estudo da aplicação de hemicelulases no reaproveitamento...

52
Estudo da aplicação de hemicelulases no reaproveitamento do licor de pentoses na produção de etanol de segunda geração Bolsista Thiago Neitzel Estudante de Engenharia Química da Universidade Regional de Blumenau Orientador Dra. Jaciane Lutz Ienczak / CTBE Coorientador Dr. Roberto Ruller / CTBE

Upload: phunghanh

Post on 19-Nov-2018

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Estudo da aplicação de hemicelulases no reaproveitamento do licor de pentoses na produção de etanol de segunda geração

Bolsista Thiago Neitzel

Estudante de Engenharia Química da Universidade Regional de Blumenau

Orientador Dra. Jaciane Lutz Ienczak / CTBE

Coorientador

Dr. Roberto Ruller / CTBE

Projeto

Estudo da aplicação de hemicelulases no

reaproveitamento do licor de pentoses na

produção de etanol de segunda geração

Bolsista

Thiago Neitzel

Estudante de Engenharia Química da Universidade

Regional de Blumenau

Relatório técnico-científico apresentado como

requisito parcial exigido no

22º Programa Bolsas de Verão do CNPEM -

Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais.

Orientador

Dra. Jaciane Lutz Ienczak / CTBE

Coorientador

Dr. Roberto Ruller / CTBE

Campinas, SP, 2013

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

3

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Moacir Neitzel e Carmen M. Z. Neitzel por sempre me

apoiarem em minhas decisões, por tudo que puderam me proporcionar e pelo

amor incondicional. Assim como ao meu irmão Jonatan Neitzel e a minha

cunhada Ericka C. y Pérez.

A minha namorada Anna C. Vier por todo o suporte que tive nestes dois

meses distante. Espero que esta experiência somente fortaleça a nossa relação.

A professora Dra. Lorena B. B. Tavares da Universidade Regional de

Blumenau (FURB) por ter me acolhido como um filho desde o momento em que

ingressei na universidade, proporcionando-me diversas oportunidades

profissionais bem como ensinamentos e aprendizados acadêmicos.

Aos meus orientadores Dr. Roberto Ruller e especialmente a Dra. Jaciane

L. Ienczak pela confiança depositada em mim e por tudo que puderam me

ensinar nessa correria regada a adrenalina chamada Programa Bolsas de Verão.

Aos companheiros e amigos Evandro Lima, Carla B. Machado, Fernanda

Figueiredo, Zaira Hoffmam, Rosana Goldbeck, Suzane R. Dionisio, Fernanda K.

Gabrielli, João P. F. Vieira e Vânia C. G. Sthel do Laboratório de Hidrólise

Enzimática e Fermentação Alcoólica e Laboratório de Biologia Funcional e

Estrutural por todo o auxílio que me prestaram durante os experimentos.

Aos bolsistas do programa Magaly H. Garcia (FORTRAN-GIRL), Fiona

M. Britto (NANO-GIRL), Paola A. Benavides (PHTALO-GIRL), Patricio E. B.

Rejas (FERRO-BOY), Dulce I. D. Gonzales (PYRO-GIRL) e Izabel C. M. Costa

(CATALYSIS-GIRL) os quais criei laços de amizade que espero levar para toda

a vida.

Ao pessoal que está e que já passou pelo Laboratório de Engenharia

Bioquímica da FURB, em especial Marilha A. Ortiz, Vanessa Bachmann, Lívia

M. Lozano e Hayssa A. Nunes.

E principalmente ao CTBE/CNPEM e ao 22° Programa Bolsas de Verão

pela oportunidade e incentivo a jovens pesquisadores.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

4

RESUMO

Atualmente, o bagaço de cana-de-açúcar produzido é utilizado como combustível

para a produção de vapor e eletricidade nas usinas nacionais. Uma forma de

aumentar a capacidade de produção nacional de bioetanol, sem afetar a demanda

energética, está associada ao uso de parte do bagaço gerado como matéria-prima

para a produção deste biocombustível. Adotando-se esta rota, estudos para

avaliar a viabilidade e eficiência de enzimas e/ou microrganismos eficientes para

conversão destes subprodutos em açúcares fermentescíveis é de suma

importância. Neste sentido, este trabalho buscou estudar a produção e aplicação

de hemicelulases microbianas (endo-xilanases β-xilosidases) na hidrólise

enzimática de xilo-oligômeros presente na fração líquida (licor de pentoses)

proveniente do pré-tratamento de bagaço de cana visando uma posterior

fermentação alcoólica por Scheffersomyces stipitis NRRL Y7124. Primeiramente,

buscou-se um Bacillus hemicelulolítico e um substrato proveniente de bagaço de

cana-de-açúcar pré-tratado (BH, BEX, BEX+) e farelo de trigo (FT) como fontes

de carbono para a produção de hemicelulases em fermentação submersa.

Segundo, verificou-se a eficiência de uma nova hemicelulase recombinante

bifuncional (XAB – xilanase + β-xilosidase; quimera) criada em laboratório

durante trabalhos anteriores, utilizando uma linhagem de Escherichia coli

transformada (BL21 DE03). O microrganismo que apresentou um maior

potencial para a produção de hemicelulases dentre os estudados foi o isolado 60,

com pico de produção em 6 h (0,65 U/mL - xilanase) em FT. A fração sólida

proveniente de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado selecionada para a produção

de hemicelulases foi o BH (proveniente de pré-tratamento hidrotérmico com

injeção de vapor), o qual apresentou pico de produção em 30 h (0,10 U/mL -

xilanase). Após os testes preliminares de hidrólise, a quimera xilanolítica

recombinante mostrou um interessante potencial na hidrólise de xilo-oligômeros

(conversão de 25,43%) frente aos controles utilizando coquetéis de hemicelulases

comerciais (45,69% - comercial C;) e fúngicos (17,44%). Assim, numa próxima

etapa recomenda-se um aumento da carga enzimática (quimera) e da duração da

hidrólise para uma maior % de conversão. Em relação aos ensaios de hidrólise

utilizando enzimas por isolado 60 em FT e BH, constatou-se uma diminuição de

xilose (7,27% e 4,14% respectivamente) que se deve a uma contaminação, sendo

necessária uma etapa de filtração e/ou lise celular dos coquetéis produzidos. Em

relação à fermentabilidade do hidrolisado, realizada sem sucesso neste trabalho,

recomenda-se melhores estudos de suplementação do licor de pentoses

hidrolisado para uma fermentação alcoólica de sucesso.

Palavras-chave: quimeras gênicas, Bacillus, pré-tratamento, xilo-oligômeros,

hemicelulases, bioetanol.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

5

ABSTRACT

Currently, the sugarcane bagasse produced is used as fuel to produce steam and

electricity in the national mills. One way to increase the capacity of national

production of bioethanol without affecting energy demand is associated with the

use of bagasse generated as part of the feedstock for the production of this

biofuel. Adopting this route, studies to evaluate the feasibility and efficiency of

enzymes and/or microorganisms and efficient conversion of these byproducts

into fermentable sugars is of big importance. Therefore, this research aimed to

study the production and application of microbial hemicellulases (endo-xylanases

and β-xylosidases) on enzymatic hydrolysis of xylo-oligomers present in the

liquid fraction (liquor of pentoses) from the pretreatment of sugarcane bagasse

targeting a later alcoholic fermentation by Scheffersomyces stipitis NRRL

Y7124. First, it has been done a search for a hemicellulosic Bacillus and a

substrate from pretreated sugarcane bagasse (BH, BEX, BEX +) and wheat bran

(WB) as carbon sources for the production of hemicellulases in submerged

fermentation. Second, it has been verified the efficiency of a new bifunctional

recombinant hemicellulase (XAB - xylanase + β-xylosidase; chimera) created in

the laboratory, during previous work, using a transformed strain of Escherichia

coli (BL21 DE03). The microorganism that showed a greatest potential to

produce hemicellulases among those studied was isolated 60, with a peak of

production at 6 h (0,65 U / mL - xylanase) in WB. The solid fraction from

pretreated sugarcane bagasse selected to produce hemicellulases was the BH

(from hydrothermal with steam injection pre-treatment), which showed a peak of

production at 30 h (0,10 U/mL - xylanase). After preliminary testing of

hydrolysis, the xylanolytic recombinant chimera showed an interesting potential

in the hydrolysis of xylo-oligomers (conversion of 25,43%) compared to controls

using commercial hemicellulases cocktails (45,69% - commercial C,) and fungal

cocktails (17,44%). So, in a next step it is recommended to increase the load

enzyme (chimera) and the duration of the hydrolysis to a higher % of conversion.

For the hydrolysis tests using enzymes from isolated 60 in WB and BH, it was

found a reduction of xylose (7.27% and 4.14% respectively) which is due to a

contamination, requiring a filtration step and/or lysis of cocktails produced.

Regarding the fermentability of the hydrolyzate, performed without success in

this work, it is recommended supplementation studies of the hydrolyzated liquor

of pentoses for a fermentation of success.

Keywords: genetic chimeras, Bacillus, pretreatment, xylo-oligomers,

hemicellulases, bioethanol.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

6

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 7

1.1. BIOCOMBUSTÍVEIS.................................................................................. 7

1.1.1. ETANOL ................................................................................................... 7

1.2. BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA ........................................................... 9

1.2.1. A FRAÇÃO HEMICELULÓSICA ........................................................ 11

1.3. PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA ................................................... 12

1.4. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DAS HEMICELULOSES .......................... 14

1.5. MICRORGANISMOS PRODUTORES DE XILANASES E A

BIOLOGIA MOLECULAR NO DESENVOLVIMENTO DE ENZIMAS

MULTIFUNCIONAIS EFICIENTES .................................................................. 15

1.5.1. ENZIMAS MULTIFUNCIONAIS ......................................................... 16

1.6. FERMENTAÇÃO DE XILOSE ................................................................ 17

2. OBJETIVO ................................................................................................... 19

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 20

3.1. SELEÇÃO DE Bacillus sp. PRODUTOR DE HEMICELULASES ..... 20

3.2. SELECÃO DA FONTE DE CARBONO (BAGAÇO DE CANA-DE-

AÇÚCAR PRÉ-TRATADO) EM RELAÇÃO À PRODUÇÃO ENZIMÁTICA

DE HEMICELULASES POR Bacillus sp. .......................................................... 21

3.3. PRODUÇÃO DE HEMICELULASES A PARTIR DE Bacillus sp. E DAS

FONTES DE CARBONO SELECIONADAS ..................................................... 22

3.4. PRODUÇÃO DE ENZIMAS MULTIFUNCIONAIS (QUIMERA) POR

Escherichia coli RECOMBINANTE ................................................................... 24

3.5. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO LICOR DE PENTOSES ...................... 26

3.6. FERMENTABILIDADE DO LICOR DE PENTOSES HIDROLISADO 27

3.7. DETERMINAÇÕES ANALITICAS ......................................................... 28

3.7.1. ATIVIDADE ENZIMÁTICA XILANASE ............................................ 28

3.7.2. ATIVIDADE ENZIMÁTICA β-XILOSIDASE ..................................... 29

3.7.3. QUANTIFICAÇÃO DE GLICOSE, XILOSE, ETANOL E XILITOL . 29

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................. 31

4.1. SELEÇÃO DE Bacillus sp. PRODUTOR DE HEMICELULASES. ........ 31

4.2. SELEÇÃO DA FONTE DE CARBONO PARA A PRODUÇÃO DE

HEMICELULASES POR Bacillus sp. ................................................................. 36

4.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA FRAÇÃO LÍQUIDA (LICOR DE

PENTOSES), GERADA NO PRÉ-TRATAMENTO HIDROTÉRMICO DE

BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR. ................................................................. 37

4.4. FERMENTABILIDADE DO LICOR HIDROLISADO ........................... 41

5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ..................................... 43

6. REFERENCIAS ........................................................................................... 44

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

7

1. INTRODUÇÃO

1.1. BIOCOMBUSTÍVEIS

Devido à diminuição das reservas energéticas de petróleo e a constante

busca pela preservação do meio ambiente, resultando na necessidade em

diversificar a matriz energética mundial através do uso de combustíveis

renováveis, pesquisas visando à consolidação de produção desses combustíveis

tem sido realizadas. A atual matriz energética, baseada em sua maior parte nos

derivados fósseis, não apresenta sustentabilidade futura em termos ambientais.

(SCHIRMER, W. N.; GAUER, M. A., 2012).

Segundo a ANP (Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e

Biocombustíveis), biocombustíveis são definidos por derivados de biomassa

renovável que podem substituir, parcial ou totalmente, combustíveis derivados de

petróleo e gás natural em motores a combustão ou em outro tipo de geração de

energia. No Brasil, cerca de 45 % da energia e 19 % dos combustíveis já são de

fontes renováveis, sendo os dois principais biocombustíveis líquidos o bioetanol

(álcool combustível), produzido a partir da cana-de-açúcar, e o biodiesel,

produzido a partir de óleos vegetais ou de gorduras animais (ANP, 2010).

1.1.1. ETANOL

O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de biocombustíveis

do mundo e sua produção tem aumentado rapidamente nas últimas três décadas.

O aumento na eficiência das plantas de produção de bioetanol nacionais tem sido

evidente devido a muitas contribuições tecnológicas para este setor. O etanol de

primeira geração, produzido a partir dos açúcares da cana-de-açúcar, é usado

como um efetivo substituto para a gasolina em grande escala no Brasil,

primeiramente na década de 30 com a mistura de 5 % com gasolina e, mais tarde,

como uma consequência de um programa governamental iniciado na década de

setenta, quando uma importante fração da gasolina foi substituída por etanol

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

8

(COSTA, R. C.; SODRÉ, J. R, 2010; CERQUEIRA LEITE, R. C. D. et al.,

2009).

A cana-de-açúcar é a matéria-prima usada nas usinas de etanol brasileiras

e, de acordo com a safra de 2012/2013 o Brasil processou cerca de 595,13

milhões toneladas de cana-de-açúcar (CONAB, 2012) podendo-se estimar que

nesta safra foram gerados cerca de 23,62 bilhões de litros de etanol e 83,3 ton de

bagaço, uma vez que 1 ton de cana-de-açúcar processada gera aproximadamente

140 kg de bagaço seco (CGEE, 2001).

O bagaço produzido e, eventualmente, a palha coletada do solo, são

usados atualmente como combustíveis em caldeiras para produção de vapor e

eletricidade, com a finalidade de suprir a demanda do processo de produção de

açúcar e etanol (DIAS et al., 2009). No entanto, somente uma pequena parcela de

palha é usada para a cogeração em plantas de cana-de-açúcar. Parte é queimada

no solo para facilitar as operações de colheita (ALONSO PIPPO et al., 2011) e,

parte é deixada no campo para controle de doenças e reciclagem de nutrientes,

ocasionando, consequentemente, problemas ambientes.

Uma forma de diminuir os impactos ambientais causados pela queima da

palha no solo, suprir a demanda energética das usinas e, consequentemente,

contribuir para o aumento da produção de etanol nacional, utilizando a mesma

área de plantio dos dias de hoje, pode estar associada com as seguintes

considerações: i) utilizar a palha para produção de energia e vapor em caldeiras;

ii) submeter o bagaço de cana-de-açúcar à pré-tratamento físico e/ou químico

para remoção da fração líquida rica em pentoses e hexoses e da fração sólida

chamada celulignina; iii) queimar a fração de celulignina do bagaço, obtida após

pré-tratamento e remoção da fração líquida, para suprir as necessidades

energéticas; iv) utilizar o licor rico em pentoses e hexoses para obtenção de

bioetanol; v) integrar primeira e segunda geração para a obtenção de etanol,

utilizando o licor rico em xilo-oligômeros e pentoses/hexoses, associado ao

melaço de cana-de-açúcar. Desta forma, intensas pesquisas têm sido realizadas

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

9

visando à utilização do bagaço a fim de aumentar o rendimento do processo de

produção de etanol.

1.2. BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

A biomassa lignocelulósica é basicamente composta por lignina,

hemiceluloses e celulose. Esta biomassa apresenta características químicas

semelhantes a da madeira, porém em diferentes quantidades percentuais,

dependendo da espécie e condições de crescimento (FENGEL & WEGENER,

1989). A Figura 01 apresenta a composição da parede celular de biomassa

lignocelulósica.

Figura 01. Composição da parede celular de biomassa lignocelulósica (adaptado de

STICKLEN, 2008).

De acordo com SREENATH & JEFFRIES (2000), na biomassa

lignocelulósica predomina a presença dos polímeros de celulose e hemicelulose

que são potenciais fontes de açúcares passíveis de serem fermentados. Em

virtude disto, o aproveitamento de milhões de toneladas destes resíduos gerados

pelo crescente desenvolvimento da agricultura e da indústria florestal constituem

potenciais fontes de energia, combustíveis e matérias-primas de baixo custo

(FULLER et al., 1996). A Tabela 01 apresenta a composição de celulose,

hemiceluloses e lignina para diferentes biomassas.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

10

Conforme a Tabela 01, as biomassas que mais possuem celulose são a

palha de arroz, aparas de eucalipto e o bagaço de cana-de-açúcar, já em relação à

fração de hemicelulose, o bagaço de cana fica atrás somente da palha de sorgo.

A celulose é o polímero considerado como o maior constituinte da parede celular

das plantas e uma das estruturas que é constantemente regenerada durante a

fotossíntese. Trata-se de um homopolissacarídeo linear composto por unidades

de β-D-glicose, unidas por ligações β (1-4) carbono-carbono (PANDEY et al.,

2000). A unidade repetitiva da celulose é a celobiose. Isso é o que caracteriza o

polímero celulose.

A lignina, rica em compostos aromáticos, presente em todas as plantas

superiores, é a responsável pela rigidez da parede celular em vegetais, da sua

resistência ao impacto, compressão e dobra, sendo também um agente

permanente de ligação entre as células (LEMOS, J. L. S, 2001). Cabe destacar

que a lignina, quando liberada durante o pré-tratamento da biomassa pode causar

inibição durante os processos fermentativos.

Tabela 01. Composição percentual de alguns materiais lignocelulósicos (adaptado de

ARRUDA, 2011).

Biomassa Celulose

(%)

Hemicelulose

(%)

Lignina

(%)

Aparas de

eucalipto 40,20 15,67 26,90

Bagaço de

Cana-de-

Açúcar

40,00 35,00 15,00

Casca de

Aveia 29,26 28,35 22,22

Palha de arroz 43,50 22,00 17,20

Palha de cana-

de-açúcar 38,10 29,20 24,20

Palha de milho 40,00 25,00 17,00

Palha de sorgo 34,00 44,00 20,00

Palha de trigo 33,81 31,83 20,12

Sabugo de

Milho 45,00 35,00 15,00

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

11

1.2.1. A FRAÇÃO HEMICELULÓSICA

As hemiceluloses são polímeros que aparecem em grande quantidade nos

materiais lignocelulósicos. São homo e heteropolissacarídeos formados por

cadeias lineares apresentando ramificações laterais, sendo compostas por hexoses

(glicose, manose, galactose), pentoses (xilose e arabinose) e ácidos urônicos

(FERREIRA, 2010). Também de acordo com FERREIRA (2010) a fração

hemicelulósica permite o emprego de seus açúcares (glicose, xilose, frutose,

arabinose, galactose e manose) para a produção de diferentes sumos de interesse

comercial, uma vez que ela é mais facilmente hidrolisável do que a celulose

devido à sua heterogeneidade dos componentes e seu estado amorfo (JEFFRIES,

1983). A Figura 02 apresenta a estrutura típica das hemiceluloses.

Conforme mostrado na Figura 02, dentre as unidades de pentoses e

hexoses que formam a estrutura da hemicelulose destacam-se a β-D-manose, β-

D-glicose, α-L-arabinose, α-D-galactose e principalmente, β-D-xilose, em

proporções que dependem da origem do material lignocelulósico (BORGES,

2011).

Figura 02. Estrutura Típica da Hemicelulose (MUSSATO, 2012).

Depois da celulose, as xilanas constituem a mais abundante fonte de

carboidratos das plantas que, muitas vezes, após diversos pré-tratamentos,

liberam xilana na forma insolúvel e xilo-oligômeros (oligômeros de açúcar

formados por unidades de xilose) na forma solúvel além de monômeros. Estes

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

12

compostos quando hidrolisados através de enzimas do grupo hemicelulases

(principalmente as enzimas β-1,4-endoxilanase e β-xilosidase), oferecem um

rendimento maior de xilose (açúcar fermentescível) sem a posterior degradação

do produto (MENEZES, 2008; ZHANG & VIIKARI, 2012; SHEKIRO et al.

2012). Os xilo-oligômeros são formados devido a constante busca por pré-

tratamentos da biomassa lignocelulósica que visam à diminuição da cogeração de

compostos inibidores à multiplicação celular de microrganismos fermentadores.

Isto se explica pelo fato de que quanto maior a severidade em um pré-tratamento,

maior será a concentração de inibidores e as perdas em xilose e glicose. Por outro

lado, quando pré-tratamentos mais brandos são aplicados, ocorre uma diminuição

da formação de inibidores e a consequente formação de oligômeros, devido a

incompleta hidrólise da hemicelulose.

Sendo assim, dentre os gargalos da produção de etanol de segunda geração

podem-se citar: i) aperfeiçoar métodos de pré-tratamentos de biomassa

lignocelulósica que gerem baixa concentração de compostos inibidores; ii)

otimizar a hidrólise enzimática de xilanas e xilo-oligômeros,; iii)

encontrar/desenvolver microrganismos capazes de fermentar pentoses em etanol.

1.3. PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA

Segundo estudos de GALBE & ZACCHI (2007), para que um pré-

tratamento seja considerado eficaz, ele deve oferecer particularidades, como:

derivar em alta extração de açúcares; permitir alta digestibilidade da celulose, no

caso de uma posterior hidrólise; produzir quantidades insignificantes de produtos

de degradação derivados dos açúcares ou da lignina, que serão tóxicos aos

microrganismos fermentadores; ter uma baixa demanda energética ou ser

realizado em uma via que possibilite o reuso da energia em outras etapas do

processo como calor secundário; ter um baixo custo de capital e operacional.

A Figura 03 apresenta um esquema geral das mudanças ocorridas na

estrutura da biomassa lignocelulósica durante o pré-tratamento. Conforme a

Figura 03, o pré-tratamento é essencial para a remoção, liberação e separação da

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

13

lignina, da hemicelulose e da celulose. É nesta fase que ocorre também a redução

da cristalinidade das micro fibrilas de celulose, melhorando assim o processo de

hidrólise da celulose, quando este é desejado. Os pré-tratamentos podem ser

considerados físicos, químicos ou biológicos, ou uma combinação deles (BINOD

et al., 2010).

Figura 03. Pré-tratamento da estrutura lignocelulósica do bagaço de cana-de-açúcar (U.S.

Department of Energy, 2009).

Dentre os processos de pré-tratamento da biomassa vegetal, pode-se citar

o processo hidrotérmico (físico/químico) que utiliza água sob altas temperaturas

e/ou pressão promovendo então a clivagem das ligações dos complexos lignina-

carboidrato e a ruptura das ligações glicosídicas dos polissacarídeos,

principalmente das hemiceluloses. A diminuição de pH catalisa a reação da

hidrólise da biomassa promovendo a despolimerização das hemiceluloses,

processo denominado auto catalítico (MOSSIER et al., 2005).

Um pré-tratamento importante é o mediado por peróxido de hidrogênio

alcalino, este processo químico é realizado com reagentes de fácil obtenção e de

baixa toxicidade e impacto ambiental, em condições amenas de temperatura e

pressão. Este processo também é compatível com operações de separação, em

que praticamente nenhum produto secundário é gerado e apresenta quase 100 %

de recuperação da celulose na forma de glicose após hidrólise enzimática

(BANERJEE et al., 2012; RABELO et al., 2011; RIVERA et al., 2010).

RABELO (2008) reportou que a vantagem do uso deste reagente no pré-

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

14

tratamento é a não formação de produtos secundários uma vez que praticamente

todo o peróxido de hidrogênio é convertido em oxigênio e água, minimizando a

geração de poluentes.

Outro processo bastante empregado é o pré-tratamento por explosão a

vapor. Segundo BRAGATTO (2010), o pré-tratamento por explosão a vapor é

um método físico-químico que já vem sido utilizado no pré-tratamento de

diversos materiais lingocelulósicos. Durante o processo de pré-tratamento a

vapor, todos os componentes da biomassa sofrem hidrólise, mas as hemiceluloses

são as mais susceptíveis a este tipo de reação. Sob a ação da temperatura e da

pressão do vapor, os grupamentos acetil presentes nas hemiceluloses são

hidrolisados a ácido acético e o ácido liberado no meio catalisa a quebra de

ligações do complexo lignina-carboidrato, provocando a solubilização de grande

parte das hemiceluloses que são facilmente removidas por extração aquosa. A

fração insolúvel em água contém celulose e lignina parcialmente modificada,

sendo que a maior parte desta lignina pode ser removida por extração com álcali,

etanol ou dioxano (PITARELO, 2007).

1.4. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DAS HEMICELULOSES

Após o pré-tratamento da biomassa duas correntes são geradas, uma

correspondente a fração líquida, caracterizada por pentoses (xilose, arabinose),

xilo-oligômeros (quando da aplicação de pré-tratamentos brandos) e hexoses

(principalmente glicose); e outra fração sólida, composta de celulignina, que

corresponde à lignina e a celulose não degradadas durante o pré-tratamento

(TENGBORG et al., 1998; YANG et al., 2008; EWANICK et al., 2007.). A

fração sólida necessita de hidrolise (química ou enzimática) para a obtenção de

açúcares fermentescíveis (principalmente glicose), enquanto que a fração líquida

poderá ser submetida à fermentação após o pré-tratamento, dependendo da

concentração de pentoses e inibidores presentes. Desta forma, ressalta-se a

importância de se realizar um pré-tratamento brando para a obtenção de baixo

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

15

conteúdo de inibidores, por outro lado, nesta situação a formação de oligômeros

é observada e se faz necessária e hidrólise destes compostos.

A composição das hemiceluloses é mais complexa do que a celulose, mas

isso não significa que elas são mais difíceis de serem hidrolisadas pelas enzimas

(SAHA, 2003). Múltiplas enzimas são necessárias para uma hidrólise completa

da hemicelulose. As principais são as: exo-xilanases (hidrolisam as ligações

glicosídicas β-1,4 liberando xilobiose), endo-xilanases (hidrolisam internamente

a cadeia principal de xilana ente as ligações β-1,4) e β-xilosidase (liberam xilose

da xilobiose e pequenas cadeias de xilo-oligossacarídeos). Também se pode citar

as α-arabinofuranosidase, α-glucoranosidase, acetil xilana esterase, endo-β-1,4-

mannanase, exo-β-1,4-mannosidase, endo-galactanase dentre outras (MARAIS,

2008).

1.5. MICRORGANISMOS PRODUTORES DE XILANASES E A

BIOLOGIA MOLECULAR NO DESENVOLVIMENTO DE ENZIMAS

MULTIFUNCIONAIS EFICIENTES

As endo e exo β-1,4-xilanases são enzimas extracelulares, produzidas por

bactérias e fungos. A produção de xilanases por bactérias está limitada a poucas

espécies como, por exemplo, Bacillus sp. (GESSESSE & MANO, 1999 ;

DUARTE et al., 2000 ; NATH & RAO, 2001), Streptomyces sp. (RUIZ-

ARRIBAS et al., 1995 ; BEG et al., 2000) e Staphylococcus sp. (GUPTA et al.,

2001).

Para aplicações comerciais as xilanases devem ser produzidas rapidamente

e em grandes quantidades, usando substratos simples e baratos (GHILDYAL e

LONSANE, 1991), sendo que o gênero Bacillus sp. tem merecido destaque em

muitos estudos envolvendo biodegradação por possuir características como

tolerância a altas temperaturas, crescimento rápido e uma ótima atividade

enzimática. Dentre os processos utilizados, a fermentação submersa é uma das

mais comuns na produção comercial de enzimas, devido a maior facilidade de

controle do processo e monitoramento (KIRK; BORCHET; FUGLSANG, 2002).

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

16

1.5.1. ENZIMAS MULTIFUNCIONAIS

A necessidade de um grande número de diferentes enzimas atuando

sinergicamente para a conversão da biomassa em açúcares adequados a produção

do etanol constitui um desafio no sentido de aperfeiçoar e baixar os custos desse

processo. Sendo assim os maiores problemas técnicos a serem superados dizem

respeito ao aumento da atividade dessas enzimas e a redução da quantidade de

proteínas necessárias para o processo.

Na natureza são encontradas enzimas multifuncionais (quimeras)

utilizadas por microrganismos para a degradação eficiente de polissacarídeos,

como os celulossomos (DOI & KOSUGI, 2004). A utilização de enzimas com

mais de um tipo de atividade catalítica tem sido apontado como uma promissora

estratégia no sentido de diminuir a quantidade de enzimas necessárias ao

processo além de apresentar atividade sinérgica na degradação de substratos

complexos (FAN, 2009).

Estudos focando a engenharia de proteínas multifuncionais tem

demonstrado que é possível obter ganho na atividade de uma quimera quando

comparado a seus módulos separados (ADLAKHA, 2011; XUE 2009), o que tem

sido atribuído a maior proximidade física das enzimas e a flexibilidade

conformacional dada pelo linker que une as duas unidades (XUE, 2009). A

criação de enzimas multifuncionais in vitro é possível graças às técnicas de DNA

recombinante. A associação de enzimas diferentes é feita pela ligação dos

domínios via um ou mais linkers de pequenas cadeias peptídicas via utilização

das técnicas de fusão “end-to-end” (FAN, 2009). A utilização de enzimas com

mais de um tipo de atividade catalítica tem sido apontado como uma promissora

estratégia no sentido de diminuir a quantidade de enzimas necessárias a esse

processo.

Neste sentido, uma quimera bifuncional recombinante (xilanase + β-

xilosidase) foi desenvolvida pelo grupo de pesquisa de Biotecnologia de Enzimas

do CTBE que é liderado pelo pesquisador Roberto Ruller e que orientou o

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

17

trabalho de Jose Alberto Diogo no Programa Unificado de Estágios

(CTBE/CNPEM). O desenvolvimento desta enzima quimérica se deu em torno

de duas hemicelulases, que apresentaram resultados promissores de hidrólise de

xilana (comercial e derivada de biomassa de cana, resultados não publicados).

Esta nova construção foi engendrada em genes provindos de módulos do

microrganismo mesofílico Bacillus subtilis. Uma próxima etapa necessária é

testar a eficiência desta construção enzimática frente ao licor de xilo-oligômeros

provindos do pré-tratamento, para a obtenção de xilose fermentescível.

1.6. FERMENTAÇÃO DE XILOSE

A fermentação é um conjunto de reações enzimáticas, que ocorrem no

interior da célula microbiana, com o intuito de gerar energia para o crescimento e

manutenção das atividades metabólicas (FERREIRA, 2010).

No processo de fermentação do hidrolisado celulósico para a produção de

etanol, a principal espécie utilizada é a Saccharomyces cerevisiae. Estas

fermentam uma ampla variedade de hexoses, tais como glicose, frutose,

galactose, maltose e maltotriose, levando a um alto rendimento de etanol. Estas

leveduras têm sido tradicionalmente empregadas na produção industrial de etanol

porque são cultivadas para produzirem uma concentração moderadamente alta de

álcool (RABELO, 2007).

As propriedades desejadas para os microrganismos fermentadores,

necessárias à fermentação de hidrolisados de hemicelulose são: eficiente

utilização de hexoses e pentoses; taxas de fermentação rápidas, alta produção de

etanol, alta tolerância ao etanol e aos inibidores presentes no hidrolisado,

fermentação em valores baixos de pH e a altas temperaturas, alta viabilidade e

rentabilidade, posse de características apropriadas de floculação e de utilização

de uma ampla variedade de substratos (PASHA; KUHAD; RAO, 2007).

Nos últimos anos vem se destacando o desenvolvimento de processos para

a obtenção de etanol de segunda geração, ou seja, o etanol obtido a partir da

fermentação de pentoses, resultantes do pré-tratamento do bagaço de cana-de-

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

18

açúcar. A biomassa (bagaço de cana-de-açúcar) apresenta vantagens em relação

ao caldo, méis e xaropes de cana, atualmente utilizado nas Usinas nacionais para

a produção de etanol. Dentre estas vantagens podem-se citar diminuição dos

impactos ambientais, aumento na capacidade de produção nacional de etanol,

entre outras. No entanto, atualmente são poucos os microrganismos capazes de

fermentar pentoses (principalmente xilose) em etanol. Os microrganismos

reportados na literatura (Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST), Zymomonas

mobilisAX101, Schefferomyces stipitis (anteriormente Pichia stipitis) e

Escherichia coli KO11 ATCC 55124) apresentam baixos rendimentos de

conversão destes açucares em etanol, quando comparados aos microrganismos

que fermentam hexoses e sacarose. Neste sentido, se faz necessário o estudo de

cepas melhoradas geneticamente, combinado ao desenvolvimento de processos

biotecnológicos capazes de melhorar os parâmetros cinéticos destes

microrganismos.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

19

2. OBJETIVO

Geral

Estudar a produção e a aplicação de hemicelulases capazes de hidrolisar

xilo-oligômeros presentes na fração líquida (licor de pentoses), provindo do

resíduo pré-tratado do bagaço de cana-de- açúcar.

Específico

Selecionar linhagens de Bacillus capazes de produzir hemicelulases;

Selecionar substrato, dentre diferentes tipos de bagaço de cana-de-açúcar

pré-tratados, para a produção de hemicelulases, a partir da linhagem de

Bacillus selecionada(s);

Produzir hemicelulases utilizando substrato(s) e microrganismo

selecionado(s);

Produzir hemicelulases multifuncionais em cultivo submerso em

biorreator, a partir de Escherichia coli recombinante modificada para a

produção destas enzimas;

Avaliar a viabilidade de conversão à xilose a partir do licor de xilo-

oligômeros gerado no pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana-de-

açúcar, utilizando: enzimas (hemicelulases) produzidas pelo Bacillus

selecionado na fonte de substrato selecionada, as enzima multifuncionais

(quimera) produzidas por E. coli recombinante, coquetéis comerciais e

fúngicos cedidos pelo CTBE /CNPEM;

Testar a fermentabilidade do licor de pentoses hidrolisado, a partir da

fermentação à etanol por Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

20

3. MATERIAL E MÉTODOS

Todos os experimentos deste trabalho foram realizados no Laboratório de

Hidrólise Enzimática, Fermentação Alcoólica e Laboratório de Biologia

Funcional e Estrutural do Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia de

Bioetanol (CTBE/CNPEM). Vale ressaltar que, para a realização deste trabalho

houve a participação e integração junto aos programas de Pesquisa Básica e

Industrial (Laboratório de Desenvolvimento de Processos e de Bioprocessos) do

CTBE.

3.1. SELEÇÃO DE Bacillus sp. PRODUTOR DE HEMICELULASES

Em trabalhos anteriores foram isolados 106 linhagens de Bacillus

extremofílicos provindos da pasteurização de sucos. Deste foi feita um triagem

inicial para isolamento de 20 cepas que estão sendo identificadas por

genotipagem e bioquímica. Dos 20 foram selecionados em meio sólido os

melhores hemicelulolíticos. Sequencialmente, foram disponibilizados para este

trabalho 04 linhagens de isolados BH que foram usados para a seleção do

Bacillus sp. produtor de hemicelulases em meio liquido com fonte de carbono

renovável. Utilizaram-se as cepas denominadas BH54, BH60, BH62 e BH47, do

laboratório de Biotecnologia de Enzimas do CTBE liderado pelo pesquisador

Roberto Ruller juntamente com o laboratório de Bioquímica de Alimentos

(Professora Helia Sato FEA – Unicamp).

As cepas de Bacillus sp. foram conservadas em placas de petri sob

refrigeração, em que a repicagem ocorria a cada 15 dias em meio Luria-Bertani

(LB) Ágar, o qual continha (em g L-1

): NaCl, 10; Tryptona, 10; extrato de

levedura, 5 e ágar, 15. O inóculo foi realizado em meio LB, seguindo a descrição

apresentada acima, porém sem adição de ágar. O meio foi preparado em frascos

erlenmeyers de 500 mL, apresentando 150 mL de volume de trabalho. Três

alçadas das cepas de BH54, BH60, BH62 e BH47 foram transferidas para o meio

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

21

LB que foi incubado em shaker (Innova 44, marca NewBrunswick Scientific) por

24 h a 250 rpm e 37 °C.

O cultivo para produção de hemicelulases foi realizada em erlenmeyers de

500 mL, com 250 mL de volume de trabalho. Após o tempo de inóculo, 10 % do

volume final do meio de cultivo para a produção de enzimas (25 mL) foi

transferido para a inoculação do meio. O meio utilizado para a seleção do

Bacillus foi o mesmo utilizado por KASANA, 2008, porém com modificação da

porcentagem da fonte de carbono de 0,5 para 2 %, o meio era composto por (em

g L-1

): NaNO3, 2,0; KH2PO4, 1,0; MgSO4, 0,5; KCl, 0,5; peptona, 0,2; fonte de

carbono , 2 %, farelo de trigo (Fibra de Trigo, marca Jasmine)

O cultivo para a produção de hemicelulases foi realizado em shaker por

48 h, 37 °C, pH 7,0 e foram testadas diferentes condições de agitação, 150 e

250 rpm, a fim de selecionar a melhor condição de aeração para a produção de

hemicelulases. A coleta de amostras ocorreu a cada 3,5 h, para a determinação de

atividade enzimática de xilanase extracelular (sobrenadante/extrato bruto) e β-

xilosidase extracelular.

3.2. SELECÃO DA FONTE DE CARBONO (BAGAÇO DE CANA-DE-

AÇÚCAR PRÉ-TRATADO) EM RELAÇÃO À PRODUÇÃO

ENZIMÁTICA DE HEMICELULASES POR Bacillus sp.

Após a seleção do Bacillus, foram realizados cultivos submersos em

shaker para a seleção da fonte de carbono.

As fontes de carbono estudadas foram as frações sólidas geradas no pré-

tratamento de bagaço de cana-de-açúcar e o farelo de trigo, denominado

“padrão”, uma vez que já existem estudos da produção de hemicelulases por

Bacillus sp. em meio contendo farelo trigo (FT).

As frações sólidas testadas foram: BEX (bagaço de cana-de-açúcar pré-

tratado por explosão a vapor sem deslignificação), BH (bagaço de cana-de-açúcar

pré-tratado hidrotérmicamente com injeção de vapor) e BEX+ (bagaço de cana-

de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor catalisado por peróxido de

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

22

hidrogênio). Vale ressaltar que todas as frações sólidas foram gentilmente

cedidas pelo Laboratório de Desenvolvimento de Processos, LDP/CTBE,

(RABELO et al., 2012).

A composição de cada fração sólida está descrita na Tabela 02.

Tabela 02. Composição da fração sólida.

Fração

Sólida

Lignina

(%)

Hemicelulose

(%)

Celulose

(%)

Cinzas

(%)

Proteínas

(%)

BEX 1

34,3 29,0 41,8 NQ NQ

BH * 2

28,22 ± 0,75 24,62 ± 0,32 40,87 ±

035

6,75 ±

0,4

NQ

BEX+* 3

25,8 ± 0,1 22,3 ± 0,4 50,4 ± 0.8 3,0 ± 0,1 NQ

FT 4 4,89 28,88 10,86 NQ 17,61

NQ – Não quantificado pela fonte.

*Fonte: Laboratório de Desenvolvimento de Processos, LDP/CTBE

(1 – CARL, 2011; 2 – NAKASU, 2012; 3 – RABELO, 2012; 4 – ZÚÑIGA, 2010 ).

O inóculo utilizado foi o mesmo descrito no item 3.1 deste relatório para a

seleção do Bacillus.

O meio e as condições de cultivo para a produção de hemicelulases foram

os mesmos apresentados no item 3.1, porém com variação da fonte de carbono e

agitação de 250 rpm.

3.3. PRODUÇÃO DE HEMICELULASES A PARTIR DE Bacillus sp. E

DAS FONTES DE CARBONO SELECIONADAS

Após a seleção do Bacillus sp. e das fontes de carbono para a produção de

hemicelulases, realizou-se a produção de enzimas para posterior concentração

dos extratos e hidrólise do licor de pentoses.

Para isto, foram preparados 02 frascos erlenmeyers para cada fonte de

carbono, onde o frasco 01 de cada fonte foi retirado do shaker no tempo

correspondente ao pico de produção enzimática de xilanases e o frasco 02 de

cada fonte foi retirado ao final de 48 h, para posterior lise das células e obtenção

de uma maior quantidade de β-xilosidases (conforme esquema da Figura 4).

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

23

Centrifugação Filtração

Lise celular

Extrato Enzimático(xilanase) - FT

Extrato Enzimático(xilanase) – BAGAÇO

PRÉ-TRATADO

Extrato Enzimático(b-xilosidase) - FT

Extrato Enzimático(b-xilosidase) – BAGAÇO

PRÉ-TRATADO

Concentração

Coquetel Enzimático - FT Coquetel Enzimático - BAGAÇO PRÉ-TRATADO

Figura 04. Esquema da produção dos coquetéis enzimáticos para as fontes de carbono

selecionadas.

O inóculo utilizado foi o mesmo descrito no item 3.1 deste relatório para a

seleção do Bacillus.

O meio e as condições de cultivo para a produção de hemicelulases foram

os mesmos apresentados no item 3.1, porém com agitação de 250 rpm.

Ao tempo de pico de produção da enzima xilanase (estabelecido nos

ensaios anteriores), o conteúdo dos frascos número 01 de cada ensaio foi

centrifugados a 8000 rpm, 4 ºC por 30 min (Avanti Centrifuge, modelo J-26 XP).

O sobrenadante (extrato enzimático) foi concentrado até atingir um volume final

de 5 mL em Stirred Ultrafiltration Cell, marca AMICON Bioseparations

(Millipore) através de Ultrafiltration Membranes (material: Polyethersulfane;

diâmetro: 63,5 mm; NMWL: 5,000 kiloDalton).

Já para o conteúdo dos frascos número 02 de cada ensaio, ao tempo 48 h

de cultivo, realizou-se a filtração do meio por meio de papel filtro qualitativo. O

filtrado foi centrifugado a 8000 rpm, 4 ºC durante 30 min, para descarte do

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

24

sobrenadante. Os pellets das células de Bacillus sp. foram ressuspensos em

10 mL de tampão fosfato de sódio 20 mM (100 mM NaCl, 5 mM imidazol) em

pH 7,4. Em seguida, foi adicionado 1,0 mM de PMSF (fluoreto de

fenilmetilsulfonil), 1 mM de Benzamidina e 0,5 mg mL-1

de lisozima. Após

incubação à temperatura ambiente, sob agitação lenta por 30 min, foi realizada a

sonicação da seguinte forma: 7 pulsos de 10 seg com intervalos de 50 seg a 40 %

de amplitude em sonicador (Sonicador VIBRA-CELL, modelo VCX 750, marca

Sonics). O lisado foi centrifugado a 9000 rpm, 30 min e 4 °C, onde o

sobrenadante foi reservado em frascos e congelado. Este processo se faz

necessário uma vez que a produção de β-xilosidases por Bacillus sp. é

intracelular. A enzima concentrada a partir dos frascos número 01 da cada ensaio

(enzima xilanase) foi misturada a fração obtida após lise de células dos frascos

numero 02 de cada ensaio (enzima β-xilosidase). Dessa forma, ao término da

produção/recuperação/concentração obtiveram-se dois coquetéis enzimáticos de

aproximadamente 15 mL cada, contendo xilanases e β-xilosidases, para cada uma

das fontes de carbono selecionadas.

3.4. PRODUÇÃO DE ENZIMAS MULTIFUNCIONAIS (QUIMERA)

POR Escherichia coli RECOMBINANTE

Para a produção de enzimas multifuncionais utilizou-se Escherichia coli

BL21 DE03. Para a produção recombinante da quimera (XAB), foi utilizada uma

linhagem de E. coli BL21 DE03 transformada com o vetor de expressão com o

gene para xab (plasmídeo pETxab). Esta enzima é uma junção de duas

hemicelulases, uma endo-1,4-β-xilanase (GH11) e β-1,4-xilosidase(GH43),

ambas provenientes de Bacillus subtilis, unidas por meio de um linker de

laminarase proveniente de Thermotoga petrophila.

Para a produção das enzimas xilanase e -xilosidase por E. coli

recombinante inicialmente, transferiu-se uma colonia transformada de E. coli

BL21 DE03 para o inóculo. O inóculo foi realizado em frascos erlenmeyer de

500 mL, contendo 150 mL de meio LB e 50 μg mL-1

de kanamicina e incubados

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

25

a 37 °C, 250 rpm durante 16 h. O inóculo foi transferido para um biorreator

(BIOFLO 310, New Brunswick Sci. Company Inc., New Jersey, USA), com

volume de trabalho de 1,5 L. O inóculo foi utilizada para a inoculação do

biorreator, o qual representou 10 % do volume de trabalho. As condições de pH,

aeração e agitação foram 7,0, 0,125 vvm e 450 rpm, respectivamente. A aeração

e agitação foram aumentadas gradualmente para manter-se a concentração de

oxigênio dissolvido superior a 30 % em relação à saturação com ar atmosférico.

O meio utilizado para o cultivo em biorreator foi LB e 50 μg mL-1

de

kanamicina. Para o experimento foi realizado um processo de aclimatização, que

se baseou na leitura da densidade óptica ( monitorada a 600 nm) até atingir valor

próximo de 0,7 (estabelecido previamente comocorrespondente à fase de

crescimento exponencial das células). Neste instante, a temperatura de cultivo foi

alterada para 20 °C e a aclimatização ocorreu por 1 h. Após a aclimatação da

cultura, foi feita a indução para a expressão das proteínas com 0,5 mM de IPTG.

Após 16 h de indução, as células foram centrifugadas por 30 min, 9000 rpm, a

4 °C.

O pellet resultante da centrifugação das células produzidas no ensaio

descrito acima, foi ressuspenso em tampão fosfato de sódio 20 mM (100 mM de

NaCl e 5 mM imidazol) pH 7,4 , seguindo a proporção de 5 ml de tampão por

grama de pellet. Em seguida, foi adicionado 1,0 mM de PMSF (fluoreto de

fenilmetilsulfonil), 1 mM de Benzamidina e 0,5 mg mL-1

de lisozima. Após

manteve-se a mistura sob agitação em temperatura ambiente por 30 min. Em

seguida realizou-se um processo de sonicação (Sonicador VIBRA-CELL, modelo

VCX 750, marca Sonics) por meio de 7 pulsos de 10 s com intervalos de 50 s a

40 % de amplitude. O material lisado foi centrifugado a 9000 rpm por 30 min a

4 °C. Ao término, realizou-se um teste de atividade enzimática de xilanase do

sobrenadante para posterior experimento de hidrólise.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

26

3.5. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO LICOR DE PENTOSES

Para a hidrólise do licor de pentoses, utilizou-se o licor proveniente de um

pré-tratamento hidrotérmico com injeção a vapor do bagaço de cana-de-açúcar,

cedido pelo Laboratório de Desenvolvimento de Processos do CTBE, que

ocorreu sem uma etapa prévia de moagem e lavagem. O pré-tratamento foi

realizado na Planta Piloto de Desenvolvimento de Processos do CTBE (PPDP)

em um reator modelo Parr de liga Alloy C-276 com capacidade de 7,5 L, onde

600 g de bagaço in natura (50% umidade) foi alimentado no reator, a uma

concentração de sólidos de 50% (m/m), com o vapor a 12,5 bar utilizado para

aquecimento do reator. O ensaio foi realizado a 190 °C durante 10 min. A

composição química do licor resultante do processo hidrotérmico está

apresentada Tabela 03.

Tabela 03. Composição química do licor de pentoses (NAKASU, 2012).

Composto Concentração (g L-1

)

Xilose:

Monômeros 6,16

Oligômeros 17,72

Total 23,88 Glicose:

Monômeros 0,48

Oligômeros 3,54

Total 4,01

Arabinose 1,39

Ácido Fórmico 0,36

Ácido Acético 3,36

HMF 0,35

Furfural 0,63

Para a hidrolise do licor de pentoses utilizaram-se 7 cocktails de enzimas

diferentes, conforme apresentado na Tabela 04.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

27

Tabela 04. Enzimas utilizadas nos ensaios realizados.

Ensaio Enzima

A Controle (sem adição de enzima)

B Quimera (E. coli recombinante)

C Enzima C

E Enzima E (proveniente de Fungo)

F Enzima Bacillus (substrato 1)

G Enzima Bacillus (substrato 2)

H Quimera (E. coli recombinante – pH e temperatura ótimos)

Os ensaios apresentados na Tabela 04 foram realizados em erlenmeyers de

250 mL contendo 100 mL de licor, em shaker a 120 rpm, 50 ºC, pH 5,0 e 48 h. O

pH foi corrigido com NH4OH 10 %. Para cada ensaio se utilizou

0,4 mLenzima goligomeros-1

baseado em uma enzima comercial que possui 380 U/mL

de xilanase (152 FPU goligomeros-1

), conforme um protocolo gerado pelo CTBE. A

amostragem foi realizada para os intervalos de tempo 0, 24 e 48 h de hidrólise,

sendo que foi retirada uma amostra de cada frasco antes da adição de enzimas

considerada como branco. Vale ressaltar que o ensaio H foi realizado com o pH

6,5 e temperatura de 45 ºC, pH e temperatura ótimos para a enzima

multifuncional de E. coli recombinante.

3.6. FERMENTABILIDADE DO LICOR DE PENTOSES

HIDROLISADO

Para testar a fermentabilidade do licor de pentoses submetido a hidrólise

de oligômeros, realizou-se a fermentação com a levedura selvagem

Scheffersomyces stipitis NRRL Y7124 (anteriormente denominada Pichia

stipitis) capaz de metabolizar xilose. Para isto, o licor hidrolisado foi mantido em

geladeira a 4 °C durante dois dias após a hidrólise. Neste intervalo de tempo

realizaram-se o pré-inóculo e inóculo. O pré-inóculo foi realizado em meio YPD

(10 g L-1

de extrato de levedura; 20 g L-1

de peptona e 10 g L-1

de glicose). O

meio foi preparado em frascos erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL de

meio, pH 5,0, incubado em shaker, 24 h, 30 °C.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

28

O inóculo foi preparado em frasco erlenmeyer de 1000 mL contendo

250 mL de meio. Após o tempo de pré-inóculo, 10 % do volume final (25 ml)

foram transferidos para o inóculo o qual foi incubado em shaker por 24 h, a

200 rpm, 30 °C e pH inicial igual a 5,0. O meio utilizado para o inóculo está

apresentado na Tabela 5.

Tabela 05. Concentrações das soluções para a composição do inóculo utilizado para

fermentação por S. stipitis (Silva et al., 2012).

Nutriente Concentração (g L-1

)

Xilose P.A 30

Glicose P.A 5,0

Extrato de levedura 3,0

MgSO4.7H2O 1,0

Ureia 2,3

No momento da inoculação nos ensaios com licor hidrolisado se

acrescentou 2,3 g L-1

de ureia em cada frasco. Cada ensaio (A, B, C, D, E, F, G e

H) foi inoculado com 10% (10 mL) do inóculo e o pH inicial foi igual a 5,0. As

fermentações ocorreram em shaker a 200 rpm e 30 ºC durante 14 h.

Paralelamente, foi realizado um ensaio controle, contendo ureia e xilose e

submetido as mesmas condições de incubação que os demais ensaios.

3.7. DETERMINAÇÕES ANALITICAS

Todas as amostras (produção de hemicelulases, hidrólise enzimática e

fermentação) foram previamente centrifugadas a 13200 rpm (Eppendorf modelo

Centrifuge 5415 R) a 4 ºC por 10 min para posterior análises do sobrenadante

referente a atividade enzimática de xilanase, -xilosidase, xilose, glicose e etanol.

3.7.1. ATIVIDADE ENZIMÁTICA XILANASE

A atividade enzimática de xilanase foi determinada utilizando uma

solução aquosa de 0,5 % de xilana como substrato e tampão acetato 50 mM (pH

5,5). A reação ocorreu em placa de PCR de 96 poços contendo a mistura de

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

29

reação que consistiu em 50 µL de solução aquosa 0,5 % de xilana (Xilano

Beechwood Sigma), 20 µL de tampão de acetato e 30 µL de extrato de enzima.

Em seguida, a placa de PCR foi incubada a 50 °C em termociclador (Eppendorf

Mastercycler Gradient) durante 20 min, a reação foi parada imediatamente pela

adição de 100 µL de reagente de DNS. Em seguida, foi determinada a quantidade

de açúcares redutores libertados durante o período de incubação onde uma

unidade de atividade de xilanase foi determinada como 1 μmol de xilose

libertado por mL de enzima por minuto. A absorbância foi lida em

espectrofotômetro (TECAN, modelo Infinite M200) a 540 nm.

3.7.2. ATIVIDADE ENZIMÁTICA β-XILOSIDASE

A atividade enzimática de β-xilosidase foi determinada utilizando uma

solução aquosa de 25mM de PNP-X (p-nitrophenyl-beta-D-xyloside) como

substrato e tampão acetato 100 mM (pH 6,0). A reação ocorreu em placa de PCR

de 96 poços contendo a mistura de reação que consistiu em 10 µL de solução

aquosa de PNP-X, 70 µL de tampão de acetato e 20 µL de extrato de enzima. Em

seguida, a placa de PCR foi incubada a 50 °C termociclador durante 20 min, a

reação foi parada imediatamente pela adição de 100 µL de reagente de Na2CO3

1,0 M. Em seguida, foi determinada a quantidade de açúcares redutores

libertados durante o período de incubação onde uma unidade de atividade de b-

xilosidase foi determinada como 1 μmol de p-nitro-fenol libertado por mL de

enzima por minuto. A absorbância foi lida em espectrofotômetro a 400 nm.

3.7.3. QUANTIFICAÇÃO DE GLICOSE, XILOSE, ETANOL E XILITOL

Os açúcares (glicose e xilose), o produto (etanol) e subproduto (xilitol)

foram analisados em um cromatógrafo líquido HPLC, Waters 410, em uma

coluna cromatográfica Aminex HPX87H, de 300 mm x 7,8 mm (Bio-Rad Labs,

CA, USA). A temperatura da coluna foi de 50 ºC e detector 40 °C, a fase móvel

foi H2SO4 5 mM, a uma vazão de 0,5 mL min-1

.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

30

Tabela 06. Quadro resumo dos ensaios realizados.

Ensaio Estudos Microrganismos Enzimas Fonte de

Carbono Objetivos Análises

I 1 BH54, BH60, BH62,

BH47 - FT

Selecionar os dois melhores microrganismos

produtores de hemicelulases

Atividade enzimática xilanase

extracelular e -xilosidase extracelular

de todos os tempos.

II 1 BH54 e BH60 - FT

Testar a melhor agitação para produção de

hemicelulases e selecionar o melhor microrganismo

produtor de hemicelulases.

Atividade enzimática xilanase

extracelular (todos os tempos) e -

xilosidase intracelular (tempo final).

III 2 BH60 - FT, BH,

BEX+, BEX

Selecionar a melhor biomassa como fonte de

carbono a fim de produzir hemicelulases

Atividade enzimática xilanase

extracelular (todos os tempos).

IV - BH60 - FT e Bagaço

pré-tratado

Produzir coquetel enzimático para utilização em

hidrólise enzimática

Atividade enzimática xilanase do

coquetel final.

V - E. coli BL21 DE03 - -

Produzir enzimas multifuncionais em grande

quantidade através de biorreator de bancada para

utilização em hidrólise enzimática

Atividade enzimática xilanase após a

produção.

VI 3 -

QUIMERA

Enzima C

Enzimas E

BH60 – FT

BH60 – BH

Licor de

pentoses

Testar a eficiência das diferentes enzimas durante a

hidrólise enzimática do licor de pentoses

Quantificação de xilose em 0h, 24h e

48h.

VII 3 - QUIMERA Licor de

pentoses

Este ensaio ocorreu paralelamente ao ensaio VI

para comparar as condições ótimas de hidrólise

realizada pelas enzimas multifuncionais (quimera)

de E. coli BL21 DE03

Quantificação de xilose em 0h, 24h e

48h.

VIII 4 Scheffersomyces

stipitis NRRL Y-7124

QUIMERA

Enzima C

Enzimas E

BH60 – FT

BH60 – BH

Licor de

pentoses

Fermentação do licor de pentose hidrolisado pelas 7

diferentes enzimas

Quantificação de xilose, glicose,

etanol, xilitol e crescimento celular

(massa seca).

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

31

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. SELEÇÃO DE Bacillus sp. PRODUTOR DE HEMICELULASES.

Este primeiro estudo visou a seleção de microrganismos produtores de

hemicelulases dentre quatro linhagens de Bacillus sp. previamente isoladas pelo

grupo da PPB/CTBE. Esta primeira etapa ocorreu a partir de fermentação

submersa com meio contendo 2 % de farelo de trigo. As Figuras 5(a) e 5(b)

apresentam a produção de xilanases e β-xilosidases extracelular para os

diferentes Bacillus estudados, respectivamente.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 3,5 7 24 27,5 31 48

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca (

U/m

L)

Tempo (h)

BH 54

BH 60

BH 47

BH 62

(a)

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

32

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0 3,5 7 24 27,5 31 48

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca (

U/m

L)

Tempo (h)

BH 54

BH 60

BH 47

BH 62

(b)

Figura 05. Produção de hemicelulases por diferentes Bacillus sp. em farelo de trigo; atividade

de xilanase (a) e β-xilosidase (b).

Na Figura 05 (a) nota-se que o pico de produção de xilanases para o BH60

ocorreu em 3,5 h correspondendo a 0,557 U mL-1

. Vale ressaltar que, este foi o

microrganismo que apresentou o melhor resultado para a produção de xilanases

dentre as cepas testadas. Nesta mesma figura observa-se ainda que em 7 h de

cultivo houve o pico de produção para o BH54 (0,488 U mL-1

), e que não houve

uma variação significativa (análise de variância ANOVA e teste de médias

Tukey q<0,005) da atividade em relação a cepa BH60 em 7 h de cultivo. Porém

observa-se que a partir do tempo 24 h de cultivo houve a diminuição da atividade

para todos os Bacillus testados, fato que pode estar atribuído à produção de

proteases no meio.

Na Figura 05 (b) observa-se que o isolado que apresentou a maior

produção de β-xilosidase extracelular foi o BH47 (0,056 U mL-1

em 27,5 h).

Como se pode observar na Figura 5 (b) a diferença de atividade entre os isolados

é baixa, desta forma, para a escolha do microrganismo levou-se em consideração

a produção de xilanases.

Sendo assim, os isolados BH54 e BH60 foram selecionados para um teste

de influência de agitação na produção de hemicelulases, sendo que as agitações

estudadas foram 150 e 250 rpm.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

33

As Figuras 06 (a) e (b) apresentam a atividade enzimática para os Bacillus,

previamente selecionados por sua capacidade de produção de xilanases, em

diferentes condições de aeração do meio.

De acordo com as Figuras 06 (a) e (b), ambos os isolados testados (BH54

e BH60) apresentaram pico de produção de xilanase em 6 h. A diferença de

agitação não apresentou uma diferença marcante para a produção de xilanases

conforme se pode observar nos resultados apresentados nas Figuras 06 (a) e (b).

Os resultados deste ensaio mostram que o isolado BH54 produziu cerca de

0,422 U mL-1

e 0,427 U mL-1

e o isolado BH60 cerca de 0,655 U mL-1

e

0,776 U mL-1

para as agitações de 150 e 250 rpm, respectivamente.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 6 12 18 24 30 36 42,5

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca (

U/m

L)

Tempo (h)

150 rpm

250 rpm

(a)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 6 12 18 24 30 36 42,5

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca (

U/m

L)

Tempo (h)

150 rpm

250 rpm

(b)

Figura 06. Atividade de xilanases para os Bacillus BH54 (a) e BH60 (b) em farelo de trigo sob

diferentes condições de aeração: 150 e 250 rpm.

De acordo com a literatura, em estudos realizados por IRFAN et al.,

(2012), utilizando meio com 2 % de farelo de trigo e Bacillus subtilis, a ausência

de agitação favoreceu a produção de xilanase quando comparado a agitação de

140 rpm. De acordo com estes autores o pico de produção ocorre em 48 h para os

ensaios submetidos a agitação de 140 rpm e, para os ensaios sob ausência de

agitação o pico foi observado em 24 h.

Estudos apontam que durante a produção de enzimática por certos

microrganismos, pequenas quantidades de enzimas geram xilo-oligômeros que se

transportam para dentro de células onde são degradados por β-xilosidases e

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

34

xilanases intracelulares induzindo a síntese adicional de xilanases (FONTES et

al, 2000; SHULAMI et al, 1999; TEPLITSKY et al, 2000). Neste sentido,

quantificou-se a atividade enzimática de β-xilosidase extracelular (sobrenadante

do extrato bruto) e intracelular (pós-lise celular). A Figura 07 apresenta a

atividade de β-xilosidase intra e extracelular para os ensaios com BH54 e BH60

em diferentes a condições de agitação (a 150 e 250 rpm).

A partir das Figuras 07 (a) e (b) observa-se que a maior atividade

extracelular foi obtida por BH60 em 48 h de produção a 250 rpm com

0,0547 U mL-1

. Quanto a produção intracelular, verificou-se que o isolado BH54

a 150 rpm e o BH60, tanto em 150 rpm como em 250 rpm, não apresentaram

diferença estatística por variância ANOVA e teste de médias Tukey (q<0,005).

Desta forma, com os resultados obtidos, selecionou-se o Bacillus BH60

para os cultivos de seleção do substrato e produção de hemicelulases para

posterior hidrolise de xilo-oligômeros.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

150 rpm 250 rpm 150 rpm 250 rpm

SOBRENADANTE PÓS LISE CELULAR

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca (

U/m

L)

(a)

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

35

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

150 rpm 250 rpm 150 rpm 250 rpm

SOBRENADANTE PÓS LISE CELULAR

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca (

U/m

L)

(b)

Figura 07. Gráfico comparativo em relação à produção de β-xilosidase por BH54 (a) e BH60

(b) em farelo de trigo sob duas diferentes agitações.

A fim de se caracterizar as melhores condições de atuação da enzima

produzida pelo isolado BH60 em farelo de trigo, utilizaram-se amostras retiradas

no pico de produção (6 h) em uma escala de temperaturas que variou de 25 a

75 ºC e em tampão fosfato-citrato a uma faixa de pH entre 3,0 e 8,0 (Figuras 8

(a) e (b))

De acordo com as Figuras 08 (a) e (b) observa-se que a condição ótima

de pH foi de 6,5 e, em relação à temperatura, foi entre 55 e 60 ºC.

70

75

80

85

90

95

100

105

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

Ati

vid

ad

e R

ela

tiv

a (

%)

Temperatura ( C)

(a)

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5

Ati

vid

ad

e R

ela

tiv

a (

%)

pH

(b)

Figura 08. Curvas de Temperatura e pH em relação a atividade relativa (xilanase).

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

36

4.2. SELEÇÃO DA FONTE DE CARBONO PARA A PRODUÇÃO DE

HEMICELULASES POR Bacillus sp.

Após a seleção do isolado BH60 para a produção de hemicelulases,

prosseguiu-se com o estudo de seleção do substrato para a produção de xilanases.

Dentre as fontes estudadas estavam: BEX (bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

por explosão a vapor e não deslignificado), BH (bagaço de cana-de-açúcar pré-

tratado hidrotérmicamente com injeção de vapor) e BEX+ (bagaço de cana-de-

açúcar pré-tratado explosão a vapor e catalisado por peróxido de hidrogênio).

Paralelamente à produção enzimática utilizando-se estas frações, também se

realizou um cultivo em FT (farelo de trigo) como comparativo.

Figura 09. Cinética de produção de xilanase por Bacillus sp. BH60 em FT, BEX+, BEX e BH.

Nota-se na Figura 09 que a máxima atividade observada foi para o

substrato farelo de trigo (0,646 U mL-1

) no instante 6 h de cultivo. Dentre as

fontes de carbono provenientes de bagaço testadas observou-se que o bagaço

hidrotérmico (BH) apresentou os melhores resultados (0,103 U.mL-1

) em relação

as demais fontes testadas.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

37

Em estudo realizado por MAYRINK (2010) empregando-se fermentação

submersa por fungos Trichoderma, Aspergillus e Peniciillium, dentre diversos

substratos testados pelo autor, o bagaço de cana (não pré-tratado) e farelo de

trigo foram testados na proporção de (1 %), sendo que o meio com farelo de trigo

induziu atividade de xilanase superior ao bagaço não pré-tratado. Já ZÚÑIGA

(2010) indica que para uma maior produção de xilanases em FES (fermentação

em estado sólido) por Aspergillus niger é necessário suplementar o bagaço de

cana (não pré-tratado) com extrato de levedura e farelo de soja. Resultados

obtidos por GEETHA (2010) utilizando Bacillus pumilus em fermentação

submersa contendo farelo de trigo e bagaço de cana (não pré-tratado) na

proporção de 1% também apontam o farelo como um melhor produtor para

xilanases (84 U/mL) em relação ao bagaço não pré-tratado (25,33 U/mL).

LEQUART (1999) indicou que farelo de trigo consiste em açúcares solúveis

como glicose (42,5 % m/m), xilose (15,4 % m/m), arabinose (3,1 % m/m) e

galactose (2,7 % m/m), ao contrário das frações sólidas estudadas (BH, BEX e

BEX), que ainda não sofreram hidrólise para a liberação destes açúcares. Neste

sentido, as fontes de carbono selecionadas para a produção de hemicelulases

foram FT e BH.

4.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA FRAÇÃO LÍQUIDA (LICOR DE

PENTOSES), GERADA NO PRÉ-TRATAMENTO HIDROTÉRMICO DE

BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR.

Após a seleção do microrganismo e da fonte de carbono realizou-se a

produção do coquetel enzimático (Figura 10). Vale destacar que, os coquetéis

enzimáticos apresentados na Figura 10 foram preparados com retirada de frascos

nos picos de produção de xilanase em cada fonte de carbono (FT e BH), sendo de

6 h para FT e 30 h para BH, que teve seu conteúdo concentrado até atingir

volume aproximado de 5 mL. Já os frascos restantes foram retirados após 48 h de

produção, que teve seu conteúdo filtrado e centrifugado para a lise celular e

obtenção de β-xilosidase, que foi adicionado aos 5 mL concentrados, assim

gerando 15 mL de cada coquetel.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

38

Figura 10. Coquetel enzimático produzido por BH60 em FT e BH respectivamente.

Oito hidrólises foram realizadas, conforme apresentado no item 3.5 de

Material e Métodos. Todos os ensaios foram realizadas em shaker sob agitação

de 120 rpm com pH inicial igual a 5,0 e temperatura de 50 ºC, com exceção do

ensaio H que teve o pH inicial ajustado a 6,5 e ocorreu sob temperatura de 45 ºC,

sendo estas, as condições ideais de hidrólise de xilana Benchwood pelas enzimas

multifuncionais (quimera) produzidas pela E. coli BL21 DE03.

A Figura 11 apresenta a cinética de hidrólise de xilo-oligômeros presentes

em licor de pentoses para todas as enzimas testadas: A- controle, sem adição de

enzima; B – enzima multifuncional quimera (E. coli recombinante); C –

comercial ,;; E – enzima E, fungos; F – coquetel enzimático BH60 em FT; G –

coquetel enzimático BH60 em BH; e, H – enzima multifuncional quimera em pH

e temperatura ótimos (E. coli recombinante).

Nota-se na Figura 11 que o aumento da concentração de xilose e,

consequentemente, a hidrolise de xilo-oligômeros para o ensaio A não foi

observada, o que era de se esperar uma vez que não houve a adição de enzimas

neste ensaio. No entanto, para os ensaios B, C, E e H observou-se o aumento da

concentração de xilose no meio, com destaque para a enzima comercial CC

(xilose inicial = 5,26 g L-1

e xilose final = 13,35 g L-1

) e multifuncional de E. coli

recombinante nas melhores condições, H (xilose inicial = 4,8 g L-1

e xilose final

= 9,30 g L-1

).

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

39

Na Figura 11 observa-se ainda que os ensaios F e G apresentaram uma

diminuição da concentração de xilose no meio (xilose inicial = 5,35 g L-1

e xilose

final = 4,06 g L-1

, para o ensaio F e xilose inicial = 5,32 g L-1

e xilose final =

4,59 g L-1

, para o ensaio G), podendo estar relacionado a contaminação destes

ensaios pelos cocktails utilizados.

Figura 11. Cinética de conversão de xilo-oligômeros em xilose durante a hidrólise

enzimática do licor de pentoses proveniente do pré-tratamento hidrotérmico de bagaço de cana-

de-açúcar por diferentes enzimas: A – controle, sem adição de enzima; B – enzima

multifuncional quimera (E. coli recombinante); C – comercial C; E – enzima E, fungos; F –

coquetel enzimático BH60 em FT ; G – coquetel enzimático BH60 em BH; e, H - enzima

multifuncional quimera no pH e temperatura ótimos (E. coli recombinante).

A fim de melhor ilustrar a eficiência de cada enzima nos ensaios

realizados, a Figura 12 apresenta a porcentagem de conversão de xilo-oligômeros

em xilose para cada um dos ensaios. De acordo com a Figura 12 observa-se que a

enzima comercial C apresentou a maior porcentagem de conversão (45,69 %),

seguida pelas enzimas H (multifuncional E. coli, pH e temperatura ótimos –

25,43 %); enzima E (fungos - 17,44 %); e, enzima B (multifuncional E. coli –

16,44 %). SHEKIRO et al. (2012) relatou que a diluição da xilose remanescente

em pré-tratamento ácido de palha de milho para concentrações menores que

9,0 g L-1

melhorou a conversão de xilo-oligômeros e xilanas sólida a xilose em

mais de 10 vezes, chegando em rendimentos próximos de 45 %, utilizando a

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

40

enzima Cellic C Tec 2 (Novozymes), (XIAO et al., 2004). Na Figura 12 observa-

se ainda que as enzimas F e G (Bacillus em farelo de trigo e em bagaço

hidrotérmico, respectivamente) apresentaram conversão negativa.

1,71

16,44

45,69

17,44

-7,27 -4,14

25,43

-10

0

10

20

30

40

50

A B C E F G H

Co

nv

ers

ão

(%

)

Ensaios

Figura 12. Porcentagem de conversão de xilo-oligômeros em xilose durante a hidrólise

enzimática do licor de pentoses proveniente do pré-tratamento hidrotérmico de bagaço de cana-

de-açúcar por diferentes enzimas: A – controle, sem adição de enzima; B – enzima

multifuncional quimera (E. coli recombinante); C – comercial C E – enzima E, fungos; F –

coquetel enzimático BH60 em FT; G – coquetel enzimático BH60 em BH; e, H - enzima

multifuncional quimera no pH e temperatura ótimos (E. coli recombinante).

Visando investigar a conversão negativa ocorrida nos ensaios F e G

plaqueou-se (figura 13) uma alíquota de 100 µL do hidrolisado em meio LB e

incubou-se a 37 °C por 24 h. Após este tempo, observou-se o crescimento de

colônias, as quais foram submetidas à observação em microscópio. De acordo

com as Figuras 13 e 14 é possível observar a contaminação do meio por Bacillus.

Provavelmente esta contaminação tenha ocorrido em função da metodologia

aplicada para a concentração dos coquetéis de enzimas obtidos por Bacillus. Um

método de solucionar o problema poderia estar na adição de uma etapa de

filtração em membrana de diâmetro de poro igual a 0,22 µm. Desta forma um

estudo aprofundado do método de preparo do coquetel deverá ser realizado para

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

41

melhorar as condições de assepsia e garantir a lise total do microrganismo em

questão.

Figura 13. Placas contendo meio LB ágar apresentando crescimento de microrganismos do

sobrenadante dos ensaios F e G respectivamente, após a hidrólise enzimática.

Figura 14. Imagens de microscópio apresentando crescimento de microrganismos de

sobrenadante dos ensaios F e G respectivamente, após a hidrólise enzimática.

4.4. FERMENTABILIDADE DO LICOR HIDROLISADO

Após a hidrolise, os frascos contendo os licores hidrolisados foram

mantidos em refrigerador a 4 °C por 2 dias até a fermentação alcoólica a partir de

S. stipitis. A fermentação ocorreu em frascos erlenmeyer que apresentaram uma

razão de volume de frasco/volume de meio igual a 2,5, baseado nos resultados

obtidos por Silva et al., 2012, que demonstraram a importância do head space

para as fermentações realizadas com S. stipitis.

Por meio dos resultados obtidos em análise de HPLC para as amostras

coletadas durante a fermentação alcoólica, constatou-se que não ocorreu

fermentação alcoólica, uma vez que não houve produção de etanol e nem

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

42

consumo de xilose, com exceção do controle, que teve um pequeno crescimento

celular.

Hipóteses que podem ser adotadas para o ocorrido são a falta de nutrientes

no meio como o extrato de levedura ou peptona ou a formação de acetatos

durante a hidrólise e/ou fermentação. Segundo DELLWEG et al., (1984), a

adição do extrato de levedura ao meio de fermentação beneficia o crescimento

celular de P. tannophilus e P. stipitis. Neste sentido, faz-se necessário um estudo

de otimização do meio de cultura para tornar o licor de pentoses fermentável por

P. stipitis.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

43

5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

A linhagem de Bacillus sp. que apresentou um maior potencial em

produção de hemicelulases foi o isolado BH60;

As diferentes agitações (150 e 250 rpm) não apresentaram diferença

estatística entre si em relação a produção de xilanases;

O substrato selecionado dentre os diferentes bagaços de cana-de-açúcar

pré-tratados para a produção de hemicelulases a partir do isolado BH60

foi o BH (bagaço pré-tratado hidrotérmicamente com injeção de vapor);

Sugere-se que para uma maior porcentagem de conversão se efetue um

aumento na carga de enzima e no tempo de hidrólise, assim como

diferentes condições de hidrólise (agitação, pH e temperatura) utilizando

as enzimas testadas para avaliar a possibilidade de um aumento de

rendimento;

As enzimas multifuncionais produzidas pela E. coli BL21 DE03 em suas

condições ótimas de pH e temperatura apresentaram um potencial na

hidrólise de xilo-oligômeros presentes no licor de pentoses proveniente de

bagaço de cana pré-tratado hidrotérmicamente com injeção a vapor;

Melhores condições de assepsia no preparo dos coquetéis enzimáticos por

BH60 em FT e BH devem ser adotadas para que não ocorra contaminação

do licor de pentoses e consequentemente uma % de conversão negativa;

Devido à baixa produção de hemicelulases nos bagaços de cana-de-açúcar

pré-tratados, sugere-se a produção das mesmas em bagaço in natura ou até

mesmo no próprio licor de pentoses, uma vez que se constatou

contaminação pelo microrganismo utilizado e uma consequente

diminuição de xilose durante a hidrólise;

Estudos de suplementação do licor de pentoses devem ser efetuados para

que o mesmo se torne fermentescível por S. stipitis.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

44

6. REFERENCIAS

ADLAKHA, N.; RAJAGOPAL, R.; KUMAR, S.; REDDY, V. S.; YASDANI, S.

S. Synthesis and characterization of quimeric proteins based on cellulose and

xylanase from insect gut bacterium. Applied and environmental

microbiology, vol. 77, n. 14, p. 4859 - 4866. 2011.

AGBOGBO, F.K.; COWARD-KELLY, G. Cellulosic ethanol production using the

naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Journal

Biotechnology Letters, v. 30, n. 9, p. 1515-1524, 2008.

Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis – ANP.

Biocombustíveis, 2010. Disponível em: <http://www.anp.gov.br/?id=470>.

Acesso em: 09 fev. 2013.

ALONSO PIPPO, W.; LUENGO, C.A.; ALONSOAMADOR, L. M. A.;

GARZONE, P.; CORMACCHIA, G. Energy recovery from sugarcane-trash in

the light of 2nd generation biofuels. Part 1: current situation and

environmental aspects. Waste and Biomass Valorization, Volume 2, Issue 1,

p. 1 – 16. 2011.

ARRUDA, P. V. de. Avaliação do processo biotecnológico de obtenção de xilitol

em diferentes escalas a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de

cana-de-açúcar. Dissertação de mestrado (mestre). Universidade de São

Paulo: Escola de Engenharia de Lorena, Lorena, SP, 2011.

BANERJEE, G.; CAR, S.; LIU, T.; WILLIAMS, D.L.; MEZA, S.L.; WALTON,

J.D.; HODGE, D.B. Scale-up and integration of alkaline hydrogen peroxide

pretreatment, enzymatic hydrolysis, and ethanolic fermentation.

Biotechnology and Bioengineergin, v. 109, p. 922 – 931. 2012.

BEG, Q. K.; BHUSHAN, B.; KAPOOR, M.; HOONDAL, G.S. Enhanced

production of a thermostable xylanase from Streptomyces sp. QG-11-3 and its

application in biobleaching of eucalyptus kraft pulp. Enzyme and Microbial

Technology, v. 27, 459 – 466. 2000.

BINOD, P.; SINDHU, R.; SINGHANIA, R.R.; VIKRAM, S.; DEVI, L.;

NAGALAKSHMI, S.; KURIEN, N.; SUKUMARAN, R.K.; PANDEY, A.

Bioethanol production from rice straw: An overview. Bioresource

Technology, v. 101, n. 13, p. 4767 – 4774. 2010.

BORGES, E. R. Desenvolvimento de um processo biotecnológico para a produção

de ácido succínico por Actinobacillus succinogene. 2011. Dissertação de Tese

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

45

de Doutorado (doutor). Programa de Pós-graduação em Tecnologia de

Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química. Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Brasil.

BRAGATTO, J. Avaliação do potencial da casca de Eucalyptus spp. para a

produção de bioetanol. Dissertação de Tese de Doutorado (doutor).

Programa de Pós-graduação em Ciências, área de concentração: Fisiologia e

Bioquímica de Plantas da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”.

Universidade de São Paulo, SP, Brasil. 2010.

CARL, C. M. Hidrólise e fermentação do bagaço de cana-de-açúcar em escala de

bancada para a produção de etanol 2G. Dissertação de mestrado (mestre).

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal

de São Carlos. São Carlos, SP, 2011.

Centro de Gestão e Estudos Estratégicos – CGEE. Geração de energia elétrica a

partir de biomassa no Brasil: situação atual, oportunidades e desenvolvimento.

Disponível em: < http://www.cgee.org.br/arquivos/estudo003_02.pdf>.

Acesso em: 26 fev 2013.

CERQUEIRA LEITE, R. C. D.; VERDE LEAL, M.R.L.; BARBOSA CORTEZ,

L.A.; GRIFFIN, W.M.; GAYA SCANDIFFIO, M.I. Can Brazil replace 5% of

the 2025 gasoline world demand with ethanol? Energy, Volume 34, p. 655 –

661. 2009.

Companhia Nacional de Abastecimento – CONAB. Acompanhamento da Safra

Brasileira. Cana-de-Açúcar – Safra 2012/2013. Disponível em: <

http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/12_12_12_10_34_43_b

oletim_cana_portugues_12_2012.pdf> Acesso em: 10 fev. 2013.

COSTA, R. C.; SODRÉ, J. R. Hydrous ethanol vs. gasolineeethanol blend: engine

performance and emissions. Fuel, 89, p. 287 – 293. 2010.

COUGHLAN, M. P.; HZLEWOOD, G. P. Beta-1,4-D-xylan-degrading enzyme

systems: biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnology

and Applied Biochemistry, v. 17, p. 259-289, 1993.

DELLWEG, H.; RIZZI, M.; METHNER, H.; DEBUS, D. Xylose fermentation by

yeasts. Comparison of Pachysolen tannophilus and Pichia stipitis.

Biotechnology Letters, v. 6, p. 395 – 400. 1984.

DIAS, M. O. S.; ENSINAS, A. V.; NEBRA, S. A.; MACIEL FILHO, R.; ROSEL,

C. E. V.; MACIEL, M. R. W. Production of bioethanol and other bio-based

materials from sugarcane bagasse: integration to conventional bioethanol

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

46

production process. Chemical Engineering Research and Design. Volume

87, Issue 9, p. 1206 – 1216. 2009.

DOI, R. H.; KOSUGI, A. Cellulosomes: plant-cell-wall-degradingenzyme

complexes. Nat Rev Microbiol, v.2, p. 541 – 551. 2004.

DUARTE, M. C. T.; PELLEGRINO, A. C. A.; PORTUGAL, E. P.; PONEZI, A.

N.; FRANCO, T. T. Characterization of alkaline xylanases from Bacillus

pumilis. Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, p. 90 – 94. 2000.

EKLUND, R.; GALBE, M.; ZACCHI, G. Optimization of temperature and

enzyme concentration in the enzymatic saccharification of steam-pretreated

willow. Enzyme and Microbial Technology, v. 12, p. 225 – 228. 1990.

FAN, Z.; WAGSCHAL, K.; LEE, C. C.; KONG, Q.; SHEN, K. A.; MAITI, I. B.;

YUANG, L. The Construction and Characterization of Two Xylan-Degrading

Chimeric Enzymes. Wiley InterScience, p. 1 - 2. 2008.

FAN, Z.; WERKMAN, J. R.; YUANG, L. Engineering of a multifunctional

hemicellulase. Springer Science+Business Media B.V., p. 01. 2009.

FAN, Z.; WAGSCHAL, K.; CHEN, W.; MONTROSS, M. D.; LEE C. C.,

YUANG L. Multimeric hemicelullases facilitate biomass conversion. Applied

and Enviromental Microbiology, p. 1754 - 1757. 2009.

FAN, Z.; WAGSCHAL K.; LEE C. C.; KONG, Q.; SHEN, K. A.; MAITI I. B.;

YUAN, L. The construction and characterization of two xylan-degrading

chimeric enzyms.Vol 102, no 3, p. 684 - 692. 2009.

FENGEL, D.; WEGENER, G. Wood Chemistry, ultraestructure, reactions.

Berlim: Walter de Gruyter, 1989.

FERREIRA, A. D. Utilização da levedura Pichia stipitis UFMG-IMH 43.2 para a

obtenção de etanol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-

açúcar. Dissertação de mestrado (mestre). Universidade de São Paulo:

Escola de Engenharia de Lorena, Lorena, SP, 2010.

FONTES, C. M.; GILBERT, H. J.; HAZLEWOOD, G. P.; CLARKE, J. H.;

PRATES, J. A.; MCKIE, V. A.; NAGY, T.; FERNANDES, T. H.;

FERREIRA, L. M. A novel Cellvibrio mixtus family 10 xylanase that is both

intracellular and expressed under noninducing conditions. Microbiology, v.

146, p. 1959 – 1967. 2000.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

47

FULLER, G.; McKEON, T.A.; BILLS, D.D. Agricultural materials as

renewable resources: nonfoof and industrial applications. Washington:

American Chemical Society. ACS Symposium Series. p. 647. 1996.

GALBE, M.; SASSNER, P.; WINGREN, A.; ZACCHI, G. Process engineering

economics of bioetanol production. Advances in Biochemical Engineering

Biotechnology, v. 108, p. 303 – 327. 2007.

GESSESSE, A.; MAMO, G. High-level xylanase production by na alkaliphilic

Bacillus sp. By using solid-state fermentation. Enzyme and Microbial

Technology, v. 25, p. 68 – 72. 1999.

GEETHA, K.; GUNASEKARAM, P. Optimization of nutrient medium containing

agricultural waste for xilanase production by Bacillus pumilus B20.

Biotechnology and Bioprocess Engineering, v. 15, p. 882 – 889. 2010.

GHILDYAL, N. P.; RAMAKRISHNA, M.; LONSANE, B. K.; KARANTH, N. G.

Efficient and simple extraction of mouldy bran in a pulsed column extractor

for recovery of amyloglucosidase in concentrated form. Process Biocehm, v.

26, p. 235 – 241. 1991.

GUPTA, S.; KUHAD, R. C.; BHUSHAN, B.; HOONDAL, G.S. Improved

xylanase production from a haloalkalophilic Staphylococcus sp. SG-13 using

inexpensive agricultural residues. World Journal of Microbiology and

Biotechnology, v. 17, p. 5 – 8, 2001.

HECK, J. X.; SOARES, L. H. B.; HERTZ, P. F.; AYUB, M. A. Z. Purification

and properties of a xylanase produced by Bacillus circulans BL53 on solid-

state cultivation. Biochemical Engineering Journal, v. 32, p. 179 - 184.

2006.

IRFAN, M.; NADEEM, M.; SYED, Q.; BAIG, S. Effect of Medium Composition

on Xylanase Production by Bacillus subtilis using various agricultural wastes.

American-Euroasian J. Agric. & Environ. Sci., v. 12, p. 561 – 565. 2012.

JÄNIS, J.; PUKKINEM, P.; ROUVINEN, J.; VAINIOTALO, P. Determination of

steady-state kinetic parameters for a xylanase-catalyzed hydrolysis of neutral

underivatized xylooligosaccharides by mass spectrometry. Analytical

Biochemistry, v. 365, p. 165-173. 2007.

JEFFRIES, T.W. Utilization of xylose by bacteria, yeasts, and fungi. In:

PENTOSES and Lignin. Berlin: Springer, p. 1 – 32. 1983.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

48

KASANA, R. C.; SALWAN, R.; DHAR, H.; DUTT, S.; GULATI, A. A rapid and

easy method for the detection of microbial celulases on agar plates using

gram’s iodine. Curr Microbiol, v. 57, p. 503 – 507. 2008.

KIRKG, O.; BORCHERT, T. V.; FUGLSANG, C. C. Industrial enzyme

applications. Current Opinio Biotechnology, v. 13, n. 4, p. 345-351, 2002.

KUMAR, R. SINGH, S., SING, O. V. Bioconversion of lignocellulosic biomass:

biochemical and molecular perspectives. Journal of Industrial Microbiology

and Biotechnology, v. 35, p. 377 – 391. 2008.

LEMOS, J. L. S, 2001. Estudo da produção de xilanases por Aspergillus awamori

em bagaço de cana. Dissertação de Tese de Doutorado (doutor). Programa

de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químico e Bioquímicos da

Escola de Química. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil.

LEQUART, C.; NUZILLARD, J. M.; KUREK, B.; DEBEIRE, P. Hydrolysis of

wheat bran and straw by an endoxylanase: Production and structural

characterization of cinnamoyl-oligosaccharides. Carbohydr. Res., v. 319, p.

102 - 111. 1999.

MARAIS, S. Enzymatic hydrolysis with comercial enzymes of a xylan extracted

from hardwood pulp. Dissertação de Mestrado (mestre). Programa de Pós-

graduação em Engenharia Química do Departamento de Engenharia Química

da Faculty of Engineering, the Built Environment and Information Technology

of University of Pretoia, Pretoria, 2008.

MAYRINK, M. I. C. B. Produção de enzimas fúngicas e avaliação do potencial

das celulases na sacarificação da celulose. Dissertação de Tese de Doutorado

(doutor). Programa de Pós-graduação em Bioquímica Agrícola da

Universidade Federal de Viçosa. Universidade Federal de Viçosa, Viçosa,

MG, Brasil. 2010.

MENEZES, C. R.; DURRANT, L. R.. Xilooligossacarídeos: produção, aplicações

e efeitos na saúda humana. Ciência Rural, Santa Maria, v.38, n.2, p. 587 –

592, mar-abr, 2008.

MOSIER, N. et al. Features of promising Technologies for pretreatment of

lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, v. 96, p. 673 – 683. 2005.

MUSSATO, I.S. & ROBERTO, I.C, 2002. Produção biotecnológica de xilitol a

partir da palha de arroz. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. v. 28, p.

24-39. 2002.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

49

NAKASU, P. Y. S. Uso da água e recuperação de açúcares: estudo de caso para o

pré-tratamento hidrotérmico. Estágio realizado junto ao Grupo do

Bioetanol para o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do

Bioetanol, sob a orientação de Sarita Cândida Rabelo - desde maio de

2012. NATH, D.; RAO, M. pH dependent conformational and structural changes of

xylanase from an alkalophilic thermophilic Bacillus sp (NCIM 59). Enzyme

and Microbial Technology, v. 28, p. 397 – 403. 2001.

PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; NIGAM, P. E.; SOCCOL, V.T,. Biotechnological

potential of agro-industrial residues I: sugarcane bagasse. Bioresource

Technology, vol. 74, n. 1, p. 69-80. 2000.

PASHA, C.; KUHAD, R.C.; RAO, L.V. Strain improvement of thermotolerant

Saccharomyces cerevisiae VS3 strain for better utilization of lignocellulosic

substrates. Journal of Applied Microbiology v. 103, n. 5, p. 1480-1489,

2007.

PITARELO, A. P. Avaliação da susceptibilidade do bagaço e da palha de cana-de-

açúcar à bioconversão via pré-tratamento a vapor de hidrólise enzimática.

Dissertação de mestrado (mestre). Programa de Pós-graduação em Química

da Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil. 2007.

RABELO, S. C. Avaliação de desempenho do pré-tratamento com peróxido de

hidrogênio alcalino para a hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar.

Dissertação de mestrado (mestre). Programa de Pós-graduação em

Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas. Campinas, SP,

Brasil. 2007.

RABELO, S. C.; ROSSELL, C. E. V.; ROCHA, G.J.M.; ZACCHI, G..

Enhancement of the enzymatic digestibility of sugarcane bagasse by steam

pretreatment impregnated with hydrogen peroxide. Biotechnology Progress

v. 28, p. 1207-1217, 2012.

RABELO, S.C.; FONSECA, N.A.A.; MACIEL FILHO, R.; COSTA, A.C. Ethanol

production from enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated with

lime and alkaline hydrogen peroxide. Biomass and Bioenergy, v. 35, p. 2600

– 2607. 2011.

RIVERA, E.C.; RABELO, S.C.; DOS REIS GARCIA, D.; FILHO, R.M.; DA

COSTA, A.C. Enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse for bioethanol

production: determining optimal enzyme loading using neural networks.

Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 85, p. 983 – 992.

2010.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

50

RUIZ-ARRIBAS, A.; FERNANDEZ-ABALOS, J. M.; SANCHEZ, P.; GARDA,

A. L.; SANTAMARIA, R. I. Overproduction, Purification, and Biochemical

Characterization of a Xylanase (Xys1) from Streptomyces halstedii JM8.

Applied and Environmental Microbiology, v. 61, p. 2414 – 2419. 1995.

SAHA, B. D. Hemicellulose bioconversion. Journal of Industrial

Biotechnology, v. 30, p. 279 – 291. 2003

SILVA, J. P. A.; MUSSATO, S. I.; ROBERTO, I. C.; TEIXEIRA, J. A.

Fermentation medium and oxygen transfer conditions that maximize the

xylose conversion to ethanol by Picia stipites. Renewable Energi, v. 37, p.

259 – 265. 2012.

SCHIRMER, W. N.; GAUER, M. A. Os biocombustíveis no Brasil: panorama

atual, emissões gasosas e os métodos analíticos de monitoramento da

qualidade do ar referente a gases de natureza orgânica. Ambiência,

Guarapuava (PR), v.8 n.1 p. 157- 175 Jan./Abr. 2012.

EWANICK, S. M.; BURA, R.; SADDLER, J. N. Acid-catalyzed steam

pretreatment of lodgepole pine and subsequent enzymatic hydrolysis and

fermentation to ethanol. Biotechnology and bioengineering, v. 98, p. 737 0

746. 2007.

SHEKIRO, J.; KUHN, E. M.; SELIG, M. J.; NAGLE, N. J.; DECKER, S. R.;

ELANDER, R. T. Enzymatic Conversion of Xylan Residues from Dilute

Acid-Pretreated Corn Stover. Applied Biochemistry Biotechnology 168, p.

421 – 433. 2012.

SHULAMI, S.; GAT, O.; SONENSHEIN, A. L.; SHOHAM, Y. The glucuronic

acid utilization gene cluster from Bacillus stearothermophilus T-6. Journal of

Bacteriology, v. 181, p. 3695 – 3704. 1999.

SREENATH, H. K.; JEFFRIES, T. W. Production of ethanol from wood

hydrolyzate by yeasts. Bioresource Technology, v.72, n. 3, p. 253 – 260,

2000.

STICKLEN, M. B. Plant genetic engineering for biofuel production: towards

affordable cellulosic etanol. Nature Reviews Genetics, Londres, v. 9. p. 433 –

443, 2008.

TENGBORG, C.; STENBERG, K.; GALBE, M.; ZACCHI, G.; LARSSON, S.;

PALMQVIST, E.; HAHN-HÄGERDAL, B. Comparison of SO2 and H2SO4

impregnation of softwood prior to steam pretreatment on ethanol production.

Appl. Biochem. Biotechnol., p. 70–72. 1998.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

51

TEPLITSKY, A., SHULAMI, S., MORYLES, S., SHOHAM, Y. SHOHAM, G..

Crystallization and preliminary X-ray analysis of an intracellular xylanase

from Bacillus stearothermophilus T-6. Acta Crystallogr. D: Biol.

Crystallogr. 56 (Pt 2), 181–18, 2000.

U.S. DEPARTMENT. From Biomass to Cellulosic Ethanol: Genomics for

Alternative Fuels. Disponível em:

<http://genomicscience.energy.gov/biofuels/placemat.shtml>. Acesso em: 10

fev. 2013.

XIAO, Z.; ZHANG, X.; GREGG, D.; SADDLER, J. Effects of sugar inhibition on

cellulases and betaglucosidase during enzymatic hydrolysis of softwood

substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 113, p. 1115 –

1126. 2004.

XUE, Y.; PENG, J.; WANG, R.; SONG, X. Construction of the trifunctional

enzyme associating the Thermoanaerobacter ethanolicus xylosidase-

arabinosidase with the Thermomyces lanuginosus xylanase for degradation of

arabinoxylan. Enzyme and microbial technology, v. 45, p. 22 - 27. 2009.

XUE, Y.; SHAO, W. Expression and characterization of a thermostable β-

xylosidase from the hyperthermophile, Thermotoga maritma. Biotechnology

Letters, v. 26, n. 19, p. 1511 - 1515. 2004.

YANG, B.; BOUSSAID, A.; MANSFIELD, S. D.; GREGG, D. J.; SADDLER J.

N. Fast and efficient alkaline peroxide treatment to enhance the enzymatic

digestibility of steam-exploded softwood substrates. Biotechnol Bioeng, v. 77,

p. 678 – 684. 2002.

ZHANG, J.; VIIKARI, L. Xylo-oligosaccharides are competitive inhibitors of

cellobiohydrolase I from Thermoascus aurantiacus. Bioresource Technology

117, p.286 – 291. 2012.

ZÚÑIGA, U. F. R. Desenvolvimento de um bioprocesso para a produção de

celulases específicas na cadeia produtiva do etanol de segunda geração.

Dissertação de Tese de Doutorado (doutor). Programa de Pós-graduação em

Engenharia Ambiental da Escola de Engenharia de São Carlos. Universidade

de São Paulo, São Carlos SP, Brasil. 2010.

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 22º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

52

ANEXOS

Anexo 01. Pôster apresentado na 23ª Reunião Anual de Usuários do Laboratório Nacional de

Luz Síncroton (RAU).