IntroduçãoIntrodução

Este trabalho laboratorial foi Este trabalho laboratorial foi realizado com o intuito de produzir, na realizado com o intuito de produzir, na bactéria bactéria E. ColiE. Coli, a proteína Drg11 , a proteína Drg11 associada a dois “tags” diferentes:associada a dois “tags” diferentes:

6 Histidinas6 Histidinas

GST (Glutationa S-Transferase)GST (Glutationa S-Transferase)

Drg11Drg11

É uma proteína de regulação de 30KDa É uma proteína de regulação de 30KDa que funciona como factor de transcrição. que funciona como factor de transcrição.

É importante no estabelecimento do É importante no estabelecimento do circuito nociceptivo durante o circuito nociceptivo durante o desenvolvimento embrionário.desenvolvimento embrionário.

Pode estar envolvido na organização dos Pode estar envolvido na organização dos neurónios.neurónios.

Importância deste trabalhoImportância deste trabalho

A expressão heteróloga de proteínas é A expressão heteróloga de proteínas é muito importante quando se pretende muito importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das proceder ao estudo funcional das mesmas.mesmas.

Em primeiro lugar, torna-se necessária Em primeiro lugar, torna-se necessária a produção e purificação da proteína e, a produção e purificação da proteína e, finalmente, a obtenção do anticorpo finalmente, a obtenção do anticorpo que lhe corresponde.que lhe corresponde.

As proteínas de fusão consistem na As proteínas de fusão consistem na associação de duas proteínas (a Drg11 associação de duas proteínas (a Drg11 com um tag).com um tag).

A utilização de tags possibilita a A utilização de tags possibilita a purificação da proteína de interesse, purificação da proteína de interesse, através da cromatografia de afinidade, através da cromatografia de afinidade, por intermédio do uso de resinas com por intermédio do uso de resinas com determinados constituintes que determinados constituintes que apresentam afinidade para esses tags.apresentam afinidade para esses tags.

His-Drg11: resina com NíquelHis-Drg11: resina com Níquel GST-Drg11: resina com glutationaGST-Drg11: resina com glutationa

Os vectores de expressão utilizados são Os vectores de expressão utilizados são os plasmídeos:os plasmídeos:

PGEX – contém o cDNA da PGEX – contém o cDNA da proteína de fusão GST-Drg11.proteína de fusão GST-Drg11.

PRSETA – contém o cDNA da PRSETA – contém o cDNA da proteína de fusão His-Drg11.proteína de fusão His-Drg11.

Utilizam-se dois vectores diferentes Utilizam-se dois vectores diferentes porque as proteínas de fusão podem ter porque as proteínas de fusão podem ter comportamentos diferentes nas culturas comportamentos diferentes nas culturas de bactérias seleccionadas.de bactérias seleccionadas.

E.ColiE.Coli

A estirpe de A estirpe de E.ColiE.Coli utilizada foi a utilizada foi a BL21.BL21.

A BL21 é uma estirpe geneticamente A BL21 é uma estirpe geneticamente modificada, caracterizada pela modificada, caracterizada pela inactivação de muitos dos genes que inactivação de muitos dos genes que codificam as suas proteases. Assim, a codificam as suas proteases. Assim, a probabilidade de ocorrer a proteólise probabilidade de ocorrer a proteólise das proteínas de interesse é menor. das proteínas de interesse é menor.

ProcedimentosProcedimentos

Foram-nos fornecidos dois stocks Foram-nos fornecidos dois stocks de bactérias desta estirpe de bactérias desta estirpe previamente submetidas a um previamente submetidas a um processo de transformação com os processo de transformação com os dois plasmídeos recombinantes: dois plasmídeos recombinantes:

PRSETA ( His-Drg11)PRSETA ( His-Drg11)

PGEX (GST-Drg11)PGEX (GST-Drg11)

Drg11

PRSETAPRSETA

His1KDa + 30KDa = 31KDa

cDNA da Drg11

Drg11GST

26KDa + 30KDa = 56KDa

PGEXPGEXcDNA da

Drg11

Protocolo experimental2 stocks de bactérias

submetidas a um processo de transformação

Repicou-se e colocou-se em LB/Ampicilina

Rejuvenesceu-se (1/10 em LB/Ampicilina)

Adicionou-se IPTG

Overnight a 30ºC

2h30

Aguardou-se 4h para expressão das proteínas

O IPTG é um indutor da transcrição O IPTG é um indutor da transcrição genética que aumenta a quantidade da genética que aumenta a quantidade da enzima T7 RNA polimerase, a qual se liga enzima T7 RNA polimerase, a qual se liga ao promotor T7, iniciando a transcrição do ao promotor T7, iniciando a transcrição do cDNA de interesse.cDNA de interesse.

Para cada conjunto de bactérias Para cada conjunto de bactérias transformadas realizou-se um controlo e transformadas realizou-se um controlo e variou-se a concentração deste indutor, a variou-se a concentração deste indutor, a fim de conhecer a concentração ideal a fim de conhecer a concentração ideal a adicionar.adicionar.

Sedimentou-se por centrifugação

Aspirou-se o sobrenadante

Colocou-se o pellet em gelo

Adicionou-se uma mistura de lise

Nonidet P40

Mg2+

PBS

DNAse

Obteve-se um extracto de proteínas

SDS-PAGE

Corou-se com Azul de Coomassie

SDS-PAGE com amostras do SDS-PAGE com amostras do extracto proteico da extracto proteico da E. ColiE. Coli

transformada com o plasmídeo transformada com o plasmídeo PRSETA (cDNA de His-Drg11)PRSETA (cDNA de His-Drg11)

Clone 3 Clone 2IPTG(mM) 2 1 0,5 0 2 1 0,5 0

KDa2001169766

45

31

21

Uma banda de Uma banda de peso molecular de peso molecular de cerca de 100 KDa cerca de 100 KDa foi induzida. Pode foi induzida. Pode representar a T7 representar a T7 RNA Polimerase.RNA Polimerase.

Na zona de peso Na zona de peso molecular molecular esperado (31 KDa) esperado (31 KDa) encontrou-se uma encontrou-se uma banda de 26 KDa .banda de 26 KDa .

SDS-PAGE com amostras do SDS-PAGE com amostras do extracto proteico da extracto proteico da E. ColiE. Coli

transformada com o plasmídeo transformada com o plasmídeo PGEX (cDNA de GST-Drg11)PGEX (cDNA de GST-Drg11)

Não se observou Não se observou nenhuma banda de nenhuma banda de 56 KDa.56 KDa.

Provavelmente não Provavelmente não ocorreu indução.ocorreu indução.

Clone 2 Clone 1IPTG(mM) 2 1 0,5 0 2 1 0,5 0

KDa2001169766

45

31

21

Aplicou-se a técnica imunoblotting:

Repetiu-se o SDS-PAGE;

Fez-se um Western blotting;

Incubou-se com o anticorpo anti-Drg11 disponível.

Aparentemente não houve indução da transcrição do cDNA responsável pela produção da GST-Drg11, no entanto parece ter havido expressão da His-Drg11. Para confirmar estas possibilidades:

Membrana de nitrocelulose do Membrana de nitrocelulose do plasmídeo PRSETA (cDNA de plasmídeo PRSETA (cDNA de

His-Drg11)His-Drg11)

KDa200

–116

–97

–66

–

45 –

31 –

21 –

Clone 2 Clone 30 0,5 1 2 0 0,5 1 2 IPTG(mM)

Membrana de nitrocelulose do Membrana de nitrocelulose do plasmídeo PGEX (cDNA de plasmídeo PGEX (cDNA de

GST-Drg11)GST-Drg11) Clone 1 Clone 2 0 0,5 1 2 0 0,5 1 2 IPTG(mM)

KDa200

–116

–97

–66

–

45 –

31 –

21 –

Com bases nos resultados obtidos, Com bases nos resultados obtidos, conclui-se que não ocorreu a conclui-se que não ocorreu a expressão das proteínas His-Drg11 expressão das proteínas His-Drg11 e GST-Drg11.e GST-Drg11.

Razões para a falta de Razões para a falta de expressão da Drg11expressão da Drg11

Condições de indução: Condições de indução: Concentrações de IPTG insuficientes;Concentrações de IPTG insuficientes; Temperatura e tempo de indução Temperatura e tempo de indução

inadequados.inadequados. As proteínas a obter podem ter tido um As proteínas a obter podem ter tido um

efeito tóxico nas bactérias utilizadas.efeito tóxico nas bactérias utilizadas. Reconhecimento destas proteínas como Reconhecimento destas proteínas como

sendo estranhas pelas bactérias e, sendo estranhas pelas bactérias e, consequente, proteólise das mesmas.consequente, proteólise das mesmas.

Sugestões para trabalhos Sugestões para trabalhos futurosfuturos

Selecção de outra estirpe de Selecção de outra estirpe de E. ColiE. Coli;; Utilização de um meio de cultura Utilização de um meio de cultura

diferente;diferente; Variação das condições de indução;Variação das condições de indução; Fazer nova transformação bacteriana;Fazer nova transformação bacteriana; Tentativa de expressão destas Tentativa de expressão destas

proteínas por formas truncadas.proteínas por formas truncadas.

BibliografiaBibliografia

Alberts B, Jonhson A; Lewis J; Raff M; Roberts K; Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4ª edição, Garland Science, 2000.

Cooper, GM. The cell, a molecular approach. 2ª edição, Sinauer Associates, Inc., 2000.

www.invitrogen.com

www.amershambiosciences.com

AgradecimentosAgradecimentos

Serviço de Histologia e Embriologia Serviço de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado;disponibilizado;

Professor Doutor Carlos Reguenga Professor Doutor Carlos Reguenga pela orientação facultada ao longo do pela orientação facultada ao longo do trabalho;trabalho;

Professora Doutora Deolinda Lima Professora Doutora Deolinda Lima pela oportunidade de realizar um pela oportunidade de realizar um trabalho laboratorial.trabalho laboratorial.