renatura§£o prot©ica 2013

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  • 7/23/2019 Renaturao Protica 2013

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    INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

    Autarquia associada Universidade de So Paulo

    ESTUDOSDERENATURAODEPROTENASAGREGADAS

    UTILIZANDOALTASPRESSESHIDROSTTICAS

    Natlia Malavasi Vallejo

    Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias

    So Paulo

    2013

  • 7/23/2019 Renaturao Protica 2013

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    INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

    Autarquia associada Universidade de So Paulo

    ESTUDOSDERENATURAODEPROTENASAGREGADAS

    UTILIZANDOALTASPRESSESHIDROSTTICAS

    Natlia Malavasi Vallejo

    Tese apresentada como parte dos

    requisitos para obteno do Grau de

    Doutor em Cincias na rea de

    Tecnologia Nuclear Aplicaes.

    Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias

    So Paulo

    2013

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    Dedico este trabalho s pessoas mais

    importantes da minha vida: meus pais, Paulo e Beth,

    que confiaram no meu potencial para esta conquista.No conquistaria nada se no estivessem ao meu lado.

    Obrigada, por estarem sempre presentes a todos os

    momentos, me dando carinho, apoio, incentivo,

    determinao, f, e principalmente pelo Amor de vocs!

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    Agradecimentos

    Agradeo principalmente Deus, por ter me dado a vida e estar sempre do

    meu lado, permitindo que com o passar do tempo eu possa evoluir principalmente

    como ser humano.

    Aos meus pais, Pauloe Beth, por dedicarem a vida por mim, por fazer de

    mim quem sou hoje, e pelo amor incondicional que sempre me fez seguir no

    caminho que escolhi.

    Ao meu irmo Diego e a minha tia Eliane, mesmo que de longe,

    participaram de mais esta conquista e tenho certeza que torceram todos os dias

    pelo meu sucesso. Muito Obrigada, Amo vocs!!

    Ao Bruno, pelo apoio em tudo que fao, pela dedicao, pacincia e amor

    durante todos esses anos.

    minha orientadora Ligia Ely Morganti Ferreira Dias, pela oportunidade

    de ser sua aluna, pela confiana depositada em mim e por compartilhar comigo

    seus conhecimentos e experincias profissionais.

    Ao Prof. Dr. Patrick Jack Spencer, por toda a ajuda e conselhos na

    realizao deste trabalho e por dividir comigo seus conhecimentos e experincias

    no laboratrio durante todos esses anos.

    Ao Dr. Carlos Bonaf, pela colaborao permitindo a utilizao do sistema

    de presso do Laboratrio Termodinmica de Protrenas da UNICAMP e a

    Julianae Joelmapela ajuda na realizao dos experimentos.

    Ao Dr. Geraldo Santana Magalhes, pela doao do gene da eGFP.

    Ao Dr. Shaker Chuck Farah, a Cristiane Guzzo, ao Maicone ao Raphael

    pela doao dos genes das protenas de Xac e pela ajuda na realizao dos

    experimentos de purificao e atividade biolgica destas protenas.

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    As amigas de trabalho, Laura, Daniella e Rosa, cada uma com o seu

    jeitinho aprendi que a convivncia com as pessoas no fcil, porm

    impossvel realizar o trabalho sozinha. Sem vocs o trabalho ficaria muito mais

    difcil, a cada uma o meu muito obrigada!!!

    s amigas que fiz no IPEN, Danielle, Keli, Larissa, Karina e Renata,

    pelas conversas, conselhos, saidinhas, almoos e tardes de risadas que tivemos

    durante todos esses anos de amizade. Muito Obrigada!

    Aos amigos que fiz no IPEN, Alberto (Troxinha), Mariana, Tamara,

    Rodrigo, Vincent, Eliza, Bia, Fernanda, Bruno, Ed Carlos, Allison, Daniele e a

    tantos outros.

    A todos os funcionrios do Centro de Biotecnologia do IPEN, que cada um

    em seu setor fez parte da realizao deste trabalho, Rute, Arlete, Z Maria,

    Junqueira, Joo, Sr. Longino, Sandra, Beth, Nia, Marisa, Gislaine, sem

    vocs no seria possvel.

    s amigas, Renata (Fuba), Flavinha (Florzinha)e Claudinha (Japa)pela

    amizade, pelo companheirismo, pelo apoio, pela pacincia, pelas risadas e choros

    e por todos esses anos inesquecveis que passamos juntas. Muito Obrigada pela

    amizade!!

    s amigas, Bianca, Giovanna, Thas, Gabie Thalita, que com o passar do

    tempo cada uma tomou um caminho diferente e no importa a distncia e o tempo

    que passamos sem nos falar ou nos ver, que a amizade, o carinho e o amor

    continuam os mesmos, e tenho certeza que torcem pela minha felicidade. Muito

    Obrigada!!!

    Ao CNPq e a FAPESPpelo apoio financeiro.

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    S depois que o passado passou que a gente descobre o quanto ele foi

    bom enquanto durou

    Eno Teodoro Wanke

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    ESTUDOSDERENATURAODEPROTENASAGREGADAS

    UTILIZANDOALTASPRESSESHIDROSTTICAS

    NATLIAMALAVASIVALLEJO

    RESUMO

    No presente trabalho estudamos a renaturao sob alta presso

    hidrosttica de uma forma mutante da protena verde fluorescente (enhanced

    GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescncia caracterstica quando enovelada

    na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da

    bioatividade da protena recombinante, a fluorescncia, como alternativa determinao de solubilidade da protena, fator que no um indicador ideal de

    enovelamento proteico adequado. A ao da alta presso na solubilizao dos

    corpos de incluso (CI) de eGFP produzidos em bactrias E. colirecombinantes e

    no enovelamento da protena foi estudada. A compresso dos CI de eGFP em 2,4

    kbar durante 30 minutos promoveu a dissociao dos agregados. No entanto, a

    incubao nesta condio no favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo

    de renaturao foi avaliado em diversas condies de descompresso aps a

    dissociao em 2,4 kbar. Durante a descompresso gradual, o aumento da

    fluorescncia foi obtido em presses que variaram entre a presso atmosfrica e

    1,38kbar. Os nveis mais elevados de fluorescncia de eGFP foram obtidos por

    incubao durante vrias horas a nveis de presso entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta

    condio de presso se mostrou favorvel renaturao de eGFP e possvel

    que tambm possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras

    protenas monomricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que

    os CI desta protena produzidos por bactrias cultivadas em menor temperatura

    (37C) possuem maior quantidade de protena recombinante apresentando a

    fluorescncia caracterstica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os

    CI expressos em temperaturas mais elevadas (42C e 47C). A anlise realizada

    por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) tambm demonstrou que os CI

    produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas

    secundrias semelhantes s da protena na sua forma nativa. Alm disso, os CI

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    produzidos a 37C tambm so mais facilmente solubilizados pela ao da alta

    presso do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a

    renaturao da eGFP a partir de CI produzidos a 37C foi 25 vezes mais eficiente

    do que a obtida utilizando CI produzidos a 47C. No presente estudo

    demonstramos tambm que a dissociao dos agregados exercida pela ao daalta presso (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associao com a

    incubao em baixa temperatura (-9C) e que a combinao destas duas

    propriedades fsicas eleva a solubilizao dos agregados em CI, com a

    consequente elevao dos rendimentos de renaturao de eGFP. Mostramos

    ainda no presente estudo que a cintica de renaturao de eGFP em 0,69 kbar

    proporcional temperatura de incubao (entre 10C e 50C). O nvel mais

    elevado de fluorescncia foi obtido quando a renaturao de eEGP foi realizada a

    20C. A taxa de maturao do cromforo da eGFP mais fortemente afetada pelatemperatura do que a taxa de enovelamento da protena. Em concluso, a

    temperatura de produo dos CI, a temperatura de dissociao dos agregados e

    a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cintica da

    renaturao de eGFP em alta presso.

    Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para

    melhorias no processo de enovelamento de protenas a partir de CI utilizando alta

    presso. Tambm neste trabalho descrevemos a renaturao das protenas de

    Xac, PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na

    forma solvel. Os rendimentos de solubilizao destas trs protenas foram muito

    altos, entre 75% e 89%. A protena PilB renaturada em alta presso apresentou

    atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de

    Xac.

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    RENATURATIONSTUDIESOFAGGREGATEPROTEINSUSING

    HIGHHYDROSTATICPRESSURE

    NATLIAMALAVASIVALLEJO

    ABSTRACT

    In the present work we studied the refolding under high hydrostatic pressure

    of a mutant form of the green fluorescent protein (eGFP), which only emits the

    green characteristic fluorescence when in the native folded state. The approach of

    the present study was focused on controlling the bioactivity of the recombinant

    protein, the fluorescence, as an alternative for the determination of proteinsolubility, which is not an ideal indicator of proper protein folding. We studied the

    action of high pressure in the solubilization of the inclusion bodies (IB) of eGFP

    produced in bacteria E. coliand in the folding of this protein. The compression of a

    suspension of eGFP IB at 2.4 kbar for 30 minutes promoted dissociation of

    aggregates. However, the eGFP folding, monitored by the fluorescence at 509 nm,

    does not occur in this pressure l