estudos para seleção de mestrado em biologia molecular

Heidi Muniz

Material de estudo para selecao de mestrado em BiologiaMolecular

Abril de 2015

Sumario

1 Estrutura da Cromatina 2

2 Regulacao da estrutura da cromatina 5

3 Replicacao e Reparo de DNA 7

4 Transcricao 11

5 Traducao 19

6 Organelas e Membranas 21

7 Estrutura de protenas 26

8 Enovelamento de protenas 29

9 Enzimas 30

10 Crescimento Microbiano 32

11 Divisao celular bacteriana 38

12 Archaea 40

13 Biofilme 42

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Captulo 1

Estrutura da Cromatina

Pegadinha : O genoma humano esta distribudo em 23 pares de cromossomos, totalizando 46 cromossomos.Porem, existem 24 tipos de cromossomos, pois 22 pares realmente, cada par e um de um tipo, mas para o 23o

par, um cromossomo e de um tipo (X) e o outro e de outro tipo (Y), logo 22 + 2 = 24 tipos de cromossomos.Cromatina : complexo entre DNA e protenas, principalmente histonas. Estas protenas dobram e empa-

cotam o DNA em uma estrutura mais compacta.Cada cromossomo corresponde a uma unica molecula de DNA, associada a protenas, bastante compacta.OBS: o cromossomo bacteriano, tambem tem DNA associado a protenas, no entanto, estas protenas sao

diferentes daquelas do cromossomo eucarioto.Cromossomos homologos: sao os membros de um par de cromossomos, sendo um cromossomo de origem

materna e e outro de origem paterna. O unico par de cromossomos nao homologos e o par de cromossomossexuais.

cromossomos mitoticos: cromossomos na mitose, que estao altamente condensados. cromossomos in-terfasicos: cromossomos na interfase, e cuja cromatina apresenta-se como finos cordoes, emaranhados ealongados no nucleo.

Ha 3 sequencias que controlam a replicacao e divisao dos cromossomos:

Origens de replicacao: e nestas sequencias que se inicia a replicacao. Centromeros: regioes onde as duas copias de um cromossomo duplicado se ligam, e no centromero que se

forma o cinetocoro (complexo proteico) necessario para que o fuso mitotico se prenda aos cromossomose realize a separacao das cromatides irmas.

Telomeros: regiao da extremidade de uma molecula de DNA, possui varias copias de sequencias repe-tidas, e assegura a replicacao completa da molecula de DNA, alem disso a fita simples de repeticoespolimerizada pela telomerase projeta-se para dentro da dupla helice, evitando sua degradacao, e per-mitindo que a telomerase estenda numa proxima replicacao, o telomero.

Na cromatina existem dois tipos de protenas ligadas ao DNA:

Histonas : estas protenas possuem uma grande proporcao de aminoacidos carregados positivamente(arginina e a lisina), que lhes permitem ligar-se mais facilmente ao DNA, negativamente carregado.

Protenas nao histonas: estao envolvidas com outras funcoes, como replicacao e expressao genica.

Nucleossomo: nvel mais basico de organizacao cromossomica ou ainda subunidade estrutural basica dacromatina, que consiste de DNA enrolado em um nucleo de protenas histonas. Cada cerne nucleossomico eformado por um complexo de oito protenas histonas: duas de cada : H2A, H2B, H3 e H4, enrolado por umsegmento de DNA.

Cada segmento de DNA ligando nucleossomos chama-se DNA de ligacao. Conformacao das histonas:dobra de histona, com 3 alfa-helices e 2 alcas.

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CAPITULO 1. ESTRUTURA DA CROMATINA 3

Existe uma outra histona, H1, se liga a um em cada 10 nucleossomos. A H1 e a mais pesada, dentre ashistonas citadas e tem a maior porcentagem de arginina-lisina. Ela nao faz parte do octamero. E tambemchamada de histona ligadora.

O DNA e as histonas interagem por interacoes nao covalentes:

Ligacoes de hidrogenio Interacoes ionicas Interacoes hidrofobicasDobramentos: as histonas dispoem-se no cerne nucleossomico, de modo que sua extremidade N-terminal

fique projetada para fora do cerne. Essas caudas N-terminal das histonas estao sujeitas a diferentes modi-ficacoes covalentes, que acabam por determinar a estrutura e funcao da cromatina. O DNA tambem sofredobramentos ao redor do cerne de histonas, forcando uma compressao da cavidade menor da helice. Algumassequencias ligam-se aos nucleossomos mais fortemente que outras.

O DNA enrolado em um nucleossomo e bastante dinamico, se desenrola e enrola rapidamente (cerca de 4vezes por segundo) ao cerne nucleossomico; permitindo assim que outras protenas ligadoras de DNA acessemo DNA que estava enrolado em um nucleossomo. Desse modo, a maioria do DNA em um nucleossomo isoladoesta em princpio, disponvel para interagir com outras protenas.

Complexo de remodelamento da cromatina: complexo proteico que catalisa um afrouxamento adicionaldas interacoes entre DNA e histonas, sendo que este processo envolve como participante da reacao o ATP,ou seja, o processo envolve a presenca de ATP.

Ha varios complexos de remodelagem: SWISNF, NURF, RSC.Estes complexos podem gerar 3 tipos comuns de remodelagem

As histonas podem deslizar pelo DNA, alterando a posicao de uma sequencia de DNA ligada ao cernenucleossomico.

Alteracao do espacamento entre octameros de histonas, alterando assim as posicoes de sequenciasindividuais em relacao a` protena.

Um ou mais octameros podem ser totalmente deslocados do DNA, originando lacunas desprovidas denucleossomo (ou lacunas de DNA livre).

A regulacao da transcricao bacteriana pode ser explicada com o modelo de equilbrio (DNA nao ligadoDNAligado a protena) dependente da concentracao de protenas. O stio de ligacao do DNA e ocupado quandoa concentracao da protena ligadora de DNa e suficientemente alta. Quando o stio de ligacao e ocupado, oestado de expressao do DNA e afetado. Alteracoes nas concentracoes de ativadores e repressores, afetarao aexpressao genica a qualquer momento.

ESte modelo de equilbrio dependente de concentracao nao e valido para eucariotos, devido a` estruturada cromatina. Se um fator de transcricao estiver ligado ao DNa livre, as histonas nao conseguem se ligar aoDNa para formar nucleossomo. O inverso e valido: se o DNa estiver enrolado num octamero de histonas, naoe possvel um fator de transcricao se ligar ao DNA.

Cada um destes estados, o primeiro em que o gene e expresso, e o outro em que o gene nao e expresso,e dito estavel, pois o estado nao muda se for alterada a concentracao dos componentes livres. Ou seja, se oDNa esta ligado a fatores de transcricao e RNA polimerase, nao importa se houver aumento da concentracaode histonas, estas nao conseguirao se ligar ao DNa e o gene continuara no estado de expressao ativo. Ocontrario vale para o estado em que o DNA esta como componente de nucleossomo.

Regioes do DNA na superfcie do nucleossomo sao acessveis a` clivagem por determinadas nucleases. Asenzimas DNAase I e DNAase II clivam fita simples de DNA, e geram escadas de eletroforese cujo intervaloentre fragmentos e de 10 pb. Nem todos os stios sao clivados com a mesma frequencia, alguns sao maiseficientemente clivados que outros. Como os padroes de bandas de eletroforese dos fragmentos de DNAclivado por DNAase I, DNAase II e radical hidroxil sao os mesmos, supoe-se que o que determina o padraoe primariamente a organizacao o DNA, e com apenas alguma preferencia discreta por stios particularesimposta pela enzima individual. Pode-se associar a ausencia de clivagem em stios do DNA associado nonucleossomo a posicoes do DNA inacessveis.

CAPITULO 1. ESTRUTURA DA CROMATINA 4

Na transcricao, a RNA pol inicia a sntese de RNA em um segmento de DNA nao impedido por nucleosso-mos. MAs para que a RNa pol prossiga a transcricao, os nucleossomos a sua frente devem ser deslocados. Istoocorre por meio da acao de fatores de transcricao que recrutam complexos de remodelagem, os quais por meiode um processo ativo, promovem o deslocamento dos nucleossomos para a regiao adjacente a de transcricao.Os octameros reorganizam-se na regiao deixada para tras da transcricao. A protena FACT (facilitadora datranscricao da cromatina), atua como fator de elongacao de transcricao, pois altera a estrutura do octameroe consequentemente e provavel que faca parte do complexo de remodelagem.

Explicando a chatice dos stios hipersensveis Um stio hipersensvel a` clivagem por nucleases, e umstio bastante suscetvel a clivagem. Geralmente os genes ativos possuem stios hipersensveis a clivagem, eisto e essencial para sua transcricao. A sensibilidade aumentada a nucleases esta associada a` exclusao denucleossomos. Logo, o DNA em stios hipersensveis nao esta organizado em nucleossomos, e assim, estamais exposto a enzimas que outras regioes. Traduzindo, a importancia da presenca destes stios a montantede promotores de genes ativos, e que estes stios permitem a ligacao de protenas necessarias a transcricao.Existem ainda regioes que ficam protegidasquando sao flanqueadas por stios hipersensveis. Por protegidasentenda-se que se ligam protenas nao-histonas. Nos stios hipersensveis tambem se ligam protenas, queregulam e impedem a ligacao do octamero de histonas ao DNA do stio. Conclusao da historia: um domnioque contem um gene transcrito pode ser definido por uma sensibilidade aumentada a` degradacao por DNaseI.

Isoladores: stios que impedem a propagacao de um efeito (intensificador ou silenciador ) da transcricao.Estes isoladores sao flanqueados por stios hipersensveis, ou seja, por DNA nao associado a histona. Umisolador pode ter uma ou as duas propriedades:

Isolador situado entre um stio intensificador e um promotor; impede que o intensificador ative opromotor.

Isolador situado entre heterocromatina e o promotor de um gene; protege o gene contra o efeito inati-vador que se dissemina a partir da heterocromatina.

LCR: regiao de controle de locus corresponde a um grupo de genes hipersensveis, sao essenciais a expressaode cada gene em um domnio de varios genes consecutivos.

A estrutura de cromatina descrita ate agora nao e a estrutura que o DNA assume dentro de um nucleo.Na verdade, o DNA encontra-se compactado sob a forma de uma fibra de 30 nm de diametro, em vez daestrutura de colar de contas. Esta fibra de cromatina e resultante do empilhamento de nucleossomos. Hadiferentes modelos moleculares para explicar esta fibra de 30 nm de cromatina. Um modelo e o de zigue-zague, outro e o de solenoide, etc. Apesar de ainda nao ser completamente satisfatorio o conhecimento atualsobre os detalhes moleculares da fibra de 30 nm, sabe-se que dois importantes fatores que determinam o forteempilhamento de nucleossomos sao: a cauda da H4 e a histona H1.

Captulo 2

Regulacao da estrutura da cromatina

Ha dois tipos gerais de estrutura de cromatina presentes no eucariotos: heterocromatina e eucromatina.Heterocromatina: forma altamente condensada; ocorre em regioes de poucos genes, e estes normalmente

sao silenciados pela alto grau de compactacao. A heterocromatina deve ser vista como um conjunto dediferentes tipos de estrutura de cromatina altamente compactada.

Eucromatina: forma menos condensada.Efeitos posicionais: reposicionar um gene da eucromatina para uma regiao de heterocromatina tem como

resultado o silenciamento do gene.Modificacoes de histonas: acetilacoes, mono, di e trimetilacao de lisinas fosfosrilacao de serinasGrande parte destas modificacoes ocorre nas cadeias laterais das caudas N-terminais das histonas, que se

projetam para fora do nucleossomo. No entanto, modificacoes nas cadeias laterais de aminoacidos do cerneglobular do nucleossomo tambem ocorrem.

Todas estas modificacoes sao catalisadas por enzimas especficas, ex:acetil-transferase de histonas: catalisa acetilacoes nas histonas complexo de desacetilases de histonas:

catalisa a retirada dos grupos acetilas adicionados metil-transferase de histonas: catalisam metilacoes nashistonas complexo de demetilases de histonas: catalisam a retirada dos grupos metila adicionados a` histonas

Todas estas enzimas sao recrutadas por protenas de regulacao genica. A acetilacao de lisinas tende aafrouxar a estrutura de cromatina visto que o grupo acetil remove a carga positiva da lisina, reduzindo aafinidade das caudas aos nucleossomos adjacentes. Porem, o efeito mais drastico da modificacao de histonas eque histonas modificadas atraem protenas especficas para um segmento de cromatina, e estas novas protenasdeterminam como e quando os genes serao expressos. Portanto, a estrutura da cromatina determina aexpressao de genes nela empacotados, que por sua vez determinam a estrutura e funcao de uma celulaeucariotica.

Alem das modificacoes covalentes, a presenca de variantes de histonas atuam para produzir um codigo dehistonas, que auxilia a determinar a funcao biologica.

A acetilacao e a metilacao sao mutuamente exclusivas, ou seja, uma lisina nao pode ser acetilada emetilada ao mesmo tempo.

Codigo de histonas: muitas modificacoes parecem ter um significado especfico para a celula, pois deter-minam como e quando o DNa empacotado nos nucleossomos sera acessado. Ex: um tipo de marca podeindicar que o DNa foi replicado recentemente, outro tipo de marca pode indicar que o DNa esta danificado,outro tipo pode indicar quando e como a expressao genica deve ocorrer. Parece que existem moleculas de umcomplexo de leitura de codigo que identificam as modificacoes e sinalizam a acao a ser tomada. As marcasnos nucleossomos sao constantemente removidas e adicionadas, sendo a velocidade dependente da localizacaocromossomica.

Existem dois tipos de heterocromatina, a constitutiva e a facultativa. Predominantemente a heterocro-matina ocorre nos centromero e nos telomeros.

Efeito posicional variegado: variacao na expressao de um gene devido a` inativacao aleatoria deste geneem uma populacao de celulas homogeneas. Este efeito e causado frequentemente por justaposicao entre aregiao do gene e um bloco heterocromatina. Ressalta-se que quando o gene fica muito proximo ou sobrepostoa regiao de heterocromatina, este gene e silenciado.

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CAPITULO 2. REGULACAO DA ESTRUTURA DA CROMATINA 6

Complexo de leitura e escrita de codigo de histonas: as protenas de regulacao genica recrutam complexosmultisubunidades, que possuem protenas que promovem as modificacoes nas histonas (escrevem), seguidaspor protenas que reconhecem estas modificacoes (leitura). Assim, as enzimas de escritas e as protenas deleitura trabalham em conjunto para marcar os nucleossomos, um a um. Muitos destes complexos de leiturae escrita possuem tambem protenas de remodelagem de cromatina, que juntamente com ATP condensamou descondensam longos segmentos de cromatina a` medida que as protenas de leitura se deslocam pelosnucleossomos.

Fibras de cromatina:

10 nm: a fibra de 10 nm aparece no microscopio como colar de contas, isto e, uma sequencia denucleossomos, quando o DNA extrado e exposto a nuclease micrococcica.

30 nm: e a estrutura que de fato ocorre na celula, requer a presenca de H1. Para observa-la aomicroscopio e necessario expor o DNa a uma solucao de maior forca ionica. E na verdade um solenoide,em que cada volta possui cerca de 6 nucleossomos dispostos num arranjo helicoidal e cada volta empilha-se formando uma fibra com formato em S (solenoide).

Acetilacao esta associada a dois eventos: replicacao (fase S) e ativacao da expressao genica.Apos ser replicado, o DNA precisa novamente enovelar-se a`s histonas para formar nucleossomos, porem,

antes de serem incorporadas aos nucleossomos as histonas sao acetiladas na lisina da cauda N-terminal dotetramero de H3 e H4. Especula-se que a acetilacao de histonas auxilie a controlar as interacoes protena-protena a` medida que as histonas sao incorporadas ao nucleossomo.

Quanto a` expressao genica, a acetilacao de histonas em regioes adjacentes a promotores esta associadaa` ativacao da expressao genica. Alem dos eventos de acetilacao de genes individuais, ha casos em que aacetilacao ocorre em larga escala, como no caso do cromossomo X inativo em femeas de mamferos, cujashistonas H4 sao subacetiladas. Enquanto o cromossomo X em machos de Drosophila e superativo, porqueexiste acetilacao aumentada de H4. Este exemplo sugere que a acetilacao esta associada a ativacao daexpressao genica, determinando uma estrutura de cromatina menos condensada. Ressalta-se que quandoa acetilacao esta envolvida com a transcricao, a acetilacao ocorrem nas caudas de histonas que ja estaoincorporadas a` cromatina.

Como dito anteriormente, as modificacoes de histonas sao catalisadas por enzimas especficas. Ex: HAT:histona acetil-transferase, HDAC: histona desacetilase. Ha dois tipos de HAT, grupo A e grupo B.

Grupo A: as HATs catalisam a acetilacao de histonas ja presentes na cromatina e estao envolvidas nocontrole da transcricao.

Grupo B: as HATs catalisam a acetilacao de histonas recem-sintetizadas no citosol, e estao envolvidasna montagem dos nucleossomos.

Efeitos da acetilacao: a acetilacao pode ser necessaria para afrouxar a estrutura da cromatina, e nareplicacao pode facilitar o processo de incorporacao de histonas a novos cernes. Na transcricao a acetilacaopode provocar mudancas na estrutura da cromatina, como o deslocamento de histonas do DNa, ou aindapode criar stios de ligacao para protenas necessarias a` transcricao.

Acetilases estao associadas a ativadores, uma prova disso e que algumas das proprias protenas ja sabida-mente envolvidas com a transcricao possuem domnios de acetilases.

As desacetilases revertem o efeito das acetilases, e estao associadas a repressores de transcricao. Aausencia de acetilacao ocorre na heterocromatina, tanto na constitutiva(centromero e telomeros) quanto nafacultativa(regioes inativadas em uma celula, embora permanecam ativadas em outras). Tipicamente ascaudas N-terminal da H3 e H4 nao sao acetiladas na heterocromatina.

Captulo 3

Replicacao e Reparo de DNA

Replicacao

origem de replicacao: local onde ocorre a abertura inicial das fitas de DNa, para que estas possam serreplicadas.Geralmente sao sequencias especificas.

Diferenca basica entre replicacao de procariotos e eucariotos: Procariotos possuem apenas uma origemde replicacao, enquanto eucariotos podem possuir varias origens de replicacao.

Forquilha de replicacao: juncao em forma de Y que se forma a partir da origem de replicacao. A partirda origem, formam-se duas forquilhas que seguem direcoes opastos, e a` medida em que se delocam pelo DNa,abrindo a fita dupla, sao replicadas ambas as fitas de DNa. Como as forquilhas formadas a partir de umaorigem deslocam-se uma em cada direcao, a replicacao de eucariotos e procariotos e dita bidirecional.

Acredita-se que forquilhas de replicacao deslocam-se mais lentamente em eucariotos devido a` presenca deestruturas de cromatina bastante compactas e enoveladas.

Principais protenas envolvidas na replicacao

DNA polimerase: catalisa a adicao de nucleotdeos a` extremidade 3OH da nova fita nascente. Para isso,a DNA polimerase utiliza a hidrolise do nucleosdeo trifosfato que possui uma ligacao fosfoanidrido rica emenergia. A energia liberada da quebra desta ligacao e usada para polimerizar a fita nascente, estabelecendoligacao entre a extremidade 3OH de um nucleotdeo ja incorporado, com grupo 5fosfato do nucleotdeo aser incorporado.

Importantssimo: Por que a DNa polimerase so polimeriza na direcao 5para 3 ?Porque se ela polimerizasse na direcao 3 para 5 , o 3 OH do nucleosdeo trifosfato a ser incorporado

atacaria a extremidade 5 trifosfato, a quebra resultante da ligacao fosfoanidrido da extremidade 5 liberaenergia para a polimerizacao. No entanto, se a DNa polimerase verificar que o nucleotdeo anterior estaincorretamente pareado, ela o remove, e como consequencia, teramos uma extremidade 5monofosfato, eportanto, o 3OH do proximo nucleotdeo correto nao atacaria a extremidade 5monofosfato e tampouco estapode ser clivada para liberar energia para polimerizacao visto que ja foi clivado anteriormente seu trifosfato.Sendo assim, apos a remocao de um nucleotdeo incorreto, a fita de DNA nao poderia mais ser alongada. Porisso, a DNA polimerase so polimeriza de 5 para 3 e verifica e remove de 3 para 5, caso contrario, ela naoseria capaz de alongar a fita de DNA apos executar a edicao do mesmo.

Girase: enzima que usa ATP para abrir a fita dupla de DNA;SSB(protena ligadora de DNA de fita simples): se ligam a uma fita simples de DNA, impedindo que esta

volte a parea com a fita complementar durante a replicacao.grampo deslizante: protena que se liga ao DNA impedindo que a DNa polimerase se solte do DNatopoisomerase: enzima que usa ATP para cortar DNA, permitir que ele gire, e depois restaura a ligacao

fosfodiester quebrada. Topoisomerase I quebra fita simples, a Topoisomerase II quebra fita dupla. Sua funcaoe importante porque o deslocamento das forquilhas de replicacao causam giros na molecula de DNa, e istoiria gerar um problema de emaranhamento do DNa, tendo como consequencia impedimentos a` continuidadeda replicacao a` frente da forquilha. Para evitar este emaranhamento, a topoisomerase rotaciona a moleculade DNa logo a` frente da forquilha.

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CAPITULO 3. REPLICACAO E REPARO DE DNA 8

primase: enzima que produz primers que servirao para iniciar a replicacao.DNa polimerase I : retira primer de RNa ou fragmentos incorretos de DNA, e susbstitui por DNa, logo,

usando a atividade exonuclease 5 para 3; tambem tem atividade exonuclease 3 para 5. Atua no reparo.DNa polimerase II: atividade de exonuclease de 3 para 5. Atua no reparo.DNa polimerase III: polimeriza DNA de 5 para 3; atividade de exonuclease de 3 para 5. E a mais

rapida para polimerizar, e por isso atua na replicacao.DNa ligase: liga fragmentos de DNa, como os de OKAzakiobs: todas estas DNa polimerases, I, II e III sao bacterianas.Replicase: DNa polimerase que participa da replicacaonos eucariotos existem as polimerases alfa, delta e epsilon que sao necessarias para replicacao do DNA

nuclear. As outras DNA polimerases sao usadas no reparo.DNA polimerase Beta esta envolvida no reparo nuclear.DNA polimerase gama : replicacao, reparo e recombinacao mitocondrialDNA polimerase alfa: inicia a sntese de uma nova fita de DNA (tanto a contnua quanto a descontnua);

ao se ligar no complexo de iniciacao na origem, esta replicase sintetiza um primer, seguido de um pequenofragmento de DNA. Em seguida ela e substituda por outra polimerase para elongar a fita (este eventochamamos de troca de polimerase).

DNA polimerase delta: elonga a fita contnuaDNA polimerase epsilon: elonga a fita descontnua, e faz outras funcoes

Problema da replicacao na extremidade telomerica

Na extremidade de um cromossomo linear, a DNa polimerase encontra uma dificuldade para costurarpara trasna fita retardada, pois para que ela polimerize e sempre necessario um primer para formar umfragmento de Okazaki. No entanto, a primase aparentemente nao consegue se ligar a` extremidade do DNA epor isso nao sintetiza o primer. E mesmo que conseguisse, a DNa polimerase I que retira RNa e susbstitui porDNa nao conseguiria faze-lo porque com a extremidade preenchidade por primer, nao haveria extremidade3OH livre para que a DNA polimerase I se ligasse ao DNA.

Para contornar este problema, procariotos tem cromossomos circulares. Ja os eucariotos, os quais possuemcromossomos lineares, resolvem a questao com a telomerase. ESta enzima produz DNa a partir de RNA,portanto tem atividade de transcriptase reversa de 5 para 3. A regiao telomerica possui varias copias naocodificantes ricas em G, porque a telomerase polimeriza estas copias na fita molde a partir de um molde internode RNA. A extremidade do telomero e alongada para permitir que a fita descontnua seja completamentereplicada, entao geralmente a extremidade do DNa molde que permanece como fita simples adentra-se nadupla helice formando uma alca, chamada de alca t, para proteger-se de degradacao. O envelhecimento estaassociado com a diminuicao da atividade da telomerase e progressivo encurtamento dos telomeros.

Fases da replicacao

Iniciacao Elongacao Terminacao

Replicon: unidade de DNA em que ocorre um ato individual de replicacao. Possui um origem, de ondepartem as forquilhas de replicacao. E pode possuir uma terminacao, onde a replicacao e finalizada. Umgenoma eucarioto tem varios replicons, enquanto que procariotos possuem somente um replicon.

A enzima Dam metilase adiciona grupos metil a adenina da sequencia GATC (e na sua complementar)de origens de replicacao. Isto implica uma maneira de regular a replicacao. A replicacao so se inicia emuma origem que tiver as duas fitas da sequencia GATC metiladas, o que chamamos de DNA metilado, e casoapenas uma das fitas esteja metilada no stio de metilacao GATC, isto significa que a replicacao ja se iniciounaquela origem, ou seja, quando numa origem o DNA e hemimetilado, nao se inicia replicacao. Uma protenaidentifica a fita nao metilada, caso exista uma lesao, uma endonuclease cliva a fita nao metilada desde o stioGATC ate o local de lesao e depois o segmento excisado e ressintetizado, e ligado no ponto de clivagem.


ORC: complexo de reconhecimento de origem; e um complexo proteico que reconhece a origem de re-plicacao. E mais bem estudado em S. cerevisiae; as origens de replicacao deste fungo recebem o nome deARS (sequencia de replicacao autonoma). Estas sequencias especiais sao reconhecidas pelo complexo ORC.E provavel que eucariotos tenham varias origens de replicacao, a fim de assegurar que o cromossomo inteiroseja replicado em tempo habil caso algumas origens falhem. Protenas que formam o ORC: DNaA, DNaB,DNaC, HU, Girase e SSB

Uma origem deve ter

Um stio para ligacao do ORC Uma regiao rica em A-T logo mais facil de ser desenrolada Um stio de ligacao a protenas que auxiliam a atrair o ORC

ORC + Cdc6 + Cdt1 + MCM = complexo pre-replicativo O complexo pre-replicativo e formado no fimda mitose e incio de G1.

O ORC fica ligado a origem durante todo o ciclo celular. Ja o complexo pre-replicativo forma-se apenasuma vez durante o ciclo, o que garante que o DNA seja replicado somente uma vez por ciclo celular.

A Cdc6 e a Cdt1 ligam-se ao ORC, e recrutam as protenas do complexo MCM, que funcionam posterior-mente como helicase. Isto ocorre no fim da mitose e incio de G1, dando origem ao complexo pre-replicativo.

Obs: no final de G1, o complexo pre-replicativo e desmontado, logo, em S so fica o complexo de pre-iniciacao.

No fim de G1, a S-Cdk desencadeia a montagem de varios complexos proteicos na origem, formando assimo complexo de iniciacao, que desenrola a helice e inicia a replicacao com polimerases e outras enzimas. Alemdisso, a S-Cdk desencadeia a desmontagem de alguns componentes do complexo pre-replicativo, assegurandoassim que nao ocorra replicacao mais de uma vez em um ciclo. Mais: o APC/C que degrada a geminina(queinativa a Cdt1) esta inativo no fim de G1, portanto, geminina se acumula e inibe Cdt1, de modo que estanao faca parte do complexo pre-replicativo.

E como o complexo pre-replicativo se forma novamente ? No final da mitose, o APC/C inativa as Cdkse destroe a geminina, logo o que desencadeia a desmontagem do complexo esta inativo, e assim, o complexoforma-se novamente na origem, pois seus componentes sao desfosforilados e a Cdt1 e ativada.

Somente as origens que estao ligadas a um complexo pre- replicativo terao a iniciacao da replicacao nafase S

As forquilhas de replicacao param e se desmontam quando encontram DNA com dano. So depois dereparado o DNA, e que a replicacao reinicia, com a ajuda de um complexo proteico chamado primossomoque recruta entre outras proteinas, a DnaB responsavel por desenrolar o DNA. No termino da replicacao asforquilhas devem parar e ser desmontadas, para isso existem sequencias consenso chamadas de terminacao dereplicacao, sequencias ter (em E. coli), as quais se liga uma proteina chamada Tus que impede que a DnaBprossiga a desenrolar a fita de DNA. A proteina Tus impede a prosseguimento de apenas uma das forquilhas,portanto, diz-se que esta proteina age assimetricamente.

Reparo de DNA

Mutacao: alteracao permanente na sequencia de DNA.Reparo de malpareamento de DNA:corrige erros que escaparam a atividade revisora da DNA polime-

rase durante a` replicacao; este sistema de reparo baseia-se na excisao e reparo(ressintetizar) apenas da fitarecem-sintetizada com erro. Caso a fita molde fosse reparada, o erro inserido na fita recem-sintetizada seriaperpetuado em vez de corrigido. Para identificar qual das fitas e a recem-sintetizada, em eucariotos, as fitasrecem-sintetizadas(lder e a retardada) sao clivadas preferencialmente, e parece que tais quebras sao sinaispara direcionar o sistema de reparo a` fita adequada.

A metilacao auxilia o sistema de reparo de mal-pareamento a identificar qual fita e a recem-sintetizada,o que e util quando o sistema de reparo tem de agir logo depois da replicacao. Lembre-se que qualquer fita(original ou nova) pode ser alterada, porem quando a alteracao ocorre durante a replicacao da nova fita, pormal pareamento, obviamente e fita nova que recebeu um nucleotdeo incorretamente pareado, portanto, elae a fita que deve ser reparada neste caso. O DNA e metilado, e logo apos a replicacao, a fita nova ainda nao


foi metilada, somente a fita original esta metilada. Logo, o sistema de reparo identifica qual fita e a nova,pela ausencia de metilacao.

Alteracoes espontaneas:

Depurinacao: hidrolise da ligacao N-glicosil entre a base purica e o anel de acucar. Desaminacao: desaminacao da citosina produz uma uracila oxidacao(origina quebra de ligacao du-

pla, perda de hidrogenios); metilacao pela enzima S-adenosilmetionina; ataques hidrolticos alem dadepurinacao.

Ha 2 sistemas de reparo por excisao muito comuns:

Reparo por excisao de bases

DNA-glicosilases reconhecem bases alteradas(que sofreram oxidacao, desaminacao, metilacao, quebra deligacao dupla, quebra de anel, etc), por meio da mudanca de conformacao da base, a qual uma vez alterada,projeta-se para fora da dupla helice. Cada glicosilase e especifica para um tipo de base. Uma vez reconhecidaa lesao, a glicosilase remove a base.

A ausencia de base e reconhecida por uma enzima chamada AP endonuclease. Ressalta-se que a depu-rinacao tambem tem a mesma consequencia,uma desoxirribose sem base, e portanto, tambem e reconhecidapela AP endonuclease. Esta enzima quebra a ligacao fosfodiester, removendo assim o acucar fosfato quesobrou, e dessa maneira, pode vir uma DNA-polimerase e adicionar um novo nucleotdeo complementar aoda fita original. A DNa-ligase liga os fragmentos de DNA.

Reparo por excisao de nucleotdeos

Este sistema busca por distorcoes na dupla helice, em vez de procurar por uma alteracao especifica de umabase. Entre as alteracoes que causam tais distorcoes volumosas na helice, estao: reacao covalente de basesdo DNA com grandes hidrocarbonetos como o benzopireno;dmeros de pirimidinas (TT,TC,CC), resultantesda exposicao a` radiacao ultravioleta.

Os dmeros de pirimidinas sao formados por ligacoes covalentes entre estas bases; Um complexo multi-enzimatico verifica a dupla helice, buscando distorcoes volumosas, caso encontre uma distorcao em um dasfitas, uma nuclease de excisao cliva a ligacao fosfodiester nas duas extremidades da distorcao, a DNA helicaseremove o oligonucleotdeo contendo a lesao, uma DNa polimerase e uma DNA-ligase restauram o segmentoausente da fita clivada.

Captulo 4

Transcricao

Ha 2 principais diferencas qumicas entre o RNA e o DNA:

RNA tem ribonucleotdeos em vez de desoxirribonucleotdeos presentes no DNA. RNA tem uracila em vez de timina presente no DNA.

Podemos mencionar duas diferencas estruturais:

O RNA ocorre nas celulas como uma fita simples, enquanto o DNA apresenta-se como fita dupla. O RNA por ser fita simples, pode dobrar-si sobre si mesmo, e isto lhe confere formas e funcoes diversas,

diferente do DNA que sempre e helice dupla fita e que sempre armazena informacoes. O RNA podeassumir funcao cataltica, atuar na regulacao genica, assumir funcao estrutural, enfim, existem variasfuncoes importantes desempenhadas por diferentes tipos de RNA, alem do RNam.

Algumas convencoes:

Fita molde ou fita anti-senso: fita a partir da qual o RNA e sintetizado, e portanto, e complementar aoRNAm.

fita codificadora ou fita senso: fita de sequencia identica a` do RNAm, e portanto, complementar a` fitamolde.

Nos bancos de dados, os genes sao representados pela fita codificadora escrita na direcao de 5 para 3. Ponto de iniciacao: primeiro par de base transcrito pela RNA polimerase. Promotor: regiao de DNA onde a RNA polimerase inicia a transcricao. Regiao a montante do ponto de iniciacao: regiao que esta antes do ponto de iniciacao Regiao a jusante do ponto de iniciacao: regiao que esta depois do ponto de iniciacao. O ponto de iniciacao e simbolizado por +1, e a numeracao positiva aumenta na direcao a jusante. A base anterior ao ponto de iniciacao e chamada -1, e a numeracao negativa aumenta na direcao a`

montante.Obs: nao existe uma base numerada como 0.

As sequencias de genes sao escritas de tal modo que a esquerda seja a montante e a direita seja ajusante.

11

CAPITULO 4. TRANSCRICAO 12

Devido a diferenca de organizacao genica entre eucariotos e procariotos, seus RNA normalmente diferem:cada RNAm eucariotos e transcrito a partir de um unico gene, codificando uma unica protena; enquantoque em bacterias um operon e transcrito sob a forma de um unico RNAm, que consequentemente, conteminformacao referente a varias protenas diferentes.

Transcrito primario: produto imediato da transcricao. O transcrito primario e muito instavel e porisso, normalmente e degradado ou modificado. No caso dos procariotos, como estes nao possuem nucleo, oDNA bacteriano permanece exposto no citoplasma, onde se localizam os ribossomos, entao a transcricao e atraducao sao simultaneas, isto e, a` medida que sao sintetizados os RNAm sao traduzidos pelos ribossomos.E apos a traducao os RNAm sao degradados. No caso dos eucariotos, os RNAm sao processados no nucleo,e so sao transportados ao citoplasma quando maduros.

Podemos dividir os RNAs em quatro populacoes:

RNAm (RNA mensageiro) RNAr (RNA ribossomal) RNAt (RNA transportador) pequenos RNAs (incluem os RNAs regulatorios, os RNAs envolvidos no splicing, e outros processos

celulares)

Como a RNA polimerase identifica qual das fitas e a molde ?A RNA polimerase sintetiza RNA na direcao 5 para 3, e portanto, a fita molde deve ser 3 para 5.

Porem, como as denominacoes de 5 para 3 podem ser invertidas (basta girar a molecula a 180o), o que defato indica para a RNA polimerase qual fita deve ser transcrita (ou seja, qual fita e a molde), e a presencado promotor, pois o promotor contem uma sequencia que a RNA polimerase consegue identificar. Assim afita que tiver a sequencia de reconhecimento do promotor, e a fita molde, e logo, e nesta fita que a RNApolimerase se ligara firmemente para iniciar a transcricao. Ressalta-se que este mecanismo de reconhecimentoocorre em procariotos; em eucariotos, este processor envolve a participacao de outras protenas.

RNA polimerase

Esta enzima catalisa a formacao de ligacao fosfodiester entre ribonucleotdeos na direcao de 5 para 3.Tanto em procariotos como em eucariotos as moleculas de RNA polimerase tendem a ser firmar fracamentesobre o DNA quando colidem aleatoriamente. Em seguida, a molecula de polimerase desliza rapidamente sobreo DNA, e se liga fortemente ao DNA quando encontra um promotor. Apos ter feito contato com promotor, aRNA polimerase abre a dupla helice imediatamente a` sua frente, e expoe os nucleotdeos de ambas as fitas aolongo de uma curta extensao do DNA. A seguir, usando a fita molde, a RNA polimerase catalisa a uniao dosdois primeiros ribonucleotdeos complementares a` fita molde (iniciacao). Por meio deste sistema a enzimaprossegue (elongacao) ate que encontre um sinal de parada (terminacao). Durante a elongacao, a` medidaque a RNA polimerase se desloca, desenrola o DNA a` sua frente (ponto de desenrolamento) e enrola-o naparte de tras (ponto de reenrolamento), e concomitantemente o duplex de DNa que se refaz desloca a cadeiade RNA (antes parada com a de DNA), tornando o RNA uma fita simples.

OBS: expressao genica nao e composta apenas por transcricao, mas sim por transcricao e traducao.Complexo fechado: Quando a RNA polimerase se liga ao DNA este permanece temporariamente como

fita dupla.Complexo aberto: Quando a RNA polimerase catalisa a abertura da helice na regiao do promotor, que

inclui o ponto de iniciacao.

3 fases da transcricao

Iniciacao: Apos o reconhecimento do promotor, tem incio da sntese das primeiras ligacoes nucleotdicasno RNA. A iniciacao e caracterizada pela ocorrencia de eventos abortivos, nos quais a enzima produz pequenostranscritos, libera-os e recomeca a sntese de RNA. A iniciacao termina quando a enzima tem sucesso naextensao da cadeia e deixa o promotor, seguindo para a regiao subsequente da transcricao.

Elongacao: envolve o movimento processivo da RNA polimerase para alem do promotor, por meio daquebra das pontes de hidrogenio da dupla helice, exposicao da fita molde e adicao de novos ribonucleotdeos


na cadeia crescente de RNA, concomitante ao deslocamento da bolha de transcricao a jusante. Os nucleotdeossao adicionados a` extremidade 3 do RNA formando um hbrido de RNA-DNA dentro da bolha de transcricao.A visao de que a RNA polimerase sempre prossegue a um passo regular sobre o DNA tem sido questionadarecentemente, pois quando a extremidade 3 do RNA se desloca do centro ativo da RNA polimerase, estaenzima volta o caminhoe remove alguns ribonucleotdeos antes de reiniciar a transcricaos.

Terminacao: envolve a presenca de sequencias que sinalizam para a enzima cessar a adicao de nucleotdeosa` cadeia de RNA. A terminacao e caracterizada pelo colapso da bolha de transcricao o que ocorre quandoe desfeito o hbrido de RNA-DNA, o DNA refaz a dupla helice, cessa a formacao de ligacoes fosfodiesterno RNA, e o complexo de transcricao se desfaz em suas partes componentes: DNA, RNA polimerase e otranscrito primario.

Terminador: sequencia de DNA que indica a terminacao. A transcricao do terminador forma um grampono RNA seguido de uma cauda poli-U, que interrompe a sntese de RNA.

Detalhe importante: regioes UTR (untranslated region) Antes do codon de iniciacao da traducao existeum segmento de RNA que nao sera traduzido, chamado de 5-UTR. Apos o codon de terminacao da traducaoexiste um segmento que inclui tambem o grampo de terminacao da transcricao e o poli-U, que nao seratraduzido, chamado de 3UTR. A funcao destas regioes nas bacterias ainda nao e clara. Sabe-se por exemploque a regiao 5-UTR possui o RBS (stio de ligacao a ribossomos) sem o qual nao se produz protenas embacterias, afinal e neste stio que o ribossomos se ligam para realizarem o processo de traducao concomitanteao de transcicao.

Detalhes da estrutura da RNA polimerase

A RNA polimerase bacteriana e composta por multiplas subunidades. No caso dos procariotos, umamesma RNA polimerase e responsavel pela sntese de diferentes RNAs (RNAm, RNAt e RNAr), ja noseucariotos, existem diferentes RNA polimerases para diferentes tipos de RNA (pol I, II e III). As subunidades e formam o centro cataltico da enzima. As sequencias das subunidades e da RNA polimerase saoconservadas nos 3 domnios: Bacteria, Archaea e Eukarya. As diferencas entre RNA polimerases de eucariotose procariotos reside principalmente na superfcie da enzima, ja que seu centro cataltico e muito similar. Aholoenzima (enzima completa, com todas as subunidades) pode ser dividida em 2 componentes: a enzimacerne e o fator (sigma).

Cerne e formada pelas seguintes subunidades: I, II, , e .Fator : esta subunidade e essencial para o reconhecimento do promotor. O fator assegura que a RNA

polimerase inicie a transcricao em stios especficos e diminui a ligacao a stios inespecficos. O fator somentepermanece como parte da enzima ate que o RNA atinja um tamanho de cerca de 10 nucleotdeos, isto e, atuaapenas durante a iniciacao. A partir disso, esta subunidade dissocia-se da enzima cerne, a qual po sua vezprossegue na elongacao. Outra maneira de explicar a acao do fator e a seguinte: este fator desestalibilizae se solta da enzima cerne quando a enzima se liga a um stio inespecfico, e estabiliza e permanece ligadoa` enzima cerne quando a enzima se liga a um stio especfico. O fator e liberado assim que a holoenzimaproduz um RNA de cerca de 10 pb pois parte do fator esta bloqueando o canal de sada da RNA polimerase,entao o fator se separa do restante da enzima de modo que a cadeia de RNA possa continuar a crescer eser liberada pelo canal de sada da enzima. Os fatores competem por copias limitadas da RNA polimerasecerne, de modo que os fatores s podem regular a iniciacao e determinar os perfis de transcricao dos genes.

O domnio C-terminal (CTD) das subunidades I e II, interage diretamente com o promotor e portanto,contribui para o reconhecimento do promotor.

Alem disso as subunidades e o fator sao as principais superfcies da RNA polimerase que interagemcom fatores reguladores da iniciacao da transcricao.

A RNA polimerase tem como cofatores 2 ons de Mg2+, um dele fica ligado ao centro ativo e o outrochega com o novo ribonucleotdeo a ser incorporado no RNA crescente.

O fator reconhece o promotor, porem qual seria a estrategia de busca para encontrar num genomainteiro, o promotor ?

O modelo atual para responder tal pergunta e que a enzima utiliza 3 mecanismos. Mas antes de comenta-los torna-se necessario justificar por que a RNA polimerase nao encontra o promotor simplesmente por difusao,por meio de ligacoes randomicas. Entenda-se que a taxa de difusao permite inferir a taxa de ligacao da RNApolimerase a um stio. O limite superior da taxa de difusao para a ligacao a um stio de cerca de 75 pb emenor que 10e8 Me-1 se-1. No entanto, a taxa de difusao para alguns promotores foi observada , in vitro,


com valores iguais ou acima do limite superior mencionado, ou seja, a velocidade de ligacao a promotores emuito rapida.

Alem disso, considerando que por busca randomica, as RNA polimerases teriam um segmento de DNA alvomuito maior (genoma inteiro), logo a velocidade de difusao seria correspondentemente aumentada, deixandode ser limitante. Dessa maneira, associacao e dissociacao a stios randomicos, tornaria a busca pelo promotorum processo um tanto lento, e comprovadamente como indicam as taxas in vitro, este processo e muito maisrapido para ocorrer apenas por difusao.

Pela justificativa acima, pode-se supor que a RNA polimerase livre liga-se ao DNA, permanecendo emcontato com este. Porem, esta enzima deve utilizar algum tipo de estrategia para se mover de um stiode ligacao frouxa aleatorio para o promotor. Atualmente, discute-se mecanismos utilizados pela enzimapara encontrar o promotor. Ja que uma vez ligada, a enzima permanece associada ao DNA, a enzima trocarapidamente um sequencia por outra ate encontrar o promotor (troca direta). O deslocamento direto permitea enzima criar um trajeto direcionado, movendo-se de um stio fraco para um stio mais forte.

3 mecanismos possveis:

Deslizamento direto Troca intersegmento Associacao e dissociacao intrasegmentoA iniciacao pode ser subdividida em 3 etapas:

Formacao de complexo fechado (a holoenzima RNA polimerase liga ao DNA em sua forma duplex). Formacao de complexo aberto (a holoenzima promove a desnaturacao do DNA, e abertura de suas fitas;

o fator tambem contribui para este processo).

Formacao de complexo de 3 moleculas(RNA polimerase, DNA e RNA): depois de alguns eventos aborti-vos(RNA polimerse libera o RNA), a holoenzima finalmente consegue sintetizar um RNA que vai alemdo promotor.

Promotor: sua funcao e ser reconhecido por protenas envolvidas na transcricao. O promotor de umgene ou de um operon possui sequencias consenso curtas e conservadas embora com variacoes em nvel deindivduos que permitem que a RNA polimerase o reconheca.

Principais sequencias de reconhecimento de um promotor:

Elemento -10 de 6 pb (tambem conhecido como TATA box; sequencia consenso: TATAAT) elemento-35 de 6 pb (sequencia consenso: TTGACA). Ha uma sequencia espacadora entre as duas sequenciasanteriores. As sequencias adjacentes ao elemento -10 e ao elemento -35 a montante e a jusante tambeminteragem com a RNA polimerase e contribuem para eficiencia do promotor.

Elemento -35 ....espacador.... elemento -10....+1. Os elemento -10 e -35 fazem contato sequencia-especfico com o fator . O espacador nao tem relevancia de interacao com a RNA polimerase, noentanto, como ele esta entre os dois elementos que interagem com a RNA polimerase e considerando anatureza da dupla helice de DNA, o espacador determina a distancia de separacao apropriada entre osdois elementos e a orientacao geometrica dos dois stios um relacao ao outro.

Elemento UP: sequencia de cerca de 20 pb a montante do elemento -35 que interage com as CTDsdas subunidades da holoenzima RNA polimerase. Este elemento pode aumentar consideravelmentea ordem de magnitude da expressao de um gene.

Mutacoes em promotores

As mutacoes em promotores afetam o nvel de expressao sem alterar os produtos dos genes.Mutacoes down: diminuem ou cessam a transcricao de genes; podem aumentar a distancia entre os

elementos -10 e -35; podem diminuir a similaridades dos elementos -10 e -35 com as sequencias consenso.Este tipo de mutacao quando ocorre no elemento -35, reduz o ndice de formacao de complexo fechado, pois


dificulta a ligacao da RNA polimerase ao DNa. Quando ocorre no elemento -10, este tipo de mutacao reduzo ndice de formacao do complexo fechado e a sua conversao no complexo aberto, pois dificulta a ligacao daRNA polimerase ao DNA e a desnaturacao da dupla helice.

Mutacoes up: aumentam a transcricao de genes; podem fazer isso por exemplo, diminuindo a distanciaentre os elementos -10 e -35 para 17 pb, ou tornando as sequencias destes elemento mais similares a sequenciasconsenso. Este tipo

Detalhe importante: a eficiencia de um promotor nao necessariamente deve ser alta para as necessidadesda celula, pois muitos promotores evoluram suas sequencias bem diferentes da sequencia consenso porquenao era otimo para a celula produzir grandes quantidades dos produtos codificados por estes genes.

Dica para exerccios: Footprinting e uma tecnica que permite avaliar a habilidade de protenas reconhe-cerem e se ligarem ao DNA. Resumindo a tecnica, usa-se uma nuclease para clivar em varias fragmentos aamostra de DNA dupla fita ligada a uma protena. Um das fitas e marcada com sonda em um extremidade.Entao apos fazer o footprinting, a eletroforese e usada para mostrar a escada de fragmentos obtidos com anuclease. O stio onde a protena estava ligada ao DNA fica protegido de clivagem e portanto, na escada doresultado da eletroforese, o stio que nao contem nenhum fragmento detectado e o stio onde a protena seliga ao DNA.

Obs importante a respeito da terminacao: A RNA polimerase transcreve a regiao terminadora seguida depoli-U, entao o terminador transcrito forma um grampo de terminacao que sinaliza para a RNA polimeraseque deve cessar a transcricao.

Ha 2 tipos de terminadores de transcricao:Terminadores intrnsecos: nao requerem mais nada alem da presenca do proprio terminador rico em G-C

que codifica um grampo no RNA. Portanto, neste caso a terminacao depende do RNA transcrito. Outracaracterstica de terminadores intrnsecos e uma sequencia de ate 7 uracilas (Poli-U) subsequente a regiao dogrampo.

Terminadores dependentes de Rho: sao definidos pela necessidade da prenseca do fator rho in vitro, eanalises de mutacoes mostram que este fator esta envolvido com a terminacao in vivo. A protena Rho seliga ao RNA a montante do sto de terminacao e anda por ele ate alcancar a RNA polimerase. A parada ouatraso da RNA polimerase sobre o grampo de terminacao da tempo a Rho para alcancar a regiao onde hao hbrido DNA-RNA, e quebrar as pontes de hidrogenio que o mantem, desfazendo o hbrido, interage coma RNA polimerase para liberar o RNA, e por consequencia, desmonta o complexo de elongacao. A protenaRho e uma helicase dependente de ATP

Antiterminacao: quando a terminacao e prevenida por fatores que interagem com o RNA ou com a RNApolimerase.

Sendo assim, a terminacao assim como a iniciacao e a elongacao, pode ser regulada como um mecanismode controle da expressao genica.

Outras similaridades entre terminacao e iniciacao:

Ambos os processos podem utilizar protenas adicionais(fator , fator rho, supressores e ativadores). Ambos envolvem a quebra de pontes de hidrogenio(na iniciacao quebram-se as pontes do DNA, na

terminacao quebram-se as pontes entre RNA-DNA).

Ambos envolvem o reconhecimento de sinais ainda que de maneiras distintas.O que de fato desmembra o complexo de elongacao ?A interacao do grampo terminador com a RNA polimerase somada a`s forcas fracas das pontes de hi-

drogenio entre o hbrido RNA-DNA desestabilizam e desmontam o complexo de elongacao, o que resulta notermino da transcricao.

Ainda sobre terminacao, outro aspecto importante sobre a terminacao dependente de rho e que o fator rhonao consegue se ligar ao RNA ou se mover sobre ele quando os ribossomos estao traduzindo o RNA. Assima transcricao prossegue ate que os ribossomos tenham terminado a traducao. Porem, se ocorrerem mutacoessem sentido (que substituam um codon codificador de aminoacido por um codon terminador da traducao),entao os ribossomos sao liberados, a Rho pode se associar ao RNAm e a` RNA polimerase e terminar atranscricao prematuramente.

Polaridade: Quando uma mutacao sem sentido ocorre num gene que precede outros em um operon, osgenes subsequentes nao sao transcritos.


Transcricao eucariotica

RNA-polimerases eucarioticas:RNApol I : transcreve genes de RNAs ribossomais e se concentra no nucleolo.Lembre-se: nucleolo e a regiao do nucleo onde partes de diferentes cromossomos contendo genes ribos-

somais se agrupam, e onde os RNAs ribossomais sao associados a protenas para compor subunidades deribossomos.

RNapol II: transcreve os hnRNAs (RNA heterogeneo nuclear), isto e, todos os RNAs que apos o proces-samento formarao mRNAs.

RNApol III: transcreve genes de rRNAs, tRNAs e pequenos RNAs.Existem tambem RNApols especiais presentes nas mitocondrias e nos cloroplastos.As RNApol eucarioticas possuem o centro cataltico, subunidades e homologas a`s procarioticas,

porem, as demais subunidades diferem consideravelmente. Por exemplo, numa RNApol eucariotica naoexiste uma subunidade homologa ou correspondente ao fator procarioto, pois a funcao de reconhecimentodo promotor cabe a fatores basais de transcricao.

Antes de continuarmos, seria interessante deixar claro as principais diferencas entre a transcricao deprocariotos e de eucariotos:

Eucariotos possuem diferentes RNApol para diferentes tipos de RNAs, enquanto procariotos possuemapenas um tipo de RNApol para todos os RNAs.

As RNApols de eucariotos e procariotos diferem na superfcie da enzima. Ex: RNApol eucariotica naopossui nenhuma subunidade similar ao fator dos procariotos.

O mecanismo de reconhecimento do promotor e outro ponto de diferenca: o fator e as caudas C-terminal das subunidades sao responsaveis pelo reconhecimento do promotor, isso significa que so apropria holoenzima da RNApol procariota ja e suficiente para reconhecer o promotor; em eucariotoso papel de reconhecimento do promotor cabe a fatores transcricionais basais, ou seja, e necessaria apresenca de outras protenas que nao a RNapol.

Os transcritos tem propriedades diferentes: o mRNA procarioto esta apto para traducao a` medida quevai sendo sintetizado, afinal ele nao possui ntrons que precisam ser excisados e nao existe barreiraespacial entre transcricao e traducao. Ja o mRNA eucarioto precisa ser processado (capeamento,poliadenilacao e splicing), exportado do nucleo para o citoplasma, onde finalmente podera ser traduzidopor ribossomos.

Fator transcricional ou fator basal de transcricao: qualquer protena que nao seja a RNApol.Os fatores basais de transcricao atuam principalmente no reconhecimento do promotor. Cada fator basal

liga-se a um stio especfico, e o promotor e definido como o conjunto destes stios de ligacao que atuam emcis.

Somente apos a ligacao de todos os fatores basais ao promotor, a RNA polimerase podera se ligar aoDNA, juntando-se ao enorme complexo proteico que promove a transcricao.

Aparato basal de transcricao: complexo formado quando a RNA polimerase se junta ao complexo defatores basais ligados ao DNA.

Outro ponto a ser ressaltado e a cromatina. Esta deve possuir estrutura aberta para que ocorra atranscricao, e alem disso, mesmo aberta, ainda e necessario remover o octamero de histonas para que aRNApol possa se ligar ao DNA.

A RNApol se liga proximo ao ponto de iniciacao, porem, sem estabelecer contato direto com a regiaoa montante do promotor. Cada promotor contem sequencias curtas conservadas que sao reconhecidas pelaclasse apropriada de fatores basais.

Intensificador: stio identificado por sequencias que estimulam a iniciacao da transcricao, porem, quese localiza a uma distancia consideravel do ponto de iniciacao, a montante ou a jusante. O intensificadordetermina se o promotor e expresso, e caso seja expresso, se a expressao ocorrera em todas as celulas ou emcelulas de tecidos especficos. Os intensificadores geralmente sao alvos para regulacao tecido-especfica outemporal. As protenas ligadas aos intensificadores interagem com aquelas ligadas aos promotores.


A transcricao eucariotica esta mais frequentemente sob a regulacao positiva: um fator transcricionaltecido-especficos ativa um promotor ou um grupo de promotores que possuem uma sequencia-alvo em comum.A regulacao por meio de repressao negativa e menos comum.

Silenciador: stio regulatorio que se liga mais a fatores transcricionais negativos que positivos.Neste ponto, e relevante distinguir fatores basais, ativadores e repressores, e coativadores.Os fatores transcricionais basais sao aqueles que fazem parte da maquinaria de transcricao, sem os quais

nao e possvel reconhecer o promotor, e portanto sao essenciais para determinar os stios que a RNApol devetranscrever.

Ativadores e repressores sao fatores transcricionais que se ligam ao promotor, ao intensificador ou aosilenciador, e podem aumentar (caso sejam ativadores) ou diminuir (caso sejam repressores) a eficiencia doaparato basal de transcricao. Logo, estes fatores determinam a taxa de transcricao, e regulam a expressaotemporal e espacialmente, isto e, podem ser produzidos em determinado momento ou ser tecido-especficos.

Os coativadores correspondem a fatores transcricionais que funcionam como intermediarios na interacaoentre os fatores basais e os ativadores. Como mencionado anteriormente, os intensificasores podem se localizara stios muito distantes do ponto de iniciacao, mas ainda assim os ativadores ligados a tais stios se comunicamcom os fatores basais por meio dos coativadores.

A terminacao da transcricao eucariotica nao tem a mesma importancia regulatoria que na transcricaoprocariotica. O evento que gera a extremidade 3do RNA nao e a terminacao em si, mas sim uma clivagemque faz parte do processamento do RNAm.

Varios promotores eucariotos possuem o TATA box, uma sequencia localizada a cerca de 25 pb a montantedo ponto de iniciacao. A sequencia cerne e TATAA, seguida por 3 pares A-T. No caso da RNApol II, estadepende de uma classe de fatores basais para a iniciacao da transcricao de um promotor, chamados de TFiiX,onde X e substitudo pela letra de identificacao de um fator individual. Vamos discutir um fator individual,o TFiiD, que possui dois componentes: a TBP e as TAFs. A ligacao da TFiiD ao TATA box e a primeiraetapa na iniciacao.

A TBP e responsavel por reconhecer o TATA box, dai seu nome ser uma referencia a` protena de ligacaoao TATA. As TAFs sao outras subunidades, que associadas a TBP, sao responsaveis por identificar todas asclasses de promotores. TBP e um fator universal, responsavel por identificar cada tipo de promotor (sejaaquele transcrito por RNApol I, II ou III), usando um mecanismo diferente para cada tipo.

Explicacao para o fato de que nucleossomos impedem a iniciacao da transcricao: os nucleossomos saoformados preferencialmente pelo posicionamento de regioes ricas em A-T com sulco menor da dupla helicevoltado para interior, porem, a TBP liga-se na dupla helice exatamente no sulco menor. Se o sulco menor naoestiver exposto na superfcie da helice, a TBP nao podera acessa-lo, e portanto, nao se formara o complexode iniciacao da transcricao. A TBP causa uma deformacao no DNA, de tal modo que a RNApol e os outrosfatores estabelecem uma associacao mais proxima com o DNA do que seria possvel com um DNA linear.

Iniciacao

Os fatores basais ligam-se ao promotor numa ordem definida, aumentando gradativamente a area pro-tegida, a fim de construir um complexo ao qual a RNApol se associa. Nem todos os fatores desempenhamapenas o papel de promover a ligacao da RNApol ao DNA. O fator TFiiH, por exemplo, possui multiplasfuncoes: atividade de helicase, atividade de quinase capaz de fosforilar a DCT da RNApol II, e ainda estaenvolvido no reparo de DNA danificado e na liberacao da RNApol do promotor, evento que parece exigir apresenca de TFiiH a jusante do ponto de iniciacao.

A maior subunidade da RNApol II possui um domnio carboxi-terminal(DCT), composto por variasrepeticoes de uma sequencia consenso de 7 aminoacidos. O DCT pode ser fosforilado, e esta envolvido nainiciacao. No modelo atualmente proposta para a iniciacao eucariotica, a fosforilacao da cauda CTD daRNApol II e necessaria para que a enzima prossiga para alem do promotor, e portanto, passe para a fasede elongacao. Neste estagio, a maioria dos fatores transcricionais tambem e liberada do promotor. Paraseparacao das fitas do DNA, sao necessarias a TFiiE e a TFiiH.

Assim como na iniciacao procariota, na iniciacao eucariota tambem ocorrem eventos abortivos em algunsgenes, isto e, a RNApol realiza terminacao apos produzir um transcrito curto, que logo e degradado. Algunsgenes exigem que a RNApol II seja adicionalmente no DCT, pela quinase P-TEFb. Mas a regulacao de talfosforilacao e porque alguns genes tem tal exigencia e outros nao, ainda permanece obscura.


Outra funcao bastante relevante do DCT e que este esta envolvido direta ou indiretamente com o pro-cessamento do RNAm. A enzima que promove a adicao de nucleotdeos 7-metil-guanosina, liga-se ao DCTfosforilado, permitindo que o capeamento ocorra tao logo a extremidade 5 seja formada. As protenas SCAFs,que se ligam a`s protenas de splicing, se ligam ao DCT tambem. E ainda alguns componentes do aparatoclivagem/poliadenilacao se ligam ao DCT. Alem disso, todos estes fatores citados estabelecem ligacao com aRNApol II no momento da iniciacao, de modo que os aparatos de processamento do RNAm estao disponveisdesde que a RNApol inicia a transcricao.

Nao vamos entrar em detalhes do fatores basais das RNapol I e III porque o foco aqui e a RNApol quetranscreve mRNAs.

Captulo 5

Traducao

A sntese proteica ocorre simultaneamente a` transcricao em procariotos. Logo que seja produzido um curtotrecho de RNAm, a subunidade menor do ribossomo se liga ao stio RBS que fica um pouco antes do codon deiniciacao. A` subunidade menor associa-se o primeiro RNAt de metionina (em E. coli, formil-metionina), entaoo complexo desloca-se sobre o RNAm mensageiro ate encontrar o codon AUG correspondente ao anticodondo RNAt na fase de leitura correta.

Das 3 fases de leitura possveis para um RNAm, geralmente apenas uma e aberta, e o RNAt nao e capazde identifica-la, deixando tal tarefa para a subunidade menor do ribossomo. Esta por sua vez nao e capazde identificar o codon AUG, e dessa maneira, as propriedades de cada um (identificar fase de leitura abertae identificar codon de iniciacao) se complementam.

Na posicao exata para iniciar a traducao, a subunidade maior do ribossomo liga-se ao complexo subunidademenor-RNAt. O ribossomo torna-se assim completo, e possuindo 3 cavidades: stio E, stio P e stio A.

stio E: stio de sada do RNAt vazio, sem aminoacido stio P: stio onde fica o RNAt carregado com o aminoacido mais recentemente adicionado stio A: stio onde ficara o RNAt carregado com o proximo aminoacido a ser adicionado aminoacil-RNAt: aminoacido ligado ao seu respectivo RNAt (reacao catalisada por aminoacil-RNAt

sintetase

peptidil-RNAt: peptdeo ligado a um RNAt

A traducao processa-se do seguinte modo: Voltando a situacao de incio da sntese, o RNAt iniciador (quecontem o primeiro aminoacido da proteina em sntese) ocupa desde o comeco o stio P. Quando a subunidademenor + RNAt iniciador encontram o codon de iniciacao, a subunidade maior liga-se ao complexo, e entao osegundo RNAt carregado liga-se ao stio A, contendo anticodon correspondente ao codon do RNAm expostono stio A. A subunidade maior catalisa a formacao da ligacao peptdica entre a metionina e o segundoaminoacido.

Uma vez formada a ligacao peptdica, o peptdio e transferido para do RNAt do stio P para o RNAt dostio A. O ribossomo desloca-se entao pelo proximo codon(estagio denominado translocacao); o movimentodo ribossomo transfere o RNAt desacilado do stio P para o stio E, e o peptidil-RNAt do stio A para o stioP. Neste momento o codon do proximo aminoacido a ser adiocinado esta posicionado no stio A, pronto paraa entrada de um novo aminoacido, quando o todo o processo se repetira.

3 estagios do ribossomo

Antes da formacao da ligacao peptdica: o peptidil-RNAt ocupa o stio P, o aminoacil-RNAt ocupa ostio A.

Formacao da ligacao peptdica: o polipeptdeo e transferido do peptidil-RNAt do stio P para oaminoacil-RNAt do stio A.

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CAPITULO 5. TRADUCAO 20

Translocacao: o ribossomo move-se por um codon, posisiona o RNAt desacilado para o stio E de ondedeixa o ribossomo, e desloca o peptidil-RNAt do stio A para o stio P, deixando livre o stio A parareceber o proximo aminoacil-RNAt.

Quem sabe o codigo genetico ?As aminoacil-RNAt sintetases. Estas enzimas sao aminoacido especficas, portanto, existem 20 sintetases,

uma para cada aminoacido. Uma sintetase somente liga um aminoacido a um RNAt caso o RNAt possua oanticodon e braco aceptor adequados para aquele aminoacido. A reacao envolve a participacao do ATP comoreagente.

Detalhes sobre a estrutura de um RNAt

Um RNAt possui 4 segmentos pareados que sao longos o suficiente para assumir estrutura de duplahelice: alca D, alca T, braco aceptor e alca anticodon. Alem disso, o RNAt dobra-se sobre si mesmo,formando estrutura similar a letra L. As regioes de maior importancia para a traducao sao a alca anticodone o braco aceptor, ambos possuem regioes nao pareadas: o anticodon esta na alca anticodon, e a outra regiaofita simples, pertecente ao braco aceptor, fica na extremidade 3 da molecula e se liga ao aminoacido.

Detalhes da estrutura de um ribossomo

O ribossomo e formado por duas subunidades: uma maior e outra menor. Ambas sao compostas por protenase cadeias de RNAr. Um ribossomo eucarioto por exemplo, tem subunidade maior composta por cerca de 49protenas + 3 moleculas de RNAr, e a subunidade menor composta por cerca de 33 protenas + 1 moleculade RNAr. O ribossomo e uma ribozima (RNA ribossomico + protenas), cujo poder de catalise e responsavelpela formacao da ligacao peptdica.

Em eucariotos, a traducao ocorre somente apos o processamento do RNAm e sua exportacao para ocitoplasma. Para o RNAm, o processamento consiste em capeamento, poliadenilacao e splicing.

O capeamento e a poliadenilacao sao relevante para a estabilidade do RNA, auxiliam na sua exportacaodo nucleo para o citoplasma, e na sua identificacao geral como RNAm, isto e, como um molecula que deveser traduzida.

Capeamento: consiste na adicao de um nucleotdeo atpico chamado 7-metil-guanosina na extremidade5, que corresponde a um nucleotdeo guanina com grupo metil associado. Este processo ocorre quando oRNAm atinge cerca de 25 nucleotdeos.

Poliadenilacao: consiste na adicao de centenas de nucleotdeos adenina na extremidade 3 do RNAm(cauda poli-A). Primeiro uma nuclease cliva a extremidade 3 do RNAm, e entao uma segunda enzimaadiciona a cauda poli-A.

Atencao: outros tipos de RNA (ex: RNAr, RNAt, snRNA) recebem outro tipo de processamento.

Captulo 6

Organelas e Membranas

Retculo endoplasmatico

Retculo endoplasmatico: e contnuo a membrana nuclear externa, e consiste de um sistema de sacos e tubosde membrana interconectados; frequentemente o RE se estende pela maior parte da celula.

RE rugoso: porcoes do retculo endoplasmatico cuja superfcie citosolica e coberta por ribossomos.RE liso: porcoes do RE cuja superfcie citosolica nao possue ribossomos.Ha 2 tipos de protenas que vao para o RE:

Protenas transmembranicas: que vao sao parcialmente translocadas pela membrana do RE e cujodestino e residir na membrana do RE, nas membranas de outras organelas ou na membrana plasmatica.

Protenas hidrossoluveis que sao completamente translocadas pela membrana do RE e liberadas nolumen do RE; estas ou serao secretadas (para o meio extracelular) ou serao transportadas por vesculasate outras organelas.

Em ambos os casos, os RNAms destas protenas sao traduzidos por ribossomos do citosol. Logo no incioda sequencia traduzida, existe uma sequencia-sinal de RE que direciona o ribossomo que esta sintetizando aprotena para a RE. A` medida que um RNAm e traduzido varios ribossomos se ligam a ele, formando umpolirribossomo. A sequencia sinal de RE ligada a` membrana do RE inicia o processo de translocacao daprotena para dentro do RE. Lembre-se que tantos as protenas transmembranicas quanto as hidrossoluveispossuem a sequencia-sinal de RE.

Assim, os ribossomos nao estao constantemente ligados ao RE, mas sao direcionados pela sequencia sinalda protena que estao traduzindo, e so entao e que se ligam a` membrana do RE. Nao existe diferenca estruturalou funcional entre os ribossomos que ligados a` membrana do RE e os ribossomos livres no citosol. A unicadiferenca entre eles e a protena que estao sintetizando em um dado momento.

Mecanismo de ancoramento de protenas transmembranicas na membrana do RE

A protena possui a sequencia sinal que inicia translocacao proxima a` extremidade C-terminal; para impe-dir que a protena seja totalmente translocada, um outra sequencia de aminoacidos hidrofobicos, chamada desequencia de finalizacao de transferencia, localizada mais adiante na protena liga-se no canal de translocacaoimpedindo que a translocacao prossiga. Simultaneamente, a sequencia sinal aminoterminal e a sequenciade finalizacao de transferencia sao liberadas do canal de translocacao na membrana lipdica. Finalmente asequencia sinal e clivada. Deste modo a protena transmembranicas do RE possui a extremidade N-terminalvoltada para o lumen do RE, enquanto a extremidade C-terminal fica na face citosolica da membrana do RE.Uma vez inserida, a protena transmembrana nao muda de orientacao.

Existem protenas cuja sequencia sinal nao e aminoterminal, mas sim um sequencia interna, que nao eclivada apos a translocacao, chamada de sequencia de incio de transferencia. E frequente em protenas cujacadeia polipeptidica passa varias vezes pela membrana lipidica do RE. Neste caso, ambas as extremidades,amnica e carboxlica, ficam na face citosolica do RE.

O transporte vesicular consiste no brotamento de fusao de vesculas que carregam protenas e lipdeosentre organelas que fazem parte do sistema de endomembranas da celula. As vesculas de transporte sao

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CAPITULO 6. ORGANELAS E MEMBRANAS 22

formadas com uma capa, muito comumente composta de protena clatrina. Essa capa se desfaz depois quea vescula se destaca da membrana. Suas funcoes sao dar forma de cesta a` vescula e auxiliar indiretamentena captacao das moleculas a serem transportadas. Resumindo a historia, existem receptores de carga quereconhecem sinais de transporte das moleculas que devem ser transportadas. As adaptinas sao protenas queajudam a capturar moleculas especficas pelo aprisionamento de receptores de carga. Ao mesmo tempo asadaptinas estao ligadas a`s moleculas de clatrina. o brotamento da vescula se inicia com a formacao de umafossa revestida de clatrina que captura moleculas especficas, e gradativamente forma um pescocoentre avesicula em formacao e a membrana de onde esta brotando. A protena ligadora de GTP, dinamina, liga-seno pescoco e causa juntamente com outras protenas, a constricao do pescoco, destacando assim a vescula damembrana. obs: vesculas revestidas de clatrina brotam no Ap. de Golgi, na membrana plasmatica, e na rotasecretoria para fora da celula. No caso do RE, brotam vesculas revestidas com outra protena, COP (coatprotein). Lembre-se que as vesculas viajam pela celula ativamente (com gasto de energia) por protenasmotoras associadas ao citoesqueleto.

O mecanismo responsavel pela especificidade das vesculas se fundirem as organelas correspondentes, aindanao e totalmente claro, porem, acredita-se que uma famlia de protenas, chamadas de SNAREs estejamenvolvidas. Aparentemente, para cada organela e cada tipo de vescula possui em sua superfcie um tipode SNARE. Entao um certo tipo de vescula, possui uma v-SNARE que e complementar a` t-SNARE damembrana da organela alvo.

Modificacoes covalentes das protenas no lumen do RE

As pontes dissulfeto sao formadas por oxidacao da cadeia lateral de duas cistena, por uma enzima presenteno lumen do RE. Outra modificacao de protenas realizada no RE, e a glicosilacao que corresponde a adicaode oligossacardeos a` proteina. Oligossacardeos podem ajudar a proteger a protena contra degradacao;podem reter a protena no RE ate que ela seja adequadamente enovelada; podem ainda servir como sinal detransporte para as vesculas de transporte. NA glicosilacao, e comum adicionar um oligossacardeo prontode 14 acucares, pois isto permite verificar se a cadeia de oligossacardeos tem a sequencia correta; caso hajaum erro na sequencia, a protena inteira sera descartada, e e mais barato contruir um oligossacardeo de 14acucares novamente que um protena inteira.

Alem disso as enzimas tem dificuldade de acessar a estrutura arborea dos acucares, entao e mais faciladicionar um oligossacardeo pronto, que tentar adicionar um a um os acucares na protena. O oligossacardeofica preso a um lipdeo chamado dolicol, associado a membrana do RE, e a sua transferencia para o grupoamino de uma asparagina e catalisada pela enzima oligossacardeo-protena-transferase, que possui seu stioativo voltado para o lumen do RE.

Aparelho de Golgi

Conjunto de sacos achatados definidos por membrana (vesculas) dispostos em pilha. Possui duas faces :cis e trans. A face cis e onde protenas envoltas por vesculas provenientes do RE se fundem no Aparelho deGolgi, ou seja, e a face de entrada das protenas na rede de Golgi. E a face trans e aquela onde as protenassaem do Ap. de Golgi e sao transportadas para outras organelas ou para a membrana plasmatica.

Rota constitutiva de exocitose ou rota padrao Rota fixa de vesculas que brotam da rede trans de Golgi, e sefusionam a membrana plasmatica. Esta rota supre a membrana plasmatica de protenas e lipdeos (permitindoa membrana plasmatica crescer antes da celula se dividir), e encaminha protenas para a superfcie celular afim de serem liberadas no exterior. Sendo este ultimo processo chamado de secrecao. Algumas das protenasliberadas aderem a` superfcie celular, onde se tornam protenas perifericas da membrana plasmatica; outrassao incorporadas a` matriz extracelular; e outras se difundem no fluido extracelular para nutrir ou sinalizaroutras celulas. Esta rota nao exige uma sequencia sinal especfica (como a que leva protenas para o lisossomoou de volta para o RE).

Rota regulada de exocitose Opera apenas em celulas especializadas em secrecao. Celulas secretoriasproduzem hormonios, muco ou enzimas digestivas, e estocam estes produtos em vesculas secretorias. Estasvesculas se fundirao a` membrana plasmatica e liberarao seu conteudo no exterior celular somente se houvera presenca de um sinal extracelular que estimule a fusao da vescula. Se nao houver sinal extracelular, asvesculas secretorias que brotam da rede trans de Golgi, se acumulam proximo a` membrana plasmatica. Nolumen da rede trans, as condicoes sao ionicas, isto e, pH acido e alta concentracao de Ca2+. As protenas


secretorias tem s superfcie tal que sob condicoes ionicas, as protenas se agregam umas a`s outras. Entao asvesculas secretorias conseguem transportar concentracoes de protenas muito mais altas que as das protenasnao agregadas no Ap. Golgi.

Endocitose: pinocitose e fagocitose

Endocitose consiste na internalizacao celular de partculas. Assim como as rotas de exocitose, existemrotas de endocitose. Estas ultimas sao tradicionalmente subdividas em pinocitose e fagocitose. A pinocitoseenvolve a ingestao de fluidos e pequenas moleculas. A fagocitose envolve a ingestao de grandes partculas,como microoganismos e fragmentos celulares, celulas mortas. Na endocitose o material a ser ingerido eprogressivamente encerrado por uma porcao da membrana plasmatica, que brota para dentro e depois destaca-se como uma vescula endoctica intracelular. Esta vescula se funde a um endossomo, que depois se funde aum lisossomo, onde o material e degradado.

A fagocitose pode ter 3 propositos:

Nutricao: a fagocitose de microoganismos por protozoarios e bastante comum. Defesa contra infeccoes: em animais, por exemplo celulas fagocitarias englobam microoganismos inva-

sores e promovem sua digestao.

Limpeza de celulas mortas, defeituosas ou restos celulares. Este caso tambem ocorre por celulas fago-citarias de animais.

A celula fagocitaria forma projecoes com a membrana plasmatica, os chamados pseudopodes, que engolfama bacteria, e se fusionam nas pontas para formar um fagossomo. Este se funde posteriormente com o lisossomoque realiza a digestao da bacteria. Para capturar as bacterias algumas celulas fagocitarias exigem a ligacaode anticorpos aos seus varios receptores de superfcie, e entao quando a bacteria e coberta por anticorpos seliga aos receptores da celula fagocitaria, inicia-se o processo de fagocitose.

Existem dois tipos de pinocitose: aquela indiscriminada, e aquela mediada por receptores. A primeiraconsiste no englobamento de qualquer molecula que eventualmente estiver no fluido celular. Ja a segundafornece uma rota eficiente para captar moleculas especficas do fluido celular. Para o ultimo caso, pinocitosemediada por receptor, um exemplo e a captacao de colesterol por celulas animais, que necessitam deste lipdeopara produzir novas membranas.

O colesterol e muito insoluvel, de modo que e transportado no sangue ligado a` protena na forma departculas chamadas lipoprotenas de baixa densidade (LDL). O LDL se liga a` receptores especficos , oscomplexos LDL-receptores sao ingeridos por pinocitose, por meio do brotamento de uma vescula pinocticainterna. Esta vescula se funde a um endossomo. Um endossomo e um compartimento associado a membranapara o qual se dirigem vesculas pinocticas antes de serem fundidas aos lisossomos. Os receptores se destacamdo endossomo e retornam por meio de vesculas de transporte para a membrana plasmatica. E o LDLe entregue aos lisossomos. No lisossomo, enzimas hidrolticas quebram o LDL, liberando o colesterol nocitoplasma para que este seja usado na producao de novas membranas. Outros exemplos de metabolitosessenciais transportados para a celula por pinocitose mediada por receptores sao a vitamina B12 e o ferro.Vrus como o influenza e o HIV tambem usam a pinocitose mediada por receptores para invadir a celula.

Endossomos

Endossomos: sao compartimentos compostos por tubos de membrana conectados a vesculas. O endos-somo primario localiza-se proximo a` membrana plasmatica, e e o primeiro a receber a carga captada porendocitose. Os endossomos primarios amadurecem a` medida que suas vesculas se fundem, ou mesmo pelasua propria fusao a um endossomo secundario preexistente. Finalmente ja proximo do nucleo, chamamosagora este compartimento de endossomo secundario. O endossomo tem como principal funcao servir comouma estacao de distribuicao na rota endoctica, assim como a rede trans do Golgi serve como estacao dedistribuicao para a rota secretoria. No interior do endossomo e mantido um ambiente acido por meio debombas de protons dirigidas por ATP, que continuamente bombeiam protons do citoplasma para dentro doendossomo. Tal ambiente acido e essencial para que muitos receptores liberem sua carga ligada (que so semantem ligados em pH neutro ou alguma situacao similar), mas ha casos em que este complexo receptor-cargase mantem intacto.

De acordo com o tipo de receptor este pode ter 3 destinos:


O receptor pode retornar a` membrana plasmatica. O receptor pode ir para o lisossomo e ser degradado. O receptor pode prosseguir para outro espaco extracelular, transferindo suas moleculas-carga para

este novo espaco (processo chamado transcitose). Sobre a transcitose, pode-se dizer que ocorre emcelulas expostas simultaneamente a ambientes extracelulares diferentes. De um lado a superfcie celularesta exposta a m meio extracelular contendo a partcula a ser ligada ao receptor e transportada porendocitose, e do outro lado a superfcie celular esta exposta a um outro ambiente celular para o quala partcula carga do receptor sera liberada apos destacar-se do endossomo dentro de uma vesculade transporte. Exemplos de celulas que realizam endocitose : celulas epiteliais com a finalidade depromover defesa imunologica, distribuir nutrientes e produzir membrana plasmatica, celulas endoteliais,e ainda celulas do sistema endocrino.

Lisossomos

Lisossomos sao sacos membranosos de enzimas hidrolticas, que conduzem a digestao intracelular departculas extracelulares, moleculas, organelas esgotadas ou ainda celulas de microrganismos como bacterias.Todos os tipos de enzimas hidrolticas contidas nos lisossomos atuam otimamente no pH acido mantido nointerior do lisossomo(pH 5). Mesmo que estas hidrolases escapassem do lisossomo, nao ocorreriam danos aocomponentes celulares, pois no citosol e mantido um pH de cerca de 7.2, e estas enzimas so trabalham empH acido.

Sobre a membrana de um lisossomos, temos 3 pontos a destacar:

Presenca de protenas de transporte de metabolitos: aminoacidos, nucleotdeos e acucares resultantesda degradacao sao transportados para o citosol para que possam ser usados pela celula ou excretados.

Presenca de bombas de protons, dirigidas por ATP, que bombeiam constantemente protons do citosolpara dentro do lisossom a fim de manter o pH acido.

As protenas da membrana do lisossomo possuem grande quantidade de acucares associados como umaestrategia de protecao contra as proteases lisossomicas.

Alem das rotas ja conhecidas (vesculas pinocticas-endossomos e fagossomos se fundirem ao lisossomo),existe uma outra rota que degrada as proprias organelas da celula. O processo parece comecar quandoorganelas sao cercadas por uma membrana dupla, autofagossomo que depois se funde ao lisossomo quepromove a degradacao da organela obsoleta. Este fenomeno chama-se autofagia.

Como o lisossomo nao se autodigere ?Pelo menos parte da resposta e: as protenas altamente glicosiladas usam os acucares como um escudo

contra a enzimas digestivas afinal os varios acucares dificultam o acesso a`s ligacoes peptdicas das protenas.Porem, dentro do lisossomo existem glicosilases, e portanto, eventualmente os proprios acucares protetoresserao degradados. O que de fato parece ocorrer e um equilbrio entre a degradacao e a reparacao do lisossomo.Contanto que o lisossomo se autodegrade numa velocidade que de tempo suficiente para que ele realize suafuncao ( digerir o conteudo recebido), nao importa se eventualmente ele seja danificado. Ate porque mesmose as enzimas vazarem do lisossomo, serao inativas no pH neutro do citosol.

Resta ainda a duvida se existe uma estrategia dos lipdeos da membrana do lisossomo assim como existepara as glicoprotenas, que os proteja ao menos parcialmente da degradacao.

Distribuicao de protenas

Depois de sintetizadas no citosol a maioria das protenas tem duas opcoes:

As protenas sao direcionadas para organelas, por meio de uma sequencia sinal, uma regiao deaminoacidos da protena que indica qual e a organela de destino.

As protenas que nao tem sequencia sinal de distribuicao continuam no citosol.Ha 3 mecanismos para importar protenas para organelas:


Protenas que precisam chegar ao nucleo, sao transportadas para dentro desta organela por meio deporos nucleares, presentes nas membranas externa e interna do nucleo.

Para serem transportadas para dentro do RE, mitocondrias, cloroplastos e peroxissomos, as membranasdestas organelas (externa e interna) entram em contato uma com a outra em certos locais, e nesteslocais existem protenas translocadoras, que auxiliam a protena a se desdobrar, de modo que ela sejadesdobrada a` medida que e transportada. Protenas chaperonas auxiliam a puxar as protenas pelasmembranas e restituir suas conformacoes funcionais. Finalmente a sequencia sinal e clivada. Bacteriasusam este tipo de mecanismo para transportar protenas para a membrana plasmatica.

Protenas que sao transportadas do RE para algum outro compartimento, o fazem por meio de vesculasde transporte. Vesculas contendo uma carga de protenas brotam do RE, dirigem-se ate a organelade destino, se fusionam a` membrana da organela destino e liberam sua carga de protenas para dentrodesta organela.

Mitocondria

Mitocondrias sao organelas que possuem seu proprio DNA, RNA e um sistema completo de transcricaoe traducao, incluindo obviamente os ribossomos, o que as permite sintetizar algumas de suas protenas (aoutra parte e codificada por genes no nucleo). Dependendo do tipo celular, as mitocondrias podem sermoveis, associando-se aos microtubulos do citoesqueleto para formar longas cadeias moveis de mitocondrias,ou podem ser fixas para direcionar ATP diretamente para um stio de alto consumo de ATP. Para o segundocaso, pode-se citar celulas musculares cardacas e espermatozoides.

No que diz respeito a` estrutura, uma mitocondria e formada por uma membrana externa, uma membranainterna, um espaco entre estas duas membranas chamado de espaco intermembranas, e um espaco internochamado matriz. A composicao das membrana interna e externa difere consideravelmente. A membranaexterna e permeavel a moleculas de ate 5000 Daltons, pois possui varias moleculas de porina ancoradas. Asporinas formam largos canais aquosos. Portanto, o espaco intermembranas tem constituicao muito similar a`do citosol.

A membrana interna e impermeavel a ons e a` maioria das protenas, exceto em alguns stios, comopor exemplo, ATP sintase que permite a entrada de protons. Logo, a matriz possui somente moleculasselecionadas que puderam atravessar a membrana interna. E tambem na membrana interna que se da asntese de ATP, pois nela estao ancorados os componentes da cadeia de transporte de eletrons, a ATPsintase, e varias protenas que transportam o piruvato e acidos graxos para a matriz. Assim, a conversao depiruvato a Acetil-Coa e o ciclo de Krebs ocorrem na matriz mitocondrial, enquanto a fosforilacao oxidativaocorre na membrana interna. Outro aspecto importante da membrana interna, e que esta forma varias dobras(cristas) na matriz, aumentando enormemente a area de superfcie disponvel para sntese de ATP.

Ressalta-se ainda que a matriz possui DNA, ribossomos especiais, RNAt e varias enzimas necessarias a`expressao dos genes mitocondriais.

Captulo 7

Estrutura de protenas

Estrutura primaria: sequencia de aminoacidos de uma cadeia peptdica.Estrutura secundaria: enovelamento local da cadeia polipeptdica, sem incluir as cadeias laterais-grupamentos

R). Ex: alfa-helice, folha-betaEstrutura terciaria: enovelamento da cadeia polipeptdica como um todo, incluir tanto os atomos da

ligacao peptdica quanto os da cadeia lateral, ou seja, a conformacao tridimensional completa da cadeia.Estrutura quartenaria : arranjo espacial de todas as cadeias polipeptdicas. Lembre-se que uma protena

pode ter mais de uma cadeia polipeptdica.Estrutura secundariaOs atomos que participam da ligacao peptdica sao: C-alfa, C do grupo carboxilato, N do grupo aminoNa ligacao entre o C do grupo carboxilato e o N, por vezes se forma um ligacao dupla por ressonancia do

par de eletrons da dupla ligacao entre o C do grupo carboxilato e o O (oxigenio).Devido a este carater parcial de dupla ligacao, a ligacao C-N nao rotaciona. Devido a` ressonancia, a

ligacao C-N e mais curta que uma ligacao amida normal e mais longa que uma ligacao dupla normal, comcarater parcial de 40% de ligacao dupla. Outra consequencia da ressonancia e que os atomos envolvidosna ligacao peptdica tendem a ficar no mesmo plano ja a ligacao peptdica e um tanto rgida. De formaa minimizar tensoes estericas, os resduos tendem a assumir conformacao trans mais do que a cis, poremexistem casos em que certos aminoacidos obrigam os residuos com quem estao ligados a ficar em configuracaocis, exemplo disso, e a prolina que possui um anel que liga a cadeia alifatica do grupamento R com o grupoamino, este anel impoe ainda mais restricoes a` rotacao da ligacao peptdica, deixando a configuracao cis entreele (prolina) e os residuos ligados a ele.

No arcabouco peptdica (cadeia peptdica), pode ainda ocorrer rotacao das ligacoes C-alfa com C docarboxilato, e na ligacao C-alfa com N. Na verdade e somente em torno do carbono alfa que realmente ocorrerotacao. O angulo de torcao(rotacao) da ligacao entre C-alfa e C da carboxila chama-se Angulo psi(letragrega), e o angulo de torcao da ligacao C-N chama-se fi(letra grega). O fsico Ramachandran criou a teoria,que foi posteriormente comprovada, de que somente com determinados valores dos angulos psi e fi destasligacoes, e que e possvel ocorrer o enovelamento estavel das protenas. Estes angulos sao muito importantespara determinar o enovelamento pois dependendo dos valores que possuem, podem impedir a formacao depontes de hidrogenio (ex: fi: 180 e psi: 0 ou quando fi:0 e psi: -180) ou pode ocorrer colisao entre as nuvenseletronicas do N e do C (ex: fi: 0 e psi: 0 ou quando fi:-60 e psi:180).Veja a figura do penultimo slideda primeira aula da ufrgs. A colisao entre nuvens eletronicas e o impedimento da formacao de pontes dehidrogenio sao duas das restricoes da ligacao peptdica.

Como existe ressonancia na cadeia peptdica, os atomos da ligacao peptdica sao bastante polares, etendem a fazer pontes de hidrogenio, tambem chamadas de ligacoes de hidrogenio.

As pontes de hidrogenio sao estabelecidas entre o grupo amino (doador da ponte de hidrogenio) e ooxigenio do grupo carboxilato (aceptor da ponte de hidrogenio).

Em condicoes fisiologicas, a cadeia polipeptdica se dobra para satisfazer as necessidades de pontes dehidrogenio, e assume uma conformacao (estrutura secundaria) que minimize a tensao esterica.

Tensao esterica: repulsao entre nuvens eletronicas de atomos ou grupos de atomos.A alfa-helice e a folha Beta sao dois tipos de estrutura secundaria comuns encontrados em protenas.

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CAPITULO 7. ESTRUTURA DE PROTEINAS 27

alfa-helice: neste tipo de estrutura secundaria, o arcabouco peptdico gira como um helice para a direita;um aminoacido estabelece um ponte de hidrogenio entre o seu oxigenio do grupo carboxila e o NH de outroaminoacido a 4 resduos a frente. Ou seja, a cada 4 resduos existe um ponte de hidrogenio. Os atomos dacadeia peptdica estao em contato por interacoes de van der Waals; as cadeias laterais projetam-se para forada helice.

folha beta: neste tipo de estrutura secundaria filamentos ou fitas formadas por cadeias peptdicas dispoem-se lado a lado por meio de pontes de hidrogenio entre os filamentos. Cada aminoacido estabelece duas pontesde hidrogenio, exceto os aminoacidos das fitas que ficam no incio e no fim da folha. As cadeia

estudos para seleção de mestrado em biologia molecular

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