identificação de complexos protéicos de citros associados...
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Identificação de complexos protéicos de citros associados ao fator de
patogenicidade PthA de Xanthomnas citri
Bolsista Nayara Patrícia Vieira de Lira
Estudante de Biologia da Universidade Federal de Pernambuco
Orientador
Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti Co-orientador
Tiago Antonio Souza LNBio
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Identificação de complexos protéicos de citros associados ao fator de
patogenicidade PthA de Xanthomnas citri
Bolsista Nayara Patrícia Vieira de Lira
Estudante de Biologia da Universidade Federal de Pernambuco
Orientador
Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti Co-orientador
Tiago Antonio de Souza LNBio
2011
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“Nunca deixe que digam que não vale a pena acreditar no sonho que se tem, que seus
planos nunca vão dar certo ou que você nunca vai ser alguém”
Renato Russo
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha família pelo amor e pela base que me ajudaram ser o que
sou e chegar até aqui.
Agradeço à Celso Benedetti pela orientação, lições aprendidas e por ter me
escolhido dentre tantos.
À Tiago pela orientação, paciência e incasável missão de fazer o bolsista de
verão sorrir.
À Adriana pela força e doçura infinita que me ajudaram nos momentos difíceis.
Á Malu, Lílian, Mariane e Bruna pela paciência e acolhimento.
À Adriana Pas Leme do Laboratório de Espectrometria de Massas pelo apoio à
realização dos expereiemtos.
À Romênia pela ajuda nas análises do massas e pelas conversas de bancada.
À Sandra Dias pelo apoio prestado à realização dos experimentos.
À todos os bolsistas pela companhia, risos e cada momento que ficarão
guardados com carinho.
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Sumário
1. Introdução ........................................................................................................................ 7
2. Fundamentação teórica .................................................................................................... 9
2.1 Citros e a Citricultura ......................................................................................................... 9
2.2 O Cancro Cítrico ................................................................................................................. 10
2.3 Mecanismos de Interação Planta-Patógeno............................................................ 13
2.4 Xanthomonas Citri, uma ameaça à citricultura ...................................................... 14
2.5 Sistema de Secreção tipo III (SSTT) ........................................................................... 15
2.6 Efetores TAL ....................................................................................................................... 16
2.7 Proteínas Efetoras Tipo III: PthAs ............................................................................. 17
2.8 Interações Proteína-proteína entre as PthAs e as proteínas de citros ......... 19
2.9 Proteínas com potencial interação com PthAs ...................................................... 21
2.10 Complexos transcricionais ........................................................................................ 21
2.11 Espectrometria de Massas .......................................................................................... 22
2.12 GST Pull Down ................................................................................................................. 23 3. Objetivos ......................................................................................................................... 23
3.1 Objetivo Geral ..................................................................................................................... 23
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................................... 23
3.3 Perspectiva .......................................................................................................................... 23 4. Metodologia ................................................................................................................... 24
4.1 Material Vegetal................................................................................................................. 24
Extração de proteínas de Citro ........................................................................................... 24
4.1.1 Extrato Sem Pós-tratamento ................................................................................ 24
4.1.2 Extrato Tratado ......................................................................................................... 24
4.2 Expressão ............................................................................................................................. 25
4.3 Lise celular bacteriana .................................................................................................... 25
4.4 Imobilização de PthAs-GST em resina de glutationa .......................................... 25
4.5 Pull down de proteínas de folha de citrus com PthA2 e PthA4 em coluna de glutationa .................................................................................................................................... 26
4.6 Western Blot ....................................................................................................................... 26
4.7 Espectrometria de massas ............................................................................................ 27
4.7.1 Preparo dos géis e Excisão das bandas ............................................................ 27
4.7.3 Digestão tripsínica em gel ..................................................................................... 28
4.7.4 Digestão em solução ................................................................................................ 28
4.7.8 Condições de corrida e análise de dados em Espestrometro do tipo ESI-Q-TOF ....................................................................................................................................... 29
4.7.8.1 Em gel ........................................................................................................................ 29
4.7.8.2 Em solução ............................................................................................................... 29
4.8 Análise dos dados ............................................................................................................. 29 5. Resultados e Discussão ................................................................................................... 31
5.1 Extração de proteínas ................................................................................................ 31
Expressão das PthAs-GST e Pull down ............................................................................ 33
5.3 Imunodetecção .................................................................................................................. 34
5.3.1 Anti-HMG ..................................................................................................................... 34
5.3.2 Anti-Maf ........................................................................................................................ 35
5.3.3 Anti-Ubc13 .................................................................................................................. 35
5.3.4 Anti-ARF ....................................................................................................................... 36
6
5.3.5 Anti-Cyp........................................................................................................................ 37
5.3. 6 Anti-Uev ...................................................................................................................... 37
5.4 Espectrometria de Massas............................................................................................. 37
5.4.1 Excisão de bandas e identificação dos peptídeos ........................................ 37
5.4.2 Identificação das proteínas em solução ........................................................... 38 Conclusão ................................................................................................................................ 40
Bibliografia ............................................................................................................................... 41
7
1. Introdução
O citros compreende gêneros da família Rutaceae e são popularmente
conhecidos como laranjas, limões, limas, cidras entre outras. O Brasil é líder mundial
em citricultura seguido pelos Estados Unidos e México (Oliveira, 2006). Porém,
alguns fatores causam danos a produção resultando em prejuízos, dentre eles estão
os fatores ambientais como salinidade do solo e os mais graves causados pelas
doenças que acometem as plantações (Pompeu Jr et al, 2002).
Uma das mais importantes doenças que afetam o citros é o cancro cítrico causado
por dois grupos filogeneticamente distintos de bactérias do gênero Xanthomonas,
são elas: Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) e Xanthomonas axonopodis pv.
arantipholii (Xaa) (Brunings & Gabriel, 2003).
A doença é caracterizada pela formação de tumores ou pústulas resultantes da
hipertrofia e hiperplasia celular nas folhas, frutos e brotos jovens (Domingues et al,
2010). Esses tumores são envoltos por um alo amarelo e possuem líquido
proveniente do xilema e dos polissacarídeos acumulados pela bactéria no espaço
intercelular do hospedeiro. Após se replicar o patógeno rompe a epiderme ficando
livre para infectar outras plantas (Brunings & Gabriel, 2003).
Por se desenvolver no espaço extracelular da planta hospedeira, a bactéria lança
diretamente no citoplasma proteínas que acumulam-se no núcleo modulando a
expressão de genes alvo. Essas proteínas são ditas efetoras e possuem sítios de
reconhecimento de promotores de genes, no hospedeiro, que uma vez expressos
contribuem para desencadear a doença (Bogdanove, 2010).
Quando o patógeno se instala e desenvolve a doença os efetores são ditos
efetores de patogenicidade. Porém, algumas plantas são resistentes pela presença
dos chamados genes resistência (R) que são ativados por efetores bacterianos ditos
efetores de avirulência (Greenerg, 1997).
Estruturalmente as proteínas efetoras são multidomínio apresentando sinal de
localização nuclear (NLS) na porção C-terminal, um N-terminal necessário à
maquinaria de secreção tipo III e um domínio de ativador transcricional ácido
semelhante aos fatores de transcrição (Bogdanove, 2010). A estrutura dessas
8
proteínas é fundamental para desempenho de sua função uma vez que é através
desses sítios, comuns a todas as efetoras, que é possível interagir com proteínas do
hospedeiro e os genes alvo. A patogenicidade das PthAs, por exemplo, é
determinada pelo domínio repetido interno que é responsável ainda pela
especificidade de hospedeiro (Yang et al, 1994).
A Xanthomonas citri utiliza a proteína efetora tipo III PthA reconhecida como
crucial para desencadear a doença. Pertencente à família Avr/Bs3, essas proteínas
possuem um domínio interno de 34 aminoácidos repetidos em tandem que
determinam a patogenicidade ou virulência (Kay e Bonas, 2009).
Além ligarem-se ao DNA, pthAs, associam-se à proteínas do hospedeiro como a
α-importina que à direciona ao núcleo. Domingues e colaboradores (2010), através
de ensaios de duplo-híbrido identificaram além da interação com a α-importina,
interações com outras proteínas todas de co-lalização nuclear que estão envolvidas
com a transcrição, estabilização de RNA mensageiro e reparo de DNA.
Dentre as proteínas que fazem interação com as PthAs, confirmadas por duplo-
híbrido de levedura, estão a ciclofilina (cyp), Ubiquitina (UBC13), a tireoredoxina
(TDX) e a varieante de ubiquitina (UEV). Estas proteínas interagem entre si e com as
variantes de PthAs, em graus distintos, indicando haver a formação de um complexo
transcricional que modula a expressão dos genes alvo (Domingues et al, 2010).
Ainda utilizando ensaios de duplo híbrido foram identificadas interações entre
pthAs e as proteínas ARF (Auxin response factor) envolvida em sinalização mediadas
por auxina e CsHMG (High-mobility group) de Citrus sinensis envolvidas em
crescimento celular (Souza, 2010).
Os estudos apontam para a função das PthAs como fatores de transcrição e sua
interação com proteínas nucleares do hospedeiro, porém o mecanismo molecular
utilizado ainda é alvo de investigação. Além disso, os estudos feitos até o momento
utilizam proteínas recombinantes o que torna interessante uma nova abordagem
desses dados prévios, utilizando proteínas nativas de citros.
9
2. Fundamentação teórica
2.1 Citros e a Citricultura
O termo citros compreende um grande grupo de plantas originárias
principalmente das regiões subtropicais e tropicais do sul e sudeste da Ásia,
incluindo áreas da Austrália e África. À este grupo pertencem os gêneros Citrus,
espécies do gênero Fortunella e Poncirus, e híbridos da família Rutaceae. Alguns dos
representantes mais conhecidos deste grupo são as laranjas (Citrus sinensis),
tangerinas (Citrus reticulata e Citrus deliciosa), os limões (Citrus limon), limas ácidas
como o Tahiti (Citrus latifolia) e o Galego (Citrus aurantiifolia), e doces como a lima
da Pérsia (Citrus limettioides), pomelo (Citrus paradisi), cidra (Citrus medica),
laranja-azeda (Citrus aurantium) e toranjas (Citrus grandis).
Morfológicamente tratam-se de árvores de porte médio atingindo cerca de 4m
de altura com copa densa e formato geralmente arredondado. Suas folhas são ricas
em componentes aromáticos que lhes confere cheiro característico. Suas flores são
alvo de insetos polinizadores atraídos pelo aroma, também característico, e é
utilizada na indústria, produção de mel, cosméticos e fitoterápicos (IAC, 2010). Por
esses valores nutricionais e sua aplicabilidade, a citricultura é uma atividade
bastante promissora no setor primário refletindo direta e indiretamente na geração
emprego e renda.
A produção mundial de citros chegou à 102 milhões t por ano, provenientes de
7,3 milhões de hectares cultivados, superando grande parte das outras fruteiras
tropicais e subtropicais como banana, maçã, manga, pêra, pêssego e mamão.
Os maiores produtores de laranjas são o Brasil e os Estados Unidos, que juntos
representam cerca de 45% do total mundial. Outros produtores de destaque nesse
panorama são África do Sul, Espanha e Israel, com a produção de laranjas para o
mercado in natura e tangerinas, e o México, com a lima ácida Tahiti, além dos novos
parques citrícolas emergentes na Ásia, como a China (IAC, 2010).
10
As primeiras plantas cítricas introduzidas no Brasil foram trazidas, da Espanha,
pelos portugueses como forma de manter um estoque de vitamina C e evitar o
escorbuto entre os navegadores e sua tripulação.
Hoje a citricultura concentra-se principalmente no estado de São Paulo que na
última safra (2009/2010) rendeu 297,5 milhões de caixas de 40,8kg de laranja,
considerando apenas a parcela comercial, que em sua maioria é destinada ao
mercado exterior (Secretaria de Agricultura do Estado de São Paulo, 2010).
Apesar da grande diversidade de gêneros, espécies, cultivares e clones de citros a
citricultura ainda é bastante vulnerável uma vez que uma pequena parcela desta
diversidade é cultivada nos pomares comerciais. Além disso, o estabelecimento de
culturas em locais com alta plasticidade genética de patógenos as torna bastante
vulnerável. Assim, estudos voltados ao enriquecimento dos cultivares, bem como
aumento da base genética são fundamentais para otimização do sistema produtivo
(Oliveira, 2006).
Um dos fatores que limitam a produção de laranja no país são as doenças que
acometem os laranjais fazendo o preço da fruta cair. Algumas das principais doenças
que acometem à citricultura no estado de São Paulo são tristeza, cancro cítrico,
declínio, gomose e nematoides (Pompeu Jr et al, 2002).
2.2 O Cancro Cítrico
Uma das enfermidades que atacam o citros é o cancro cítrico, em seu último
levantamento a Fundecitrus (Fundação de Defesa da Citricultura) apontou um
aumento de 0,14 para 0,44% da incidência da doença nos talhões de São Paulo
(Fundecitrus, 2010).
O primeiro caso de cancro cítrico documentado no mundo data de 1827 e
1831 na índia (Amorim & Bergamim filho, 2001). No Brasil, foi diagnosticada pela
primeira vez em 1957 no estado de São Paulo. Essa ameaça ainda não está afastada,
uma vez que o agente causal da doença, a bactéria Xhantomonas axonopodis pv.
citri, penetra na planta por aberturas naturais como os estômatos (Figura 1) e é
disseminada pela chuva e ventos, sendo assim de fácil contágio podendo alcançar
em pouco tempo todo o laranjal. Além disso, todos os cultivares de citrus são
vulneráveis ao cancro cítrico (Brunings & Gabriel, 2003).
11
Figura 1: Eletromicrografia de varredura de folha de de citros evidenciando estômato com Xanthomonas. Gottmald et al (2002). In Plant Health Progress (http://www.plantmanagementnetwork.org)
A doença é caracterizada por erupções características nas folhas, frutos e brotos
jovens (Figura 2) causando com isso a queda dos frutos e consequentemente da
produção (Gottwad et al, 2002). É causada por dois grupos de cepas
filogeneticamente distintos de Xanthomonas. Um deles é Xanthomonas axonopodis
pv. citri e o outro Xanthomonas axonopodis pv. aurantiofolii que afeta apenas o
limão galego (Brunings & Gabriel, 2003).
Figura 2: Frutos jovens, caule e folhas apresentando sintomas do Cancro cítrico. Gottmald et al (2002). In Plant Health Progress (http://www.plantmanagementnetwork.org)
Nos órgãos afetados formam-se tumores ou pústulas com a aparência
encharcada, resultados do acúmulo de água, polissacarídeos e da hipertrofia e
hiperplasia celular, causados pela infestação. Esses tumores rompem a epiderme
liberando o patógeno para infectar outras partes da mesma planta ou plantas
12
vizinhas. Além disso, o aumento da produção de etileno em resposta ao estresse
biótico causa a queda precoce dos frutos que acabam sem nenhum valor comercial
(Gottwad et al, 2002).
Nas folhas os sintomas iniciam pelo surgimento de manchas amareladas,
pequenas que aos poucos crescem transformando-se em tumores (Figura 3). Com o
tempo e envelhecimento da lesão cresce um halo amarelo e bem distinguível em sua
volta.
Figura 3: Folha de citros apresentando sintomas do Cancro cítrico. Gottmald et al (2002). In Plant Health Progress (http://www.plantmanagementnetwork.org)
Nos ramos as lesões são bem semelhantes a das folhas, salientes e corticosas de
corloração parda, porém agrupam-se cobrindo grandes áreas. Nos frutos os
sintomas são superficiais no início, porém causa a ruptura da casca levando à
contaminação por outros microorganismos que aceleram a podridão (EMBRAPA,
2011).
Existem pelo menos três formas distintas da doença, designadas cancroses A ou
Asiática, B e C. Essa variação é reflexo dos diferentes pathovars que as causa. Esses
pathovars são distinguíveis de acordo com a gama de hospedeiros que infecta,
mapeamento genético entre outros (Gottwad et al, 2002; Brunings & Gabriel, 2003)
A cancrose tipo A ou Asiática como é conhecida constitui a mais severa e
difundida dentre as cancroses. É causada pelo grupo Xanthomonas axonopodis pv.
citri. O tipo B é causado pelo grupo X. axonopodis pv. aurantifolii originário da
América do sul e afeta os limões, laranjas mexicanas, toranjas e limões azedos. O
tipo C da doença é causado também pela X. axonopodis pv. aurantifolii. Foi isolada
13
no México e no Brasil no estado de São Paulo. As cepas que provocam as cancroses B
e C não são facilmente distinguíveis (Gottwad et al, 2002) .
A maneira mais eficaz de controle dessa doença é a prevenção e é feita na
implantação do pomar onde deve-se utilizar mudas sadias, e plantio de quebra
ventos. Os cuidados devem ser ainda maiores na colheita, uma vez que nessa época
o ocorre intenso contato com pessoas e instrumentos que podem ser vetores do
patógeno. As medidas preventivas devem começar com uma rigorosa inspeção dos
pomares. Assim, todo o instrumento deve ser desinfetado e as pessoas treinadas
para evitar a proliferação (EMBRAPA, 2011).
2.3 Mecanismos de Interação Planta-Patógeno
As plantas para lidarem com o ataque de patógenos utilizam mecanismos de
defesa que podem ser pré-exixtentes (constitutivos) e aqueles que são induzidos
pela presença do patógeno (Greenberg, 1997).
Algumas plantas desenvolveram genes de defesa que são reconhecidos pelas
proteínas efetoras do patógeno, nesse caso chamadas de fatores de avireulência, e
desencadeiam uma resposta de defesa com morte celular programada e necrose do
tecido, resposta conhecida como HR (Hypersensitive Response). Esse mecanismo
onde a planta apresenta genes de resistência reconhecidos pelo produto de genes
de avirulência, presentes no patógeno, é chamado mecanismo de defesa gene-por-
gene (Keen, 1990).
Os mecanismos de interação planta-patógeno são dinâmicos onde a planta
desenvolve defesas contra o patógeno e este, mecanismos diferentes de ataque ou
desintoxicação que vençam as barreiras impostas pelo hospedeiro. Assim, pode-se
encontrar entre as plantas mecanismos mais robustos onde o patógeno é
completamente eliminado através de vias específicas que impedem o seu
desenvolvimento. Outros, apesar do patógeno desencadear respostas de defesa no
hospedeiro ainda consegue se instalar (Greenberg, 1997).
Uma vez que a bactéria Xac é exclusiva do citros, a faz um excelente modelo
para estudos de interação planta-patógeno. Muitas abordagens tem sido feitas nos
últimos anos com a finalidade de entender essa relação (Brunings & Gabriel, 2003).
14
Os mecanismos mais conhecidos em Xanthomonas tem sido o dos PthA/AvrBs3
que são proteínas lançadas diretamente no citoplasma do hospedeiro para alterar a
expressão de genes favoráveis à infestação pelo patógeno como também garantem
sua replicação dando continuidade ao seu ciclo de vida.
2.4 Xanthomonas Citri, uma ameaça à citricultura
A Xanthomona axonopodis pv. citri (Xac) é uma bactéria fitopatogênica gram-
negativa, possui um único flagelo lateral e apresenta pigmentação amarela. Os
hospedeiros das Xanthomonas citri são plantas da família Rutaceae especialmente
do gênero Citrus spp. A gama de hospedeiros afetada pelo gênero Xanthomonas é
grande. De todas as bactérias fitopatogênicas esse gênero é o que apresenta maior
gama de hospedeiro podendo infectar 68 famílias de plantas e até 240 gêneros.
Porém, as espécies, bem como as cepas dessas espécies possuem uma gama de
hospedeiros bastante restrita. Por isso, recebem o epíteto de pathovar (pv) que
expressa, logo após o nome da espécie, o grupo mais afetado pela cepa em questão.
Essa característica faz desse gênero ideal para estudos de interação planta-
patógeno.
A Xac ocupa o espaço extracelular na planta hospedeira e por isso necessita
injetar no interior dessas células proteínas efetoras responsáveis diretos pelo
desenvolvimento da doença ou desencadeamento da resposta de defesa por parte
do hospedeiro (Brunings & Gabriel, 2003). Para injetar as proteínas efetoras a Xac
utiliza o sistema de secreção tipo III, discutido adiante.
Uma vez no interior da célula, as proteínas efetoras, por possuírem domínios
específicos de sinalização nuclear e funcionarem como fatores de transcrição,
interagem com proteínas da planta sendo conduzidas ao núcleo. A proteína que
realiza esse papel de reconhecimento do sinal de localização nuclear é a α-importina
(Szurek, 2001; Kay & Bonas, 2009).
15
2.5 Sistema de Secreção tipo III (SSTT)
As bactérias patogênicas gran-negativas utilizam de
vários sistemas para infectar o hospedeiro. Algumas lançam
enzimas que causam a necrose celular no hospedeiro. Outras,
contudo, injetam moléculas diretamente na célula hospedeira
que são responsáveis por desencadear a doença. Na maioria
das vezes essas moléculas são proteínas (Jacob, 2009).
Existem cinco tipos diferentes de sistemas de secreção
que podem ser utilizados. Esses encontram-se nomeados
de I a V. O sistema de Secreção Tipo III (Figura 4), utilizado
pela Xanthomonas Citri, foi reportado pela primeira vez por
volta de 1990 em estudos feitos com Yersinia (Cornelis &
Gijsegem, 2000). No genoma de Xanthomonas campestris são
encontrados genes para os tipos III e IV.
Diferente dos demais, esses sistemas lançam as
proteínas efetoras diretamente no citoplasma da planta
hospedeira. Assim, o sistema é especializado em atravessar
não apenas as camadas celulares da bactéria, mas também as
do hospedeiro (Jacob, 2009). O SSTIII é um sistema sec-
independente, ou seja, secreta as proteínas da bactéria sem a
necessidade de associação com proteínas que catalisem o processo (Duong, 1997).
Para que moléculas como proteínas atravessem a célula bacteriana, adquirem sua
conformação ainda no periplasma, antes de atravessar a membrana. Essa passagem
é feita mediante gasto energético.
O SSTT nas bactérias é codificado por um grupo de aproximadamente 25 genes
que codificam proteínas que se unem em um complexo que atravessa os envoltórios
bacterianos e penetra na célula hospedeira. Essas proteínas formam uma estrutura
aculiforme também chamada de pilus devido a sua semelhança com proteínas da
estrutura flagelar (Thanassi, 2000; Gophna, 2003) que permite a passagem de
moléculas proteicas em seu interior, lançando-as diretamente no citoplasma da
célula hospedeira (Anderson, 1999). São necessárias cerca de 20 proteínas para
Figura 4: Modelo do Sitema de Secreção Tipo III. Modificado de Thanassi et al, (2000)
16
formação do complexo que atravessa as barreiras bacterianas e do hospedeiro
(Thanassi, 2000).
Em Xanthomonas o SSTT é fundamental para que ocorra a infecção, uma vez que
através da secreção das proteínas efetoras produtos dos genes conhecidos como Hrp
ou genes efetores de patogenicidade/avirulência (Darsonval, 2008). Dentre as
proteínas desse grupo secretadas pela Xanthomonas citri estão as PthAs cruciais
para desencadear a doença no citros.
2.6 Efetores TAL
Os efetores TAL (Transcricional activator like effectors) são uma classe
estrutural e funcionalmente distinta de proteínas de bactérias fitopatogênicas que
utilizam o sistema de secreção tipo III. Estes efetores são endereçados ao núcleo da
célula hospedeira e ligam-se à sequencias-TALEs de DNA ativando genes no sentido
downstream da fita (Figura 5).
Esse tipo de interação foi selecionada durante a evolução para que uma vez
ativados esses genes da planta com sequencias TALEs facilitem a entrada e
estabelecimento do patógeno. Porém, algumas plantas desenvolveram genes que
são alvo dos efetores bacterianos e desencadeiam respostas de defesa hipersensivas
onde ocorre a morte celular programada e põe fim à infecção. Esses genes são
chamados genes R e os efetores que os ativa chamados fatores de avirulência ou
Avers (Bogdanove, 2010).
As proteínas AvrBs3, um dos mais estudados efetores TAL, ao serem lançadas no
citoplasma da célula hospedeira interagem com importinas α e são direcionadas ao
núcleo através do sinal de localização nuclear (Szurek et al, 2001).
Ao entrarem no núcleo essas proteínas ligam-se à promotores de genes alvo que
irão desencadear a doença, ou reconhecem genes promotores de genes R e
desencadeiam respostas de defesa na planta que culmina coma morte celular
programada (Kay & Bonas, 2009).
17
2.7 Proteínas Efetoras Tipo III: PthAs
As PthAs são proteínas efetoras membros da família PthA/AvrBs3, o genes que
as codifica são 98% homólogas aos fatores de avirulência AvrBs3 e avrBs3-2 de
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, 97% homóloga à avrb6 de X. campestris pv.
malvacearum e 95% homóloga a avrXa10 de X. oryzae (Yang & Gabriel, 1995). Além
de possuírem estruturalmente os mesmos domínios, um C-terminal com ativador
trancricional ácido, sinal de localização nuclear e um domínio interno com 17,5
repetições que codificam 34 aminoácidos. Esse domínio central define os limites de
homologia entre os membros do grupo (Jacob, 2009).
Figura 5: Modelo de ação das proteínas efetoras em a) estrutura da proteína efetora AvrBs3; b) o SSTT; c) dimerização e translocação para o núcleo com auxílio da α-importina; d) ativação do gene alvo. Modificado de Kay & Bonas, 2009. In: Microbiology
18
Apresentam peso molecular calculado por volta de 122kDa e ponto isoelétrico
de 7.72. PthAs são proteínas ricas em leucinas, correspondendo à 12,3% do total de
aminoácidos da proteína e na região dos 34 aminoácidos repetidos em tandem, as
leucinas respondem por 14,7% do total (Yang & Gabriel, 1995).
Figura 6: Estrutura das proteínas da família PthA/AvrBs3. LRR- Região de Leucinas Repetidas; NLS- Sinal de Localização Nuclear e AAD- Domínio Ativador Transcricional Ácido.
A patogenicidade das PthAs está diretamente ligada a sua estrutura (Figura 6),
uma vez que a região repetida interna é responsável pela patogenicidade e
especificidade de hospedeiro (Yang et al, 1994).
Essas proteínas fazem parte da grande e também conhecida família de efetores
TAL conhecidos pela sua ação como ativadores trancricionais bastante semelhantes
a fatores de transcrição (Kay & Bonas, 2009).
Em uma única cepade Xnthomonas citri podem ser encontradas até quatro
variantes de PthAs denominadas de 1 a 4. As PthA-4 são, como já mencionado
cruciais para desencadear a doença. As demais participam do processo e diferem
entre si pelo número de repetições presentes no domínio repetido interno. Isso
reflete a possibilidade de interação com diversos alvos dentro da célula hospedeira
além do DNA. Domingues e colaboradores estudando as interações entre essas
quatro variantes e as proteínas de citros identificaram ocorrer a formação de homo-
e hetrodímeros entre essas variantes bem como interaçãoes variante- específicas. O
número e o grau de interações variou entre as diferentes PthAs o que era esperado
uma vez que essas proteínas diferem extamente no sítio responsável pelo
reconhecimento dos alvos de interação (Figura 7).
19
Figura 7: Modelo esquemático das quatro variantes de PthAs. As diferenças entre elas está
exatamente na região de domínio repetido interno.
A PthA-2 nos ensaios de duplo híbrido mostrou interações com a maioria das
proteínas testadas e em maior grau que a PthA3 que apresenta basicamente a
mesma estrutura. Já as PthA-1 e PthA-4 mostraram-se bastante semelhantes no
número e grau de interação embora a PthA-4 tenha interagido mais fortemente
principalmente com a α-importina.
2.8 Interações Proteína-proteína entre as PthAs e as proteínas de citros
Domingues e colaboradores (2010), em estudos feitos utilizando duplo-híbrido
de levedura com o objetivo de encontrar interações do tipo proteína-proteína entre
as PthAs e proteínas recombinantes de citros, evidenciaram interações com
diferentes proteínas nucleares envolvidas com transcrição, reparo de DNA e
estabilização de RNA, além da anteriormente reportada interação com a α-
importina.
Dentre as proteínas estudas estão a Cyp, Uev, Ubc13 e TDX. Foram observadas
ainda interações entre as variantes de PthAs indicando a formação de homo e
heterodímeros. As proteínas estudadas foram também submetidas aos testes de
duplo híbrido e foram detectadas interações entre elas levando à hipótese de que as
proteínas de citros e as PthAs interagem formando um complexo que atua
modulando a expressão gênica no hospedeiro. Além disso, as proteínas interactoras
com PthAs também estão presentes no núcleo da célula vegetal (Figura 7).
20
Em estudos estruturais as proteínas PthAs de Xac apresentam vários domínios
que são indícios das múltiplas interações que podem haver com proteínas
hospedeiras . Além disso, quatro variantes de PthAs foram identificadas numa única
cepa da bactéria corroborando com a hipótese de que não só essas proteínas
interagem com diversos alvos na célula hospedeira, além do DNA, como também o
grau e número de interações varia entre as diferentes isoformas da proteína
(Domingues, 2010).
A ocorrência de várias cópias de genes do tipo Avr no genoma de
Xanthomonas já foi documentado por Yang & Gabriel (1995). Essas isoformas
diferem justamente no domínio repetido interno que é responsável pela
especificidade e reconhecimentos de alvos na célula hospedeira. Ainda em suas
observações Yang & Gabriel (1995) observaram a taxa de mutações que ocorrem
nesses domínios indicando ser esse o mecanismo que ocorre no patógeno
resultando na adaptação ao sistema de defesa gene-por-gene.
Assim, abre-se uma gama de combinações e interações possíveis entre as
proteínas de citros e as PthAs. Porém, os dados obtidos até o momento foram feitos
com proteínas recombinantes abrindo a possibilidade de aprimoramento e avanços
ao utilizar proteínas nativas do citros, reproduzindo, desta vez, condições mais
semelhante ás in vivo.
Figura 8: Localização das PthAs e proteínas de citros. A) Localização nuclear da PthA4 com GFP; B) Localização nuclear da Cyp (ciclofilina) de citros com DsRed e C) Sobreposição evidenciando a co-localização nuclear das proteínas Cyp e PthA4 com GFP + DsRed. Em D) Localização nuclear da PthA2 com GFP; E) Localização nuclear da Uev e F) Co-ocalização nuclear das proteínas PthA2 e Uev com GFP + DsRed . Setas apontam as proteínas identificadas.
21
2.9 Proteínas com potencial interação com PthAs
As proteínas PthAs por serem ativadores transcricionais, no contexto da
complexidade da regulação trascricional em eucariotos, é esperado que haja
interações com diversos outros tipos de proteínas atuantes na transcrição e
promotores cis de DNA (Souza, 2010).
Cernadas e colaboradores (2008) ao comparar as alterações na expressão
gênica provocadas pelos dois grupos de Xanthomonas causadoras do cancro cítrico,
Xac e Xaa encontrou variações em genes relacionados à resposta à auxina e possíveis
fatores trancricionais. Assim, justificável encontrar através de ensaios de duplo-
híbrido interações com proteínas envolvidas no processo de transcrição e
principalmente relacionadas à respostas hormonais como as ARFs (Fator de resposta
à auxina), a HMG (proteína do grupo de alta mobilidade) que facilita o acesso de
outros fatores transcricionais ao DNA, as ubiquitinas Ubc13 e Uev que juntas
perticipam do mecanismo de reparo do DNA , a Maf envolvida no controle da
transcrição e proliferação celular em aucariotos e a Cyp requerida para ativação do
AvrRpt2 na célula do hospedeiro.
2.10 Complexos transcricionais
As plantas, como os demais eucariotos apresentam um complexo e fino
controle de expressão gênica. Onde nos diferentes estágios de desenvolvimento
bem como em situações específicas como estresse biótico e abiótico grupos também
específico de genes são ativados e/ou inativados resultando num fenótipo
correspondente (Singh, 1998).
Os eucariotos apresentam diferentes níveis de regulação gênica que vai desde
o empacotamento do DNA até modificações pós-traducionais. Os principais tipos de
regulação gênica em eucariotos são: reorganização da cromatina, controle da
transcrição, estabilidade do RNA mensageiro, modificações pós-transcricionais,
controle da tradução e modificações pós-traducionais. Dentre estes o mais
importante é sem dúvida o controle da transcrição uma vez que é o processo mais
dispendioso do ponto de vista energético (Watson, 2006).
A transcrição para ocorrer necessita da formação de um complexo iniciador de
transcrição associado à RNA polimerase II (Pol II). Assim, a Pol II precisa associar-se à
22
seis outras proteínas, fatores de transcrição, para que seja confeccionado o RNA
mensageiro. Os fatores de transcrição desempenham um importante papel na
regulação gênica, pois são responsáveis por reconhecer e iniciar o processo de
formação do complexo transcricional além de reconhecer os genes alvo
(Singh,1998).
Em situação de estresse biótico o patógeno utiliza proteínas que interferem na
expressão de genes no hospedeiro por serem estruturalmente semelhantes à fatores
de transcrição (Yang & Gabriel, 1995). Porém essas proteínas provavelmente não
atuam sozinhas na ativação gênica devendo associar-se às proteínas do hospedeiro
(Domingues et al, 2010).
2.11 Espectrometria de Massas A espectrometria de massas tornou-se uma ferramenta essencial para
análise de biomoléculas devido a sua sensibilidade e conteúdos de informações
totais fornecidos. A técnica se baseia na identificação de moléculas de acordo com
sua razão massa/carga determinadas com base no tempo de vôo e carga da
molécula ionizada (Newton et al, 2004).
O espectrômetro de massas é composto por: um sistema de ionização das
moléculas, um analisador de massas e um detector. Os métodos de ionização de
massas mais utilizados são o MALDI (dessorção ionizante assistida por matriz) e o ESI
(ionização por eletrodispersão). Os principais analisadores de massas associados a
estas técnicas são o tempo de vôo (TOF – time off light), o quadripolo e o
aprisionamento de íons (IT – ion trap) (Cunha et al., 2006).
Os espectrômetros podem ser classificados de acordo com seus constituintes
de análise em: MALDI-TOF, que associa o método de ionização baseado na
dessorção ionizante assistida por uma matriz, com o analisador tempo de vôo e ESI,
que associa a ionização por eletrodispersão com espectrometria de massas em
tandem (MS/MS). Este último é geralmente associado a cromatografia líquida de alta
performance (HPLC - high performance liquid chromatography) (Newton et al.,
2004). Pode ser também associado à cromatografia líquida de ultra performace
(UPLC - ultra performance liquid chromatography).
23
2.12 GST Pull Down A Glutationa-S-transferase (GST), são proteínas de fusão que tem ampla
aplicação desde a sua introdução para a síntese de proteínas recombinantes em
bacteria. Hoje tem aplicação em técninas como o GST pull-down que é são
utilizado para identificar as interações entre uma proteína sonda e alvos
desconhecidos. Assim pode-se confirmar interações entre uma proteína e suas
possíveis parceiras de interação. A proteína da sonda é uma fusão GST, cuja
seqüência de codificação é clonada em veores de expressão induzíveis por isopropil-
β-Dthiogalactoside(IPTG).
Esta proteína de fusão é expressa em bactérias e purificada por cromatografia
de afinidade em granulos agarose-glutationa. As proteínas-alvo são geralmente
lisados de células marcadas com [35S] metionina, dependendo do método utilizado
para análise da interação entre o alvo e a sonda. O lisado celular e a proteína de
fusão GST são incubados juntamente com grânulos do agarose-glutationa. Os
complexos formados são recuperados dos grânulos por eluição
resolvidos por SDS-PAGE e analisadas por western blotting autoradiografia ou
coloração (Nature- Classic Protocol, 2004).
3. Objetivos
3.1 Objetivo Geral Identificar complexos proteicos de citros associados ao fator de
patogenicidade PthA de Xanthomonas citri, a fim de confirmar interações já
identificadas por duplo híbrido.
3.2 Objetivos específicos
Separar proteínas de folha de citros que interagem com as vaiantes PthA2 e
PthA4 através de GST pull down.
Identificar através de espectrometria de massas e imunodetecção as
proteínas interactoras provenientes do pull down.
3.3 Perspectiva Confirmar as interações previamente identificadas por duplo-híbrido de
levedura (DH) e descobrir novas proteínas parceiras de PthAs.
24
4. Metodologia
4.1 Material Vegetal
Foram utilizadas folhas jovens e sadias de Citrus sinensis cultivadas por seis
meses em casa de vegetação.
Extração de proteínas de Citro
4.1.1 Extrato Sem Pós-tratamento
Para obtenção do extrato bruto de folhas jovens de laranja doce (Citrus sinensis)
foram coletadas e imediatamente congeladas à –96ºC. Posteriormente as folhas
foram maceradas em nitrogênio líquido, até a obtenção de um pó fino. Á esse pó foi
adicionado o tampão de lise contendo 10% de PBS, 10Mm de cloreto de magnésio,
0,1% de Triton-x, 10mM de EDTA e 0,1 mM de PMSF. A fim de evitar a degradação
das proteínas foi adicionado ao tampão de lise 10µg/mL de inibidor de protease
(Sigma). O extrato foi homogeneizado, em cadinho, até formar um líquido ralo. Este
foi centrifugado à 5000g e 4 °C por 5 min. O sobrenadante foi coletado e novamente
centrifugado até não formar pellet visível, sempre em gelo. O extrato final foi
submetido à SDS-PAGE para verificação qualitativa.
4.1.2 Extrato Tratado
Ao extrato bruto foi adicionado 0,4 volumes de tert-butanol e 1:10 de acetato de
sódio 3M pH 4,5. As amostras forma então incubadas em gelo por 30min e agitadas
em vortex a cada 10 minutos. Após esse período o extrato foi centrifugado a
velocidade de 15000g por 10 minutos à 4°C. O sobrenadante foi avaliado através de
SDS-PAGE e estocado à 4°C até a utilização.
Figura 9: Plantas de citrus cultivadas em casa de vegetação por seis meses. A) Folhas jovens e sadias de citros utilizadas no experimento; B) Plantas de citros em casa de vegetação.
25
4.2 Expressão
As contruções em cepas BL21(DE3) de E. coli contendo os plasmídeos pGEX-T1-
PthA2-GST, pGEX-T1-PthA4-GST e pGEX-T1-GST (GE-HealthCare) foram pré-
inoculadas em 5mL de meio LB (1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 1% de
cloreto de sódio pH7,0) e incubado por 16h a 37°C e 200rpm. No dia seguinte 250µL
do pré-inóculo foi adicionado à 250mL de meio LB, com o antibiótico de resistência
com 10% de ampicilina. Este foi incubado em shaker a 37° C até a O.D. (Optical
Density) de 1,1. Em seguida as bactérias foram induzidas utilizando-se 0,1% de IPTG
e incubadas em shaker a 30°C por 3h. Os mesmos passos foram feitos para a PthA2-
GST e para controle com GST.
4.3 Lise celular bacteriana
Os pellets formados por centrifugação da indução à 15000rpm, por 45min á 4°C
foram ressuspendidos em 10mL de tampão A (20mM de Tris-HCl pH 8,0, 200mM de
NaCl, 1mMde PMSF e 5% de glicerol) à essa suspensão foram adicionados 40mg/mL
de lisozima e sonicado com pulsos de 10s com intervalos de 20s entre eles com 40%
da frequência máxima do equipamento até clarificar o extrato. Esse extrato foi então
centrifugado a 10000rpm por 45 min à 4°C. O sobrenadante contendo a proteína
solúvel foi submetido à eletroforese unidimensional ou SDS-PAGE para verificação
da qualidade da expressão. Em seguida esse extrato foi filtrado em filtro 45 m e
incubado em resina de glutationa.
4.4 Imobilização de PthAs-GST em resina de glutationa
Foram utilizados 500µL de resina GST-Fastflow (GE-Healthcare) em cada um dos
três pull downs (PthA2, PthA4 e GST). Esta foi lavada 3 vezes com 5 volumes de
coluna com tampão A. A coluna foi carregada com 5 volumes do extrato filtrado de
E. coli, contendo as PthAs com cauda de GST e o controle com GST, por 1 hora e 30
minutos (4°C). A resina foi lavada 4 vezes com 10 volumes de coluna com o mesmo
tampão e dela retirada uma alíquota para verificação através de SDS-PAGE.
26
4.5 Pull down de proteínas de folha de citrus com PthA2 e PthA4 em
coluna de glutationa
Uma vez carregada com as pthAs-GST e GST a coluna foi lavada três vezes com 5
volumes do tampão A para retirada das interações inespecíficas. Incubada com 7
volumes do extrato bruto de proteínas de folhas de citros com fluxo lento e
constante a 4°C durante 3h. A resina foi novamente lavada com tampão A por 3
vezes com 10 volumes de coluna. As proteínas foram eluídas com 15mg/mL de
glutationa reduzida (Thermo Scitific) em tampão A. Foram coletadas três eluições de
cada pthA e da GST. Essas eluições bem como a resina final de cada pull down foram
analisadas em SDS-PAGE e Western Blot.
Um segundo pull down foi feito, desta vez com incubação por 16h nas etapas de
imobilização das proteínas recombinantes à coluna de glutationa e incubação com o
extrato bruto de citros. As incubações foram feitas em câmara fria à 4°C sob
movimentação orbital. Neste ensaio foram utilizados 200 L de resina carregada com
6mL extrato bacteriano filtrado e 5mL de extrato bruto de citros. A intenção foi
diminuir a degradação sofrida pelas PthAs.
4.6 Western Blot
Para a imunodetecção as proteínas foram separadas em gel SDS-PAGE 10% e
13% e transferidas por cerca de 1h10min com amperagem constante de 350mA para
membrana de PVDF (Milipore) em tampão de transferência (48 mM de Tris-base; 39
mM de glicina; 0,037% de SDS e 20% de metanol). A membrana foi incubada em
solução bloqueadora TBS (20 mM de Trisbase; 150 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, pH
7,5) + 5% de leite por 1h sob agitação. Em seguida incubada por 1 hora e incubadas
com diluições dos anticorpos primários (fabricados pela Célula B, empresa vinculada
á UFRGS, coordenada pelo Dr. Itabajara, apartir de proteínas purificadas com
imunização em coelhos e camundongos) utilizados na proporção de 1:3000: Anti-
HGM, Anti-Maf, Anti-Uev, Anti-Ubc13, Anti-Cyp e Anti-ARF, também por uma hora.
Após a incubação com o anticorpo primário a membrana foi lava em tampão TBS-T
pH 7,5 por três vezes de 10min cada, sob constante agitação. Incubada com o
anticorpo secundário Anti-Rabbit ou Anti-Mouse (GE-HealthCare), também na
proporção de 1:3000, por 1h agitando sempre. Após esse período procedeu-se
27
novamente lavagens TBS-T. A detecção foi realizada com o kit ECL Fast Blotting
Analysis System (GE-HealthCare) de acordo com as recomendações do fabricante.
4.7 Espectrometria de massas
Para espectrometria foram testadas duas abordagens uma com digestão em
gel e outra em solução. Na digestão em gel foram utilizadas as eluições do primeiro
pull dow. A digestão em solução foi feita com as mostras do segundo pull down com
incubação por 16h.
4.7.1 Preparo dos géis e Excisão das bandas
Para digestão em gel foram feitos dois géis SDS-PAGE 10%, um 5cm x 8cm corado
com prata onde foram aplicados 8,5µL de cada amostra e outro 12cm x10cm corado
com azul de coomassie onde foram aplicados 15µL de cada amostra. Deles foram
excisadas 38 bandas diferenciais em relação ao controle sendo 28 do gel menor
(corado com prata) e 10 do maior (corado com coomassie). Estas foram armazenas
em 200µL de água milli-Q à -20°C.
4.7.2 Coloração com prata
O gel foi aquecido em solução fixadora (50% Metanol, 12% Acido acético e 0,05%
de formaldeído) no microondas em potência máxima por 30 segundos e mantido
nessa solução sob agitação por 5 minutos. Aquecido em etanol 30% no microondas
em potência máxima por 30 segundos seguida de mais uma incubação de 5 minutos
sob agitação. Aquecido em solução de tiossulfato de sódio 0,02% em microondas em
potencia máxima por 30 segundos, seguida de incubação por cinco minutos sob
agitação. Lavado duas vezes em água destilada à temperatura ambiente sob
agitação. Aquecido em solução de nitrato de prata (0,2% de nitrato de prata, 0,07%
de formaldeído) em microondas por 30 segundos seguida de incubação por 5
minutos. Lavado com água destilada e revelado com solução reveladora (6% de
carbonato de sódio, 0,05% de formaldaído e 0,0004% de tiossulfato de sódio) em
temperatura ambiente até que aparecessem as bandas. A reação foi parada com
solução stop (50 % de metanol e 12% ácido acético).
28
4.7.3 Digestão tripsínica em gel
As proteínas (bandas) diferenciais detectadas foram excisadas dos géis com
bisturi em frações de aproximadamente 3 mm3. Os segmentos de gel foram lavados
duas vezes em uma solução Destain (metanol 50%, ácido acético 2,5%) por 2h na
primeira lavagem e 1h a segunda. Os pedaços de gel foram desidratados em
acetonitrila (100%) por 5 minutos e secos por evaporação. Reduzidos em solução de
DTT (10mM de DTT em bicarbonato de amônio 100mM) por 30 minutos à
temperatura ambiente. Essa solução foi removida e adicionada solução de IAA (50
mM de Iodacetamida em bicarbonato de amônio 100mM) e os fragmentos
incubados por 30 minutos à temperatura ambiente protegido da luz.
Posteriormente, os fragmentos de gel foram desidratados em 200µL de acetonitrila
100% por 5min e secos por evaporação. Estes fragmentos foram reidratados em
acetonitrila duas vezes e secos por evaporação. Em seguida os fragmentos foram
reidratados em solução de tripsina contendo aproximadamente 0,24µg de tripsina
(Promega) em bicarbonato de amônio 25mM. Após 30min, a 4°C, foi adicionado
50mM de bicarbonato de amônio até completa cobertura dos spots, sendo mantido
a 37°C por 16 horas. Foram adicionados 10µL de solução de extração 1 (ácido
fórmico 5%) com incubação por 10min à temperatura ambiente. O sobrenadante da
digestão enzimática foi transferido para um tubo novo. Ao tubo contendo os
fragmentos de gel foram adicionados 12µL da solução de extração 2 (50% v/v
acetonitrila e 5% v/v ácido fórmico) com incubação por 10min à temperatura
ambiente. O sobrenadante foi transferido para o tubo contendo a primeira extração
e seco em Speed Vac.
A preparação dos peptídeos (ou conjuntos de peptídeos) diferenciais
selecionados foi realizada conforme metodologia descrita pelo grupo colaborador de
espectrometria de massas, coordenado pela Dr. Adriana Paes Leme, localizado do
LNBio (Laboratório Nacional de Biociências) em Campinas-SP, onde está foi efetuada
a identificação dos peptídeos via espectrometria de massas, após a digestão
enzimática.
4.7.4 Digestão em solução
As eluições 1, 2 e 3 resultantes do pull down, contendo volume de 100 µL, foram
submetidas à digestão com tripsina. As proteínas foram reduzidas em 5µL de
29
solução de DTT (10mM de ditiotreitol (DTT) em bicarbonato de amônio 100mM) por
30 minutos a 60°C. Alquiladas em solução de Iodacetamida (IAA) (50mM de IAA em
bicarbonato de amônio 100mM) por 30 minutos à temperatura ambiente protegido
da luz. A digestão foi feita com solução de tripsina (Promega) (20ng/µL em
bicarbonato de amônio 50mM ) à concentração final para digestão de 50µg/µL. A
digestão foi incubada por 16h à 37°C. Após a incubação reação foi parada com ácido
fosfórico na concentração final de 1%.
4.7.8 Condições de corrida e análise de dados em Espestrometro do tipo ESI-Q-TOF
4.7.8.1 Em gel
A corrida foi feita em espectrômetro do tipo ESI Q-Tof. Foram feitas corridas de
20min e 4,5µL de amostra.
4.7.8.2 Em solução
A identificação foi feita também em espectrômetro do tipo ESI Q-Tof foram feitas
corridas de 20min e 60min para minimizar as chances de contaminação e erro.
Foram utilizados 4,5µL de amostra em cada corrida.
4.8 Análise dos dados
Os dados brutos gerados pelo aparelho passaram por um refinamento no
programa Distiller (Versão 2.3.2.0 da Matrix Science), o resultado foi enviado no
formato .*raw para o programa de que realiza as buscas (Figura 9). A busca dos
dados foi feita com auxílio do programa MASCOT Deamon (versão 2.3.0 da Matrix
Science) cuja interface encontra-se ilustrada na Figura 10. O banco utilizado foi o
banco público do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) considerando todos os
organismos “All entries”.
Os parâmetros do programa utilizados foram: como tolerância de erro do
peptídeo e do fracionamento 0.1 Da. Os resultados relevantes considerados foram
mantidos padrão (AUTO).
30
Para análise das amostras digeridas em solução foi feita uma segunda busca
modificando os parâmetros para tolerância de 0.2 Da e resultados considerados para
os dez primeiros.
Figura 11: Interface do programa Mascot Deamon (Versão 2.3.0 da Matrix Science) utilizado para refinamento busca dos dados.
Figura 10: Interface do programa Distiler (Versão 2.3.2.0 da Matrix Science) utilizado para refinamento
dos dados. A seta aponta os espectros gerados para uma das amostras.
31
Foi utilizado o banco de sequencias expressas de citros (CitrusEST) e organismo
citrus. Os ESTs gerados foram alinhados com o banco de dados de proteínas do
NCBIatravés de Blastx (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Dos dados gerados
foram eliminados os resultados ao controle.
5. Resultados e Discussão
5.1 Extração de proteínas
A extração de proteínas íntegras é fundamental para o sucesso do experimento,
contudo os tecidos vegetais apresentam alto índice de polissacarídeos e polifenóis
que dificultam a obtenção de proteínas puras (Pirovani et al, 2008). A extração de
proteías de folha de citros sem pós-tratamento foi eficiente do ponto de vista
qualitativo como pode ser observado na Figura 12.
Figura 12: Gel SDS-PAGE 10% com proteína de citros extraídas sem pós-tratamento com tert-butanol. 1) 7,5µL de extrato; 2) 6µL de extrato e 3- 5µL de amostra.
32
Diferente do observado por Pirovani et al (2008) com folhas de cacau, o extrato
tratado apresentou menor quantidade de proteínas quando comparado ao extrato
sem tratamento (Figura 13).
Esse resultado sugere que a ação do tampão de lise utilizado, associado à
maceração e centrifugação são eficazes para extração de proteínas totais de folha
citros. Ambos os extratos foram utilizados para imunodetecção utilizando Anti-HMG
(Figura 14).
Pode-se perceber a presença da HMG em ambos os extratos, porém a Maf foi
detectada apenas no extrato tratado (Figura, 15) . Esse resultado sugere que a
purificação do extrato apesar de diminuir a quantidade proteínas aumenta a
possibilidade de interação com o anticorpo.
Figura13: Gel SDS-PAGE 10% com proteína de citros extraídas sem pós-tratamento. 1) 5µL de extrato sem pós-tratamento; 2) 8µL de extrato tratado; 3) 8µL de extrato sem pós-tratamento; 4) 5µL de extrato tratado.
1 2
Figure 14: Imunodetecção de proteínas de citros com anticorpo Anti-HMG. 1) Extrato tratado; 2) Extrato sem pós-tratamento
kDa27-
33
Contudo, para realização do pull donw é necessária uma grande quantidade de
proteínas sendo, portanto, escolhido o extrato sem pós-tratamento para realização
do mesmo.
Expressão das PthAs-GST e Pull down As proteínas recombinantes foram expressas em boa quantidade e qualidade
como pode ser observado na Figura 16.
É possível observar que apesar de o extrato de E. coli não ter passado por uma
pré-purificação a seleção feita pela cauda de GST na coluna foi suficiente para isolar
as proteínas recombinantes das proteínas bacterianas. Porém é possível perceber
nas PthAs bandas provavelmente resultantes de degradação, comum devido a seu
tamanho (Figura 16).
Figura 16: Gel SDS-PAGE 10% de proteínas. MM- Marcador Molecular; 1- Extrato de folha de citros; 2- Extrato de E. coli expressando GST(setas pretas) ; 3-Extrato de E. coli expressando PthA2-GST (setas verdes); 4-Extrato de E. coli expressando PthA2-GST (setas vermelhas); 5-Proteína GST na resina; 6-PthA2-GST na resina e 7-PthA4 na resina.
1 2
Figura 15: Imunodetecção com proteínas de extrato de citros com anticorpo Anti-MAF. Em 1) extrato tratado evidenciando uma interação fraca; 2) extrato não tratado.
116.0
45.0
35.0
25.0
66.2
18.0
kDa
kDa 30-
34
A Figura 17 mostra o resultado do pull down GST. Pode-se observar um
perfildiferencial entre as PthAs e o controle com GST. Pode-se perceber também um
perfil semelhante entre as PthAs 4 e 2.
5.3 Imunodetecção
As imunodetecções revelaram haver interações entre as PthAs e proteínas de
citros. Porém algumas proteínas foram detectadas apenas no extrato como a Cyp.
Outras, como a ARF e HMG apresentaram padrão diferente do esperado, contudo
não aparecem no controle. Apenas a HMG, Maf e Cyp foram detectadas no extrato
de citros. Esse resultado pode ser explicado pelo fato de a proporção de proteína de
citros no pull down ter sido bem maior que a aplicada no gel SDS-PAGE resultando
na concentração das proteínas e consequente detecção.
5.3.1 Anti-HMG
A proteína HMG foi detectada no extrato de citros tratado e não-tratado.
Contudo, no pull dow com as PthAs foram detectadas bandas menores que as
esperadas para proteína inteira. Esse resultado pode indicar a degradação das
proteínas HMG sendo detectados apenas alguns domínios mais estáveis (Figura 17).
Figura 17: Gel SDS-PAGE 10% com proteínas após GST pull down com proteínas de citros. MM- Marcador Molecular; 1- GST; 2- PthA2 e 3-PthA4.
35
Essa hipótese é reforçada pelo fato de ter sido utilizado anticorpo específico
para essa proteína bem como as bandas serem exclusivas das PthAs, não
aparecendo no controle GST.
Uma outra explicação é estas bandas serem provenientes do HMG-box comum
a muitas proteínas de plantas e apresenta tamanho semelhante ao encontrado nas
imunodetecções. Em Ababdopsis foram encontradas proteínas que apresentam de
14,4kDa (HMGB5) a 27kDa com essencialmente dois domínios HMG-box
relativamente conservados (Stros & Grasser 2007). Além disso, ter sido detectada no
extrato demonstra sua alta concentração na amostra.
5.3.2 Anti-Maf
A Maf foi detectada como monômero no tamanho esperado, porém em pequena
quantidade quando comparado ao sinal emitido pelas demais proteínas detectadas.
Além disso, foi necessário um tempo maior de exposição para a detecção (Figura 19)
5.3.3 Anti-Ubc13
A Ubc13 foi detectada em ambas as PthAs porém mostrou-se interagir mais
fortemente coma PthA4. Foram detectadas duas bandas em cada PthA que pode ser
fruto de degradação ou sugere a presença de outra proteían com os mesmos
domínios conservados presentes na Ubc13 (Figura 20).
Figura 18: Imunodetecção com Anti-HMG de proteínas selecionadas através de pull down com PthA4 e PthA2.
Figura 19: Imunodetecção com Anti-Maf de proteínas selecionadas por pull down com Ptha2 e PthA4.
30-
36
Figura 20: Imunodetecção com Anti-Ubc13 de proteínas selecionas por GST pull dow com PthA2 e PthA4.
As interações com ambas as PthAs foi semelhante diferente do que ocorre com
a utilização de Anti-HMG e Maf que apresentaram maior interação coma a PthA4.
5.3.4 Anti-ARF
As ARF são proteínas envolvidas nas vias de resposta à auxina e pertencem a
família Aux/IAA que abrange um grande número de proteínas. Essa proteína
apresenta domínios comuns aos membros da família como, por exemplo, o domínio
de interação proteína-proteína carboxi-terminal (Guifoile, 1998).
Foram detectadas três bandas em cada PthA apresentando auto grau de
interação quando comparado às demais proteínas estudadas. Porém também não
encontra-se no tamanho esperado (Figura 21).
Esse sultado pode ser devido ainda à degradação ou à presença de mais de uma
proteína com os mesmos sítios da ARF. Em algumas plantas é comum serem
codificadas várias ARFs. Arabidopsis por exemplo codifica 23 ARFs e arroz 25 (Shen
et al, 2010). O Anti-ARF, como acontece com o Anti-HMG e Anti-Maf, apresentou
uma maior interação com as amostras do pull down com a PthA4. Esses resultados
são ainda preliminares uma vez que não foi feita a quantificação das proteínas
Figura 21: Imunodetecção com Anti-ARF de proteínas selecionas através de pul down com ptha2 e ptha4. Foram detectadas três bandas em ambas as PthAs.
32- 28-
32- 28-
24-
37
aplicadas. Contudo, por não haver diferença significativa nos perfis de géis SDS-PAGE
e por terem sido aplicadas as mesma quantidades de amostra em cada lane do gel,
esse tipo de correlação pode ser considerada embora não sejam dados conclusivos.
5.3.5 Anti-Cyp
A Cyp não foi detectada nas PthAs estando presente apenas no extrato sem
pós-tratamento (Figura 22). Indicando não haver interações detectáveis com as
variantes PthA2 e PthA4. Porém, o fato de terem sido detectadas interações através
de duplo-híbrido constitui um forte indício de interação com as PthAs. Assim,
modificações que venham à otimizar a extração de proteínas íntegras possa
confirmar essa interação.
Figura 22: Imunodetecção de proteína de extrato de citros utilizando o anticorpo Anti-Cyp. Em 1) extrato de citros; 2) proteínas do Pull Down com GST; 3) proteínas do pull down com PthA2 e 4) proteínas do pull down com PthA4
5.3. 6 Anti-Uev
A Uev não foi detectada em nenhuma das amostras testadas utilizando o
anticorpo Anti-Uev1. Indicando que esta proteína pode não estar presente no
extrato de citros ou estar em concentração muito baixa. O Anti-corpo utilizado pode
não ser o mais indicado para esta proteína.
5.4 Espectrometria de Massas
5.4.1 Excisão de bandas e identificação dos peptídeos
As proteínas do primeiro pull down foram separadas em SDS-PAGE e as bandas
diferenciais excisadas do gel. Pode-se observar um grande número de bandas nas
PthAs que não estão presentes no controle com GST (Figura 23). Essas bandas foram
digeridas para espestrometria de massas, porém foi detectada alta contaminação
pelos ligantes PthA e GST que acabou por suprimir o sinal das proteínas do citros que
devem estar em pouca quantidade. Além disso, desde o processo de expressão até o
kDa
28-
38
GST pul down ocorre um elevado índice de degradação das proteínas PthAs. Isso
pode interferir na aderência à coluna GST e dificulta a análise por espectrometria.
Por ser mais específica a imunodetecção se aplica melhor à esse tipo de
análise. Além disso, ajustes no protocolo de extração das PthAs e das próprias
proteínas de Citros podem resolver o problema. Um caminho plausível seria
aumentar ainda mais a proporção de proteínas de citros em relação a recombinante,
associado à redução da degradação das PthAs pelo uso de inibidores de proteases
também na extração dessas proteínas.
Figure 23: Gel SDS-PAGE 10% com proteínas selecionas por GST pull down. Em 1, 2 e 3 estão as eluições, em ordem crescente, de cada pull down. É possível notar (evidenciado com retângulos azuis) as bandas diferenciais presentes em cada uma das diluições com PthA.
5.4.2 Identificação das proteínas em solução
As proteínas provenientes do pull down com incubação por 16h apresentaram o
mesmo perfil das proteínas digeridas em gel com alta contaminação por PthA e GST.
Através da segunda análise com a busca por ESTs de Citros foram encontradas
algumas sequencias diferenciais entre as ampostras que podem ser alvos de
investigações futuras mediante otimização dos protocolos utilizados (Tabela 1).
Nesta tabela estão categorizadas apenas as proteínas exclusivas de cada PthA.
39
Tabela 1: Proteínas do pull dow em solução identificadas através de busca no banco de dados de sequencias expressas de citros (CitrosESTs).
Variante de PthA Proteína Identificada Frequencia
PthA2
Fungal Elicitor Protein 0,05
LRR protein 0,05
DHAR Glutathione Transferase 0,05
Chitinase 0,05
Zinc-Finger 0,05
Glucose Dehydrogenase 0,05
ULT1 DNA binding 0,05
Cystein Proteinase 0,05
Sugar Transporter 0,05
Protein kinase APK1B 0,05
Prolin Iminopeptidase 0,05
DNA photolyase 0,05
Transferase I 0,10
ATP-Binding Protein 0,05
Peroxisomal receptor 0,10
Peroxisomal targeting signal 0,10
Citrate Transporter 0,05
DNA Polimerase III 0,05
ATBzip 0,05
ATIREG 0,05
COp1-interacting protein 0,05
PthA4
Hydroxycinnamoyltransferase 0,13
NBS-LRR Resistance Protein 0,13
DNA Photolyase 0,13
Transferase II 0,13
Ubiqutiin Fusion Degradating Protein 0,13
beta-fructofuranosidase 0,13
E3 Ubiquitin Ligase PUB14 0,13
Sodium exchanger 0,25
Abaixo estão categorizadas por função as proteínas identificadas em cada uma
das PthAs (Gráficos 1 e 2). Pode-se perceber a presença de fatores de transcrição,
ubiquitinas e proteínas de defesa principalmente na PthA2, enquanto que na PthA4,
já referida como responsável por desencadear a doença no citros, a proporção das
proteínas de defesa por exemplo é menor.
40
Gráfico 1: Proteínas identificadas através de espectrometria de massas nas amostras do pull down com PthA-GST com proteínas de citros. As proteínas foram categorizadas por função.
Gráfico 2: Proteínas identificadas através de espectrometria de massas nas amostras do pull down com PthA-GST com proteínas de citros. As proteínas foram categorizadas por função.
Conclusão
As proteínas de citros HMG, Maf e UBC13 como já identificado por duplo
híbrido parecem interagir com as PthAs 2 e 4. Essa interação é mais intensa de
acordo com a variante de PthA em questão. Nos ensaios de imunodetecão em que
houve interação as proteínas parecem interagir mais fortemente com a variante
PthA4. Algumas proteínas não foram detectadas, podendo ser resultado da
14%
21%
9%12%
0%
44%
PthA2Transportadores
Defesa
Fatores de Transcrição
Hipoteticas
Ubiquitina
Outras
14% 3%
8%
6%
6%
63%
PthA4
Transportadores
Defesa
Fatores de Transcrição
Hipoteticas
Ubiquitina
Outras
41
degradação ou protocolo de extração utilizado. Tanto a espectrometria de massas
quanto o GST Pull down se mostraram técnicas promissoras à detecção de
interações proteína-proteína entre as PthAs e proteínas nativas de citros. Contudo,
otimizações em algumas etapas do experiemento são necessários para obtenção de
resultados mais conclusivos.
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