Função protéica(ou nanobiotecnologia sem criador)

Prof. Dr. Francisco Prosdócimi

• Aula baseadano livro do Lehninger(Nelson e Cox)

• Capítulo 5

• The cell– Cap 11

Hormônios protéicos

• Hormônios que são proteínas– Prolactina– Hormônio de crescimento (GH, HGH)– Hormônio adenocorticotrófico (ACTH)– Vasopressina– Oxitocina– Insulina– Somatostatina, etc.

• Todos esses hormônios viajam no sangue e precisam ser reconhecidos e incorporados em células específicas que são identificadas e reconhecidas através de receptores protéicos ligados às membranas celular

Cascatas de regulação

• Proteínas viajam no sangue até encontrar receptor de membrana

• Interações proteína-proteína e proteína-ligante regulam o metabolismo celular

• Acionadas por proteínas de membrana

• Reconhecem modificações no meio externo e modificam o ambiente intracelular em resposta

A estrutura dinâmica das proteínas

• Ligação reversível a outras moléculas: ligantes– Permite resposta rápida a

modificações ambientais e condições metabólicas

• Sítio de ligação: interage com o ligante– Complementar em tamanho,

forma, carga e afinidade à água

• A estrutura definida da proteína é como uma foto, na realidade a proteína opera de forma dinâmica

O Ligante e o encaixe induzido

• O sítio de ligação discrimina entre diferentes moléculas, ou seja, a interação é específica

• Uma proteína pode ter sítio de ligação para diversas moléculas

• Proteínas são flexíveis, vibram, “respiram”

• Mudanças conformacionais (alostéricas) são essenciais para a função protéica

• Encaixe induzido: adaptação estrutural da proteína que se liga firmemente a ele

Teoria do caos e estrutura de proteínas

• Novas teorias dizem que o modelo chave-e-fechadura está refutado

• A proteína fica em um estado de movimentação dinâmica razoavelmente caótico – É o substrato induz a mudança

conformacional na proteína

• Complementaridade interativa: é como se a chave moldasse a fechadura ao encontrar com ela – ou vice-versa

Modificações conformacionais• Em uma proteína contendo várias subunidades, uma mudança

conformacional em uma delas normalmente afeta a conformação das demais

• As ligações com os ligantes podem ser reguladas por meio de interações específicas (fosforilação, glicosilação, etc.) ou por ligação a outros ligantes

• Nas enzimas, os ligantes são chamados substratos e o sítio de ligação é chamado sítio catalítico ou sítio ativo

• Palavras-chave: ligação, especificidade e mudança conformacional

Proteínas de ligação ao O2

• A mioglobina e a hemoglobina são provavelmente as proteínas mais estudadas do mundo– Primeiras a terem estrutura 3D

conhecida– Reação reversível de ligação ao O2

• Por que uma proteína?– O2 é pouco solúvel em solução

aquosa (sangue)

Como ligar e transportar O2

• O problema: nenhuma cadeia lateral de aminoácido é adaptada a ligar uma molécula de oxigênio– Sabe-se que metais de transição (Ferro e

cobre) ligam-se bem ao O2, mas... – Ferro livre gera espécies reativas de

oxigênio

• Grupo prostético: composto associado permanentemente a uma proteína e que contribui para sua função

• O grupo heme: anel de protoporfirina, seis ligações

A mioglobina

• 154 aa; 16700 Kda

• Encontrada no tecidomuscular de mamíferos– Em focas e baleias guarda

O2 para mergulhos longos

• Globina (prot. globular)– 8 α-hélices – 78% dos resíduos

• Ligações proteína-ligantes são descritas por expressões de equilíbrio

>gi|44955888|ref|NP_976312.1| myoglobin [Homo sapiens] MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKHPGDFGADAQGAMNKALELFR KDMASNYKELGFQG

P + L PL

Hemoglobina

• Proteína tetramérica quase esférica com 4 grupos heme– 2 cadeias alfa– 2 cadeias beta

• <50% de similaridade na cadeia primária!!– Estrutura 3D muito

similar

Eritrócitos• Eritrócitos são células altamente

especializadas em transportar O2– Perderam núcleo, mito, retículo– Vivem 120 dias– 34% de seu peso total é de

hemoglobina

• Hemoglobina está 96% saturada no sangue arterial e 64% no sangue venoso

• o CO tem mais afinidade à hemoglobina do que o O2

Proteínas alostéricas

• Hemoglobina possui 2 tipos de estados conformacionais: T(enso) e R(elaxado)

• A ligação do O2 à subunidade da hmb no estado T desencadeia mudança para o estado R

• Em proteínas alostéricas, como a Hmb, a interação com um ligante altera as propriedades de ligação a outros sítios da mesma proteína

A hemoglobina também carrega o CO2

• Liga CO2 de forma inversamente proporcional quando relacionado à ligação com o oxigênio

• CO2 liga-se como grupo carbamato ao grupo amino do aminoácido que está no N-terminal

• Os carbamatos formam pontes salinas adicionais que auxiliam na estabilização do estado T e provem liberação do O2

A ligação do O2 à hmg é regulada por BPG

• 2,3 bisfosfoglicerato• Presente em alta concentração nos

eritrócitos• Uma molécula ligada para cada

hemoglobina – estabiliza o estado T– Dificulta a ligação do O2 à hmg

• Quantidade de O2 liberada nos tecidos é ~40% da quantidade máxima transportada no sangue – regulado com altitude

• Excesso de BPG => hipoxiaFuncionamento inadequado do pulmão

• Feto tem hemoblogina que é mais afim de O2 do que a da mãe

Anemia falciforme• A mutação homozigota (aa) de um

único nucleotídeo que codifica para a cadeia B da hemoglobina faz com que a forma da hemácea seja modificada– Não há cura, transporte ineficiente de

O2

• Por outro lado, o heterozigoto (Aa) possui maior resistência à malária já que o Plasmodium não consegue infectar tão bem as hemáceas falciformes– Qual o tipo de tratamento que se dá à

doenças genéticas?

Interações protéicas moduladas por energia química (ATP)

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Citoesqueleto• Rede de filamentos protéicos que

se prolongam no citoplasma

• Rede estrutural da célula– Define formato e organização geral

do citoplasma

• Responsável pelos movimentos celulares– Transporte interno de organelas– Transporte de cromossomos na

mitose

• Estrutura dinâmica– Organizado e desorganizado

(divisão celular)

Composição do citoesqueleto

• Formados por três tipos principais de filamentos arranjados em conjunto e associados a organelas e à membrana por proteínas acessórias– Filamentos de Actina– Filamentos intermediários– Microtúbulos

• Funções– Motilidade celular, transporte de

organelas, divisão celular e outros tipos de transporte celular

FA FI MT

Filamentos do citoesqueleto• Cada tipo de filamento do

citoesqueleto é um polímero construído a partir de subunidades menores (monômeros)

• Podem difundir-se rapidamente pelo citoplasma

• Proteínas acessórias associam-se ao citoesqueleto

• Os polímeros do citoesqueleto são mantidos por ligações fracas (não covalentes)

Actina• Proteína globular, principal proteína do

citoesqueleto– 20% das proteínas totais de uma célula– Leveduras: um gene; Mamíferos: 6 genes

• Uma das proteínas mais conservadas sendo 90% idêntica desde os fungos até os mamíferos• Usada frequentemente como controle negativo

• Quando polimerizada forma filamentos do citoesqueleto

• Participa da contração muscular, mobilidade celular, divisão celular, citocinese, movimentação de vesículas e organelas, sinalização celular, estabilização e manutenção das junções celulares, formato celular

• Interage com as membranas celulares

Filamentos de Actina

• Microfilamentos formam feixes ou redes tridimensionais com propriedades de géis semi-sólidos

• O arranjo e a organização dos filamentos, as ligações entre feixes e redes e estruturas celulares são regulados pela ligação com uma variedade de proteínas de associação com a actina

• Os filamentos são particularmente abundantes junto à membrana plasmática– Suporte mecânico e forma celular– Movimento da superfície celular

Microfilamentos de actina• Cada monômero de actina faz

uma rotação no filamento, que apresenta estrutura de hélice de dupla cadeia

• Possui uma polaridade que será importante para a definição do movimento da miosina

• Polimeriza espontaneamente em condições fisiológicas– Polimerização reversível

(dinâmica)• Extremidade positiva cresce de 5

a 10 vezes mais rápido do que a negativa

Organização dos filamentos

• Feixes de actina– Filamentos ligados em agrupamentos paralelos– Proteínas empacotadoras de actina

• Redes de actina– Arranjo ortogonal

Feixes paralelos

• Responsáveis pelas microvilosidades das membranas

Redes de actina

• Filamentos de actina ligados por proteínas filaminas

• Ligações ortogonais– Malha tridimensional

frouxa

• Sustentação da superfície da célula

Adesão celular

• Responsáveis pelo contato com células adjacentes• Fibras de estresse– Fibras de actina que promovem adesão celular

• Fibras de alfa-actinina ligam cateninas e caderinas• Contato célula-célula– Junções de adesão

Projeções de membrana

• Microvilosidades intestinais• Estruturas de resposta a estímulo– Formadas por formação e retração de feixes de actina

• Pseudópodos• Microespículas

Resumo: filamentos de actina

• A: Microvilosidades • B: feixes contráteis citoplasmáticos• C: Protrusões em forma de lâmina e em forma de dedo• D: Anel contrátil durante a divisão celular

Actina, miosina e o movimento celular

• Filamentos de actina estão associados a proteínas miosinas, responsável por movimentos celulares

• A miosina é motor molecular– Converte ATP em energia mecânica– Gera força e movimento

• Responsável pela contração muscular, divisão celular, movimentações celulares

Miosinas• Reconhecidas originalmente como

ATPases presentes em músculos lisos e estriados

• Conservadas na cabeça (liga actina e hidrolisa ATP), mas variáveis na cauda (interação com moléculas)

• Genoma humano possui aproximadamente 40 genes diferentes para miosinas

• Forma define a velocidade com a qual se deslocam nos feixes de actina

Contração muscular• Especialização das células musculares• Músculo como modelo para o estudo

do movimento em nível celular e molecular

• Músculos– Estriado esquelético: movimentos

voluntários– Estriado cardíaco: bombeia sangue do

coração– Liso: movimentos involuntários do

estômago, intestino, útero e vasos sanguíneos

Músculo esquelético

• São feixes de fibras musculares• Citoplasma composto de miofibrilas

– Filamento espessos de miosina – Filamentos finos de actina

• Sarcômeros– Cadeia de unidades contráteis

Sarcômeros• Proteínas titinas

– Ligam miosina da linha Maté o disco Z

• Modelo do filamento deslizante (1954)– Contração do sarcômero– Aproximação dos discos Z– Banda A não sofre alteração– Bandas I e H desaparecem– Deslizamento dos filamentos de

actina

Linha M

O modelo do filamento deslizante

• As cabeças globulares da miosina ligam-se à actina– Ligação entre filamentos finos e

espessos

• A miosina movimenta seus domínios globulares sobre os filamentos de actina em direção ao terminal positivo

Modelo da ponte pênsil

• Além de ligar-se à actina, as regiões globulares da miosina ligam-se e hidrolisam o ATP, que fornece a energia para a realização do deslizamento

• Deslizamento dos feixes de miosina sob os feixes de actina

Miosinas não-convencionais

• Não formam filamentos• Envolvidas em outros tipos de movimentos celulares– Transporte de vesículas e organelas– Fagocitose, emissão de pseudópodos

• Caudas se ligam a organelas• Movimentação sob o

esqueleto de actina

Microtúbulos• Cilindros ocos de 25nm de

diâmetro

• Estruturas dinâmicas em constante processo de organização e desorganização

• Definem a forma da célula

• Promovem locomoção, transporte intracelular de organelas e separação dos cromossomos durante a mitose

Tubulina

• Proteína globular• Arranjos das formas

alfa e beta formam osmicrotúbulos

Estrutura dos microtúbulos

• Formado por dímeros de tubulinasalfa e beta

• Formados por 13 filamentoslineares organizados em volta docentro do túbulo

• Assim como os filamentos de actina são estruturas polares– Extremidade positiva: crescimento rápido– Extremidade negativa: crescimento lento

• A polaridade interfere na direção do movimento ao longo do microtúbulo

Instabilidade dinâmica• Tubulina ligada a GTP é incorporada ao microtúbulo• A adição de tubulina-GTP ocorre mais rápido do que a

hidrólise do GTP -> formação de cap GTP• Na falta de moléculas de GTP ligadas a tubulina, a

hidrólise ocorre de forma mais rápida e o complexo é despoli-merizado

• Remodelamento dos microtúbulos é impor-tante na mitose

Microtúbulos, drogas e câncer• Drogas que se ligam à

tubulina, como a colchicina e a colcemida inibem a polimerização de microtúbulos

• Inibem assim a divisão celular (mitose)

• Outras drogas que se ligam aos microtúbulos são também utilizadas no tratamento de câncer, como vincristina e vimblastina

Centríolo, centrossomo e organização dos microtúbulos

• Microtúbulos se estendem a partir de um centro organizador de microtúbulos– O centrossomo se localiza

junto ao núcleo

• Durante a mitose os centrossomos formam os fusos mitóticos, responsáveis pela separação dos cromossomos nas células filhas

Centrossomos

• Formados por um par de centríolos organizados perpendicularmente, circundados pelo material peri-centriolar

• Centríolo: estrutura cilíndrica formada por 9 tripletes de microtúbulos

• Funções de organizaçãodos microtúbulos pelocentrossomo

Organização dos microtúbulos na mitose

• Organização do fuso mitótico: responsável pela separação dos cromossomos homólogos

• Centríolo e componentes do centrossomo são inicialmente duplicados

• Os dois centrossomos são então localizados em cada um dos lados do núcleo

• Na mitose ocorre despolimerização e retração geral dos microtúbulos

Microtúbulos motores e movimentos

• Responsáveis por movimentos celulares, transporte intracelular, posicionamento de vesículas e organelas, separação dos cromossomos, batimento de cílios e flagelos

• Assim como no caso da actina a movimentação é realizada por proteínas motoras que usam a energia do ATP

• Cinesinas e dineínas fazem aqui o papel da miosina

Cinesinas e dineínas

• Movem-se em direções opostas ao longo dos microtúbulos– Cinesina: move-se para a extremidade positiva– Dineína: extremidade negativa

• Cerca de 100 diferentes cinesinas em humanos

Transporte de organelas

• Neurônios com metros de comprimento precisam ter moléculas transportadas para o axônio

• Vesículas secretoras vindas do Golgi são transportadas ao longo dos microtúbulos aos axônios

Separação dos cromossomos mitóticos

• Ocorre durante a anáfase• Anáfase A– Movimento dos cromossomos em

direção ao polo do fuso

• Anáfase B

Separação dos polos do fuso

Cílios e Flagelos

• Projeções de membrana formadas por microtúbulos e responsáveis pelo movimento de células eucarióticas

• Flagelos de bactérias são protéicos (não tubulina)

• Estrutura emaxonema (9+2)

Sistema imunológico

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Proteínas e imunologia• A maioria das interações proteína-ligante não envolve

grupo prostético• Discriminação efetiva do ligante é na forma de sítio de

ligação proteína-proteína• Resposta imunológica– A distinção molecular entre “próprio” e “não-próprio”– Teoria de rede– O sistema homeostático bioquímica é altamente sensível

e desenvolvido através das reações entre ligantes e proteínas

Sistemas imunológicos• Imunidade celular

– Células hospedeiras infectadas por vírus, parasitas e tecidos estranhos

– Linfócitos T• Parasitas possuem receptores de células Tc• Células T auxiliares produzem proteínas

sinalizadoras (citocinas)

• Imunidade humoral– Infecções bacterianas e virais, proteínas

estranhas– Anticorpos ou imunoglobulinas (Ig)– 20% das proteínas do sangue são Igs

produzidas pelos linfócitos B

Proteínas imunológicas• Proteínas de reconhecimento

altamente específicas (humanos teem 108 anticorpos com especificidades diferentes)– Receptor de célula T– Anticorpo produzido por célula B

• Antígeno: molécula que induz resposta imunológica– Epitopo: determinante antigênico,

região da molécula reconhecida

• Imunoglobulinas (ig’s): formadas por 4 cadeias polipeptídicas, sendo 2 pesadas e 2 leves

Imunoglobulinas• Ligação específica entre

antígeno e anticorpo• Imunoglobulinas podem ser

encontradas em monômeros, dímeros, trímeros, multímeros

• Marcação do patógeno para engolfamento por macrófagos

Ligação antígeno-anticorpo• Firme e específica• É a base para procedimen-tos

analíticos importantes• Anticorpo

– policlonal: reconhecido por várias células B diferentes

– Monoclonal: reconhecidos pela mesma população de células B

• Anticorpo pode ser ligado a uma resina cromatográfica para separação de uma proteína específica

• Exames sorológicos: detecta presença e quantidade do antígeno

• Immunoblot

Conclusões• As proteínas teem inúmeras funções celulares• A estrutura da proteína é altamente relevante para que ela tenha uma função celular• O contato proteína-proteína regula muitas funções intra e intercelulares (receptores

de membrana)• As proteínas mudam de conformação quando encaixadas a um ligante

– A ligação reversível da proteína ao ligante é importante na regulação do metabolismo– Sítios de ligação podem ligar diferentes moléculas, algumas com mais afinidade do que o

ligante desejado

• Proteínas interagem para a formação do citoesqueleto e contração muscular, gastando energia química

• Polimeração e despolimerização de complexos poliméricos acontecem em todo o instante nas células

• Proteínas podem ligar moléculas indiretamente -- através de grupos prostéticos• Há um controle dos ligantes mais comuns dentro de um organismo e a presença de

novas moléculas desconhecidas aciona o sistema imune

• Aula baseadano livro do Lehninger(Nelson e Cox)

• Capítulo 5

• The cell– Cap 11