homologia entre as enzimas catecol 1,2- dioxigenases
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HOMOLOGIA ENTRE AS ENZIMAS CATECOL 1,2-DIOXIGENASES PRESENTES EM ROTAS DE
DEGRADAÇÃO DE PESTICIDAS
Vanessa Monteiro Santana
Rio de Janeiro 2011
VANESSA MONTEIRO SANTANA Aluna do curso de Biotecnologia
Matrícula: 0713800344
HOMOLOGIA ENTRE AS CATECOL 1,2-DIOXIGENASES PRESENTES EM ROTAS DE DEGRADAÇÃO DE
PESTICIDAS
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC,
apresentado ao curso de graduação em
Biotecnologia, da UEZO como parte dos
requisitos para a obtenção do grau de
Tecnólogo em Biotecnologia, sob a orientação
da Profª Ida Carolina Neves Direito.
Rio de Janeiro
Dezembro 2011
S232 Santana, Vanessa Monteiro.
Homologia entre as enzimas catecol 1,2-
Dioxigenases presentes em rotas de degradação de
pesticidas / Vanessa Monteira Santana. — 2011.
49 f.; 30 cm.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação
Tecnológica em Biotecnologia) — Centro Universitário
Estadual da Zona oeste, Rio de Janeiro, 2012.
Bibliografia: f. 37-39.
1. pesticida. 2. biodegradação. 3.microorganismo.
4. genes. 5. catecol. 6. dioxigenases I. Título.
CDD 572.7
ii
HOMOLOGIA DE CATECOL 1,2-DIOXIGENASES PRESENTES EM ROTAS DE DEGRADAÇÃO DE PESTICIDAS
Elaborado por Vanessa Monteiro Santana Aluna do Curso de Biotecnologia da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau: 9 (nove)
Rio de Janeiro, 15 de dezembro de 2011.
Judith Liliana Solórzano Lemos (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos)
Vânia Lúcia Muniz de Pádua (Doutorado em Ciências Biológicas (Genética))
Ida Carolina Neves Direito (Doutorado em Biotecnologia Vegetal)
Rio de Janeiro, RJ – Brasil
iii
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, a Deus por ter me dado força para concluir este
trabalho.
À minha orientadora Ida Carolina Neves Direito, por todos os
conhecimentos adquiridos e também pelo apoio, paciência, compreensão...
Ao meu esposo Vitor, por todas as vezes que precisei, sempre estar à
disposição para me trazer, me buscar, cozinhar nos dias de prova, enfim, por todo
o apoio, carinho e compreensão.
À minha mãe e minhas irmãs, por sempre me dar uma palavra de apoio e
força nos momentos de fraqueza.
À Vanessa Frazão pelo companheirismo nos trabalhos em grupo, caronas,
passeios e também, por me dar força para não desistir.
Às minhas colegas do trabalho, Taiana, Elis, Marilene e Izabella por
sempre, que eu quis, pararem o que estavam fazendo e escutavam o meu treino
para apresentação do TCC.
E, mais uma vez, a Deus por me abençoar com o melhor presente do
mundo neste fim de curso, ano, enfim, de etapa na minha vida...
iv
Resumo Os pesticidas são substâncias que agem quimicamente com diferentes ingredientes ativos e estruturas, combatendo pragas, doenças e ervas daninhas. A aplicação inadequada pode afetar o ambiente contaminando o solo e as águas subterrâneas e outras fontes de água. Sabe-se que os pesticidas podem ser degradados em formas diferentes, mas, recentemente, a investigação tem sido focada na biodegradação. A biodegradação é um processo realizado principalmente por microorganismos que degradam em compostos orgânicos e inorgânicos. Processo de biodegradação pode ter como um intermediário comum a molécula catecol a qual pode degradar-se a partir da clivagem realizada por enzimas presentes nestes microorganismos: as catecol dioxigenases. O objetivo deste trabalho foi estudar a homologia entre as catecol dioxigenases de diferentes microrganismos. Para isso, foi realizada uma busca por seqüências dessas proteínas no banco de dados, alinhamento e construção de uma árvore evolutiva. Observou-se que as enzimas foram agrupadas de acordo com o seu substrato e também pelas suas subunidades. Com base nestes resultados, considera-se que há mais de dois genes que codificam para a mesma enzima em diversos microrganismos e que microrganismos podem ter mais do que um gene para codificar uma mesma enzima.
Palavras – chave: pesticida, biodegradação, microorganismo, genes, catecol
dioxigenases.
v
Abstract
Pesticides are substances that act chemically with different active ingredients and structures, battling pests, diseases and weeds. The improperly application of them can affect the environment contaminating the soil and the groundwater and other water sources. It is known that pesticides may be degraded in different ways, but recently, research has been focused on biodegradation. Biodegradation is a process performed mainly by microorganisms in which they degrade organic and inorganic compounds. Biodegradation process can have as a common intermediate the molecule catechol which can be degraded from the cleavage performed by enzymes present in these microorganisms: the catechol dioxygenases. The aim of this work was to study the homology between the catechol dioxygenases from different microorganisms. For this, we performed a search for sequences of these proteins in the database, alignment and construction of an evolutionary tree. It was observed that the enzymes were grouped according to their substrate and also by the enzyme subunits. Based on these results, we consider that there are genes that encode the same enzyme in various microorganisms and that there are microorganisms which have more than one gene encoding the same enzyme.
Keywords: pesticide, biodegradation, microorganisms, genes, catechol
dioxygenases.
vi
SUMÁRIO
1. Introdução.................................................................................................................. 1
1.1. Biodegradação................................................................................................... 6
1.2.Bioinformática..................................................................................................... 9
1.2.1. Bancos de dados........................................................................................ 9
1.2.2. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)..................................... 10
1.2.3. Alinhamento de sequências................................................................... 12
1.2.4. Árvore evolucionária ............................................................................... 13
1.3. Justificativa ...................................................................................................... 14
1.4. Objetivo ............................................................................................................. 14
1.4.1. Objetivos específicos ......................................................................... 15
2. Material e Métodos ............................................................................................. 16
2.1. Análises preliminares..................................................................................... 16
2.2. BLAST................................................................................................................ 16
2.3. Árvore evolucionária ...................................................................................... 17
3. Resultados e discussão........................................................................................ 18
3.1. Resultados preliminares................................................................................ 18
3.2. Homologia entre catecol 1,2-dioxigenases................................................ 24
4. Conclusões.............................................................................................................. 36
5. Referências Bibliográficas ................................................................................... 37
ANEXO I ........................................................................................................................ 40
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Estrutura química do 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) (ANVISA/SIA, 2004).................................................................................................1
Figura 1.2. Principais formas de dispersão de pesticidas no ambiente (RIBEIRO et al., 2010)..................................................................................................................3
Figura 1.3. Transformação de compostos aromáticos em catecol (WETLER, 2006)........................................................................................................................4
Figura 1.4. Clivagem extradiol proximal e distal, e intradiol do anel do catecol por dioxigenases (WETLER, 2006)................................................................................7
Figura 1.5. Rota de degradação do 2,4-D por Ralstonia eutropha JMP134 (DIREITO, 2009)......................................................................................................8
Figura 1.6. Página de resultados do BLAST..........................................................11
Figura 1.7. Alinhamento de sequências no programa MEGA 4.0..........................12
Figura 3.1.1. Árvore evolucionária das enzimas catecol 1,2-dioxigenases...........19
Figura 3.1.2. Apresentação da estrutura química dos substratos das enzimas dioxigenases..........................................................................................................20
Figura 3.1.3. Ramo em que o estudo foi detalhado devido as enzimas catecol 1,2-dioxigenases e clorocatecol 1,2-dioxigenases ficarem agrupadas em grande ramo.......................................................................................................................21
Figura 3.1.4. Árvores evolucionárias com as enzimas catecol 1,2-dioxigenases e clorocatecol 1,2-dioxigenases................................................................................23
Figura 3.2.1. Árvore evolucionária do primeiro segmento da árvore do anexo I..............................................................................................................................25
Figura 3.2.2. Árvore evolucionária do segundo segmento da árvore do anexo I..............................................................................................................................27
Figura 3.2.3. Árvore evolucionária do terceiro segmento da árvore do anexo I..............................................................................................................................29
Figura 3.2.4. Árvore evolucionária do quarto segmento da árvore do anexo I..............................................................................................................................31
Figura 3.2.5. Árvore evolucionária do quinto segmento da árvore do anexo I..............................................................................................................................32
Figura 3.2.6. Árvore evolucionária do sexto segmento da árvore do anexo I..............................................................................................................................33
Figura 3.2.7. Árvore evolucionária do sétimo segmento da árvore do anexo I..............................................................................................................................35
1
1. Introdução
A qualidade da produção agrícola é intensamente afetada pelo
aparecimento de pragas, doenças e ervas daninhas (COUTINHO et al., 2005;
DAMALAS et al., 2011). Na agricultura, os pesticidas são utilizados para proteger
as culturas contra esses organismos (BJORLING-POULSEN et al., 2008). Os
pesticidas são divididos em diferentes classes, dentre as quais podemos citar
herbicidas, fungicidas, acaricidas, larvicidas e inseticidas (DIREITO, 2005). De
acordo com dados da SINDAG (2011), as vendas de pesticidas atingiram a cifra
de R$ 12,706 bilhões entre janeiro e dezembro de 2008, com alta de 24% em
relação ao mesmo período de 2007 que foi de R$ 10,213 bilhões.
A toxidez do pesticida varia de acordo com o grupo químico em que se
enquadra (COUTINHO et al., 2005). Os pesticidas podem ser classificados de
acordo com a sua composição química em organoclorados, organofosforados,
carbamatos, piretróides, ditiocarbamatos, fentalamidas, dinitrofenóis,
pentaclorofenol, fenoxiacéticos e dipiridilos (GIL, 2010; RIBAS et al., 2009).
Dentre estes compostos, aproximadamente 70% dos pesticidas apresentam anéis
aromáticos em sua estrutura (DIREITO, 2005). Por exemplo, os herbicidas
clorofenoxi consistem de uma simples molécula de ácido carboxílico alifático
(BJORLING-POULSEN et al., 2008) (Figura 1.1). Devido à presença do anel
aromático, a degradação do pesticida pode ser dificultada (DIREITO, 2009).
Figura 1.1. Estrutura química do 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) (ANVISA/SIA, 2004).
2
O que devemos considerar é que o uso indiscriminado de pesticidas pode
acarretar danos para o ambiente e a saúde humana (COUTINHO et al., 2005).
Estes podem se dispersar na natureza através de diferentes processos como
lixiviação e volatilização, dentre outros (GEBLER, 2004) (Figura 1.2). Conforme
Bjorling-Poulsen et al. (2008), mais de 25% de frutas, verduras e cereais contêm
resíduos detectáveis de pesticidas. Além disso, outras fontes, tais como água
contaminada, poeira e pulverizações também contribuem para a exposição
humana a pesticidas (BJORLING-POULSEN et al., 2008). Foi publicado que 45%
das substâncias que causam neurotoxicidade são pesticidas (BJORLING-
POULSEN et al., 2008). Os principais sintomas de intoxicação envolvem dores
de cabeça, tremores, náuseas, câimbras abdominais, diarréias e suores
(COUTINHO et al., 2005; BJORLING-POULSEN et al., 2008).
A degradação pode acontecer por meio de processos físicos, químicos e
biológicos (GEBLER, 2004). Na degradação física pode ocorrer adsorção,
lixiviação e volatilização (RIBAS et al., 2009). Na adsorção ocorre a adesão das
moléculas do pesticida com as partículas do solo (ROMAN et al., 2007; RIBAS et
al., 2009). A volatilização do pesticida se dá pela sua mudança de estado físico, o
que o torna mais vulnerável à degradação (GEBLER, 2004). A lixiviação ocorre
devido à movimentação lateral e vertical do herbicida através do solo (RIBAS et
al., 2009).
A degradação química pode ocorrer por meio da fotólise, oxi-redução e
hidrólise (GEBLER, 2004). Na fotólise ou fotodecomposição as moléculas do
pesticida são degradadas pela ação da luz solar (ROMAN et al., 2007). A oxi-
redução é o processo que atua nas trocas químicas que o pesticida realiza com
os componentes do solo, principalmente com a matéria orgânica (GEBLER et al.,
2007). Na hidrólise ocorre a reação do pesticida com a água, onde uma ou mais
ligações são rompidas e os produtos da reação incorporam os elementos da
molécula de água (ROMAN et al., 2007). A hidrólise facilita a absorção e
transformação do produto pelos micro-organismos (GEBLER, 2004).
3
Figura 1.2. Principais formas de dispersão de pesticidas no ambiente (RIBEIRO et
al., 2010).
A degradação biológica, também conhecida como biodegradação, é um
processo realizado pelos micro-organismos, no qual eles degradam compostos
orgânicos e inorgânicos (CARVALHO, 2010). Os micro-organismos podem fazer a
degradação de pesticidas utilizando-os como única fonte de carbono (DIREITO,
2009). São exemplos de famílias de bactérias biodegradadoras de pesticidas:
Coccaceae, Mycobacteriaceae, Bacteriaceae, Pseudomonadaceae, Spirillaceae e
Bacillaceae. Fungos dos gêneros Aspergillus, Penicillium, Oospora e Neurospora,
dentre outros, também são relatados como biodegradadores de pesticidas
(DIREITO, 2005). Quando esta degradação é utilizada para a eliminação de
elementos contaminantes do ambiente, este processo chama-se biorremediação
(DIREITO, 2009).
O processo de biodegradação tem como intermediário comum o catecol
(Figura 1.3) (WETLER, 2006). A degradação do catecol é originada a partir da
clivagem realizada pelas enzimas presentes nestes micro-organismos: as catecol
dioxigenases (WETLER, 2006). As enzimas catecol dioxigenases estão presentes
na maioria das rotas de degradação de compostos aromáticos (SILVA et al.,
2011). Primeiramente, ocorre a inserção de um átomo de oxigênio no anel
4
formando um grupamento hidroxila pelas mono-oxigenases, originando o catecol
(WETLER, 2006; SILVA et al., 2011). Em seguida, as dioxigenases inserem dois
átomos de oxigênio ao catecol, o que resulta na ruptura deste anel (DIREITO,
2009; WETLER, 2006). As catecol dioxigenases se dividem em dois grandes
grupos: catecol 1,2-dioxigenases e catecol 2,3-dioxigenases (WETLER, 2006).
Figura 1.3. Transformação de compostos aromáticos em catecol (WETLER,
2006).
Em bancos de dados como o NCBI (National Center for Biotechonology
Information) e Swiss-prot verifica-se que as enzimas catecol 1,2-dioxigenases são
codificadas por diferentes genes presentes em vários organismos (NCBI, 2011;
Swiss-prot, 2011). A partir desta observação, foi levantado o questionamento
sobre a evolução destas enzimas nos diferentes organismos em que elas se
encontram. Para buscar a compreensão da distribuição destas enzimas, pode-se
recorrer a análises de homologia.
5
Homologia é a similaridade atribuída a descendentes de um ancestral
comum (MESQUITA, 2011). Dois genes são homólogos se eles descendem de
um mesmo ancestral (RUSSO, 2011). Os genes podem ser classificados em
ortólogos e parálogos (CRUZ-COKE, 2001; SÓLIS-CALERO, 2008). Os genes
ortólogos descendem de um ancestral comum das espécies e, portanto, exercem
a mesma função em organismos diferentes (SÓLIS-CALERO, 2008). Ainda
conforme este autor, genes parálogos são aqueles que aparecem em uma ou
mais cópias em um organismo por um processo de duplicação.
O mecanismo evolutivo da duplicação gênica, que está associado a
mutações, permite certas divergências ao longo do tempo e, consequentemente,
à formação de famílias de proteínas correlacionadas, que apresentam algumas
diferenças com relação às suas sequências de aminoácidos, mas conservam alto
grau de similaridade estrutural (SILVA, 2007 apud DIREITO, 2009). As proteínas
que evoluem a partir de um ancestral comum são conhecidas como homólogas
(SANTOS FILHO, 2002). De acordo com Silva (2007), duas sequências
homólogas podem ser praticamente idênticas, similares em vários aspectos ou
até muito diferentes devido a várias mutações. Uma das maneiras mais eficientes
para se realizar uma busca de proteínas homólogas é através de similaridade
sequencial, lançando-se mão de técnicas de bioinformática (SILVA, 2007). Uma
vez que genes codificam proteínas que podem ser evolutivamente conservadas
(CRUZ-COKE, 2001), é possível realizar análises de homologia pela análise de
sequências de aminoácidos.
Na análise de homologia, podemos observar a nomenclatura de genes e
proteínas. Os problemas mais freqüentes relacionados à nomenclatura de genes
em trabalhos científicos são autores que se referem ao mesmo gene usando
nomes diferentes e autores que não deixam claro se estão se referindo ao gene
ou à proteína (SPLENDORE, 2005). Ainda de acordo com SPLENDORE, a
existência de problemas na nomenclatura de genes foi percebida já na década de
1960, quando ainda existiam poucos genes humanos identificados, e as primeiras
normas de nomenclatura foram apresentadas em 1979.
6
A seguir, serão introduzidas algumas informações adicionais, relacionadas
à biodegradação e bioinformática necessárias para o melhor entendimento deste
estudo.
1.1. Biodegradação
Biodegradação é a transformação de compostos orgânicos pela atividade
metabólica dos organismos (MORAIS, 2005). Um exemplo destes organismos são
as plantas, mas poucas espécies realizam biodegradação, sendo mais comum a
bioacumulação (LASAT, 2000; SINGER et al., 2003). Os micro-organismos são os
principais seres vivos a realizarem a biodegradação.
Micro-organismos degradam compostos orgânicos e inorgânicos por meio
da biodegradação (DIREITO, 2009). Através da biodegradação, os pesticidas
podem ser eliminados da natureza, já que os micro-organismos podem utilizá-los
como fonte de carbono (FLORES, 2010). Para que a biodegradação aconteça, os
micro-organismos utilizam um “maquinário enzimático” (DIREITO, 2009). Em
geral, as vias metabólicas de degradação microbiana consistem em uma série de
reações que originam uma molécula intermediária comum: o catecol (WETLER,
2006; SILVA, 2007). O catecol é formado a partir da introdução de um átomo de
oxigênio no anel aromático pelas enzimas mono-oxigenases (AVANZI et al., 2009;
DIREITO, 2009). As catecol dioxigenases inserem dois átomos de oxigênio ao
catecol, realizando a cisão do anel aromático (SILVA, 2007). A quebra do anel
pode ocorrer entre os grupos hidroxila (clivagem intradiol ou orto) ou adjacente a
um dos grupos hidroxila (clivagem extradiol ou meta) (WETLER, 2006; SILVA,
2011; CUNHA 2008) (Figura 1.4). As enzimas catecol 1,2 dioxigenases fazem a
orto-clivagem do catecol, enquanto as enzimas catecol 2,3 dioxigenases atuam na
meta-clivagem do catecol (CUNHA, 2008).
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Figura 1.4. Clivagem extradiol proximal e distal, e intradiol do anel do catecol por
dioxigenases (WETLER, 2006).
As catecol dioxigenases fazem parte do grupo de enzimas que catalizam
as rotas de degradação em micro-organismos (DIREITO, 2009), resultando na
eliminação do pesticida do meio ambiente (FLORES, 2010). Um modelo de
estudo em que a rota de degradação do herbicida 2,4-D foi totalmente elucidada é
a de Ralstonia eutropha JMP134 (HOFFMANN et al., 2003). Nesta rota, há várias
enzimas que são codificadas por diversos genes (Figura 1.5). Dentre eles,
podemos destacar o gene tfdC, que codifica a enzima clorocatecol 1,2-
dioxigenase. Em bancos de dados como o NCBI e Swiss-Prot, observa-se que as
enzimas catecol dioxigenases são codificadas por diferentes genes em diferentes
micro- organismos. A partir desta observação, foi levantado o questionamento
sobre a evolução dessas enzimas nos diferentes organismos em que elas se
encontram. Para buscar a compreensão da distribuição destas enzimas, pode-se
recorrer a análises de homologia. Essas análises são realizadas utilizando-se
ferramentas de bioinformática.
8
Figura 1.5. Rota de degradação do 2,4-D por Ralstonia eutropha JMP134
(DIREITO, 2009).
9
1.2.Bioinformática
Bioinformática é uma ciência multidisciplinar, que envolve a união de
diversas linhas de conhecimento – a engenharia de softwares, a matemática, a
estatística, a ciência da computação e a biologia molecular (PROSDOCIMI, 2011).
Ela é a aplicação de ciência da computação à resolução de problemas da área
biológica (FORMIGHIERI, 2011). Formighieri (2011) diz que a bioinformática
suporta e potencializa muitas das tecnologias mais modernas na fronteira do
conhecimento, como sequenciamento e fenotipagem de alta quantidade de
dados. Outros exemplos do uso da bioinformática incluem os alinhamentos de
sequências (tanto de nucleotídeos quanto de aminoácidos), inferência
filogenética, buscas por similaridade de sequências em bancos de dados e a
classificação e predição de estruturas tridimensionais de proteínas (VIANEZ JR,
2007).
Para análises de homologia podemos utilizar as seguintes ferramentas da
bioinformática: busca em bancos de dados, alinhamento de sequências, BLAST e
construção de árvores evolucionárias.
1.2.1. Bancos de dados
Tem importância na bioinformática, devido à grande quantidade de
informações de sequências de nucleotídeos e aminoácidos que são produzidas
atualmente (PROSDOCIMI, 2011). Devido à magnitude do conjunto de dados
produzidos torna-se fundamental a organização desses dados em bancos que
permitam acesso on-line (VIANEZ JR, 2007). Os principais bancos de dados são
o NCBI (National Center for Biotechnology Information), GenBank, PDB (Protein
Data Bank) e Swiss-Prot. O NCBI foi criado para armazenagem e análise do
conhecimento sobre biologia molecular, bioquímica e genética (NCBI, 2004). Mais
especificamente, segundo o mesmo autor, o NCBI criou sistemas automatizados
para armazenar e analisar o conhecimento sobre a biologia molecular, bioquímica
e genética, facilitando o uso desses bancos de dados e softwares. O GenBank foi
criado e distribuído pelo NCBI (NCBI, 2004). É um completo banco de dados que
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contém sequências de nucleotídeos, disponíveis ao público, de mais 380.000
organismos (NCBI, 2004). Estas sequências são conseguidas principalmente de
submissões de laboratórios individuais ou em lotes, de projetos de
sequenciamento de larga escala, incluindo projeto genoma e amostras de projetos
ambientais (BENSON et al., 2010). O PDB (Banco de Dados de Proteína) é o
único repositório mundial de informações sobre as estruturas 3D de grandes
moléculas biológicas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos (PDB, 2011). O
Swiss-Prot é um banco de dados onde as informações sobre sequências de
proteínas foram anotadas e associadas a informações sobre função, domínios
funcionais, proteínas homólogas e outros (PROSDOCIMI, 2011).
1.2.2. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
Busca sequências homólogas em bancos de dados de proteínas e ácidos
nucléicos (PROSDOCIMI, 2011). Utilizado para encontrar similaridades entre
sequências de nucleotídeos e proteínas contra bancos de dados com grande
número de seqüências dos mais diversos organismos (PROSDOCIMI, 2011). É
um dos principais programas utilizados na identificação dos genes
(PROSDOCIMI, 2011).
No BLAST, estão disponíveis várias sequências referências de diferentes
tipos de genomas para pesquisa, como por exemplo de humano, rato, Arabidopsis
thaliana, Drosophila melanogaster e micro-organismos. O programa BLAST
possui os recursos blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx, que realizam a busca
em bancos de dados específicos de proteínas ou nucleotídeos. O blastp realiza a
busca em bancos de dados de proteínas utilizando sequências de aminoácidos na
consulta (BLAST, 2011). Blastn busca sequências de nucleotídeos em bancos de
dados de nucleotídeos (BLAST, 2011). Blastx realiza busca em bancos de dados
de proteínas utilizando sequências de nucleotídeos traduzidos na consulta
(BLAST, 2011). O tblastn busca nucleotídeos traduzidos utilizando sequências de
proteínas na consulta (BLAST, 2011). O tblastx busca nucleotídeos traduzidos
utilizando sequências de nucleotídeos traduzidos na consulta (BLAST, 2011).
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Como resultado, o BLAST mostra um quadro com os hits encontrados e os
alinhamentos realizados (Figura 1.6). Observa-se os parâmetros max scores de
alinhamento, que indicam a pontuação do alinhamento, query coverage, que
indica a porcentagem de cobertura da sequência pela sequência-molde e o valor
esperado (e-value), que representa a probabilidade desse evento ocorrer ao
acaso (VERLI, 2011; LBSBM, 2011). Quanto menor o valor do e-value, melhor o
resultado (LBSBM, 2011).
Figura 1.6. Página de resultados do BLAST.
12
1.2.3. Alinhamento de sequências
É usado para descobertas funcionais, estruturais e nos oferece informações
de sequências biológicas evolutivas. É um método que compara duas ou mais
sequências (alinhamento múltiplo) determinando o grau de similaridade entre elas
(PROSDOCIMI, 2011; VIANEZ JR, 2007) (Figura 1.7). No alinhamento múltiplo
procura-se uma série de caracteres individuais ou padrões de caracteres que
estão na mesma ordem nas seqüências (VIANEZ JR, 2007). Segundo este autor,
é uma matriz de dados onde as colunas representam caracteres homólogos. Com
esta técnica é possível identificar regiões conservadas na estrutura primária de
proteínas (VIANEZ JR, 2007). Um dos programas utilizados para alinhamento é o
CLUSTAL, que é um software que realiza alinhamentos múltiplos. Ele pode estar
disponível como software em versão individual ou inserido em programas como o
BLAST e MEGA 4.0.
No alinhamento há introdução de espaços (gaps), entre os monômeros de
uma ou mais sequências afim de se obter o melhor alinhamento possível (PINTO,
2011). Os gaps representam os eventos evolutivos de inserção ou deleção -
indels (VIANEZ JR, 2007), que dificultariam o alinhamento.
Figura 1.7. Alinhamento de sequências no programa MEGA 4.0.
13
1.2.4. Árvore evolucionária
Uma vez selecionadas as sequências homólogas dos organismos de
interesse e realizado o alinhamento destas, pode ser construída a árvore
evolucionária, que mostra graficamente como as sequências estão relacionadas
entre si (PROSDOCIMI, 2011). Para esse mesmo autor, essas árvores são
usadas para marcar as mudanças de aminoácidos que ocorrem durante a
evolução dos genes. É possível inferir que aminoácidos tenham sido derivados de
um gene ancestral em comum durante a evolução empregando esta ferramenta
de análise (PROSDOCIMI, 2011).
Os parâmetros observados para se construir a árvore evolucionária são
Teste Bootstrap de filogenia e Neighbor-joining (melhor vizinho). Bootstrap é um
método de construção de árvore onde ocorrem testes estatísticos para medir o
grau de suporte dos nós nas árvores filogenéticas pelo alinhamento das
seqüências (MELO JORGE, 2011). De acordo com MELO JORGE, 2011, o valor
de bootstrap representa o número de vezes que o agrupamento ocorreu nas
replicações. O método Neighbor-joining é baseado no princípio de evolução
mínima e identifica os vizinhos que sequencialmente minimizam o tamanho total
da árvore. É um dos algoritmos mais usados, eficiente e rápido (MELO JORGE,
2011).
Muitas enzimas já foram identificadas no genoma de bactérias com
capacidade de degradação de xenobióticos, dentre elas, fenol-monooxigenases e
catecol-dioxigenases (AVANZI et al., 2009). Há na literatura estudos que relatam
homologia entre organismos que degradam compostos aromáticos. Um exemplo
disso é o estudo realizado por AVANZI et al., 2009 onde sequências obtidas de
micro-organismos presentes em ambientes contaminados por fenóis foram
comparadas com outras sequências em bancos de dados como BLAST e
GenBank e apresentaram 95% de homologia com Pseudomonas aeruginosa.
Conforme este autor, diversas bactérias têm sido identificadas com ampla
capacidade de degradação de compostos aromáticos. Estas adquirem
rapidamente a capacidade de degradar compostos xenobióticos quando expostas
a estes compostos e na ausência de nutrientes mais facilmente degradáveis
14
(AVANZI et al., 2009). Por isso, encontram-se frequentemente envolvidas em
diversos processos de biorremediação (AVANZI et al., 2009).
1.3. Justificativa
O meio ambiente está cada vez mais contaminado por compostos de difícil
degradação, como os pesticidas. A partir daí, pensa-se em estudar uma forma de
melhorar estas condições. Uma delas é a Biorremediação, onde micro-
organismos utilizam os compostos contaminantes como alimento e, assim,
deixam o ambiente livre de contaminação. Esses micro-organismos apresentam
enzimas que fazem este serviço de “limpeza” do ambiente contaminado. Essas
enzimas estão presentes em diferentes gêneros e famílias de micro-organismos
que se encontram no solo. Para realizar a Biorremediação, é necessário o
conhecimento das espécies degradadoras presentes no solo, ou pelo menos,
requer o conhecimento da estrutura primária das enzimas encontradas nestes
micro-organismos. Para começar este estudo, é necessário uma busca das
sequências de aminoácidos dessas enzimas e verificar quais genes as codificam.
Fazendo isso, observa-se a variedade de genes e enzimas em diferentes micro-
organismos. Estudar a homologia entre essas enzimas pode facilitar o
entendimento da distribuição destas e também questionar a nomenclatura desses
genes, já que se as sequências são homólogas, por que são codificadas por
genes diferentes? Responder a esta e outras questões facilitariam o estudo de
muitos pesquisadores na área, pois poderá reduzir a variedade de informações
diferentes que, ao se obter resultados positivos de homologia, poderemos agrupá-
las e torná-las unificadas. E, mais adiante, podemos monitorar a degradação de
pesticidas por micro-organismos para, dessa forma, promovermos a
Biorremediação.
1.4. Objetivo
Estudar a homologia entre as catecol 1,2-dioxigenases presentes em rotas
de degradação de pesticidas em micro-organismos.
15
1.4.1. Objetivos específicos
• Selecionar sequências de aminoácidos de catecol 1,2-dioxigenases de micro-
organismos em bancos de dados.
• Alinhar as sequências de aminoácidos obtidas.
• Construir árvore evolucionária das catecol-dioxigenases.
16
2. Material e Métodos
2.1. Análises preliminares
As seqüências de aminoácidos das enzimas catecol 1,2 - dioxigenases
foram selecionadas no banco de dados Swiss–Prot (Disponível em:
<http://www.ebi.ac.uk/uniprot/>). Estas sequências foram alinhadas utilizando-se o
software ClustalX, empregando alinhamentos múltiplos. As análises
evolucionárias foram realizadas utilizando-se o software MEGA 4.0 (Tamura et al.,
2007). A história evolutiva foi inferida utilizando o método Neighbor-Joining
(Saitou & Nei, 1987). Foi realizado o teste de bootstrap (Felsenstein, 1985) 1000
vezes, e as distâncias evolutivas foram computadas utilizando a distância P do
software MEGA 4.0. Todas as posições contendo indels foram eliminadas do
conjunto de dados (opção complete deletion do software MEGA 4.0).
2.2. BLAST
Foi utilizado o parâmetro BLASTRefSeq, onde foram testadas 1776
sequencias referências de genomas de micro-organismos das famílias
Crenarchaeota, Desulfurococcales, Sulfolobales, Thermoproteales,
Archaeoglobales, Halobacteriales, Methanobacteriales, Methanococcales,
Methanomicrobiales, Methanopyrales, Methanosarcinales, Thermococcales,
Thermoplasmales, Nanoarchaeota, Actinobacteria, Bacteroidetes/Chlorobi,
Chlamydiae, Cyanobacteria; Bacillales, Clostridia, Lactobacillales; Mollicutes;
Rhizobiaceae, Burkholderiaceae, Neisseriaceae, Pseudomonadaceae,
Xanthomonadaceae com a sequência de nucleotídeos de Ralstonia eutropha
JMP134 para a enzima catecol 1,2-dioxigenase. Foi utilizada a ferramenta blastx.
Foi realizado download das sequências de aminoácidos para posterior
criação da árvore evolucionária dos micro-organismos que apresentaram query
coverage igual e maior que 80%.
17
2.3. Árvore evolucionária
Análises moleculares evolucionárias foram conduzidas utilizando o
software MEGA versão 4 (TAMURA et al., 2007). A árvore evolucionária foi
construída com 267 sequências de aminoácidos dos micro-organismos que
apresentaram query coverage igual e maior que 80%. Foi construída uma árvore
evolucionária com distância P e Neighbour-joining baseada no alinhamento de
aminoácidos. Foi realizado bootstrap baseado em 1000 amostragens de dados.
18
3. Resultados e discussão
3.1. Resultados preliminares
Com base na metodologia utilizada, foi construída a árvore evolucionária
das catecol 1,2 - dioxigenases (Figura 3.1.1). Observamos que as enzimas
clorocatecol 1,2 - dioxigenases estão agrupadas em um mesmo ramo (Figura
3.1.1), sendo codificadas pelos genes clcA, tcbC e tfdC. Os genes tfdC
permanecem juntos no ramo, embora presentes em duas espécies diferentes
(Burkholderia cepacia e Ralstonia eutropha). Neste ramo, os genes clcA estão
distantes evolutivamente. Em outro ramo, estão agrupadas as enzimas catecol
1,2 - dioxigenases codificadas pelos genes catA, hqd2 e pheB (Figura 3.1.1).
Também está presente neste ramo a enzima hidroxiquinol 1,2 - dioxigenase
codificada pelo gene chqB em Candida albicans. Note que no mesmo grupo dos
genes catA está presente o gene pheB, mas ambos codificam para catecol 1,2 -
dioxigenase. Observe a presença do gene catA em Rhodococcus opacus no ramo
das enzimas clorocatecol 1,2 - dioxigenases. Os demais genes catA estão juntos
em um mesmo ramo e são oriundos de micro-organismos do gênero
Acinetobacter. As clorocatecol 1,2 - dioxigenases e as catecol 1,2 - dioxigenases
ficaram agrupadas em um ramo maior. As enzimas 2,3 dihidroxifenilpropionato /
2,3 ácido dihidroxicinâmico 1,2 – dioxigenase estão agrupadas em função do
gene mhpB em um ramo distinto (Figura 3.1.1). Esse gene está presente em
Escherichia coli, Ralstonia eutropha e Rhodococcus sp.. Os genes bphC e linE
ficaram afastados dos demais e codificam as enzimas 2,3 – dihidroxibifenil 1,2 –
dioxigenase manganês dependente e clorohidroquinona 1,2 – dioxigenase,
respectivamente.
Os resultados obtidos sugerem uma proximidade entre catecol 1,2-
dioxigenases e clorocatecol 1,2-dioxigenases, embora estas enzimas utilizem
substratos diferentes. Uma possível explicação para isto é que, embora estas
enzimas utilizem substratos diferentes, todas são agrupadas no banco de dados
NCBI como catecol 1,2-dioxigenases pela sua função.
19
Figura 3.1.1. Árvore evolucionária das enzimas catecol 1,2-dioxigenases. Ramos apresentam o nome do gene que codifica a enzima seguido pela espécie microbiana na qual este foi estudado e, entre barras verticais, o código da sequência de aminoácidos no Genebank. Os símbolos indicam as enzimas codificadas: ■, clorocatecol 1,2 – dioxigenase; ▲, catecol 1,2 – dioxigenase; ♦, hidroxiquinol 1,2 – dioxigenase; ●, 2,3 – dihidroxifenilpropionato – ácido 2,3 – dihidroxinâmico 1,2 – dioxigenase; □, 2,3 – dihidroxibifenil 1,2 – dioxigenase manganês dependente; ○, clorohidroquinona/hidroquinona 1,2 – dioxigenase. Árvore evolucionária com distância P e neighbour-joining baseada no alinhamento de aproximadamente 214 aminoácidos. A escala de distância indica 0,2 substituições por sítio, números situados nas ramificações da árvore indicam porcentagem de recuperação de bootstrap baseado em 1000 amostragens de dados.
As similaridades não são apenas entre os genes. Conforme apontado por
Kim et al. (1999) e Moon et al. (1996), é possível encontrar até 94% de
similaridade entre as seqüências de aminoácidos que codificam catecol 2,3-
dioxigenase. É provável que essa situação também exista para catecol 1,2-
dioxigenases. Nesse contexto, um gene pode codificar a mesma enzima em
micro-organismos diferentes, como observado pela presença do gene tfdC em
Burkholderia cepacea e Ralstonia eutropha. Ou diferentes genes codificam uma
mesma enzima, como observado pela presença de clcA e tcbC em
Pseudomonas. Carrington et al. (1994) sugeriram que a nomenclatura a ser
utilizada em bph fosse a mesma de xyl em função destes genes apresentarem as
mesmas funções. Talvez esse aspecto deva ser considerado para buscar uma
20
maior clareza quanto às relações de homologia entre enzimas.
Outro aspecto a ser colocado é a possibilidade da existência de mais de
um cluster para estes genes, como observado para o gene catA em Acinetobacter
lwoffii K24 (Kim et al., 1999). Nesse exemplo, um deles é uma adaptação do seu
antecessor (Kim et al., 1999). Pudemos observar que realmente uma das
sequências se afasta evolutivamente das demais sequências de catA no gênero
Acinetobacter.
A análise da árvore evolucionária sugere que as enzimas ficaram mais
próximas, ou seja, são mais homólogas, quanto mais semelhantes as estruturas
moleculares de seus substratos (Figura 3.1.2). As catecol 1,2-dioxigenases
ficaram agrupadas com as clorocatecol 1,2-dioxigenases e a hidroxiquinol 1,2-
dioxigenase que apresentam substratos com pequenas diferenças estruturais. As
demais enzimas ficaram em ramos distintos, provavelmente em função da maior
complexidade de seus substratos.
Figura 3.1.2. Apresentação da estrutura química dos substratos das enzimas
dioxigenases.
Em sequência, foi realizado um estudo para detalhar o resultado
apresentado anteriormente. Mais especificamente, para verificar a presença do
gene catA que codifica catecol 1,2-dioxigenases em Rhodococcus opacus entre o
ramo dos genes que codificam as enzimas clorocatecol 1,2-dioxigenases. Neste
caso, somente foram utilizadas as sequências das enzimas catecol 1,2-
dioxigenases e clorocatecol 1,2-dioxigenases devido a estas ficarem agrupadas
em um ramo maior (Figura 3.1.3).
Substrato / Enzima Substrato / Enzima
21
.
Figura 3.1.3. Ramo em que o estudo foi detalhado devido as enzimas catecol 1,2-dioxigenases e clorocatecol 1,2-dioxigenases ficarem agrupadas em grande ramo.
Foram realizadas duas árvores: uma com e outra sem o gene catA de
Rhodococcus opacus (Figura 3.1.4). Como resultado, foi observado na árvore
sem o gene catA de Rhodococcus opacus que as enzimas ficaram totalmente
separadas em dois ramos de acordo com o substrato (Figura 3.1.4.a). E, na
árvore com este gene, o ramo com o mesmo ficou localizado entre os ramos dos
genes que codificam as clorocatecol 1,2-dioxigenases (Figura 3.1.4.b). Isto deve
ter ocorrido porque ao retirar as outras sequências, aumentou o número de
aminoácidos das sequências das enzimas catecol 1,2-dioxigenases e clorocatecol
1,2-dioxigenases que foram reanalisadas. Quando temos várias sequências de
tamanhos diferentes e com maior distância evolutiva, aumenta o número de gaps
e, estes são deletados ao realizarmos as análises evolutivas. Talvez, nesta
deleção pode-se perder fragmentos de regiões conservadas que alterem
consideravelmente o alinhamento e as análises evolucionárias.
E também podemos observar na Figura 3.1.4 que as enzimas novamente
22
ficaram agrupadas de acordo com o substrato, repetindo a mesma distribuição
entre os ramos, com exceção da enzima catecol 1,2-dioxigenase que ficou entre o
ramo das clorocatecol 1,2-dioxigenases. Mais uma vez, pode-se explicar isto
devido à sua classificação no banco de dados, onde as enzimas possuem a
mesma função, mas utilizam substratos diferentes. E talvez, a nomenclatura deste
gene seja diferente sem nenhum motivo aparente, já que as enzimas codificadas
por ele possuem a mesma função. Pode-se sugerir que esse aspecto deva ser
considerado para buscar uma maior clareza quanto às relações de homologia
entre enzimas.
Esses resultados preliminares serviram como base para um
aprofundamento deste estudo, utilizando um número muito maior de sequências
de aminoácidos das enzimas catecol 1,2-dioxigenases para melhor compreensão
da homologia entre essas enzimas. Essas sequências foram comparadas com a
sequência de aminoácidos de catecol 1,2-dioxigenase presente em Ralstonia
eutropha JMP134, micro-organismo no qual sua rota de degradação para o
herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) já foi completamente elucidada.
23
Figura 3.1.4. Árvores evolucionárias com as enzimas catecol 1,2-dioxigenases e clorocatecol 1,2-dioxigenases. Ramos apresentam o nome do gene que codifica a enzima seguido pela espécie microbiana na qual este foi estudado e, entre barras verticais, o código da sequência de aminoácidos no Genebank. Neighour-joining baseado no alinhamento de 240 aminoácidos. 0,1 substituções por sítio. Ramos em vermelho identificam as clorocatecol 1,2-dioxigenases e ramos verdes identificam as catecol 1,2-dioxigenases. a, árvore evolucionária sem o gene catA de Rhodococcus opacus. b, árvore evolucionária com o gene catA de Rhodococcus opacus.
clcA Pseudomonas putida |P11451|
tcbC Pseudomonas sp. strain P51)|P27098|
tfdC Burkholderia cepacia |P0A397|
tfdC Ralstonia eutropha (strain JMP134)|P0A396|
clcA Rhodococcus opacus |O67987|
pheB Pseudomonas sp. (strain
catA Acinetobacter sp. (strain ADP1)|P07773|
catA1 Acinetobacter lwoffii |O33948|
catA2 Acinetobacter lwoffii |O33950|
catA Acinetobacter genomo sp. 11 |Q43984|
hqd2 Candida albicans |P86029|
100
86
100
94
82
51
100
46
0.1
A
clcA Pseudomonas putida |P11451|
tcbC Pseudomonas sp. (strain P51) |P27098|
tfdC Burkholderia cepacia |P0A397|
tfdC Ralstonia eutropha (strain JMP134)
catA Rhodococcus opacus
clcA Rhodococcus
catA1 Acinetobacter lwoffii
catA Acinetobacter genomo sp.
pheB Pseudomonas sp. (strain EST1001)
catA Acinetobacter sp. (strain ADP1)
hqd2 Candida albicans
100
82
100
42
49
100
54
96
0.1
B
24
3.2. Homologia entre catecol 1,2-dioxigenases
Com base na metodologia utilizada, foi construída uma árvore
evolucionária com todas as sequências de aminoácidos das enzimas catecol 1,2-
dioxigenases que apresentaram homologia (query coverage) igual ou superior à
80% com a sequência de nucleotídeos de catecol 1,2-dioxigenase de Ralstonia
eutropha JMP 134. Foram analisados 1776 genomas e encontradas 267
sequências de aminoácidos com homologia igual ou superior a 80%.
Primeiramente, foi construída uma árvore evolucionária com todas as
sequências encontradas (Anexo 1). A partir desta árvore, foram construídas sete
árvores para detalhar os resultados observados na árvore inicial. Essas árvores
foram delimitadas de acordo com a divisão dos ramos na grande árvore (Anexo
1).
Nas árvores das Figuras 3.2.1; 3.2.2; 3.2.3; 3.2.4; 3.2.5 e 3.2.6 podemos
observar em ramos na cor rosa que há a mesma enzima sendo encontrada em
diferentes micro-organismos. E também podemos observar em ramos na cor
laranja que há vários ramos onde ocorrem diferentes enzimas em micro-
organismos diferentes, sendo observado 100% de bootstrap. Possivelmente,
estes agrupamentos ocorram porque o sítio de reações das enzimas podem não
se alterar devido à pequenas mudanças entre os respectivos substratos.
Na árvore da Figura 3.2.1, há dois grandes ramos onde há micro-
organismos das famílias Burkholderiaceae e outras Proteobacterias no ramo
delineado pelo retângulo de cor vermelha. No retângulo de cor verde da Figura
3.2.1, temos micro-organismos do grupo Actinobacteria.
25
Figura 3.2.1. Árvore evolucionária do primeiro segmento da árvore do anexo I. Ramos na cor rosa demonstram mesma enzima presente em micro-organismos diferentes. Ramos na cor laranja demonstram 100% de homologia em enzimas diferentes presentes em micro-organismos diferentes. Retângulo vermelho delimita micro-organismos da família Burkholderiaceae e outras Proteobacterias. Retângulo verde delimita micro-organismos da família Actinobacteria. Neighour-joining baseado no alinhamento de 348 aminoácidos. 0,1 substituções por sítio.
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Comamonas testosteroni KF-1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Comamonas testosteroni KF-1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Leptothrix cholodnii SP-6]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia cenocepacia MC0-3]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia sp. 383]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria AMMD]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia graminis C4D1M]
6-chlorohydroxyquinol-1,2-dioxygenase [Herbaspirillum seropedicae SmR1]
6-Chlorohydroxyquinol-1,2-dioxygenase [Cupriavidus necator N-1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Acidovorax avenae subsp. avenae ATCC 19860]
Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Variovorax paradoxus S110]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia graminis C4D1M]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Burkholderia phytofirmans PsJN]
catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia eutropha JMP134]
catechol 1,2-dioxygenase [Verminephrobacter eiseniae EF01-2]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Burkholderia pseudomallei MSHR346]
catechol 1,2-dioxygenase [Verminephrobacter aporrectodeae subsp. tuberculatae At4]
catechol 1,2-dioxygenase [Polaromonas sp. JS666]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Variovorax paradoxus EPS]
6-chlorohydroxyquinol-1,2-dioxygenase [Cupriavidus necator N-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia eutropha JMP134]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Variovorax paradoxus S110]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Sphingobium chlorophenolicum L-1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Catenulispora acidiphila DSM 44928]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Mycobacterium vanbaalenii PYR-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces scabiei 87.22]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Nocardioidaceae bacterium Broad-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces griseoaurantiacus M045]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Streptomyces hygroscopicus ATCC 53653]
catechol 1,2-dioxygenase [Rhodococcus jostii RHA1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Arthrobacter chlorophenolicus A6]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Arthrobacter chlorophenolicus A6]
catechol 1,2-dioxygenase [Corynebacterium glutamicum ATCC 13032]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Rhodococcus opacus B4]
catechol 1,2-dioxygenase [Amycolatopsis mediterranei U32]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Pseudonocardia dioxanivorans CB1190] 100
100
100
68
78
85
72
91
64
52
50
99
100
100
99
100
100
100
63 74
38
66
71
78
63 94
52
61
41
39
35
10
46
0.1
26
A presença de Cupriavidus necator N-1 e Ralstonia eutropha JMP134 em
um mesmo ramo com 100% de homologia ocorreu devido à mudanças na
taxonomia e, desde então, estas bactérias são consideradas sinônimos (NCBI,
2011). Há duas enzimas 6-clorohidroxiquinol 1,2-dioxigenases presentes em
Cupriavidus necator N-1 e duas enzimas catecol 1,2-dioxigenases presentes em
Ralstonia eutropha JMP134. Considerando que estamos falando da mesma
bactéria, é curioso que uma enzima 6-clorohidroxiquinol 1,2-dioxigenase e uma
enzima catecol 1,2-dioxigenase tenham ficado juntas em um mesmo sub-ramo.
Possivelmente, a enzima 6-clorohidroxiquinol 1,2-dioxigenase é uma catecol 1,2-
dioxigenase por estarem no mesmo micro-organismo e a distância evolutiva ser
mínima. Isto sugere que a nomenclatura destas enzimas estão inadequadas,
devendo ser padronizada.
A outra enzima catecol 1,2-dioxigenase presente em Ralstonia eutropha
JMP134 está bem distante evolutivamente tanto da outra 6-clorohidroxiquinol 1,2-
dioxigenase quanto do sub-ramo que contém as enzimas 6-clorohidroxiquinol 1,2-
dioxigenase e catecol 1,2-dioxigenase juntas. Possivelmente, tenham origem
evolutivas diferentes devido estarem em ramos distintos. Como o valor de
bootstrap do sub-ramo é inferior a 90%, teríamos que detalhar o estudo deste
ramo e verificar se a nossa hipótese é fundamentada.
Chama a atenção a proximidade evolutiva de catecol 1,2-dioxigenases
entre micro-organismos patogênicos, como a Burkholderia cenocepacia e um
fixador de nitrogênio, Herbaspirillum seropedicae. Possivelmente, Herbaspirillum
seropedicae necessita de dioxigenases, não só para seu metabolismo básico,
mas principalmente para sua interação com vegetais. Isto porque utiliza
metabólitos secundários vegetais como fonte de carbono e energia (SOARES et
al., 2011)
No ramo destacado em verde estão os micro-organismos dos gêneros de
grande interesse para a indústria e para o meio ambiente em função da produção
de aminoácidos e antibióticos (SILVA et al., 2005). Seria interessante detalhar que
esses micro-organismos que produzem estas substâncias tenham em seus
genomas enzimas relacionadas com degradação de compostos aromáticos e não
com a síntese destes.
27
Figura 3.2.2. Árvore evolucionária do segundo segmento da árvore do anexo I. Ramo rosa demonstra mesma enzima presente em micro-organismos diferentes. Ramo laranja demonstra 100% de homologia entre enzimas diferentes presentes em micro-organismos diferentes. Retângulo vermelho delimita micro-organismos da família Proteobacteria. Retângulo verde delimita homologia entre micro-organismos da família Actinobacteria. Neighour-joining baseado no alinhamento de 667 aminoácidos. 0,1 substituções por sítio.
Na árvore da Figura 3.2.2, há um ramo onde aparecem os micro-
organismos dos gêneros Rhodopseudomonas e Bradyrhizobium, ambos do grupo
Proteobacteria, delimitados em vermelho. Nesta mesma árvore, podemos
observar, destacado em verde, um pequeno ramo de micro-organismos da família
catechol 1,2-dioxygenase [Rhodopseudomonas palustris BisB5]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Rhodopseudomonas palustris HaA2]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Rhodopseudomonas palustris TIE-1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Rhodopseudomonas palustris DX-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Rhodopseudomonas palustris BisB18]
dioxygenase [Bradyrhizobium japonicum USDA 110]
catechol 1,2-dioxygenase [Bradyrhizobium sp. BTAi1]
catechol 1,2-dioxygenase [Bradyrhizobium sp. ORS 278]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Methylobacterium nodulans ORS 2060]
catechol 1,2-dioxygenase [Pelagibacterium halotolerans B2]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Sphingomonas wittichii RW1]
dioxygenase [Azorhizobium caulinodans ORS 571]
dioxygenase [Bradyrhizobium japonicum USDA 110]
iron-containing alcohol dehydrogenase [Pseudonocardia sp. P1]
maleylacetate reductase 1 [Streptomyces sp. AA4]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Pseudonocardia dioxanivorans CB1190]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Roseomonas cervicalis ATCC 49957]
100
84
91
89
6568
55
100
100
94
98
80
100
76
0.1
28
Actinobacteria. Note que esse ramo aparece em uma árvore onde predominam
micro-organismos da família Proteobacteria.
Nesta árvore onde predominam Proteobacterias, ocorrem micro-
organismos do grupo Actinobacteria apresentando duas enzimas com
similaridade com catecol 1,2-dioxigenases de Ralstonia eutropha JMP134,
embora com nomenclatura toatalmente diferentes: iron-containing alcohol
dehydrogenase e maleilacetato redutase. Estudos de homologia deveriam ser
realizados antes das nomenclaturas das proteínas, facilitando o estudo.
Na árvore da Figura 3.2.3, temos um ramo onde ficaram agrupados os
micro-organismos da família Rhizobiaceae, destacado em vermelho. Neste ramo,
observa-se a presença de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM1325 e de
bactérias do gênero Agrobacterium. Destacado em verde, há um grande ramo
onde ficaram agrupadas bactérias do grupo Actinobacteria. Destacado em azul,
estão os micro-organismos da família Burkholderiaceae, exceto os micro-
organismos Pseudomonas aeruginosa PA7 e Achromobacter xylosoxidans A8.
No retângulo vermelho, a família Rhizobiaceae possui espécimes
patogênicas e outras que são fixadores de nitrogênio. É conhecido que na
identificação da planta com a espécie Rhizobium leguminosarum ocorre a
sinalização através de flavonóides (Direito, 2009). Possivelmente, a presença de
catecol 1,2-dioxigenase está relacionada com a necessidade de degradação
destes flavonóides. No caso do gênero Agrobacterium, é realizada a infecção da
célula vegetal por estas bactérias, e estas enzimas podem ser úteis tanto para
sua defesa contra os metabólitos secundários vegetais, quanto para a
degradação de estruturas celulares. Também nesta árvore observamos a
proximidade de dioxigenases em Actinobacterias. Em azul, observou-se que
evolutivamente Pseudomonas areuginosa e Achromobacter xylosidans
descendem do mesmo ancestral de Burkholderia spp.
29
Figura 3.2.3. Árvore evolucionária do terceiro segmento da árvore do anexo I. Ramo rosa demonstra mesma enzima presente em micro-organismos diferentes. Retângulo vermelho delimita micro-organismos da família Rhizobiaceae. Retângulo verde delimita micro-organismos do grupo Actinobacteria. Retângulo azul delimita micro-organismos da família Burkholderiaceae. Neighour-joining baseado no alinhamento de 296 aminoácidos. 0,05 substituções por sítio.
dioxygenase [Agrobacterium sp. ATCC 31749]
dioxygenase [Agrobacterium tumefaciens str. C58]
catechol 1,2-dioxygenase [Agrobacterium sp. H13-3]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Agrobacterium tumefaciens F2]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Mesorhizobium ciceri biovar biserrulae WSM1271]
dioxygenase subfamily protein [Polymorphum gilvum SL003B-26A1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM1325]
catechol 1,2-dioxygenase [Bradyrhizobium sp. ORS 278]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Sphingomonas wittichii RW1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Sphingobium chlorophenolicum L-1]
dioxygenase [Agrobacterium radiobacter K84]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Pseudonocardia dioxanivorans CB1190]
catechol 1,2-dioxygenase [Rhodococcus jostii RHA1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium smegmatis str. MC2 155]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Pseudonocardia dioxanivorans CB1190]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Rhodococcus jostii RHA1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium smegmatis str. MC2 155]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces scabiei 87.22]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces scabiei 87.22]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces zinciresistens K42]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces sviceus ATCC 29083]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces viridochromogenes DSM 40736]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Azospirillum sp. B510]
dioxygenase [Stappia aggregata IAM 12614]
dioxygenase [Sagittula stellata E-37]
6-chlorohydroxyquinol-1,2-dioxygenase [Rhodococcus jostii RHA1]
dioxygenase [Agrobacterium vitis S4]
catechol 1,2-dioxygenase 1 [Pelagibacterium halotolerans B2]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2304]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus necator N-1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas aeruginosa PA7]
dioxygenase family protein 2 [Achromobacter xylosoxidans A8]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus metallidurans CH34]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia phymatum STM815]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia ambifaria MC40-6]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia ambifaria AMMD]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia ambifaria IOP40-10]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia ambifaria MEX-5]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans CGD2M]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans CGD1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans ATCC 17616]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Burkholderia multivorans ATCC 17616]
95
74
100
84
91
67
75
100
100
60
63
80
98
99
51
97
66
60
69
54
66
92
69
99
92
99
34
99
100
69
89
97
98
72
100
99
57
99
52
0.05
30
Na árvore da Figura 3.2.4, observa-se um ramo destacado em vermelho
onde ocorrem somente micro-organismos da família Rhizobiaceae. Em verde,
estão os micro-organismos do grupo Proteobacteria. Mais uma vez temos uma
representação em Rhizobium leguminosarum e Agrobacterium, enfatizando a
importância das catecol 1,2-dioxigenases para estas bactérias. Também ocorre
nesta árvore homologia entre hidroxiquinol 1,2-dioxigenases de Cupriavidus
taiwanenses com uma enzima identificada como uma desidrogenase presente em
Cupriavidus necator. Novamente devemos repensar a questão da nomenclatura
destas enzimas.
Na árvore da figura 3.2.5, observe que ocorre apenas um ramo, destacado
em vermelho, em que ocorre a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase. Em toda a
árvore é predominante a enzima catecol 1,2-dioxigenase.
Assim como nas outras árvores, a filogenia não está diretamente
relacionada com a evolução de proteínas como vimos nas enzimas catecol 1,2-
dioxigenases. Isto pode está relacionado com a transferência de material genético
entre bactérias pela troca de plasmídeos ou pela inserção de material genético ao
cromossomo.
31
Figura 3.2.4. Árvore evolucionária do quarto segmento da árvore do anexo I. Ramo rosa demonstra mesma enzima presente em micro-organismos diferentes. Ramo laranja demonstra 100% de homologia em enzimas diferentes presentes em micro-organismos diferentes. Retângulo vermelho delimita micro-organismos da família Rhizobizaceae. Retângulo verde delimita homologia entre micro-organismos da família Proteobacteria. Neighour-joining baseado no alinhamento de 363 aminoácidos. 0,1 substituções por sítio.
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Rhizobium etli GR56]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM2304]
catechol 1,2-dioxygenase [Sinorhizobium fredii NGR234]
catechol 1,2-dioxygenase [Rhizobium etli CFN 42]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Agrobacterium sp. H13-3]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Methylobacterium nodulans ORS 2060]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Sphingomonas wittichii RW1]
catechol 1,2-dioxygenase [Bradyrhizobium japonicum USDA 110]
catechol 1,2-dioxygenase [Bradyrhizobium sp. BTAi1]
catechol 1,2-dioxygenase [Bradyrhizobium sp. ORS 278]
catechol 1,2-dioxygenase [Polymorphum gilvum SL003B-26A1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Delftia acidovorans SPH-1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Xanthobacter autotrophicus Py2]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Variovorax paradoxus S110]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Polaromonas sp. JS666]...
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Sphingomonas wittichii RW1]
short-chain dehydrogenase/reductase SDR [Cupriavidus necator N-1]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus taiwanensis LMG 19424]
catechol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus taiwanensis LMG 19424]
dioxygenase family protein 1 [Achromobacter xylosoxidans A8]
Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Variovorax paradoxus S110]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Variovorax paradoxus EPS]
hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [Burkholderia gladioli BSR3]
Intradiol ring-cleavage dioxygenase [Polymorphum gilvum SL003B-26A1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Rubrobacter xylanophilus DSM 9941]
chlorocatechol 1,2-dioxygenase [Rhodobacterales bacterium Y4I]
dioxygenase [Oceanicola batsensis HTCC2597]
dioxygenase [Sagittula stellata E-37]
dioxygenase [Stappia aggregata IAM 12614]
dioxygenase [Roseobacter sp. MED193]
dioxygenase [Roseovarius sp. 217]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Roseovarius sp. TM1035]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Mesorhizobium ciceri biovar biserrulae WSM1271]
catechol 1,2-dioxygenase [Bradyrhizobium sp. ORS 278]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM1325]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Cupriavidus taiwanensis LMG 19424]
100
100
100
99
100
96
100
100
100
73
99
100
66
71
57
34
76
84 43
78
83
97
100 99
89
91
61
93
50
100
84
71
50
0.1
32
Figura 3.2.5. Árvore evolucionária do quinto segmento da árvore do anexo I. Ramo rosa demonstra mesma enzima presente em micro-organismos diferentes. Retângulo vermelho delimita enzimas clorocatecol 1,2-dioxigenases. Neighour-joining baseado no alinhamento de 362 aminoácidos. 0,1 substituções por sítio.
Na árvore da figura 3.2.6, ocorre um grande ramo, destacado em vermelho,
com todos os micro-organismos da família Pseudomonaceae que apresentaram
80% ou mais de homologia com catecol 1,2-dioxigenase de Ralstonia eutropha
JMP134. Em verde há um ramo com predominância de micro-organismos do
grupo Proteobacteria, exceto o micro-organismo Cupriavidus necator N-1, que
pertence à família Burkholderiaceae.
Nos gênero Pseudomonas a identificação de catecol 1,2-dioxigenases está
adequada porque em apenas uma espécime é observada uma enzima com
nomenclatura diferente: Pseudomonas forenses em intradiol ring-cleavage
catechol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium sp. KMS]
catechol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium sp. MCS]
catechol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium sp. JLS]
catechol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium smegmatis str. MC2 155]
catechol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium gilvum PYR-GCK]
catechol 1,2-dioxygenase [Mycobacterium sp. Spyr1]
catechol 1,2-dioxygenase [Nocardioidaceae bacterium Broad-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Gordonia alkanivorans NBRC 16433]
catechol 1,2-dioxygenase [Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces sp. AA4]
catechol 1,2-dioxygenase [Saccharomonospora viridis DSM 43017]
catechol 1,2-dioxygenase [Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338]
catechol 1,2-dioxygenase [Nocardioides sp. JS614]
catechol 1,2-dioxygenase [Arthrobacter arilaitensis Re117]
catechol 1,2-dioxygenase [Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3]
catechol 1,2-dioxygenase [Gordonia bronchialis DSM 43247]
catechol 1,2-dioxygenase [Arthrobacter sp. FB24]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces ghanaensis ATCC 14672]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces hygroscopicus ATCC 53653]
catechol 1,2-dioxygenase [Geodermatophilus obscurus DSM 43160]
Catechol 1,2-dioxygenase [Pseudonocardia sp. P1]
catechol 1,2-dioxygenase [Corynebacterium ammoniagenes DSM 20306]
catechol 1,2-dioxygenase [Corynebacterium efficiens YS-314]
catechol 1,2-dioxygenase [Dietzia cinnamea P4]
catechol 1,2-dioxygenase [Rhodococcus erythropolis SK121]
catechol 1,2-dioxygenase [Gordonia alkanivorans NBRC 16433]
catechol 1,2-dioxygenase [Rhodococcus jostii RHA1]
catechol 1,2-dioxygenase [Rhodococcus opacus B4]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudonocardia dioxanivorans CB1190]
Catechol 1,2-dioxygenase [Pseudonocardia dioxanivorans CB1190]
chlorocatechol 1,2-dioxygenase [Sphingobium japonicum UT26S]
3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia xenovorans LB400]
chlorocatechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia eutropha JMP134]
catechol 1,2-dioxygenase [Streptomyces griseoaurantiacus M045]
98 100
100
99
100
98
66
49
92 99
99 85
68 100
100
95
99
69
35
79 18
33 51
96
61
54
45
98
29
14
17
0.1
33
dioxigenase. Novamente observa-se a enzima catecol 1,2-dioxigenase de
Cupriavidus necator sinalizando a diversidade nas sequências de catecol 1,2-
dioxigenases desta bactéria. Isto se deve a várias cópias de enzimas com a
mesma função em um mesmo micro-organismo.
Figura 3.2.6. Árvore evolucionária do sexto segmento da árvore do anexo I. Ramo rosa demonstra mesma enzima presente em micro-organismos diferentes. Retângulo vermelho delimita micro-organismos da família Pseudomonaceae. Retângulo verde delimita micro-organismos da família Proteobacteria, exceto Cupriavidus necator N-1. Neighour-joining baseado no alinhamento de 325 aminoácidos. 0,05 substituções por sítio.
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas putida KT2440]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas putida W619]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas entomophila L48]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas fluorescens Pf0-1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Pseudomonas fluorescens Pf0-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas sp. TJI-51]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas putida GB-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas putida F1]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas putida KT2440]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 = LMG 11199]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas mendocina NK-01]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas aeruginosa PA7]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas aeruginosa LESB58]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas aeruginosa PAO1]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas fluorescens WH6]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas fluorescens WH6]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas fluorescens SBW25]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas fluorescens Pf-5]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas fulva 12-X]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas syringae pv. japonica str. M301072PT]
Catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum NFM421]
Catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas syringae pv. aesculi str. NCPPB3681]
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas syringae pv. actinidiae str. M302091
catechol 1,2-dioxygenase [Pseudomonas syringae pv. morsprunorum str. M302280PT]
catechol 1,2-dioxygenase [Methylobacterium nodulans ORS 2060]
catechol 1,2-dioxygenase [Methylobacterium sp. 4-46]
catechol 1,2-dioxygenase [Sphingobium japonicum UT26S]
catechol 1,2-dioxygenase [Sphingomonas wittichii RW1]
catechol 1,2-dioxygenase [Xanthobacter autotrophicus Py2]
catechol 1,2-dioxygenase [Agrobacterium radiobacter K84]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Delftia acidovorans SPH-1]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Polaromonas naphthalenivorans CJ2]
catechol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus necator N-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Achromobacter xylosoxidans A8]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Acidovorax ebreus TPSY]
intradiol ring-cleavage dioxygenase [Acidovorax sp. JS42]100
90
78
68
100
100
89
42
67
55
100
98
59
100
88
93
82
78
48
99
92
84
100
100
86
99
100
99
70
59
98 93
89
78
94
0.05
34
Na árvore da figura 3.2.7, só ocorreram as enzimas catecol 1,2-
dioxigenases presentes predominantemente em organismos da família
Burkholderiaceae. Note que, em vermelho, estão os micro-organismos da família
Neisseriaceae em um pequeno ramo. Nesta árvore ocorre a presença de catecol
1,2-dioxigenase em Ralstonia solanacearum, uma bactéria que é responsável
podridão em raízes de solanáceas. É possível que assim como em
Agrobacterium, esta enzima seja empregada para degradação de estruturas
celulares e para a sobrevivência da bactéria frente à ação de metabólitos
secundários.
Devemos considerar que todos os organismos possuem substâncias
aromáticas que podem dar origem ao catecol na sua degradação. Um exemplo
destas substâncias aromáticas é o aminoácido triptofano, onde em seu
catabolismo, pode chegar a catecol (URCAMP, 2011). É curioso não observar
estas enzimas em muitos micro-organismos devido a presença do triptofano.
Talvez, estas enzimas não tenham apresentado homologia por ter sido
selecionado somente um micro-organismo e uma enzima como referência.
35
Figura 3.2.7. Árvore evolucionária do sétimo segmento da árvore do anexo I.Retângulo vermelho delimita micro-organismos da família Neisseriaceae. Neighour-joining baseado no alinhamento de 321 aminoácidos. 0,05 substituções por sítio.
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia cenocepacia HI2424] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia cenocepacia AU 1054]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia cenocepacia HI2424] catechol 1,2-dioxygenase 1 [Burkholderia cenocepacia J2315]
catechol dioxygenase [Burkholderia sp. 383] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria MC40-6] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria AMMD]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria IOP40-10] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria MEX-5]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ubonensis Bu] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans CGD1] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans ATCC 17616]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia oklahomensis EO147] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia oklahomensis C6786]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia thailandensis TXDOH] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia thailandensis E264]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia thailandensis MSMB43] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia pseudomallei 7894] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia mallei ATCC 23344] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia mallei FMH] catechol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus necator N-1]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia phytofirmans PsJN] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia xenovorans LB400]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia phymatum STM815] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia gladioli BSR3]
catechol 1,2-dioxygenase [Herbaspirillum seropedicae SmR1] catechol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus metallidurans CH34]
catechol dioxygenase [Ralstonia eutropha JMP134] Catechol 1,2-dioxygenase [Oxalobacteraceae bacterium IMCC9480] catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia solanacearum CFBP2957] Catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia solanacearum UW551]
catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia solanacearum PSI07] Catechol 1,2-dioxygenase [Cupriavidus metallidurans CH34]
catechol 1,2-dioxygenase CatA [Cupriavidus necator N-1] catechol 1,2-dioxygenase [Lutiella nitroferrum 2002] catechol 1,2-dioxygenase [Pseudogulbenkiania sp. NH8B] catechol 1,2-dioxygenase [Pseudogulbenkiania sp. NH8B]
catechol 1,2-dioxygenase [Xanthobacter autotrophicus Py2] catechol 1,2-dioxygenase [Azospirillum sp. B510]
catechol 1,2-dioxygenase [Alicycliphilus denitrificans BC] catechol 1,2-dioxygenase [Herbaspirillum seropedicae SmR1]
catechol 1,2-dioxygenase [Paracoccus denitrificans PD1222] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans CGD1]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans ATCC 17616] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia multivorans CGD2M]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia graminis C4D1M] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia phytofirmans PsJN]
Catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia glumae BGR1] catechol 1,2-dioxygenase 1 [Ralstonia sp. 5_2_56FAA] catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia sp. 5_7_47FAA] catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia pickettii 12J]
catechol 1,2-dioxygenase [Ralstonia pickettii 12D] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia vietnamiensis G4]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria AMMD] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria MC40-6]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria IOP40-10] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia ambifaria MEX-5]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia sp. 383] catechol 1,2-dioxygenase 2 [Burkholderia cenocepacia J2315]
catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia cenocepacia AU 1054] catechol 1,2-dioxygenase [Burkholderia cenocepacia MC0-3]
90 90
100
57
63
73
63 97
76
88 100
88
66
68
25
22
34
100
99
97 100
99
100
90
98
92
100
81
100
99
78
51
66
70
100 95
64
70 88
100
100
99
99
85
55
83 100
51
64
41
89 98
73
91
99 59 56
0.05
36
4. Conclusões
• Nos estudos preliminares não foi observado um padrão entre espécies
microbianas e os genes codificadores para uma mesma enzima.
• No detalhamento deste estudo preliminar, a presença do gene catA
codificando catecol 1,2-dioxigenases em Rhodococcus opacus pode indicar
que, talvez, a nomenclatura deste gene não seja adequada, visto que, as
enzimas foram agrupadas anteriormente de acordo com o seu substrato.
• A presença de micro-organismos que codificam a mesma enzima ou
enzimas diferentes pode ocorrer devido ao sítio das enzimas não se
alterarem com pequenas mudanças em seus substratos.
• A presença de homologia entre o mesmo micro-organismo codificando
enzimas diferentes pode indicar que, talvez, a nomenclatura dessas
enzimas não estejam adequadas, devendo ser padronizadas. Estudos de
homologia deveriam ser realizados antes das nomenclaturas das proteínas,
facilitando o estudo.
• Possivelmente, a presença de catecol 1,2-dioxigenase em bactérias
patogênicas ou fixadoras de nitrogênio está relacionada com a
necessidade de degradação de estruturas celulares ou para sua defesa
contra os metabólitos secundários vegetais.
• A enzima catecol 1,2-dioxigenase em Cupriavidus necator N-1 ou Ralstonia
eutropha JMP134 sinaliza a diversidade nas sequências de catecol 1,2-
dioxigenases desta bactéria. Isto se deve a várias cópias de enzimas com
a mesma função em um mesmo micro-organismo.
• Foi observado que a filogenia não está diretamente relacionada com a
evolução de proteínas.
37
5. Referências Bibliográficas
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65
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40
38
22
28
18
13
0.1
Figura I.1. Árvore evolucionária de enzimas dioxigenases Neighour-joining baseado no alinhamento de 321 aminoácidos. 0,05 substituções por sítio.
Primeiro segmento
Segundo segmento
Terceiro segmento
Quarto segmento
Quinto segmento
Sexto segmento
Sétimo segmento