de forma codificada neste trabalho (L para os

caracterizados por Lanaud et al., (1999) e P para os caracterizados em Pugh et

al., (2004).

A comprovação das amplificações foi realizada por eletroforese em gel

de agarose e a separação dos fragmentos amplificados foi em géis de

poliacrilamida, utilizando o seqüenciador automático ABI 3730. Após a

obtenção dos géis os dados foram avaliados utilizando-se o programa

GENEMAPPER®. Realizou-se a análise de dados, extraindo os

eletroferogramas dos géis e determinando o tamanho dos fragmentos, em

pares de bases, utilizando-se padrão de peso molecular (ROX400). As

informações armazenadas nesse projeto foram analisadas com base na

presença/ausência de fragmentos, gerando-se, assim, uma matriz de dados

binários.

3.4.4 Avaliação do polimorfismo da população segregante e de ligação

entre marcadores e características

As marcas polimórficas indicadas a serem utilizadas na construção do

mapa de ligação foram identificadas quanto à presença em um parental e

ausência no outro. Alguns marcadores detectavam duas marcas exclusivas

para um único genitor, indicando que um ou ambos os genitores eram

heterozigotos para os referidos locos. Contudo, foi realizado o artifício de

duplicar o marcador e inverter a denominação, a fim de identificar a origem das

bandas, como proposto por Al-Janabi et al. (1993). Dessa forma, os fragmentos

42

presentes nos genitores TSH-1188 e CCN-51 tiveram suas origens

determinadas e também puderam ser utilizados nas análises subseqüentes.

Dentre as 60 plantas que atingiram o mínimo de 15 autopolinizações,

somente as 44 foram genotipadas com os primers microssatélites. Cada alelo

SSR exclusivo de TSH-1188 foi analisado quanto à segregação na proporção

1:1 pelo teste qui-quadrado; procedimento idêntico foi realizado com os alelos

exclusivos de CCN-51. A codificação dos dados foi realizada de acordo com

Lander et al. (1987). Portanto, a matriz com os comprimentos de alelos foi

transformada em uma matriz de A e H e os genótipos nos locos contendo

alelos exclusivos para pelo menos um dos genitores foram padronizados.

As características cor do fruto e compatibilidade foram incluídas nessa

análise, codificando-as da seguinte forma: (i) para testar a hipótese de ligação

entre características e alelos exclusivos de TSH-1188, progênies com fruto

roxo foram codificadas como H e fruto amarelo como A, enquanto que

progênies autoincompatíveis como H e autocompatíveis como A; (ii) para testar

a hipótese de ligação entre características e alelos exclusivos de CCN-51,

progênies com fruto amarelo foram codificadas como H e fruto roxo como A,

enquanto que progênies autocompatíveis como H e autoincompatíveis como A.

A análise pelo teste de multipontos, empregando-se LOD > 3,5 e r ≤ 0,5

foi feita com auxílio dos comandos “group”, "Compare" e "Map" do programa

MAPMAKER/EXP 3.0.b. (LANDER et al., 1987; LINCOLN et al., 1992). Além do

comando básico de mapeamento pelo teste multipontos, testes de ligação

adicionais foram utilizados para quantificar os valores de LOD e distancia

genética relativos a hipóteses de ligação das características com o conjunto de

marcadores, utilizando-se o comando "Try" do Mapmaker.

43

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Determinação da compatibilidade sexual

Dentre as 250 plantas da progênie que foram polinizadas artificialmente,

somente 60 (24%) atingiram o número mínimo de 15 autopolinizações durante

os dois anos de avaliação (Figura 1). Segundo Lopes & Carletto (1995), para

cada cacaueiro, deve-se utilizar entre 15 e 40 flores para autopolinização e

polinizações cruzadas, sendo 26 o número médio ótimo. A baixa

disponibilidade de flores apresentada pelas plantas durante o experimento

pode ter sido uma resposta fisiológica da planta as condições climáticas

atípicas apresentadas no ano de 2007. Esse período foi caracterizado por um

excesso de chuva apresentada nos primeiros meses de 2007, seguido por

longas estiagens e elevadas temperaturas, o que comprometeu a floração

subsequente.

Apesar de a roça ser nova e a recomendação de poda ser restrita a um

mínimo necessário para a boa formação da árvore e um perfeito arejamento da

cultura, o presente cultivo encontra com um alto índice de alto sombreamento,

causado pela ausência de podas e fechamento dos ramos. Portanto, esse

aspecto pode ter influenciado o baixo índice de floração apresentado durante o

período de avaliação, uma vez que essas condições podem favorece a

estabilidade da temperatura e da umidade no ambiente, fatores que tem

influência negativa na floração e produção de frutos no cacau. Além disso,

observa-se que em plantações tecnicamente podadas, a produção de flores e

de frutos aumenta significativamente, em relação às não podadas (DIAS,

44

2001). Desta forma, espera-se nos próximos anos de avaliação, alcançar um

maior número de polinizações por planta.

Figura 1. Histograma de número de plantas autopolinizações artificiais 250 plantas F1 do cruzamento TSH-1188 x CCN-51.

Não houve alteração na proporção esperada de segregação da

característica na população quando respeitado o número mínimo de 15

autopolinizações por planta utilizando um índice de pegamento ajustado ao

número de autopolinizações (Tabela 1). A correlação entre índice de

pegamento e número de flores polinizadas foi não significativa (r = -0,069),

possibilitando a utilização das plantas com até 15 autopolinizações nas

análises, sem superestimar a determinação da característica (LOPES:

CARLETTO, 1995). Observa-se que ao utilizar um número inferior a 15

autopolinizações controladas, a segregação da característica sofreu uma

grande distorção, resultando em um qui-quadrado significativo em relação à

segregação 1:1. Embora seja recomendado de 15 até 40 polinizações (LOPES:

CARLETTO, 1995; PIRES, 1998), o presente resultado evidencia que, nessas

condições, se for adotado índice de pegamento ajustado ao número de

45

polinizações, esse número de polinizações artificiais pode ser reduzido até o

mínimo utilizado neste trabalho.

Tabela 1. Relação entre o número de autopolinizações e o índice de

pegamento na determinação da compatibilidade sexual do cacaueiro e

verificação da segregação da característica pelo teste qui-quadrado

Autopolinizações

Índice de Pegamento

(%)

Nº de Plantas

(E) AC: AI

(O) AC: AI

Qui-quadrado

p

≥ 26 10 43 1:1 22:20 0,095 0,758ns

20 a 25 15 3 1:1 1:2 0,333 0,564ns

15 a 19 20 14 1:1 7:7 0,000 1,000ns

10-14 25 16 1:1 2:14 9,000 0,003* ns Não significativo e as frequências observadas (O) de plantas autocompatíveis (AC) para plantas autoincompatíveis (AI) não diferem estatisticamente da razão esperada (E) de segregação 1:1 pelo teste qui-quadrado a 5% de probabilidade. * Significativo e as frequências observadas (O) de plantas AC para plantas AI diferem estatisticamente da razão esperada (E) de segregação 1:1 pelo teste qui-quadrado a 5% de probabilidade.

A segregação genética da característica compatibilidade sexual na

população estudada no presente trabalho foi consistente com padrão de

retrocruzamento (Figura 2). Dentre as 60 plantas para as quais foi alcançado

um mínimo de 15 autopolinizações, 29 apresentaram foram classificadas como

autocompatíveis e 31 como autoincompatíveis, uma segregação tipicamente

1:1 (comprovado pelo teste de qui-quadrado a 5% de significância: X2 = 0,067;

p= 0,796). Os genitores são contrastantes para essa característica: CCN-51 é

autocompatível e TSH-1188 é autoincompatível (BARTLEY, 2005). Portanto, a

natureza heterozigota deste loco no clone CCN-51 é demonstrada no presente

trabalho. Desta forma, denominando-se o alelo de incompatibilidade de i,

recessivo, têm-se: CCN-51, Ii; e TSH-1188, ii. Isso implica que as plantas

selecionadas nesta população como autocompatíveis serão heterozigotas.

46

Figura 2. Número de plantas observado e esperado para a característica da autocompatibilidade (AC) e autoincompatibilidade (AI), em 60 plantas F1 do cruzamento TSH-1188 x CCN-51.

4.2. Caracterização morfo-fisiológica dos frutos

4.2.1 Cor do fruto

A segregação genética da característica cor do fruto maduro nesta

população foi compatível com a segregação 3:1 para frutos roxos (43 plantas) e

verdes (17 plantas) (X2 = 0,356; p = 0,551, teste qui-quadrado a 5% de

significância para 60 plantas). A cor do fruto em cacaueiro na fase imatura é

verde ou roxa nesta população. Ao amadurecerem, os frutos de cor verde

tornam-se amarelos. Contudo, os frutos de cor roxa podem tornar alaranjados

ou permanecer roxos. Essa característica é descrita como monogênica, sobre o

controle do gene R, com dois alelos (R e r); e em frutos imaturos a

pigmentação vermelha (RR e Rr) é dominante sobre a verde (rr) (SORIA,

1964). Ambos o genitores dessa população em estudo apresentam frutos roxos

quando imaturos, com os frutos CCN-51 tomando uma coloração alaranjada

quando maduros, porém, a segregação de 3:1 observada na progênie para

frutos imaturo de coloração roxa (genótipos RR ou Rr) e verde (genótipo rr),

comprova que ambos genitores são heterozigotos (Rr) para essa característica.

47

A análise da segregação conjunta das características cor do fruto e

compatibilidade sexual (Figura 3), apresentou uma proporção de 3:3:1:1, para

as classes fenotípicas: 1) plantas autoincompatívels com frutos roxo (21

plantas); 2) plantas autocompatíveis com fruto roxo (22 plantas); 3) plantas

autocompatíveis com fruto verde (7 plantas); e 4) plantas autoincompatíveis e

fruto verde (10 plantas).

Estes resultados esta compatível com o produto das probabilidades de

independência dos dois locos, nos quais se observou a segregação 3:1 para

cor do fruto imaturo e 1:1 para compatibilidade sexual. Essa proporção dos

fenótipos sugere que essa características segregam independentemente uma

da outra, podendo também ser também confirmado pela baixa correlação (r =

0,090; p = 0,494), encontrada em 60 plantas entre essas características.

Figura 3. Frequências esperadas (colunas sólidas) e observadas (colunas rachuradas) das classes fenotípicas (1) plantas autoincompatívels com frutos roxo; (2) plantas autocompatíveis com fruto roxo; (3) plantas autocompatíveis com fruto verde; e (4) plantas autoincompatíveis e fruto verde) distribuídas em 60 plantas da progênie em estudo. Qui-quadrado não significativo (X2 = 0,977 e p = 0,8066 a 5% de probabilidade e 3 graus de liberdade).

48

4.2.2 Número de sementes por fruto

O histograma de freqüências observadas para o número de sementes

por fruto e o número de sementes chochas por fruto configurou-se

aproximadamente em uma distribuição normal (Figura 4A e 4B), sugerindo a

existência de vários genes controlando essas características. Na distribuição

de freqüência do número médio de sementes por fruto observou-se que as

maiores produções e as menores quantidades de sementes inviáveis (chochas)

concentraram-se em um maior número de plantas, evidenciando que a

característica de produtividade de ambos os genitores foi transferida para

indivíduos da progênie. O número médio de sementes por fruto na progênie

variou entre 20 e 52, com uma média de 39,7 sementes por fruto nessa

progênie.

Figura 4. Histograma de freqüência de 60 plantas F1 do cruzamento TSH-1188 x CCN-51, relativa ao número de sementes por fruto (A) e número médio de sementes chochas por fruto (B).

Dos 60 indivíduos da progênie avaliados para número de sementes por

fruto, foram identificados 25% de plantas (15 plantas, cuja média foi de 48,20

sementes por fruto) com número de sementes superior ao genitor de maior

média (45,6 sementes por fruto). O número de sementes chochas variou de

zero a três sementes por fruto, e esteve presente em 73,3% das plantas, das

B A

49

quais 51,2% (21 plantas) apresentaram média inferior ao genitor de menor

média de sementes chochas (0,7).

Essa tendência de segregação transgressiva, ou seja, o aparecimento,

em gerações segregantes, de indivíduos que estão fora do intervalo dos

genitores no que se refere à dada característica, também foi observado nesta

população quanto ao número de óvulos por ovário (BAHIA, 2006).

As médias das variâncias estimadas para o caráter número de sementes

por fruto mostraram que essa característica tem alta herdabilidade nesta

progênie (Tabela 2). No entanto, a presença de sementes inviáveis mostrou-se

fortemente influenciada pelo ambiente (herdabilidade baixa) e corresponde a

uma baixa percentagem do número total de sementes por fruto. Estudos

posteriores poderão ser realizados no sentido de verificar a performance

desses clones quanto ao peso médio por semente e produção.

Tabela 2. Médias e variâncias estimadas para as frequências de número de

sementes por fruto (A) e número de sementes inviáveis por fruto (B) nos

genitores e na progênie

A População Média a Extremos Var. Fen. Var. Amb.b Var. Gen.c Ha CCN-51 39,00 38 e 40 1,00 1,00 - - TSH-1188 45,60 44 e 50 6,30 6,30 - - Progênie 39,81 20 e 52 62,08 3,65 58,33 0,94 B População Média a Extremos Var. Fen. Var. Amb.b Var. Gen.c Ha CCN-51 1,00 0,0 e 2,0 0,50 0,50 - - TSH-1188 0,60 0,0 e 2,0 0,80 0,80 - - Progênie 0,59 0,0 e 3,0 0,44 0,65 -0,21 -0,48 a As médias dos genitores e da progênie foram diferentes entre si pelo teste t a 5% de probabilidade. b Var. Amb. da progênie = (CCN-51 + TSH-1188)/2. c Var. Gen. = Var. Fen. – Var. Amb. Ha = Var. Gen. / Var. Fen.

A taxa de conversão de óvulos em sementes foi superior a 70% nesta

progênie (Tabela 3). Curiosamente, CCN-51 apresentou uma conversão de

apenas 67% bem como um maior número de sementes chochas. Mesmo tendo

o maior número de óvulos por ovário, apresentou menor número de sementes

por fruto. A maior produtividade conferida ao clone CCN-51 em relação ao

clone TSH-1188, pode ser atribuída ao fato do CCN-51 ser autocompatível e

produzir um maior número de frutos por planta que o TSH-1188 que é

50

autoincompatível (BARTLEY, 2005). Pois mesmo tendo um menor número de

sementes por fruto em relação ao TSH-1188, o CCN-51 possui sementes

grandes e mais pesadas, compensando o menor número de sementes por fruto

e a menor taxa de conversão de óvulos em sementes mostrados nesse

trabalho. É relatada na literatura uma correlação negativa entre quantidade e

tamanho de semente por fruto (ENGELS, 1983).

Tabela 3. Relação entre o número médio de óvulos e número médio de

sementes dos genitores e progênie

Genótipos Número médio de óvulos (BAHIA, 2006)

Número médio de sementes

Taxa de conversão de óvulos em sementes

CCN-51 58,6 39,0 0,67 TSH-1188 53,5 45,6 0,85 Progênie 54,5 39,8 0,73

Normalmente, a polinização com maior quantidade de pólen resulta em

frutos com maior número de sementes e menor possibilidade de aborto

(STEPHENSON et al., 1988). Esse processo de abortamento pode ser

considerado um mecanismo pelo qual as plantas podem influenciar a qualidade

de suas sementes (LEE, 1984).

Falque et al. (1995), estudando as relações entre a intensidade de

polinização e número de sementes por fruto em clones Forasteiros Alto

Amazônicos, na Costa do Marfim, verificou uma estreita correlação entre essas

características. Porém, sabe-se que o número de sementes por fruto depende

do número de óvulos (NEPI; PACINI, 1993) e de sua fertilização (BARTLEY,

2005). Uma leve correlação negativa foi observada entre número médio de

sementes por fruto e número médio de sementes chochas por fruto, o que

mostra que além da fertilização dos óvulos e da intensidade de polinização,

outros aspectos fisiológicos devem influenciar o preenchimento das sementes.

As correlações destas características com compatibilidade sexual foram

de modo geral próximas de zero (Tabela 4). Contudo, visto serem aspectos

relevantes para o caráter produtividade, é necessário verificar aspectos da

biologia reprodutiva, visando elucidar mecanismos da fertilização e formação

das sementes, pois se sabe que estas características dependem de condições

51

ambientais favoráveis para o seu sucesso (MARTÍN, 1982). Segundo Leal

(2005), a baixa produtividade em algumas plantações comerciais se deve em

parte a uma polinização pouco efetiva, tratos culturais inadequados e

condições ambientais desfavoráveis e outros aspectos fisiológicos.

Tabela 4. Coeficientes de correlação de Pearson entre as características

avaliadas em 60 plantas F1 de TSH-1188 x CCN-51

Características CS SP ScP CF Compatibilidade sexual (CS) 1 -0,051 0.107 -0,090 Número médio de sementes por fruto (SP) 1 -0,169 0,110 Número médio de sementes chochas por fruto (ScP) 1 0,017 Cor do fruto maduro (CF) 1

4.3 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51

As amostras de DNA apresentaram concentrações variando de 35,0 a

629,8 ng/µl que foram suficientes para a realização de todas as reações

necessárias para a análise (Tabela 5). A razão A260/A280 variou entre 2,1 e 10,3,

indicando que as amostras encontram-se com algumas contaminações,

supostamente proteínas. No entanto, essas contaminações não interferiram no

andamento das reações PCR.

Tabela 5. Identificação dos indivíduos, relação das absorbâncias das amostras

de DNA a 260 nm e 280 nm e quantificação das concentrações de DNA com

base em três repetições

Nº

Indivíduo A(260) A(280) A(260)/A(280) Conc. (ng/µl)

01 CCN-51 P02 0,691 0,135 8,038 317,7 02 CCN-51 P03 0,663 0,173 7,086 281,3 03 CCN-51 P04 0,414 0,126 8,200 164,3 04 CCN-51 P05 0,705 0,440 7,463 151,8 05 CCN-51 P06 0,599 0,367 10,280 127,8 06 CCN-51 P07 0,846 0,218 7,097 365,3 07 CCN-51 P08 0,951 0,425 3,300 358,3 08 CCN-51 P10 0,768 0,145 8,691 352,5 09 TSH-1188 P01/L05 0,478 0,279 3,211 144,3 10 TSH-1188 P01/L07 1,043 0,496 4,091 360,7 11 TSH-1188 P01/L08 0,102 0,052 3,381 35,0

52

12 TSH-1188 P01/L09 0,261 0,820 6,265 106,5 14 TSH-1188 P02/L02 0,324 0,083 7,179 139,7 15 TSH-1188 P02/L03 0,598 0,167 7,952 247,0 16 TSH-1188 P02/L04 1,155 0,775 2,720 303,3 17 TSH-1188 P02/L05 0,870 0,068 8,438 67,7 18 TSH-1188 P02/L06 0,450 0,175 5,825 166,2 19 TSH-1188 P02/L07 1,199 0,708 3,054 368,2 20 TSH-1188 P02/L08 0,262 0,125 4,044 90,5 21 TSH-1188 P02/L09 1,881 0,995 3,375 629,8 22 TSH-1188 P03/L03 0,805 0,492 3,204 228,0 23 TSH-1188 P03/L04 0,598 0,167 7,952 247,1 24 TSH-1188 P03/L05 1,155 0,775 2,720 303,4 25 TSH-1188 P03/L06 0,870 0,068 8,438 67,8 26 TSH-1188 P03/L07 0,450 0,175 5,825 166,2 27 TSH-1188 P04/L06 0,629 0,518 2,067 108,8

O DNA extraído apresentou-se íntegros ou com baixa proporção de

fragmentação (Figura 5). Apenas algumas amostras apresentaram leve arraste

e em todas as amostras foi observada a formação de uma banda nítida de

DNA. A presença de amostra retida no poço de aplicação e entre ele até a

banda de DNA é outra indicativa de presença de proteínas ou outras

macromoléculas misturadas ao DNA, o que foi também indicado pelos altos

valores de relação de absorbância 260 por 280.

Figura 5. Padrão eletroforético das amostras de DNA genômico total, separadas em gel de agarose 1 % e coradas com Brometo de Etídio. Foram aplicados 2 µL de DNA + 2 µL de corante tipo lV por canaleta.

As amplificações com primers RAPD ocorreram com sucesso (Figura 6),

o que garantiu um DNA de qualidade para a continuidade dos trabalhos com os

marcadores microssatélies. Neste estudo, o uso de apenas dois primers RAPD,

escolhidos aleatoriamente, teve como único objetivo verificar se DNA extraído

apresentava condições ideais para as reações de amplificação, visto que esta é

uma técnica bastante simplificada além de requerer pouca quantidade de DNA

por análise (GOULÃO et al., 2001).

53

Como informação, o resultado dos dois primers consistiu em bandas

monomórficas entre todos os indivíduos analisados em cada grupo. Esse

padrão monomórfico evidencia que os indivíduos são geneticamente

homogêneos para esses dois primers utilizados. Embora apenas dois primers

não sejam suficientes para essa finalidade, os marcadores RAPD podem ser

úteis para testar a pureza genética e discriminar cultivares em certas situações.

Figueira et al. (1998), usando marcadores RAPD para analisar a similaridade

genética entre acessos mantidos em duplicatas em coleções do

CEPEC/CEPLAC (CEPEC, 2005) e BAL Plantations (Malásia), considerou

como não-idênticas essas plantas. De acordo com os autores, 3 (27,3%) dos

11 acessos não mostraram a mesma identidade genética nas duas coleções.

Figura 6. Padrão de bandas RAPD separadas em gel de agarose a 1,2 % e corado com Brometo de Etídio. Amplificações com os primers: AX15 a partir das amostras de DNA dos 16 indivíduos de TSH-1188 (A) e das amostras dos oito indivíduos de CCN-51 (B); D20, 16 indivíduos de TSH-1188 (C) e oito de CCN-51 (D). M = corresponde ao padrão de tamanho de fragmento de DNA do fago Lambda 100 Kb.

54

Nenhum dos 15 primers microssatélites evidenciou diferenças entre os

acessos de mesmo genitor, utilizados nos cruzamentos, como pode ser

ilustrado com bandas evidentes e monomórficas para cada grupo de genitor

(Figura 7). O padrão das amplificações mostrado nessa figura referente a esse

marcador retrata bem os resultados obtidos com os 15 marcadores, onde a

diferença de padrão bandas entre TSH-1188 e CCN-51 revela polimorfismo

entre esses dois clones para esse loco (duas bandas na figura 8A para o TSH-

1188 e uma banda na figura 8B para o CCN-51). A homogeneidade dentro de

cada clone que é representada pela ausência de diferenças alélicas entre os

indivíduos de mesmo clone, indicando uma pureza varietal nos clones

estudados neste trabalho. Portanto, esses resultados indicam que os genótipos

de todos os clones mostram-se indistinguíveis entre si, não existindo mistura

varietal, com base nestes 15 locos microssatélites. No entanto, nas reações de

amplificação utilizando géis de agarose, o tipo de eletroforese pode ter

influenciado na determinação do número de alelos, uma vez que o poder de

resolução de géis de agarose permite distinguir fragmentos que diferem acima

de 3 pb ao passo que o de poliacrilamida permite distinguir fragmentos que

diferem em um pb. Ferreira e Grattapaglia (1998) recomendam o uso de matriz

de alta resolução para a visualização dos fragmentos, pois dependendo do

número de nucleotídeos do elemento repetido no microssatélite, a visualização

em gel de agarose pode não ser possível. Embora as diferenças de até 3 pb

não poderem ser detectadas em gel de agarose, esse tipo de polimorfismo não

compromete este estudo, visto que para estes genitores, dos 36 primers

polimórficos, apenas 4 (11%) apresentaram diferenças alélicas inferiores a 4

nucleotídeos.

55

Figura 7. Padrão de bandas de DNA amplificado com primers microssatélites separadas em gel de agarose a 3 % e corado com Brometo de Etídio. Amplificações com o primer microssatélite: UENF/CEPLAC 129 a partir das amostras de DNA dos 24 indivíduos de TSH-1188 (A) e das amostras dos oito indivíduos de CCN-51 (B); UENF/CEPLAC 118, 24 indivíduos de TSH-1188 (C) e oito de CCN-51 (D). M = corresponde ao padrão de tamanho de fragmento de DNA do fago Lambda 100Kb.

A ausência de alelos exclusivos na progênie em relação aos genitores é

mais uma evidência da pureza clonal desses acessos, visto que, todos os

alelos encontrados na população estavam presentes também nos acessos

utilizados neste trabalho como genitores.

A análise dos comprimentos dos alelos dos genitores amplificados por

15 primers SSR utilizados pode-se verificar que a maioria dos locos (71,43%)

apresenta dois alelos em cada indivíduo, confirmando a natureza heterozigota

dos genitores. Além disso, pode-se comprovar que todos esses primers

apresentam polimorfismo entre os genitores em, pelo menos, um alelo por loco.

O número de locos a ser testado depende do grau de pureza das

amostras. Para os casos em que são encontradas diferenças, as análises

terminam quando as diferenças são detectadas (SCHUSTER et al., 2004). O

estudo sobre identidade e variabilidade genética em geral e de certificação

clonal de acessos de cacaueiro de banco de germoplasma tem sido feito com

cerca de 8 a 9 locos SSR, sendo idealmente utilizados 15 locos SSR para a

diferenciação satisfatória de acessos fortemente relacionados geneticamente

(RISTERUCCI et al., 2000b; 2001; GILMOUR, 2001). Saunders et al. (2000),

56

baseado na análise das características de diferentes tipos de marcadores de

DNA, propôs o estabelecimento de um protocolo de caracterização molecular

de acessos de cacau usando 15 locos microssatélites. De acordo com Zhang et

al. (2006), trabalhos de diversidade genética utilizando 15 locos SSRs permite

alcançar uma probabilidade de identificação de 1 em 10000 , ou seja, um nível

de confiança de 99,99%, fornecendo um alto rigor estatístico na identificação

de acessos de cacau. Andrade (2006), em estudos de diversidade genética de

cacaueiros, mostrou que a utilização de 15 primers microssatélites eram

suficientes para eliminar incongruências presentes em dendrogramas oriundos

de análises de agrupamento gerados com dados de 8 primers microssatélites.

Em um estudo para diferenciação de cultivares de soja, Priolli et al.

(2002) relataram que 12 locos microssatélites não foram suficientes para

diferenciar os cultivares de soja avaliados, e atribuíram esse impedimento a

estreita base genética dos programas brasileiros de melhoramento de soja.

Além disso, outras regiões do genoma com grande variabilidade podem não ter

sido amostradas. Por outro lado, Garcia et al (2007) relatou que 10 locos SSR

foram suficientes para identificação adequada de cultivares de soja.

Devido à genealogia de TSH-1188 e CCN-51 incluírem clones

geneticamente distintos e com alta heterozigosidade, a utilização de 15 primers

microssatélites mostra-se suficientemente segura para certificação da

identidade genética dos acessos desses clones neste trabalho.

Tabela 6. Tamanho estimado dos alelos identificados (pb) na análise de

39 locos de microssatélites da em 44 indivíduos da progênie ‘TSH-1188 x CCN-

51, em comparação à localização nos grupos de ligação do mapa consensual

do cacaueiro (PUGH et al., 2004) e alelo clonado (LANAUD et al., 1999)

Loco

Grupo de ligação

Alelo clonado (pb)

Alelos observados (pb) Nº de alelos TSH-1188 CCN-51

L03 1 254 232 232 232 250 2

P21 1 139 116 141 130 116 3

L08 1 289 286 286 286 286 1

P28 1 192 196 206 196 206 2

P29 1 - 142 144 142 144 2

P30 1 - 185 187 185 187 2

P14 2 129 123 135 123 127 3

57

L06 2 376 371 371 352 371 2

P9 2 112 114 114 109 114 2

P15 3 - 205 213 205 211 3

L07 3 - 142 153 140 153 3

P13 4 - 191 195 191 191 2

P19 4 175 175 177 175 175 2

L04 4 271 271 281 271 281 2

L05 4 345 116 141 116 130 3

P23 4 220 219 221 217 219 3

P26 4 - 112 145 112 114 3

P10 4 139 120 136 108 136 3

L02 5 208 203 205 203 210 3

P12 5 105 92 102 92 93 3

P27 5 190 189 189 189 189 1

P05 6 - 147 153 133 145 4

L01 6 274 185 187 185 187 2

P16 7 - 209 215 209 215 2

P20 7 288 283 291 281 283 3

P04 7 265 192 202 184 202 3

P06 7 234 231 231 226 231 3

P07 7 354 328 362 352 362 3

P22 8 - 150 152 150 161 3

P25 8 193 192 192 192 192 1

P17 9 - 115 118 113 118 3

P18 9 288 291 291 291 295 2

L09 9 198 184 184 184 192 2

P01 9 182 180 180 171 180 2

P02 9 235 237 237 232 237 2

P08 9 226 235 257 262 262 3

P24 10 307 315 323 309 309 3

P03 10 150 146 176 133 153 4

P11 10 - 185 187 185 187 2

4.4 Segregação e ligação genética

De modo geral, os tamanhos dos fragmentos de microssatélites obtidos

nas amplificações corroboraram os valores relatados por Lanaud et al. (1999) e

Pugh et al. (2004) (Tabela 6). Foram identificados 97 alelos nos 39 locos que

exibiram produtos de amplificação, e o número de alelos por microssatélite

variou de 1 a 4 (média de 2.49 alelo por loco), o que está de acordo com o

esperado para essa população, que envolve seis clones diferentes em sua

58

genealogia. Os genitores TSH-1188 e CCN-51 apresentaram respectivamente

71,79% e 82,50% dos locos heterozigotos, confirmando sua natureza

heterozigota, sendo, portanto adequados para estudos de mapeamento

genético.

Dos 39 microssatélites analisados, os alelos exclusivos de cada genitor

segregaram de acordo com a proporção mendeliana 1:1 em 28 microssatélites,

sendo 20 desses marcadores comuns para ambos os genitores (Tabela 7).

Essa segregação é típica de retrocruzamentos. Dos 11 locos microssatélites

não utilizados na construção do mapa de ligação, um apresentou problemas e

codificação (P30), três foram monomórficos (L08, P25 e P27) e sete

demonstraram outros padrões de segregação típicos de

intercruzamentos (L04, L05, P11, P12, P16, P28 e P29). Os marcadores com

tais desvios de segregação foram descartados no presente estudo. Tal medida

foi adotada pelo fato de que os mesmos alteraram a construção dos grupos de

ligação, gerando, portanto, grupos desuniformes, o que não retrata a realidade

de um grupo de ligação genético. Nesse caso, os programas utilizados para

calcular a freqüência de recombinação levam em consideração a segregação

1:1. A utilização desses marcadores pode aumentar a probabilidade de erro, ou

seja, assumir como verdadeira uma associação entre dois locos não ligados.

Do total de 28 marcas utilizadas para construção do mapa, 13 não

permaneceram agrupadas e mostraram-se independentes aos grupos de

ligação formados e os demais possibilitaram evidenciar grupos de ligação

correspondentes a regiões genômicas de 5 grupos de ligação do cacau (Figura

8). Os alelos exclusivos de TSH-1188 possibilitaram identificar dois locos

ligados à característica de compatibilidade: P23, cuja banda exclusiva de TSH-

1188 está ligada em repulsão com a autoincompatibilidade; P10, cuja banda

exclusiva do TSH-1188 está ligada em acoplamento com autoincompatibilidade

(Figura 8). De fato, a maioria das progênies auto-incompatíveis possui alelos

de P10 exclusivo de TSH-1188.

Tabela 7. Marcadores microssatélites que segregaram na proporção

esperada (1:1) para os alelos exclusivos de cada genitor (CCN-51 e TSH-

1188), e o valor do quí-quadrado significativo a P > 0,05 (X2 < 3,846)

59

Marcador

CCN-51

Marcador

TSH-1188

X2 P X

2 p

L02 0,701 0,402 L02 1,140 0,286

P12 0,972 0,324 P12 0,581 0,446

P14 0,015 0,902 P14 0,220 0,639

P15 2,304 0,129 P15 3,789 0,052

P17 2,833 0,092 P17 0,095 0,758

P20 0,701 0,402 P20 0,022 0,881

P21 0,015 0,904 P21 1,884 0,170

P22 1,457 0,227 P22 1,455 0,228

L07 0,059 0,808 L07 0,095 0,758

P23 0,159 0,690 P23 1,400 0,237

P03 0,505 0,477 P03 0,818 0,366

P04 0,014 0,906 P04 0,364 0,546

P05 0,069 0,793 P05 1,000 0,317

P07 0,368 0,544 P07 0,023 0,879

P10 0,396 0,529 P10 2,077 0,150

L01 2,833 0,092 L01 0,023 0,879

P19 0,130 0,719 P09 0,243 0,622

P13 0,132 0,717 L03 0,095 0,758

P24 0,229 0,632 P18 0,209 0,647

P08 3,409 0,065 L06 1,524 0,217

L09 0,022 0,881

P01 0,000 1,000

P02 0,818 0,366

P06 0,000 1,000

A característica cor de fruto não apresentou ligação genética significativa

a nenhum dos microssatélites testados. Por tentativa de ligação (comando “Try”

do Mapmaker), foi demonstrada uma hipótese fraca de associação entre a

característica cor de fruto e o GL7 (P07 com Cor: 57,9 cM; LOD 0,76).

Contudo, esses dados indicam a necessidade de testar um maior número de

locos visando identificar marcadores mais fortemente associados a essa

característica.

O ordenamento das marcas nos grupos de ligação onde foram

detectados, de uma maneira geral, apresentou semelhança com o observado

nos grupos de ligação do mapa consensual para o cacaueiro publicado por

Pugh et al. (2004).

60

Observam-se também pequenas diferenças de distância calculada entre

algumas marcas nos diferentes grupos de ligação, relativamente aqueles

obtidos por Pugh et al. (2004), o que pode ser explicado pelo reduzido número

de indivíduos e marcadores empregados no presente estudo. Além disso, cada

genitor pode ter diferentes taxas de recombinação nas diferentes posições do

genoma. A baixa saturação destes grupos de ligação construídos a partir de

alelos exclusivos de TSH-1188 e CCN-51 dificultou a integração entre eles.

Mesmo assim, quando comparado com o mapa consensual (PUGH et al.,

2004) e havendo locos com bandas informativas simultaneamente entre os dois

genitores, foi possível evidenciar a integração entre grupos de ligação.

Clement et al. (2003a) encontrou um conjuntos de QTLs relacionados ao

número de óvulos por ovário, identificados em diversos cromossomos (1, 2, 4,

5 e 6). Três QTLs foram encontrados no grupo de ligação 4 do mapa consenso

(PUGH, et al., 2004) associados aos clones DR 1(Trinitário), S 52 (Trinitário) e

IMC 78 (Forasteiro) e explicou 23,5%, 15,0% e 24,2% respectivamente, da

variação fenotípica para essa característica. Os QTLs associados aos clones

DR 1 e IMC 78 estão situados em uma mesma região cromossômica do grupo

de ligação 4 e distantes em torno de 61,15 cM da marca mTcCIR76, enquanto

que o associado ao clone S 52 encontra-se na marca mTcCIR18, situado 16,1

cM da marca mTcCIR76.

61

Figura 8. Grupos de ligação determinados a partir de 26 alelos exclusivos de TSH-1188 e 24 de CCN-51, bem como das características cor de fruto e compatibilidade sexual, com base na população F1 derivada desses clones. GL1, 2, 4, 7 e 9 correspondem ao mapa integrado por Pugh et al. (2004).

P04

P06

P07 P20

10,0

P04

P07 7,5

57,5

7,3

Cor

P21

L03

27,7

L06

P14

14,8

GL2 GL9

GL7

GL4

TSH

TSH

CCN TSH

P10

Incomp.

14,8

P23

P19

9,4

12,8

P10

P23

Comp.

21,0

CCN

TSH

TSH

P18

P02

L09

P01

10,0

12,9

7,5

GL1

TSH

62

Albuquerque (2006) localizou um QTL relacionado à resistência a VB no

grupo de ligação 4, tendo como marcas cofatores o mTcCIR18 a esquerda e

mTcCIR76 a direita, explicando 41,9% da variação fenotípica das progênies

quanto a resistência a M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’. Três

QTLs associados à resistência do cacaueiro a P. palmivora foram encontrados

também no grupo de ligação 4, em regiões muito próximas de onde foi

localizado o QTL associado à resistência M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x

CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006). Um destes QTLs foi encontrado por

Crouzilat et al. (2000) e foi capaz de explicar 13,2% da variação fenotípica da

resistência de frutos de ‘Catongo’ (Forasteiro). Dois QTLs foram encontrados

por Clement et al. (2003b) associados aos clones IMC 78 e DR1. Estes QTLs

foram capazes de explicar 22,6% e 10,1% respectivamente, da variação

fenotípica da resistência à podridão em frutos com base em dados de campo

acumulados por mais de seis anos.

No mapeamento de genes homólogos de resistência (RGH) realizado

por Lanaud et al. (2004) utilizando as mesmas progênies F1 do mapa de

referência do cacaueiro (PUGH et al., 2004), foram localizados quatro genes

alinhados em seqüência no grupo de ligação 4. Estes genes estavam próximos

dos locos de microssatélites mTcCIR17 e mTcCIR18 na mesma região onde

foram detectados os QTLs associados à resistência a P. palmivora (CLEMENT

et al., 2003b), QTL associado a resistência à M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39

x CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006) e QTLs associados ao número de óvulos

por ovário (CLEMENT et al., 2003a) em cacaueiros.

O grupo de ligação 9, apresentou quatro marcas com 30,4 cM,

mostrando apenas pequenas diferenças de posicionamentos em relação ao

mapa consenso (PUGH, 2004). Apesar deste estudo não levar em

consideração aspectos de resistência a vassoura-de-bruxa, este grupo de

ligação é de extremo interesse, pois nele foi localizado o principal QTL para

resistência a essa doença, oriundo do genótipo ‘Scavina 6’ (QUEIROZ, et al.,

2003; FALEIRO et al., 2006), que esta presente na genealogia dos dois

genitores desta população de estudo.

63

5 CONCLUSÕES

O uso de um índice de pegamento ajustado ao número de polinizações

artificiais por planta possibilita a realização de testes de compatibilidade com a

utilização de um número reduzido de no mínimo de 15 autopolinizações por

planta sem superestimar a determinação da característica.

As características compatibilidade sexual e cor do fruto segregaram na

proporção de 1:1 e 3:1, respectivamente, e de forma independente nesta

população.

O número de sementes por fruto distribui-se de forma contínua na

população de acordo com um padrão multigênico e com segregação

transgressiva, assim como o número de sementes inviáveis por fruto.

Os acessos que representam os clones TSH-1188 e CCN-51 na coleção

de germoplasma do Centro de Ciências do Cacau M&MMars, são

geneticamente puros. Os acessos de cada grupo mostram-se indistinguíveis

entre si pela genotipagem em 15 locos SSR.

As marcas microssatélites P23 e P10 (não divulgadas por motivos de

sigilo de pesquisa) estão ligados à característica de compatibilidade sexual. A

característica cor de fruto não apresentou ligação genética significativa a

nenhum dos microssatélites testados. A existência da segregação da

característica compatibilidade sexual e cor do fruto, possibilita que esta

população seja utilizada em estudos de mapeamento genético para essas

características.

64

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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