A Edição de Genomas e os Impactos na Agricultura

Giancarlo Pasquali

Universidade Federal do Rio Grande do SulInstituto de Biociências & Centro de Biotecnologia

Hereditary Tyrosinemia

Massachusetts Institute of Technology - MIT - USA

Novas Metodologias de Melhoramento Genético de Plantas Edição de DNA – DNA Editing

Tópicos

1.Edição de DNA: principais metodologias

2.Vantagens e aplicações das técnicas de edição de DNA a vegetais

3.Exemplos de plantas geradas por edição de DNA

4.Principais organizações envolvidas

5.Biossegurança relativa à edição de DNA em plantas

O Dogma Central da Biologia Molecular

http://www.rsc.org/images/FEATURE-nobel-400_tcm18-165980.jpg

Promotor A Sequência

codificadora

Terminador A

Promotor B Terminador B

G. Pasquali - CBiot/UFRGS

G. Pasquali - CBiot/UFRGS

Gene de interesse + Gene marcador

TRANSGENIA = TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA

Edição de DNA: Principais Metodologias

Meganucleases - 2001 - Engineered Meganuclease Re-engineered Homing

Endonucleases

ZFN - 2003 - Zinc Finger Nucleases (Nucleases do Tipo “Dedos-de-Zinco”)

TALENs - 2009 - Transcription Activator-like Effector Nucleases (Nucleases Efetoras

Semelhantes a Ativadores da Transcrição)

CRISPR/Cas9 - 2012/2013 - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

/Cas9 System (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e

Regularmente Interespaçadas/Sistema Cas9)

CRISPR/Cas9Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Genome Editing with CRISPR-Cas9Published on Nov 5, 2014

This animation depicts the CRISPR-Cas9 method for genome editing – a powerful new technology with many applications in biomedical research, including the potential to treat human genetic disease. Feng Zhang, a leader in the development of this

technology, is a faculty member at MIT, an investigator at the McGovern Institute for Brain Research, and a core member of thBroad Institute. Further information can be found on Prof. Zhang’s website at http://zlab.mit.edu.

https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8

Wiedenheft et al. (2012) RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature 15: 331 (doi: 10.1038/nature10886)

Mali et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339: 823(doi:10.1126/science.1232033)

CRISPR/Cas9Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Gene Editing Mechanism of CRISPR-Cas9https://vimeo.com/112757040

In this animation, learn how CRISPR-Cas9 gene editing technology can be used to preciselydisrupt and modify specific genes.

Credit: Wyss Institute at Harvard University.

More information: wyss.harvard.edu/viewpressrelease/180/broad-institute-harvard-and-mit-license-crisprcas9-technology-to-editas-medicine-for-therapeutic-applications

Ann Ran et al. (2013) Nature Protocols 8: 2281 (doi:10.1038/nprot.2013.143)

(short-guide RNA)

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology

New England Biolabs Inc. - CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing

http://www.artofthecell.com/animation/crispr-cas9-gene-editing

ZFNsZinc Finger Nucleases

Urnov et al. (2010) Genome editing with engineered zinc fingernucleases. Nature Reviews Genetics 11: 636

Isalan (2012) Zinc-finger nucleases: how to play two good handsNature Methods 9: 32

Os domínios “dedos-de-zinco” de proteínas que ligam DNA sãoconhecidos desde 1994. Pesquisadores produziram 64 versõesde domínios dedos-de-zinco capazes de ligar tri outetranucleotídeos e, assim, ligar especificamente qualquersequência de DNA. Aos domínios dedos-de-zinco foi acopladauma nuclease, FokI, que realiza a clivagem de DNA. Portanto, asZFNs realizam essencialmente a mesma atividade de Cas9,porém a região de ligação ao DNA é determinada por domíniosproteicos do tipo “dedos-de-zinco” (e não por gRNAs).

ZFNsZinc Finger Nucleases

http://cen.acs.org/articles/87/i30/Knockout-Rats-Easy-Way.html

Each zinc finger protein (Zn is silver) iscoupled to a FokI domain (central ribbonstructures). When two of the proteins bindto their target sequence, the FokI domainsjoin and create a double-strand break.

Credit: Sangamo Biosciences

TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)

Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors:customizable proteins for DNA targeting.Science 333: 1843(doi: 10.1126/science.1204094)

No sistema TAL ou TALENs, as nucleases FokIsão acopladas a domínios peptídicos quereconhecem um único nucleotídeo e,portanto, são de 4 tipos, fundamentalmente.Novamente, qualquer região cromossômicapode ser acessada a partir da sequência dedomínios de ligação ao DNA.

TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)

Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333: 1843 (doi: 10.1126/science.1204094)

Structure of a TAL effector protein wrapped arounda DNA double helix. Image based on data fromMak et al. (2012) Science

http://mcgovern.mit.edu/news/?attachment_id=1807#sthash.xuVcALVi.dpuf

Engineered Meganuclease Re-engineeredHoming Endonucleases

Meganucleases are endodeoxyribonucleases characterized by a large recognition site:

double-stranded DNA sequences of 12 to 40 base pairs.

Grizot et al. (2009) Nucleic Acids Research 38: 2006 (doi:10.1093/nar/gkp1171)

Crystal structure of I-DmoI meganuclease in complex with its target DNA.

Marcaida et al. (2008) PNAS 105: 16888

Cientistas da Cellectis(França) desenvolveram uma coleção de mais de 20.000 domínios proteicos a partir da meganucleasehomodiméricaI-CreI, assim como para outros arcabouços de meganucleases.

Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA

➢ Edição direta de sequências cromossômicas sem extensos

programas de melhoramento

vs

➢ Melhoramento genético tipicamente obtido por métodos

aleatórios seguido de seleção, incluindo:

➢ Indução de mutações aleatórias

➢ Cruzamentos genéticos

➢ Transformação genética mediada por agrobactérias, biobalística, etc.

Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA

➢ Silenciamento por “deleção” (ablação): as nucleases

direcionadas a sítios específicos do genoma promovem quebras

de dupla fita (DSB). Ao reparar a quebra de DNA, a célula

inadvertidamente rompe a sequência gênica, adicionando ou

removendo alguns nucleotídeos (união terminal não-homóloga

ou nonhomologous end-joining - NHEJ).

Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA

➢ Correção de genes: ao combinar ao sistema da nuclease um

fragmento de DNA exógeno com complementaridade às

extremidades do DNA clivado, a sequência-alvo pode ser

reescrita por reparação dirigida por homologia (homology

directed repair - HDR).

➢ Especificidade: a tecnologia CRISPR/Cas9 potencialmente possui

razão de um erro a cada 100 bilhões de bp (teoria), ou seja,

especificidade suficiente para aplicações em pesquisa.

Edição de DNA – Vetores

Integração de DNA: plantas transgênicas capazes de expressar Cas9 e gRNA/crRNA.Transformação mediada por agrobactérias.

(Micro)injeção de RNAs ou Cas9 e gRNAs/crRNAPor eletroporação, choque osmótico, biobalística.Não há introdução de DNA e não há integração de transgenes no genoma.

Exemplos de Plantas Geradas por Edição de DNA

1....

http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2015.01.010

Araki & Ishii

Disease R

Oil Qlity

Disease R

Herbicide

Nutrition

Application of genome editing technologies in plants

PLANT SPECIES TRAIT STUDIED METHOD USED

Arabidopsis thaliana Gene modification ZFN

Nicotiana tabacum Gene editing ZFN

Zea mays Targeted integration into endogenous loci ZFN

Arabidopsis thaliana Targeted mutagenesis TALEN

Oryza sativa Targeted mutagenesis TALEN

Oryza sativa Gene editing TALEN

Arabidopsis thaliana Targeted transcriptional gene repression TALEN

Arabidopsis thaliana Herbicide resistance ODM

Nicotiana tabacum Herbicide resistance ODM

Oryza sativa Herbicide resistance ODM

Shah T, Andleeb T, Lateef S, AliNoor M (2018) Genome editing in plants: Advancing crop transformation and overview of tools. Plant Physiology & Biochemistry 131: 12-21.

(1/3)

PLANT SPECIES TRAIT STUDIED METHOD USED

Zea mays Herbicide resistance ODM

Brassica napus Herbicide resistance ODM

Arabidopsis thaliana Gene knockout or editing CRISPR/Cas

Nicotiana benthamiana Gene knockout or editing CRISPR/Cas

Nicotiana tabacum Gene knockout or editing CRISPR/Cas

Oryza sativa Gene knockout or editing CRISPR/Cas

Arabidopsis thaliana Multiplex genome editing CRISPR/Cas

Nicotiana tabacum Multiplex genome editing CRISPR/Cas

Arabidopsis thaliana Gene insertion or replacement CRISPR/Cas

Nicotiana benthamiana Gene insertion or replacement CRISPR/Cas

Arabidopsis thaliana Epigenetic gene regulation CRISPR/Cas

Glycine max Targeted mutagenesis CRISPR/Cas

(2/3)

Shah T, Andleeb T, Lateef S, AliNoor M (2018) Genome

editing in plants: Advancingcrop transformation andoverview of tools. Plant

Physiology & Biochemistry131: 12-21.

PLANT SPECIES TRAIT STUDIED METHOD USED

Oryza sativa Targeted mutagenesis CRISPR/Cas

Camelina sativa Improvement of nutritional value CRISPR/Cas

Solanum lycopersicum Yield improvement CRISPR/Cas

Zea mays Yield improvement CRISPR/Cas

Oryza sativa Salt resistance CRISPR/Cas

Oryza sativa Drought resistance CRISPR/Cas

Zea mays Herbicide resistance CRISPR/Cas

Triticum aestivum Biotic resistance CRISPR/Cas

Oryza sativa Biotic resistance CRISPR/Cas

Arabidopsis thaliana Biotic resistance CRISPR/Cas

Oryza sativa Biotic resistance CRISPR/Cas

Oryza sativa Biotic resistance CRISPR/Cas

Cucumis sativus Biotic resistance CRISPR/Cas

(3/3)

Shah T, Andleeb T, Lateef S, AliNoor M (2018) Genome

editing in plants: Advancingcrop transformation andoverview of tools. Plant

Physiology & Biochemistry131: 12-21.

Exemplos de Organizações Atuando em Edição de DNA

http://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/genome-editing/genome-editing-publications/genome-engineering-poster.html#

Exemplos de Organizações Comerciais(ordem alfabética)

Cellectis – Meganucleases

Dow – ExZact™ – ZNF

Horizon Discovery – GENASSIST™ – CRISPR/Cas9

New England Biolabs – CRISPR/Cas9

OriGene – CRISPR/Cas9

Precision Biosciences – Meganucleases

Sigma (Aldrich) Life Science – CompoZr™ – ZNF & CRISPR/Cas9

Thermo Fisher Scientific – CRISPR/Cas9

Addgene – TAL Effectors & CRISPR/Cas9

Life Technologies – GeneArt® Precision TALs – TALENs & CRISPR/Cas9

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

➢ A edição de DNA permite o melhoramento vegetal sem a

introdução de transgenes. Permite gerar plantas semelhantes ou

essencialmente idênticas àquelas geradas por técnicas

convencionais de melhoramento, criando fronteiras indistinguíveis

para a regulamentação de OGMs.

➢ Transgênese vs Cisgênese vs Intragênese: a engenharia genética

convencional é trabalhosa e requer longa e intensa seleção para

encontrar os vegetais mutantes desejados.

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

➢ Off-target effects: a ocorrência de mutações não-alvo é a mais

forte crítica ao emprego das tecnologias de edição de DNA.

➢ Pesquisadores vem desenvolvendo estratégias que permitirão

reduzir a um mínimo a possibilidade de mutações não-alvo.

➢ Aumento do tamanho de RNAs guias

➢ Emprego de duas CRISPR/Cas9 combinadas com quebras

de fitas-simples

Canela et al. (2015) Collateral DNA damage produced by genome editing drones: exception or rule? (Review)Molecular Cell 58: 565

Translocations Discovered by LAM-PCR HTGTS (human DNA-edited)

(A) Top: CRISPR/Cas9 wild-type (left) and D10A nickase (right) generates DSBs and DNA nicks, respectively, leading to on-target and potentially off-target DSBs; aberrant fusions of the DNA ends can cause chromosomal translocations. Bottom: scheme of LAM-PCR HTGTS technology to detect novel translocation partners. Cartoon illustrates the arrangement of chromosomes into three distinct territories within the nucleus. The highlighted square indicates the enlarged view of the on-target (red) and off-target (green) DSBs that are in proximity to each other, thus promoting translocations. Following DNA extraction and shearing, a biotinylated primer specific to the bait DSB is extended, amplifying the hybrid fragment on-target-off-target (bait-prey). The product is subsequently purified with streptavidin and ligated to an adaptor, allowing PCR amplification followed by the identification of the off-targets by next-generation sequencing.

(B) Circos plot illustrating the different type of translocations discovered by the HTGTS method, including off-targets DSB ‘‘hotspots,’’ widespread DSBs reflecting non-specific and endogenous DSBs, and inter-homologous fusions involving DSBs generated on both homologous chromosomes. CRISPR/Cas9 (D10A nickase) suppresses translocation hotspots and reduces widespread DSBs in contrast to wild-type CAS9, although inter-homologous fusions at the bait chromosome still persist.

(C) Combination of a known DNA break instigator (CRISPR/Cas9; leading to translocation pattern depicted by red lines, bottom) together with an uncharacterized genomic mutator (e.g., TALEN or AID, top) reveal novel translocation partner induced by the latter (blue lines, bottom).

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

➢ Off-target effects: plantas mutantes geradas por agentes

mutagênicos clássicos (raios X ou químicos) apresentam

(inúmeras) mutações não-alvo (e raríssimamente investigadas).

Qual é a diferença entre produtos?

➢ Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança: “Organismo vivo

modificado é qualquer organismo vivo que possua uma nova

combinação de material genético obtida por meio do uso da

biotecnologia moderna.”

Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas

➢ Plantas geradas por edição de DNA podem gerar segregantes

nulos, isto é, linhagens sem quaisquer transgenes ou insertos de

DNA exógeno integrados nos cromossomos e, assim, escapariam

da definição do Protocolo e das regulamentações sobre OGMs.

➢ Lei Brasileira de Biossegurança (No 11.105): “Organismo

Geneticamente Modificado - OGM: organismo cujo material

genético – ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer técnica

de engenharia genética.”

Process-based GMO Regulations:

➢ União Europeia, Austrália e Nova

Zelândia: mais exigentes

➢ A adição de sequências/genes mediada

por HDR (reparação dirigida por

homologia) será regulamentada.

➢ A introdução de indels por NHEJ (união

terminal não-homóloga) será

regulamentada na EU, mas não na Nova

Zelândia (Suprema Corte vs EPA).

Product-based GMO Regulations:

➢ EUA, Argentina e Canadá: menos

restritivas

➢ A adição de sequências/genes mediada

por HDR (reparação dirigida por

homologia) será regulamentada.

➢ A introdução de indels por NHEJ (união

terminal não-homóloga) não será

regulamentada.

Araki & Ishii (2015) Trends in Plant Science 20: 145