eletroquímica acoplada à ressonância de plásmons de ......figura 28: fotos da segunda etapa do...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE MATERIAIS

Raimundo Rômulo Martins Júnior

Eletroquímica Acoplada à Ressonância de Plásmons de Superfície

no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino

Recife 2007

Raimundo Rômulo Martins Júnior

Eletroquímica Acoplada à Ressonância de Plásmons de

Superfície no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino

Recife 2007

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Materiais da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciência de Materiais, com ênfase em Físico-Química. Orientador: Prof. Flamarion Borges Diniz.

Martins Júnior, Raimundo Rômulo Eletroquímica acoplada à ressonância de plásmons de superfície no estudo de adsorção de proteína em filme fino / Raimundo Rômulo Martins Júnior. - Recife: O Autor, 2007. 156 folhas: il., fig., tab.. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Pernambuco. CCEN. Ciência de Materiais, 2007. Inclui bibliografia, apêndice. 1. Físico-química. 2. Plásmons de superfície 3. Adsorção de proteína 4. Impedância eletroquímica I. Título. 541.3 CDD (22.ed.) FQ2008-033

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao Dr. Fernando Monteiro de Paula, professor aposentado do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Ceará (UFC).

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao Conselho Nacional de Pesquisa Brasileiro (CNPq) pela concessão da bolsa de Mestrado, aos grupos de Eletroquímica e Fotônica e à UFPE (Universidade Federal de Pernambuco) por disponibilizar o uso de suas instalações propiciando o desenvolvimento deste trabalho. Agradeço ao Prof. Flamarion Borges Diniz pela oportunidade acadêmica, confiança e desafios durante estes anos. Agradeço também pela disponibilidade e dedicação despendidas e principalmente pela amizade e por acreditar na minha capacidade. Prof. Cid Bartolomeu de Araújo pela co-orientação, por sua confiança em meu trabalho e pelas recepções sempre calorosas. Ao Dr. Fernando Monteiro de Paula, meu orientador durante a graduação, por me ensinar a ser um pesquisador. Dele aprendi que um professor não é só quem dá aulas, mas também quem sabe ser amigo e ter as palavras certas para incentivar o aluno a ampliar seus horizontes. À Sra. Ângela Farias, secretária do curso de pós-graduação em Ciência de Materiais, pelo estímulo recebido para prosseguir e realizar esse trabalho. Ao Físico Blênio José da Silva por seu apoio no uso do equipamento de evaporação de filmes finos. Ao Mestre Maxwell Aragão Marques pela ajuda inicial no processo de montagem do aparato experimental de SPR. Aos membros do grupo de Eletroquímica e Fotônica da UFPE. A todos aqueles que colaboraram direta ou indiretamente com este trabalho.

“Sem a convicção de uma harmonia íntima do Universo, não poderia haver ciência. Esta convicção é, e continuará a ser, a base de toda criação científica. Em toda extensão de nossos esforços, nas lutas dramáticas entre as velhas e as novas concepções, entrevemos a ânsia eterna de compreensão, a intuição inabalável da harmonia universal, que se robustece na própria multiplicidade dos obstáculos que se oferecem ao nosso entendimento”.

Albert Einstein

RESUMO

Biosensor é um dispositivo no qual o material de origem biológica, tais como enzima,

organela, tecido animal ou vegetal, microrganismo, antígeno ou anticorpo, ácidos nucléicos,

lectina, entre outros, é imobilizado junto a um transdutor adequado. Portanto, o estudo da

interface eletrodo/biomolécula/solução consiste em uma das principais etapas para o

desenvolvimento de biosensores. O objetivo deste trabalho foi estudar a interface

ouro/lectina utilizando as técnicas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) e

Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR), como meios de transdução para a confecção

de um futuro biosensor. Contudo, as lectinas pertencem a um grupo de proteínas com

especificidade a carboidratos, característica que ampliou o foco da dissertação para a

interação entre a lectina Concanavalina A e os carboidratos glicogênio e galactose. Neste

trabalho foi montado um sistema de SPR acoplado ou não a um sistema eletroquímico, com

o intuito de monitorar e caracterizar a adsorção da proteína em diferentes potenciais e sua

interação com carboidratos. Com base nos resultados obtidos, a proteína na configuração

desativada adsorveu mais que a forma ativada na superfície do eletrodo de filme fino de

ouro, porém, foi a configuração ativada que melhor reconheceu o glicogênio e ambas não se

ligaram à galactose. Além disso, foi verificado que a proteína, em ambas as configurações,

não reconheceu a galactose e adsorveu mais facilmente em potenciais mais positivos, devido

a um maior contraste de cargas entre o eletrodo e a proteína.

Palavras-Chave: Concanavalina A; adsorção de proteína; impedância eletroquímica; Plásmons de superfície

ABSTRACT

Biosensor is a device in which the biological source material, such as enzyme, organelle,

animal or vegetable tissue, microorganism, antigen or antibody, nucleic acids, lectina,

among others is immobilized close to an adequate transducer. Therefore, the electrode/bio-

molecule/solution interface characterization consists in one of the main stages for biosensors

development. The goal of this work was to study the gold/lectina interface using the

Electrochemistry Impedance Spectroscopy (EIS) and Surface Plásmons Resonance (SPR)

techniques as transduction means for the confection of a future biosensor. Lectinas belong to

a proteins group with specificity to carbohydrates. This characteristic enlarged the

dissertation focus for the Concanavalina A protein and the glycogen carbohydrate

interaction. In this work it was set up a SPR's system coupled or not to an electrochemistry

system, with the intention of monitoring and characterizing the protein adsorption in

different potentials and its interaction with carbohydrates. With base in the obtained results,

the protein in the disabled configuration adsorbed more than the activated form, however,

the activated configuration better recognized the carbohydrate. Besides, it was verified that

the protein, both configurations, adsorbs more easily in more positive potentials, due to a

larger charges contrast between electrode and the protein.

Key Words: Concavalina A, protein adsorption, electrochemistry impedance, surface

Plásmons

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura tridimensional do monômero da Concanavalina A na conformação cis. O sítio 1 (S1) está representado pela pequena esfera cinza claro, e o sítio 2 (S2) pela esfera preta. A estrutura β é representada por setas. As posições dos resíduos Thr-11(treonina), Ser-96 (serina), e Glu-102 (glutamato) em cada um dos lados escuros das setas estão destacadas.................................................. 28

Figura 2: Esquema ilustrativo do funcionamento geral de um biosensor............................................... 35

Figura 3: Representação de uma onda senoidal de período tp e a amplitude Ip e sua relação entre a representação do correspondente vetor de comprimento Ip girando em sentido anti-horário a uma velocidade angular constante de ω = 2πƒ radianos/segundo ou uma freqüência de ƒ Hz. .................... 40

Figura 4: Ondas senoidais com diferentes amplitudes (Vp ou Ip) e com diferença de fase de 90 graus

ou 2π

radianos. A diferença de fase é chamada ângulo de fase (φ), que aparece pelo fato de um vetor se atrasar ou adiantar-se em relação ao outro, similar a um circuito de corrente alternada.......... 41

Figura 5: Circuito elétrico puramente resistivo...................................................................................... 44

Figura 6: Circuito elétrico puramente capacitivo................................................................................... 45

Figura 7: Circuito elétrico capacitivo em série com a resistência.......................................................... 48

Figura 8: Circuito elétrico com uma capacitância em paralelo com uma resistência ou RC em paralelo................................................................................................................................................... 49

Figura 9: Circuito elétrico tipo R(RC)................................................................................................... 51

Figura 10: Circuito de Randles............................................................................................................... 54

Figura 11: Analogia entre um capacitor de um circuito elétrico e a interface eletrodo/solução de um sistema eletroquímico com o modelo proposto por Helmholtz, onde uma das placas representa o eletrodo e a outra placa do capacitor, a solução..................................................................................... 55

Figura 12: Circuito de Randles e os respectivos gráficos Nyquist e Bode............................................ 56

Figura 13: Uma representação usando raios mostrando a reflexão e a refração de um feixe de luz incidente numa superfície plana de vidro. Estão assinalados os ângulos de incidência (θ1), de reflexão (θ1`), e de refração (θ2) ............................................................................................................ 61

Figura 14: Geometria utilizada na análise de reflexão e refração em uma interface simples................. 65

Figura 15: Ilustração das oscilações na densidade da carga de superfície, junto com as linhas do campo..................................................................................................................................................... 70

Figura 16: Plásmons de superfície não irradiados em um metal, porque a curva da dispersão para os plásmons se encontra abaixo “da linha tracejada”.................................................................................. 71

Figura 17: Configuração de Otto para excitação de SPR....................................................................... 72

Figura 18: Configuração de Kretschmann para excitação de plásmons superficiais.............................. 73

Figura 19: Eletrodo de referência de Ag/AgCl, KCl saturado................................................................ 79

Figura 20: Eletrodo auxiliar de platina (Pt)............................................................................................ 79

Figura 21: Desenho técnico da célula EIS-SPR...................................................................................... 81

Figura 22: Ilustração da montagem do conjunto prisma/ eletrodo de filme fino de ouro/célula EIS-SPR......................................................................................................................................................... 82

Figura 23: Foto do processo de acoplamento das partes integrantes da célula EIS-SPR. a) peça em aço para fixar o prisma na célula com o eletrodo; b) célula EIS-SPR em teflon; c) conjunto peça em aço, célula e prisma e d) eletrodo de filme fino de ouro......................................................................... 83

Figura 24: Ilustração do método de Evaporação térmica a baixa pressão.............................................. 85

Figura 25: Foto do equipamento Evaporador (Modelo 980-2462 da Varian) utilizado na confecção de filmes finos de ouro............................................................................................................................ 86

Figura 26: Esquema simplificado do sistema de evaporação utilizado na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro. 1) bomba difusora. 2) bomba mecânica. 3) válvula dianteira “foreline valve”. 4) válvula de vácuo-intermediário “rough valve”. 5) válvula de alto-vácuo “HiVac”. 6) entrada de ar ou nitrogênio. 7) campânula. 8) cadinho. 9) Shutter (auxilia no controle da espessura do filme depositado).............................................................................................................................................. 87

Figura 27: Diagrama esquemático do sistema de evacuação da evaporadora utilizada na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro....................................................................................................... 88

Figura 28: Fotos da segunda etapa do processo de confecção do eletrodo de trabalho de filme fino de ouro por evaporação a baixa pressão. a) posicionamento do material no cadinho da campânula. b) posicionamento das lâminas de vidro no porta-substrato, na parte superior da campânula; c - d) processo de evaporação do ouro; d) filmes finos de ouro após o processo de crescimento e acomodados em porta-filmes de PVC .................................................................................................... 90

Figura 29: Foto ilustrando o processo de construção do contato elétrico no eletrodo de filme fino de ouro. a-1) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro e a-2) em um substrato de vidro sem filme. b) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro, cuja junção foi revestida com fita de teflon................................................................... 91

Figura 30: Amostras do eletrodo de filme fino de ouro utilizada na caracterização da morfologia superficial por AFM.............................................................................................................................. 92

Figura 31: Célula EIS-SPR com os eletrodos fixados. Sistema utilizado na caracterização da adsorção da Con A e da reação Con A e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por EIS................................................................................................................................................... 95

Figura 32: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção de biomoléculas na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR................................................................................................. 96

Figura 33: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção da Con A e da reação Con A e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR. a) foto do suporte ajustável com a célula EIS-SPR fixada; b) foto do sistema óptico completo............................................................... 98

Figura 34: Espectro de absorção no UV-visível, numa região de 190 a 900 nm para a Concanavalina A ativada 200 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC, preparada após 24 horas (linha contínua) e 7 dias (linha pontilhada)..................................................................... 106

Figura 35: Solução de Concanavalina ativada 200 µg/mL (a) e glicogênio 60 µg/mL(b) em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC; (c) reação entre ambas as soluções............... 106

Figura 36: Resultados da absorção no visível a um comprimento de onda de 460 nm, um dia após a confecção () e 7 dias após a confecção da solução (+). Solução de Concanavalina ativada 200 µg/mL e glicogênio 60 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC........................................................................................................................................................ 107

Figura 37: Imagem topográfica em 3D obtida por AFM do filme fino de ouro (50 nm) depositado em substrato de vidro comum................................................................................................................ 108

Figura 38: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em solução de NaCl 0,15M, v = 50 mV s-1, 25° C................................................................................................................... 109

Figura 39: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em H2SO4 0,1M, v = 50 mV s-1, 25° C........................................................................................................................................... 110

Figura 40: Gráfico de Nyquist, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5...................................................................... 111

Figura 41: (a) Gráfico de Bode e de (b) admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.................................. 112

Figura 42: Gráfico de admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5..................................................................................................... 113

Figura 43: Gráfico de Bode, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5................................................................................................................... 114

Figura 44: Curvas teórica (linha contínua) e experimental (pontilhada) da intensidade de refletividade na interface Au/ar, com n(ar) = 1, ε (Au) = -10,333-j1,685 e d(Au) = 50nm e λ = 670 nm............................................................................................................................................................ 115

Figura 45: Função refletividade, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. d(Au) = 50nm e λ = 670 nm (laser). Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5............................................ 116

Figura 46: Circuito equivalente à interface eletrodo/proteína/solução................................................... 118

Figura 47: Ajuste utilizando o modelo apresentado na Figura 48, sendo () a interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl, () interface Au/ConA-ativada/NaCl e (____) são os ajustes, nas respectivas cores das interfaces. Experimento realizado em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C e pH 5,5. Gráfico registrado na região de 9 a 3000 Hz para uma melhor visualização................ 119

Figura 48: Gráficos de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl, (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5............................................ 119

Figura 49: Gráficos de Bode, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5............................................ 120

Figura 50: Parâmetros (a) Rct e (b) Q, versus potencial (E) aplicado durante a etapa de adsorção, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5........................................................................................................ 121

Figura 51: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-desativada/NaCl e () Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.............................................................................................................................. 122

Figura 52: Parâmetros (a) Rct, (b) Q e (c) n, versus potencial de circuito aberto (ECA) aplicado durante a medida de impedância, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5......................................................... 123

Figura 53: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5.................................................................... 125

Figura 54: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/NaCl e (b) interface Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5....................................................................................................................... 127

Figura 55: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5................................................................... 128

Figura 56: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.......................................................... 130

Figura 57: Gráfico de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/Glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/Glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5........................................................................................................................................................... 132

Figura 58: Parâmetro Rct (a) e Q (b) versus potencial (E) aplicado, para as interfaces () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5....................................................................................................................... 133

Figura 59: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para a interface () Au/ConA-desativada/galactose/NaCl, ()Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em ECA, a 25° C e pH 5,5......................................................................................................................................... 134

Figura 60: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E =

+0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.........................................................................................

135

Figura 61: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para interface () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5..................................................................................................... 136

Figura 62: Cinética da reação lectina-carboidrato para uma solução com concentração final de 200mg/mL. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5............................................................ 137

Figura 63: Estabilidade do sensor EIS-SPR. (a) variação do ângulo de plásmons em função do tempo e (b) ângulo relativo em função do tempo. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5...................................................................................................................................................... 138

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Técnicas usadas na investigação da adsorção de proteína............................................. 34

Tabela 2: Associação de impedâncias em série e em paralelo...................................................... 53

Tabela 3: Gráficos Nyquist e Bode para circuitos R em série, C em série. RC em série, RC em paralelo e R em série com RC em paralelo............,...................................................................... 57

Tabela 4: Relação dos componentes utilizados na montagem experimental do sistema óptico............................................................................................................................................. 97

Tabela 5: Resultados experimentais obtidos com ajuste de curva teórica/experimental para a interface Au/ar.............................................................................................................................. 116

Tabela 6: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 45..................... 117

Tabela 7: Parâmetros extraídos da modelagem de circuitos equivalentes dos resultados da Espectroscopia de Impedância Eletroquímica............................................................................... 121

Tabela 8: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 53...................... 126

Tabela 9: Parâmetros extraídos da modelagem de circuitos equivalentes dos resultados da interação entrem a Concanavalina a adsorvida e açúcares por EIS............................................... 130

Tabela 10: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 59................................................................................................................................................... 134

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍGLAS

ConA Concanavalina A, lectina isolada de extratos da Canavalia ensiformis

EIS Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS)

SPR Ressonância de Plásmons de Superfície

Thr Treonina

Ser Serina

Glu Glutamato

ECA Potencial de circuito aberto

ELISA enzyme-linked immunosorbent assays

pH Potencial hidrogeniônico

pI Ponto isoelétrico

D Debye

QCM Microbalança de Cristal de Quartzo

FTIR Infravermelho com Transformada de Fourier

CV Voltametria Cíclica

TIRF Fluorescência de Reflexão Interna Total

AFM Microscopia de Força Atômica

SP plásmons de superfície

ATR reflexão interna total atenuada

IgG Imunoglobuilina G

ET Eletrodo de trabalho

ER Eletrodo de referência

EA Eletrodo auxiliar

PVC poli cloreto de vinila

PAR Princenton Applied Research

F1 Fotodetector 1 ou de referência

F2 Fotodetector 2

LISTA DE SÍMBOLOS

φ Ângulo de fase

º

ω Freqüência angular, sendo igual a 2πf

Rad.s-1

εο Permissividade no vácuo

φ(t) Ângulo de fase em função do tempo

º

εp Permissividade dielétrica da proteína

Z Modulo da impedância

Ω

C Capacitância

µF

C(t) Capacitância em função do tempo

µF

Cdc Capacitância de dupla camada

µF

E Potencial de um eletrodo versos uma referência

V

Ep Potencial de pico

V

f Freqüência

Hz

I Corrente

A

Ip Corrente de pico

A

j 1−

n Natureza da dispersão na capacitância, sendo resistivo para n=0, capacitivo para n=1, Warburg para n=1/2

Q Constante que contem informações simultâneas da superfície e das espécies eletroativas

µF.cm-2

R Resistência elétrica

Ω

RΩ Resistência da solução

Ω

Rct Resistência transferência de elétrons

Ω

t Tempo

s

Y Admitância S

Yim Parte imaginária da admitância

S

Zre Parte real da admitância

S

ZCPE Impedância referente ao elemento de fase constante

F.cm-2.sn-1

Zim Parte imaginária da impedância no plano complexo

Ω

Zre Parte real da impedância no plano complexo

Ω

ZW Impedância de Warburg

Ω

W Constante que contem informações do processo de transporte das espécies eletroativas

Ω-1.s1/2

-∆Gi-sΦ Variação da energia de solvatação íon-solução KJmol-1

SUMÁRIO

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de Abreviaturas e Símbolos

Resumo

Abstract

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO E OBJETIVOS 21

1.1. Introdução......................................................................................................................... 21

1.2. Objetivos específicos........................................................................................................ 22

CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 23

2.1. Lectinas............................................................................................................................ 23

2.1.1. Lectinas leguminosas............................................................................................ 25

2.1.1.1. Concanavalina A..................................................................................... 27

2.2. Adsorção de biomoléculas em superfícies sólidas........................................................... 29

2.3. Biosensores....................................................................................................................... 35

2.4. Técnicas empregadas na detecção de interações bioespecíficas....................................... 38

2.4.1. Espectroscopia Impedância Eletroquímica............................................................ 39

2.4.1.1. Conceitos fundamentais.......................................................................... 39

2.4.1.2. Circuito equivalente de um sistema eletroquímico................................. 54

2.4.1.3. Gráficos de impedância........................................................................... 56

2.4.2.Ressonância de Plásmons de Superfície................................................................. 58

2.4.2.1. Plásmons de Superfície........................................................................... 60

2.4.2.2. Conceitos fundamentais.......................................................................... 61

2.4.2.3. Condições de existência de oscilações de plásmons de superfície.......... 67

2.4.2.5. Modelos práticos de observação de plásmons de superfície................... 70

2.4.3.5.1. Configuração de Otto............................................................. 72

2.4.3.5.2. Configuração Kretschmann.................................................... 73

2.4.3. Eletroquímica acoplada a Ressonância de Plásmons de Superfície...................... 74

CAPÍTULO III – MATERIAIS E MÉTODOS 76

3.1. Reagentes e limpeza de vidrarias...................................................................................... 76

3.2. Proteína............................................................................................................................. 76

3.2.1. Teste de atividade biológica da Concanavalina A................................................ 77

3.3. Células e eletrodos........................................................................................................... 78

3.3.1. Eletrodos .............................................................................................................. 78

3.3.1.1. Eletrodo de referência............................................................................. 78

3.3.1.2. Eletrodo Auxiliar..................................................................................... 79

3.3.1.3. Eletrodo de trabalho................................................................................ 80

3.3.2. Célula eletrolítica EIS-SPR................................................................................... 80

3.3.2.1. Conjunto integrado prisma-célula ......................................................... 82

3.3.3. Eletrólito suporte e solvente.................................................................................. 83

3.4. Confecção de eletrodos de filme fino............................................................................... 83

3.5. Análise topográfica por Microscopia de Força Atômica................................................. 91

3.6. Voltametria cíclica........................................................................................................... 92

3.7. Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS)........................................................ 93

3.7.1. EIS aplicada na caracterização da adsorção de biomoléculas.............................. 93

3.8. Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR)................................................................ 96

3.8.1. Sistema óptico....................................................................................................... 96

3.8.2. SPR aplicada na caracterização da adsorção de biomoléculas.............................. 99

3.8.2.1. Evolução temporal da refletividade......................................................... 102

3.9. Eletroquímica acoplada a SPR......................................................................................... 103

3.9.1. Técnicas eletroquímicas acopladas a SPR na caracterização da adsorção de

biomoléculas.................................................................................................................................. 104

3.9.1.1. Estabilidade do Sistema EIS-SPR....................................................................... 104

CAPÍTULO IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO 105

4.1. Caracterização da Concanavalina A................................................................................. 105

4.2. Caracterização topográfica do eletrodo de filme fino de ouro......................................... 107

4.3. Caracterização eletroquímica e SPR do eletrólito de suporte.......................................... 108

4.3.1. Técnicas eletroquímicas........................................................................................ 108

4.3.2. Resultados utilizando a técnica de SPR................................................................. 114

4.4. Caracterização da adsorção da Concanavalina A............................................................ 117

4.4.1. Resultados de impedâncias.................................................................................... 117


4.4.2.1. Análise em potencial de circuito aberto.................................................. 125

4.4.2.2. Análise em diferentes potenciais............................................................. 127

4.5. Caracterização da interação entre a Concanavalina A adsorvida e açúcares................... 129

4.5.1. Resultados de impedâncias.................................................................................... 129

4.5.1.1. Análise em potencial de circuito aberto.................................................. 129



4.5.2.1. Análise em potencial de circuito aberto................................................. 133


4.6. Evolução temporal da refletividade.................................................................................. 136

4.7. Estabilidade do sistema EIS-SPR..................................................................................... 138

CAPÍTULO V – CONCLUSÕES & PERSPECTIVAS 140

5.1. Conclusões........................................................................................................................ 140

5.2. Perspectivas futuras.......................................................................................................... 142

REFERÊNCIAS........................................................................................................................... 143

APÊNDICE A............................................................................................................................... 156

Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo I

Raimundo Rômulo Martins Júnior 21

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

INTRODUÇÃO

Recentes avanços em bio-eletroquímica têm permitido o uso de um grande número

de procedimentos para a construção de dispositivos sensores, nos quais interações

eletrônicas entre a superfície do eletrodo e o sistema biológico representam um papel

fundamental. Biomoléculas, especialmente lectinas capazes de se ligarem especificamente a

carboidratos, são utilizadas na fabricação de dispositivos bio-eletrônicos, tais como

biosensores eletroquímicos e ópticos [1-7]. Como resultado, essas informações têm

proporcionado um desenvolvimento analítico bem como sua incorporação a outras áreas

científicas e técnicas, de forma a resultar cada vez mais na automação, miniaturização e

simplificação desses sistemas.

Há de se ressaltar a relevante importância das técnicas capazes de avaliar fenômenos

em superfícies e interfaces, em especial métodos como Espectroscopia de Impedância

Eletroquímica (EIS – Electrochemical Impedance Spectroscopy) e a Ressonância de

Plásmons de Superfície (SPR – Surface Plasmon Resonance). A espectroscopia de

impedância eletroquímica tem-se destacado pois possibilita a obtenção de grande número de

informações a partir de um único experimento, bem como pela obtenção de informações

complementares às obtidas por SPR. Assim sendo, o trabalho apresentado nesta dissertação

de mestrado discute os princípios básicos e aplicações individuais e combinadas das técnicas

EIS e SPR, destacando suas complementaridades com o propósito de demonstrar a

importância destes como transdutores em biosensores, através da investigação de processos

superficiais e interfaciais.

O presente trabalho está organizado em cinco capítulos e um apêndice, cuja

formatação está de acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT)*. No

Capítulo II foi feita uma revisão referente à proteína Concanavalina A, utilizada nesta

pesquisa, uma breve revisão sobre biosensores e uma descrição teórica das técnicas de

Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e Ressonância de Plásmons de Superfície, e os

Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo I


seus princípios de utilização na caracterização de processos de adsorção de biomoléculas.

No Capítulo III é feita a descrição de todo o material utilizado e a montagem e

desenvolvimento do sistema de detecção eletroquímico/óptico (EIS-SPR) para aplicações

biológicas. No Capítulo IV são descritos os resultados experimentais obtidos, demonstrando

a grande aplicabilidade do sistema de detecção no desenvolvimento de biosensores.

Finalmente, no Capítulo V são apresentadas as conclusões e propostas para futuros

trabalhos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Verificar o processo de adsorção da proteína Concanavalina A em eletrodos de

filmes fino de ouro e sua interação com carboidratos em diferentes potenciais aplicados,

utilizando as técnicas EIS e SPR.

* ABNT NBR 15287:2005; A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Fórum Nacional de Normalização. As Normas Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais Temporárias (ABNT/CEET), são elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas por representantes dos setores envolvidos, delas fazendo parte: produtores, consumidores e neutros (universidades, laboratórios e outros).

Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II

_________________________________________________________________________ Raimundo Rômulo Martins Júnior

23

CAPÍTULO II

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Lectinas

As lectinas foram descobertas em 1888 por Hermann Stilmark, ao observar que

extratos tóxicos de mamona (Ricinus communis) aglutinavam hemácias. O autor

também observou que o extrato, o qual denominou de ricina, reagiu diferentemente com

hemácias de diferentes animais, evidenciando assim a capacidade desses extratos de

expressar seletividade e/ou especificidade [8].

Em 1908, Landsteiner e colaboradores [9] verificaram que extratos de plantas

não tóxicas, como a lentilha (Lens culinaris), o feijão (Phaseolus vulgaris) e a ervilha

(Pisum sativum), também causavam aglutinação de hemácias.

Posteriormente, em 1936, verificou-se que a hemaglutinação produzida pela

Concanavalina A ou ConA, uma lectina isolada de extratos da Canavalia ensiforms

(feijão-de-porco), poderia ser bloqueada ou inibida pelo açúcar da cana (sacarose) [10].

Este estudo foi importante no estudo de lectinas, pois os autores sugeriram que a

aglutinação observada para a ConA seria devido a uma interação entre a lectina e os

carboidratos presentes na superfície das hemácias, identificando pela primeira vez a

principal característica das lectinas, ou seja, a afinidade por açúcares.

Até então se acreditava que lectinas não apresentavam especificidade para

eritrócitos humanos, e que o mesmo grau de aglutinação seria observado para os

diferentes grupos sanguíneos (sistema ABO). Entretanto, em 1948, Renkonen [11]

observou que a aglutinina da enguia japonesa, Asnguilla japonica, aglutinava

preferencialmente eritrócitos do grupo O e que extratos de sementes de Vicia cracca

(ervilhaca), mostraram seletividade para hemácias do grupo sanguíneo A.

Boyd e Reguera em 1949 [12] observaram especificidade para o grupo

sanguíneo A em lectinas do feijão lima, Phaseolus limensis e, mais tarde, Boyd e

Shapleigh [13] utilizaram pela primeira vez o termo lectina, para descrever a atividade

destas aglutininas.



24

Goldstein [14] definiu as lectinas como proteínas de origem não imune, capazes

de se ligar reversivelmente a carboidratos e de aglutinar células ou precipitar

polissacarídeos e glicoconjugados.

Mais recentemente, as lectinas foram definidas como proteínas que possuem,

pelo menos, um domínio não catalítico que se liga de maneira reversível a mono ou

oligossacarídeos específicos [15].

Em 1997, Cummings [16], seguindo a mesma idéia empregada por Peumans e

Van Damme [15], inseriu um caráter restritivo ao mencionar que anticorpos ou

proteínas com atividade enzimática voltada a carboidratos não podem ser considerados

como lectinas.

Dessa forma, as lectinas (do latim lectus, particípio de legere, selecionar,

escolher) são proteínas ou glicoproteínas de origem não imunológica que podem

aglutinar hemácias, devido à sua propriedade de se ligar especifica e reversivelmente a

mono ou oligossacarídeos (carboidratos), mas são destituídas de atividade catalítica

[17].

As lectinas foram reunidas em grupos pelos quais apresentam afinidade [15, 18]:

•Merolectinas – proteínas que possuem um único domínio ligante a carboidrato

sendo, portanto, incapazes de aglutinar hemácias e precipitar glicoconjugados;

•Hololectinas – proteínas que possuem dois ou mais domínios ligantes a

carboidrato, podendo aglutinar hemácias e/ou precipitar glicogonjugados, e, atualmente,

representam um dos grupos mais estudados de lectinas;

•Quimerolectinas – Possuem pelo menos um domínio ligante a carboidrato, e

um outro domínio com uma atividade catalítica ou uma outra atividade biológica. Como

exemplos desse grupo podem ser citadas as quitinases e as proteínas inativadoras de

ribossomos (RIPs).

•Superlectinas - Proteínas de natureza quimérica que consistem de, no mínimo,

dois domínios ligantes a carboidratos, domínios esses com especificidade para açúcares

diferentes (não relacionados).



25

•Multilectinas - Lectinas possuindo dois ou mais domínios ligantes a

carboidratos, idênticos, mas que podem se ligar a açúcares diferentes. É o caso da

frutalina, lectina de sementes de Artocarpus altilis (fruta-pão), que ligam tanto D-

galactose como D-manose [19, 20].

Assim, de acordo com as diferentes especificidades por açúcares apresentadas

pelas lectinas, foi sugerido por Makela [21], em 1957, que elas fossem classificadas em

quatro grupos, conforme a configuração relativa dos átomos de carbono C3 e C4 no anel

piranosídico do açúcar responsável pela ligação especifica. Assim, ao grupo I pertencem

as lectinas especificas por L-fucose; ao grupo II aquelas que se ligam especificamente a

D-galactose e N-acetil-galactosamina; ao grupo III incluem-se as específicas por D-

glicose e D-manose e ao grupo IV aquelas capazes de se ligar a D-idose, D-gulose, L-

glicose e L-xilose.

Embora tenham sido inicialmente detectadas em plantas, as lectinas são

encontradas em muitos organismos, desde vírus e bactérias até animais vertebrados e

invertebrados [22]. Apesar de possuírem muitas propriedades em comum, representam

um grupo bastante diversificado de proteínas com respeito ao tamanho, composição e

estrutura. Neste sentido, apresenta-se na seção 2.1.1 um estudo referente às lectinas

provenientes das leguminosas, com atenção direcionada à Concanavalina A, lectina

utilizada nesta dissertação.

2.1.1 Lectinas Leguminosas

Os estudos envolvendo lectinas leguminosas têm se intensificado ao longo dos

últimos anos. A forte interação entre lectinas e açúcares pode ser uma poderosa

ferramentas para o reconhecimento e isolamento de glicoproteínas solúveis e de

membranas, tais como: proteínas do plasma, antígenos, anticorpos, hormônios ou

mesmo organelas e células como um todo [22]. Estudos in vitro da aplicação de lectinas

na estimulação de linfócitos têm possibilitado diagnosticar imunodeficiências

congênitas ou adquiridas, bem como monitorar o efeito de drogas imunoterapêuticas

[23]. A Concanavalina A é um exemplo de lectina que pode ser usada como padrão de



26

referência imunológica na indução da proliferação de linfócitos no sangue periférico

humano.

A família das lectinas leguminosas compreende aproximadamente 650 gêneros

e 18.000 espécies, e é a maior família das lectinas. Esta família é uma das mais

importantes do ponto de vista econômico, oriundas de alimentos, principalmente de

sementes [24].

A nomenclatura das lectinas é originada da denominação científica das

espécies em que são purificadas, de acordo com o protocolo de purificação, pela

designação dos monossacarídeos aos quais têm especificidade ou ainda pela designação

do tecido do qual foram extraídas. Assim, a lectina da Vicia faba é conhecida como

favina, a Concanavalina A é uma lectina obtida da Canavalia ensiformis, e D-galactose-

N-acetil-D-galactosamina é uma lectina específica da Erythrina cristagalli [25].

A maioria das lectinas leguminosas já estudadas é de natureza glicoprotéica,

sendo que algumas delas podem apresentar, em sua constituição, até 50% de açúcar,

como é o caso da lectina da batata Solanum tuberosum [26] e da aglutinina isolada do

feijão de inhame Sphenostyles stenocarpa. Entretanto, a lectina Concanavalina A e a

lectina da ervilha são exemplos de aglutininas que não possuem carboidratos em suas

estruturas.

As lectinas da família das leguminosas possuem elevados teores de

aminoácidos básicos e hidroxilados [27]. De modo geral, as lectinas de plantas

apresentam grande heterogeneidade, sendo normalmente ricas em aminoácidos

hidrofóbicos e ácidos, perfazendo até mais de 30% do conteúdo de aminoácidos, e são

pobres em aminoácidos sulfurados [22].

Dentre as lectinas leguminosas, a Concanavalina A é a que possui a estrutura

tridimensional mais estudada e tem sua interação por moléculas de carboidratos bem

conhecida [27-32]. Tal interação justifica seu uso nas áreas tecnológicas e nas áreas de

pesquisas de adsorção. Portanto, a Concanavalina A será apresentada em maiores

detalhes na seção 2.1.1.1, a seguir.



27

2.1.1.1 Concanavalina A

A proteína Concanavalina A é uma lectina isolada de extratos da Canavalia

ensiformis (feijão-de-porco) que foi estudada sistematicamente pela primeira vez por

Jones e Johns em 1916 [33]. Sumner em 1919 [34] conseguiu cristalizar duas frações,

Concanavalina A e B. A fração de A, ConA, é solúvel em água e apresenta uma

afinidade por glicose e manose [35].

A ConA foi a primeira lectina de leguminosa a ser seqüenciada e analisada

quanto à estrutura tridimensional. A proteína consiste de quatro subunidades idênticas,

ligadas por interações polares, ligações de hidrogênio e por interações eletrostáticas [36,

37]. A estrutura do monômero da Concanavalina A (Figura 1) é globular e com

dimensões de 42 Å X 40 Å x 39 Å. Ela é constituída apenas de duas folhas β

antiparalelas pregueadas, uma com seis fitas de forma quase plana e a outra com sete

fitas de forma côncava apresentando um total de 237 aminoácidos, pesando 27kDa. Os

sítios específicos aos carboidratos localizam-se em uma depressão no topo da superfície

de cada subunidade. Contudo, para estes sítios formarem ligações com carboidratos é

necessária a presença de íons metálicos divalentes (Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+), que além de

favorecer as ligações com carboidratos, conferem um alto grau de estabilidade estrutural

na proteína, protegendo-a contra a inativação pelo calor e aumentando a resistência à

hidrólise enzimática [38]. Portanto, quando a Concanavalina A é dita ativada ou na

forma ativa, ela contém os íons em sua estrutura, apresentando uma melhor ordenação

estrutural, pois estes formam ligações com aminoácidos da proteína.

A ConA foi agrupada e classificada como uma proteína hololectina de classe III,

devido à sua especificidade a D-glicose e D-manose [26] e também pela sua resistência

a concentrações elevadas de ácidos [39]. Entre o pH 2,0 e 5,5, a ConA existe como

dímero de duas subunidades ligadas covalentemente, com um peso molecular de 55kDa

visto que, em valores de pH acima de 5,5, encontra-se na forma tetramérica com um

peso molecular de 110kDa e com dimensões de 60 Å X 70 Å x 70 Å, sendo esta forma a

que apresenta o sítio específico a carboidrato [40-45]. Os dímeros da estrutura

tetramérica são estabilizados por ligações de hidrogênio e por seis pontes em seu

interior.



28

Figura 1: Estrutura tridimensional do monômero da Concanavalina A na conformação cis. O sítio 1 (S1) está representado pela pequena esfera cinza claro, e o sítio 2 (S2) pela esfera preta. A estrutura β é representada por setas. As posições dos resíduos Thr-11(treonina), Ser-96 (serina), e Glu-102 (glutamato) em cada um dos lados escuros das setas estão destacadas [36].

A interação entre os carboidratos que possuem sítios de ligação com a ConA

ocorre pela formação da ligação de hidrogênio, essencialmente em três resíduos de

aminoácidos lectínicos: um aspartato (Asp-208), uma asparagina (Asn-14) e uma

arginina (Arg-228). Tal ligação é também complementada por uma interação de Van der

Waals entre resíduos aromáticos da lectina (tirosinas, leucinas e cisteínas) e as porções

cíclicas dos açúcares. Todas essas interações são dependentes direta ou indiretamente da

presença de íons ativadores [46].

A Concanavalina A tem sido freqüentemente utilizada como ferramenta no

isolamento de glicoconjugados. Entretanto, poucos estudos foram conduzidos até o

momento, relacionando sua especificidade com relação a vários carboidratos,

possibilitando a sua utilização em pesquisas na área biológica e médica tais como:

investigação da superfície de células, caracterização de eritrócitos, como agentes

mitogênicos, caracterização de estádios de desenvolvimentos de microorganismos



29

diversos, purificação de glicoproteínas, morfologia de neurônios e identificação de

conexões neurais no sistema nervoso central [28-32, 47-49].

Neste sentido, a compreensão do processo de adsorção de lectinas em

superfícies sólidas e de sua interação frente a carboidratos pode ser uma ferramenta

importante na área de desenvolvimento de biosensores bioquímicos; além disso, as

lectinas são excelentes modelos para examinar reações específicas que ocorrem entre

proteínas e outros tipos de moléculas, como por exemplo, as ligações antígeno-

anticorpo e substrato-enzima.

2.2 Adsorção de biomoléculas em superfícies sólidas

A compreensão da adsorção e dos mecanismos de ligação das proteínas em

superfícies é de grande importância na pesquisa de biomateriais e adesão celular [50]. É

interessante reconhecer que a maioria das proteínas são anfóteras e grandes,

característica que, intrinsecamente, permitem qualificá-las como moléculas ativas em

superfícies. Assim, o conhecimento das interações proteína/proteína, proteína/solução e

proteína/superfície é essencial para o controle do processo de adsorção da proteína,

como, por exemplo, o uso de biosensores no monitoramento do nível de glicose no

sangue de pacientes diabéticos in situ, onde a especificidade, sensibilidade e

durabilidade do sensor dependem da adsorção da proteína em sua superfície. Não

obstante, em alguns casos, é necessário minimizar ao máximo uma possível adsorção,

como em materiais utilizados em próteses, substratos para exames ELISA (enzyme-

linked immunosorbent assays), na fabricação de lentes de contato, sistemas para cultura

de células modeladas, engenharia de tecido, sistemas analíticos e em dispositivos usados

na liberação controlada de fármacos [51, 52].

As interações proteína/proteína em solução são controladas pela atração entre

seus resíduos de aminoácidos encontrados na superfície. Este tipo de interação favorece

a formação de oligômeros por meio de ligações não-covalentes, formando um complexo

protéico [53, 54]. Portanto, um aumento na concentração da proteína provoca o aumento

na quantidade de oligômeros na solução, mas a existência de sítios específicos na

proteína também pode influenciar a formação de oligômeros. Quando os oligômeros se



30

formam, ocorre a liberação de moléculas de água e contra-íons para o meio, logo, essas

interações entre proteínas são favorecidas pela entropia, uma vez que modificam a

ordenação global do sistema.

As principais interações proteína/solução podem ser resumidas em função da

solubilidade da proteína na solução, ou seja, dependem do número e do arranjo de

cargas na molécula, que, por sua vez, depende da composição em aminoácidos. Partes

não protéicas da molécula, como lipídeos, carboidratos, fosfatos, etc., também afetam a

solubilidade. Portanto, a solubilidade das proteínas em meio aquoso deve-se, em grande

parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo da molécula. Nesse sentido, se a

interação proteína-proteína é grande e a interação proteína - água é pequena, a proteína

tenderá a ser insolúvel.

A solubilidade da proteína pode ser modificada por fatores como [51, 55]:

pH - O pH da solução pode controlar as repulsões laterais entre as proteínas

e/ou provocar a desnaturação das mesmas [54]. As proteínas tendem a formar

oligômeros em pH próximo ao ponto isoelétrico (pI). Por outro lado, nos casos em que o

pH está distante do pI, ocorre a desnaturação da proteína, logo:

pH ≈ pI : aumenta a solubilidade da proteína;

pH = pI: diminui a solubilidade da proteína tendendo à precipitação.

O ponto isoelétrico (pI) é o valor de pH onde uma molécula (aminoácido ou

proteína) apresenta carga elétrica líquida igual a zero, pois há equivalência entre as

cargas negativas e positivas dos grupamentos iônicos de um aminoácido ou de uma

proteína. A diferença entre os valores de pI de proteínas pode ser utilizada para separá-

las, submetendo-as à migração eletroforética em um gradiente de pH.

Força iônica - Altas concentrações de sais precipitam proteínas de suas

soluções. Este fenômeno é denominado de “salting out” ou precipitação por sais. Os

sais desidratam as proteínas, atraindo as moléculas de água do meio, de modo a ficar

menos água disponível para as moléculas protéicas. A solubilidade de uma proteína



31

depende do grau de hidratação de seus grupos iônicos (quanto menor for o número de

moléculas de água, menor será a solubilidade). Por outro lado, baixas concentrações de

sais podem aumentar a solubilidade de muitas proteínas. É o fenômeno conhecido como

“salting in”, ou solubilização por sais. Isso pode ser explicado através da interação entre

os íons salinos e as cargas iônicas das proteínas, aumentando assim o número efetivo de

cargas (a tendência de ionização dos grupos dissociáveis das proteínas) e a quantidade

de moléculas de água fixadas à superfície protéica.

Constante dielétrica do solvente - A miscibilidade de uma proteína em uma

determinada solução pode ser alterada por fatores como a constante dielétrica da

solução.

Constantes dielétricas elevadas da solução aumentam a solubilidade das

proteínas [55]. Mas, para que se possa definir e entender, o significado do valor da

constante dielétrica no processo de miscibilidade é necessário entender a Lei de

Coulomb, determinada pelo físico francês Charles Augustin de Coulomb (1736 - 1806),

que investigou a força que existe entre duas partículas com carga. Sua Lei diz que tal

força é diretamente proporcional ao produto das cargas, e inversamente proporcional ao

quadrado da distância que as separa, ou seja, F = q1 q2/r2, onde F é a força de atração

entre duas cargas q1 e q2 separadas por uma distância r. Contudo, a força depende ainda

do meio no qual as partículas estão imersas: tais forças são muito maiores se as

partículas estiverem no ar do que se elas estiverem na água. De fato, a força coulombica

é inversamente proporcional à constante dielétrica (ε) do meio, ou seja, F = q1 q2/εr2.

Com ε sendo o valor da constante dielétrica do meio. Se q1 e q2 forem de sinais

opostos, a força F é de atração, e será negativa. Caso q1 e q2 forem de mesmo sinal, F

será positiva, e será de repulsão. Portanto, quanto maior a ε do meio, menor a força de

atração entre as cargas, o que em outras palavras significa que, um líquido com alta

constante dielétrica é capaz de solvatar íons, eficazmente, mantendo-os dissociados em

solução.

Temperatura - A maioria das proteínas é solúvel a temperatura ambiente e a

solubilidade tende a aumentar à medida que se eleva a temperatura até 40, 50oC. Porém,



32

acima dessas temperaturas, a proteína começa a desnaturar provocando mudanças

irreversíveis em suas estruturas e conseqüentemente diminuindo a sua solubilidade [50].

As interações proteína/superfície ocorrem devido à hidrofobicidade e à carga

superficial tanto da proteína como da superfície. Haynes e Norde [50] pesquisaram os

vários tipos de interações que contribuem para a adsorção da proteína e verificaram que

a adsorção deste tipo de molécula é um resultado da afinidade de um grupo funcional do

adsorvente, que apresenta certa especificidade para interagir com a superfície do

substrato. A força motriz para a organização origina-se a partir de interações do tipo

Van der Waals, forças coulombianas e pelas forças ácido/base de Lewis, provenientes

das cadeias longas ligadas ao grupo funcional. A importância dessas interações durante

a adsorção consiste na conformação e orientação finais da proteína adsorvida.

Portanto, as propriedades da proteína, em particular aquelas relacionadas à

flexibilidade de sua conformação e o papel das moléculas de água presentes entre a

proteína e a interface, quando em meio aquoso, devem ser considerados no estudo de

sua adsorção. O principal fator que influencia o processo de adsorção de proteínas é a

energia de superfície, sendo que, superfícies hidrofóbicas adsorvem mais facilmente

proteínas quando comparadas com superfícies hidrofílicas [56, 57]. Susanne e

colaboradores [58] verificaram que a isoterma de adsorção estabelecida para a adsorção

de insulina humana em partículas de Teflon indicou que a insulina adsorveu com

elevada afinidade ao material hidrofóbico, pois a adsorção prossegue também em

condições de repulsão eletrostática, onde o processo é provavelmente governado pela

desidratação da superfície hidrofóbica do Teflon e também pelos aminoácidos

hidrofóbicos no exterior da insulina.

Proteínas adsorvidas em superfícies hidrofóbicas mudam significativamente sua

conformação, pois os aminoácidos não polares interagem preferencialmente com a

superfície. Isto causa interações superficiais fortes e adsorção irreversível. Já em

superfícies hidrofílicas ou carregadas, as interações eletrostáticas dominam as interações

interfaciais e a adsorção é mais reversível [51, 56-58]. Portanto, a tendência da proteína

reter sua conformação nativa depende fortemente da estabilidade estrutural da proteína

na solução. Um rearranjo estrutural é possível quando há disponibilidade de cadeias

laterais de aminoácidos que são eletrostaticamente complementares à superfície.



33

O tamanho da molécula protéica também pode afetar a quantidade a ser

adsorvida, ou seja, proteínas consideradas pequenas (ácidos graxos, por exemplo)

podem adsorver em maior quantidade quando comparadas com proteínas mais

complexas, ou seja, maiores [59]. Para as interações eletrostáticas, quanto maior o

contraste entre a carga da superfície e da proteína, maior será a quantidade de proteína

na superfície, mas isto não se aplica a proteínas que apresentam uma grande perda

conformacional [60].

A caracterização da quantidade de proteínas adsorvidas requer elevada exatidão,

caso a quantidade adsorvida por área de unidade seja extremamente baixa. Na Tabela 1,

as técnicas experimentais são sumariadas, incluindo-se uma descrição breve de seus

princípios e a informação obtenível à exceção da quantidade de proteínas adsorvidas.



34

Tabela 1: Técnicas usadas na investigação da adsorção de proteína.

Técnica Principio Informação obtida Referência

Microbalança de Cristal de

Quartzo (QCM)

Mudança da freqüência de oscilação de um sensor

de massa piezelétrico.

Curso da adsorção e desorção. 61-64

Infravermelho com

Transformada de Fourier (FTIR)

Mudança do espectro de adsorção infravermelho

para a proteína adsorvida

Conformação da proteína adsorvida sobre a superfície

65-67

Espectroscopia de Impedância Eletroquímica

(EIS)

Envolve a aplicação de uma perturbação de

potencial ou de corrente no sistema sob investigação.

Quantidade e conformação da molécula adsorvida;

Irreversibilidade do adsorbato; Interações bioespecificas.

68-74

Voltametria Cíclica (CV)

O analito é submetido a uma diferença de

potencial entre eletrodos.

Detecção de intermediários

ou/e da existência de reações acopladas a processos

eletroquímicos.

74-77

Ressonância de Plásmons de

Superfície (SPR)

Reflexão atenuada da luz devido à excitação por uma onda evanescente.

Quantidade da molécula adsorvida; Formação de

monocamadas; Interações bioespecificas.

78-83

Radiotraço Diminuição na concentração do

radioisótopo, ligado a molécula na solução.

Quantidade de moléculas adsorvidas irreversivelmente.

84-87

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Reação enzimática com anticorpos.

Quantidade de moléculas adsorvidas irreversivelmente.

88-90

Elipsometria Muda o estado da luz polarizada acima da

reflexão

Quantidade e espessura do adsorbato sobre a superfície.

91-94

Fluorescência de Reflexão Interna

Total (TIRF)

Fluorescência da camada adsorvida é obtida a partir

da excitação por uma onda evanescente.

Quantidade de fluoróforos adsorvidos sobre a superfície.

95-99

Microscopia de Força Atômica

(AFM)

Interação atômica entre a superfície e a ponta de

prova.

Imagem em 3 dimensões da superfície.

100-104



35

2.3 Biosensores

Um biosensor pode ser definido como um dispositivo compacto de análise que

incorpora um elemento de reconhecimento biológico (enzima, anticorpo, ácido nucléico,

tecido, células e suas organelas) ou biomimético (polímero de impressão molecular ou

PIM, peptídeos de ácidos nucléicos), associado a um sistema transdutor (ex., elétrico ou

óptico) que permite processar o sinal produzido pela interação entre o elemento de

reconhecimento e o analito.

O princípio de detecção do biosensor se baseia na interação específica entre o

composto ou proteína de interesse com o elemento de reconhecimento. Como resultado

dessa interação específica podem-se observar variações das propriedades físico-

químicas do sistema (pH, reações de transferência de elétrons, variação das

propriedades ópticas, de massa, de potencial, etc.) que são convertidas em um sinal

eletrônico mensurável pelo transdutor, em poucos minutos, como ilustrado na Figura 2

[105].

elemento de

reconhecimento

transdutor

amplificador

ANALITO

SINAL

MostradorMostrador

elemento de

reconhecimento

transdutor

amplificador

ANALITO

SINAL

elemento de

reconhecimento

transdutor

amplificador

ANALITO

SINAL

MostradorMostrador

Figura 2: Esquema ilustrativo do funcionamento geral de um biosensor.



36

O termo biosensor aparece na literatura científica no final dos anos 70, embora o

conceito básico e a comercialização terem começado antes. O primeiro biosensor

construído foi um detector de glicose desenvolvido por Clark e Lyons em 1962 e

comercializado somente a partir de 1972 por Yellow Springs Instrument Company [105].

Este biosensor foi denominado como “enzyme electrode”, composto de um eletrodo

para oxigênio com a enzima glicose oxidase adsorvida em sua superfície. A enzima

catalisa a oxidação da D-glicose em D-Glucono-δ-lactona (ácido glutâmico) e a redução

do oxigênio em meio aquoso (ver Equação 2.1). O consumo do oxigênio ou a oxidação

anódica do peróxido de hidrogênio é detectado pelo eletrodo e pode ser utilizado na

quantificação da glicose. Nos anos seguintes foram desenvolvidos eletrodos enzimáticos

para substâncias de interesse médico, mediante a interação de enzimas apropriadas em

sensores eletroquímicos.

D-glicose + O2 + H2O → oxidaseglico. ácido glutâmico + H2O2 (2.1)

Em 1977, foi desenvolvido o primeiro dispositivo que utilizava

microorganismos vivos imobilizados na superfície de um elétrodo sensível à amônia.

Esse dispositivo era utilizado na detecção do aminoácido arginina e seus criadores o

denominaram “sensor bio-seletivo”, posteriormente denominado como “biosensor”,

termo que vem sendo utilizado até o momento para designar a união entre um material

biológico e um transdutor físico. Desde então, a área de biosensores tem evoluído muito

devido a sua potencial aplicabilidade [77, 83, 106-109].

As aplicações vão desde o emprego na agricultura [105] e no monitoramento e

controle ambientais [106], até diferentes segmentos industriais, especialmente nos

ramos alimentício e farmacêutico [96, 97, 107]. Porém, o desenvolvimento de

biosensores está centrado principalmente no campo de diagnóstico clínico (com grande

êxito para os biosensores de glicose). As vantagens de se trabalhar com biosensores

residem na simplicidade, rapidez e baixo custo da análise que os mesmos oferecem,

quando comparados com métodos químicos ou bioquímicos, como, por exemplo, as



37

técnicas ELISA (Enzyme-Linked-Immunosobent Assay) e RIA (Radioimunoensaio), que

são muito utilizadas no estudo das reações imunológicas e têm sido as responsáveis pela

maioria dos diagnósticos fornecidos pelos laboratórios nesses últimos anos [107, 108].

Os sensores químicos se diferenciam dos biosensores pelo fato de não utilizarem

componentes biológicos na transdução do sinal físico emitido, apesar dos esforços no

desenvolvimento de compostos que mimetizem as principais características de bio-

componentes.

Os biosensores podem ser classificados em função de: tipo de interação que se

estabelece entre o elemento de reconhecimento e o analito; método utilizado para a

detecção da reação bioespecífica; natureza do elemento de reconhecimento; sistema de

transdução utilizado .

Vários sensores e, conseqüentemente, diferentes sistemas de transdução estão

disponíveis. A escolha de um transdutor está condicionada ao tipo de elemento de

reconhecimento selecionado, já que este determina que variações das propriedades

físico-químicas ocorreriam em função da interação.

Os principais sistemas de transdução utilizam métodos eletroquímicos

(amperométricos e potenciométricos têm sido os mais investigados) ou métodos ópticos

de detecção (empregam, por exemplo, a Ressonância de Plásmons de Superfície). Os

eletroquímicos, em geral, requerem a participação de sistemas eletroquimicamente

ativos (reações de transferência de elétrons ou mudança de potencial via transporte

iônico), o que muitas vezes limita sua aplicação. Porém, métodos baseados em medidas

de impedância, apesar de serem classificados como métodos eletroquímicos, não

requerem atividade eletroquímica, uma vez que os mesmos medem propriedades da

interface eletrodo/solução, independente de reações de transferência de elétrons ou da

presença de transporte iônico.

A propriedade de transdução dos biosensores impedanciométricos é a detecção

de capacitância da interface eletrodo/biomolécula/solução que depende de fatores

geométricos, em particular das dimensões das moléculas adsorvidas, e da constante

dielétrica das mesmas (juntamente com a solução). Essa detecção baseia-se no fato de

que a interface possui uma capacitância na ausência do analito e outra capacitância na

presença do analito, resultante da interação biomolécula/analito. Este sensor de

afinidade é adequado para a investigação de interações bioespecíficas do tipo



38

antígeno/anticorpo, proteína/DNA, proteína/carboidrato, etc [108-110]. Como a

sensibilidade é fortemente dependente das modificações ocorridas na interface, o

mínimo de moléculas estranhas deve estar presente e, em princípio, agentes de

imobilização são dispensáveis, já que a maioria das proteínas adsorve fortemente sobre

superfícies metálicas [108-116].

Os biosensores ópticos correlacionam mudanças na concentração, na massa ou

no número de moléculas com as mudanças nas características da luz captadas por um

fotodetector. Os biosensores ópticos podem ser subdivididos em duas modalidades, de

acordo com a configuração óptica: óptico extrínseco e óptico intrínseco. No modo

óptico extrínseco, a onda incidente não é dirigida através da amostra, mas se propaga ao

longo de uma guia de onda e interage com a amostra na superfície do filme metálico,

dentro do campo evanescente, como por exemplo, a técnica de Ressonância de

Plásmons de Superfície. No modo óptico intrínseco, a luz incidente passa através da

amostra e interage diretamente com a amostra adsorvida.

Na seção 2.4 serão abordados detalhes teóricos das técnicas de transdução

eletroquímica e óptica, em particular, a Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e a

Ressonância de Plásmons de Superfície e a combinação de ambas. A grande

importância desses estudos é o desenvolvimento de novos suportes para materiais

biológicos, que podem ser utilizados para o desenvolvimento de biosensores.

2.4 Técnicas empregadas na detecção de interações bioespecíficas

Esta seção trata de alguns princípios teóricos das técnicas comumente usadas

para caracterizar a adsorção e/ou reações de macromoléculas biológicas em superfícies

metálicas. Na última seção (2.4.4), serão discutidos os princípios básicos e aplicações

individuais e combinadas das técnicas EIS e SPR, com o propósito de apresentar a

importância destas na investigação de processos superficiais e interfaciais, ressaltando

suas complementaridades.



39

2.4.1 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica

A técnica de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica é uma técnica de

caracterização elétrica, que fornece um aspecto completo e detalhado das características

elétricas da interface eletrodo/solução [72-74]. Portanto, é bastante sensível a

modificações que podem ocorrer na interface, como por exemplo, a adsorção de

proteínas, com a vantagem de não perturbar as propriedades da interface permitindo,

dessa forma, estudar o comportamento geral de um sistema quando um número grande

de processos intercorrelacionados ocorre em diferentes velocidades, mas que não se

alteram no tempo, pelo menos naquele necessário para que a medida seja realizada.

Atualmente, a EIS é utilizada em ampla gama de estudos, abrangendo desde o

transporte eletrônico em dispositivos semicondutores até o estudo de processos cinéticos

eletroquímicos das mais diferentes naturezas, ou seja, processos que ocorrem em células

fotovoltaicas [117-118], baterias de íons lítio [119], sistemas de corrosão e/ou processos

eletrocatalíticos [120-122].

Portanto, devido às características descritas acima, a EIS foi uma das técnicas

utilizadas no processo de caracterização da adsorção da Concanacavalina A e de suas

interações de afinidade com carboidratos, sobre eletrodos de filme fino de ouro.

2.4.1.1 Conceitos fundamentais

As correntes e tensões na maioria dos circuitos não são estacionárias, possuindo

uma variação com o tempo. A forma mais simples de variação de tensão (ou corrente)

com o tempo é a forma senoidal, a qual é representada convenientemente por um vetor

comprimento Vp (ou Ip), também chamado de valor máximo de tensão (ou corrente), que

gira em sentido anti-horário com velocidade angular constante ω. A correspondência

entre a representação do vetor e o gráfico da onda senoidal é mostrada na Figura 3.

É importante lembrar que uma onda senoidal pode ser medida em uma base

temporal ou angular. Como o tempo para concluir um ciclo completo depende da



40

freqüência da onda, em geral é comum especificar os valores em uma onda senoidal em

termos de medida angular, expresso em graus ou em radianos [123].

A corrente instantânea (i) em um instante t é dada por:

,senpI

it =ω (2.2)

( ) ( ),2sensen ftItIi pp π=ω= (2.3)

onde, i é a corrente instantânea (Volt); Ip é a amplitude máxima da onda senoidal ou

corrente máxima (Volt); ω é a freqüência angular (rad. s-1) ou igual a 2πƒ, sendo ƒ a

freqüência com que a corrente alternada oscila (Hz).

π 2π

3π/2

π/2 tp

π/2

3π/2

2π

00

Vp π

ω

Vp

Vetor rotatório Onda senoidal

ω

Vp ωt v v

t

00

Figura 3: Representação de uma onda senoidal de período tp e a amplitude Ip e sua relação entre a representação do correspondente vetor de comprimento Ip girando em sentido anti-horário a uma velocidade angular constante de ω = 2πƒ radianos/segundo ou uma freqüência de ƒ Hz.



41

Duas ondas senoidais que têm amplitudes diferentes também podem estar em

fases diferentes. Isto significa que os valores máximos de picos e zeros das ondas não

ocorrem necessariamente ao mesmo tempo. Na Figura 4, a onda de tensão ou de

corrente estão deslocadas ou defasadas uma em relação à outra. A onda de tensão está

deslocada para a direita em 90 graus ou 2π radianos. Assim, há uma defasagem de 90º

entre v e i, ou seja, as duas ondas estão fora de fase. A diferença de fase é chamada

ângulo de fase, que surge pelo fato de um vetor se adiantar ou se atrasar em relação ao

segundo por esta quantidade. Para este exemplo podemos escrever

( ) ( ),2sensen φπφω +=+= ftVtVv pp (2.4)

ou, alternativamente

( ) ( ),2sensen φπφω +=+= ftItIi pp (2.5)

onde, φ é o ângulo de fase, que corresponde à defasagem do potencial em relação à

corrente.

Figura 4: Ondas senoidais com diferentes amplitudes (Vp ou Ip) e com diferença de fase de 90 graus ou π/2 radianos. A diferença de fase é chamada ângulo de fase (φ), que aparece pelo fato de um vetor se atrasar ou adiantar em relação ao outro, similar a um circuito de corrente alternada.



42

Nos circuitos de corrente alternada a relação entre o potencial e a corrente pode

ser definida por uma expressão semelhante à Lei de Ohm (v = Ri, onde R é a resistência

à passagem de corrente elétrica, quando existe uma diferença de potencial aplicada):

,i

vZ = (2.6)

onde Z é chamado de impedância.

Substituindo “v” e “i” pelas Equações (2.4) e (2.5), obtemos

( )( ) .

sen

sen

φ+ωω

=tI

tVZ

p

p (2.7)

Portanto, a razão entre o potencial e a corrente é a impedância Z [124-128].

Porém, se o potencial e a corrente estão em fases diferentes, então podemos dividir a

impedância numa parte resistiva, onde o potencial e a corrente estão em fase (φ = 0), e

numa parte capacitiva, onde a diferença de fase entre a corrente e o potencial é 90º (φ =

2π ).

Sendo a impedância uma grandeza vetorial ou complexa, as coordenadas

retangular ou polar podem ser utilizadas para indicar o vetor. No primeiro formato, o

vetor Z é um número complexo, onde a parte resistiva é representada pelo componente

real Zre (eixo X) e a parte capacitiva pelo componente imaginário (Zim) no eixo Y, que

é multiplicada por j, logo:

,imre jZZZ += (2.8)

onde, j é o número complexo, isto é, j2 = -1.



43

A magnitude de Z é dada por

( ) .21

22imre ZZZ += (2.9)

Da Equação (2.9), é possível identificar três relações e construir o gráfico, logo, abaixo:

φcosZZ re = (2.10)

φsenZZ im = (2.11)

=⇔= −

re

im

re

im

Z

Z

Z

Zarctg 1tanφφ (2.12)

A recíproca da impedância Z é chamada de admitância e é denotada com o

símbolo Y:

,1

jBGZ

Y +== (2.13)

onde, B é a parte imaginária, chamada susceptância, e G a parte real ou condutância. A

unidade de admitância, condutância e susceptância é o Siemen (1 S = 1 Ω-1). Portanto, a

condutância é a parte real do inverso da impedância.



44

- Impedância de circuitos elétricos resistivos e capacitivos:

A impedância de um circuito puramente resistivo (Figura 5), ou seja, contendo

somente um elemento resistivo (R), é dada pela Equação (2.7).

R

Figura 5: Circuito elétrico puramente resistivo

Porém, como o circuito é puramente resistivo, a corrente e a tensão estão em fase, logo,

φ = 0. Então,

p

p

I

VZ = (2.14)

Portanto, a impedância num resistor será real e é dada por:

RZ = (2.15)

logo,

ZZre = (2.16)

Entretanto, nem sempre a relação entre a corrente e a tensão, em circuitos de

corrente alternada, são determinadas pela resistência (R) do circuito. Elas podem

também sofrer influência de elementos que tendem a se opor a qualquer variação da

intensidade de corrente ou de tensão. Esta oposição reativa deve-se a elementos

capacitivos (C) e/ou indutivos (L) que podem alterar as relações entre tensão e corrente,



45

quando presentes. Mas serão excluídos os casos em que os circuitos exibam elementos

indutivos.

Um capacitor é um elemento de circuito que armazena energia num campo

elétrico, acumulando um desequilíbrio interno de carga elétrica (Figura 6). É composto

por dois eletrodos ou placas condutoras, que armazenam cargas opostas, separadas por

um dielétrico (isolante). Devido ao fato de cada placa armazenar cargas iguais, porém

opostas, a carga total no dispositivo é sempre zero. Portanto, a capacitância (C) de um

capacitor de placas paralelas, constituído de dois eletrodos planos idênticos, contendo

um dielétrico, é dada por:

d

AC

r .. 0εε= (2.17)

Onde C é capacitância em Faraday, 0ε é a permissividade eletrostática do vácuo

(8,85 x 10-12 F-1 m-1), rε é a constante dielétrica ou permissividade relativa do isolante

utilizado entre as placas e A é a área de cada eletrodo ou placa, separados a uma

distância constante d.

C

Figura 6: Circuito elétrico puramente capacitivo

A quantidade de eletricidade q requerida para carregar um capacitor dependerá

essencialmente da área das placas, de sua forma, do espaçamento entre elas e da

constante dielétrica do material que as separa. Além disso, a carga q é diretamente

proporcional à voltagem aplicada. Isto é,

V

qCCVq =⇔= (2.18)



46

Onde V é a diferença de potencial entre os condutores em volts, q é a quantidade

de carga em coulombs e C é a constante de proporcionalidade, chamada de capacitância

do capacitor. A unidade de capacitância é o farad. Um capacitor que tem a capacitância

de 1 farad armazena, então, um coulomb de carga por volt aplicado. Porém, são

utilizados valores de capacitâncias expressos em microfaraday (µF), nanofaraday (nF)

ou picofaraday (pF), já que o Faraday é considerado uma unidade de medida muito

grande para circuitos práticos.

Quando uma tensão é aplicada a um capacitor através de um circuito externo, a

corrente flui para uma das placas carregando-a, e flui da outra placa, descarrengando-a

(ou carregando inversamente). Este comportamento é observado quando diferenciamos

a Equação (2.18), obtendo,

.dt

dVC

dt

dq= (2.19)

Por definição, a corrente i é a taxa de variação da carga em relação ao tempo; isto é,

dq/dt = i. Então,

dt

dVCi = (2.20)

No caso de uma corrente contínua (DC) estabelece-se um equilíbrio

rapidamente, onde a carga das placas corresponde à tensão aplicada pela relação

CVq = , e nenhuma corrente poderá fluir pelo circuito. Logo, a corrente contínua não

poderá passar, o que não ocorre para correntes alternadas (AC), pois cada mudança de

tensão ocasiona carga ou descarga do capacitor, permitindo dessa forma que a corrente

flua. A quantidade de resistência de um capacitor sob regime AC é conhecida como

reatância capacitiva (XC), e a mesma varia conforme varia a freqüência do sinal AC.



47

A reatância capacitiva é uma propriedade do capacitor que é análoga à

resistência de um resistor, sendo considerada um tipo de resistência pois tem unidade

em ohm, mas que difere das resistências comuns por variar com a freqüência do sinal

AC, ou seja, é igual à recíproca do produto de 2π pela freqüência em hertz e pela

capacitância em faradays, onde X < 0:

CfCXC ω

=π

=1

2

1 (2.21)

Pode-se reescrever a Equação (2.11) como sendo:

Cim XZ −= (2.22)

Enfim, a corrente em um circuito puramente capacitivo, ou seja, contendo

somente um elemento capacitivo (Figura 6), é dada pela substituição da tensão na

Equação (2.20) e com i na forma da Equação (2.4), obtém-se:

.2

sen

π+ωω= tCIi p (2.23)

Combinando-se a Equação (2.23) com a Equação (2.21), obtém-se:

.2

sen

π+ω= t

X

Ii

C

p (2.24)



48

Mas, como o circuito não possui elemento resistivo, a impedância será:

Cp

p XI

VZ == (2.25)

ou, alternativamente

C

jZ

ω−= (2.26)

logo,

ZZim = (2.27)

e

2

π=φ (2.28)

Em um circuito elétrico em que se combina um resistor e um capacitor em série

(Figura 7), a impedância Z é dada pela Equação (2.29).

.C

jRZ

ω−= (2.29)

R C

Figura 7: Circuito elétrico capacitivo em série com a resistência.



49

Logo, é possível identificar relações semelhantes às obtidas nas Equações (2.10)

à (2.12) e na Equação (2.29):

RZZre == φcos (2.30)

CsenZZ im ω

φ 1−== (2.31)

RCZ

Z

Z

Zarctg

re

im

re

im

ωφφ 1

tantan 11 −− =

=⇔= (2.32)

A impedância Z do circuito do tipo RC em paralelo (Figura 8) é dada pela

Equação (2.33).

C

R

C

Figura 8: Circuito elétrico com uma capacitância em paralelo com uma resistência ou RC em paralelo.

.11

CjRZ

ω+= (2.33)



50

Multiplicando a Equação (2.29) pelo complexo conjugado ( )CRjω−1 , obtém-se:

( )( )( ) ,

11

1

CRjCRj

CRjRZ

ω−ω+ω−

= (2.34)

( )( ) .11 222

2222

RC

CRjRC

RZ

ω+ω

−

ω+= (2.35)

Na Equação (2.31), é possível identificar as relações:

( ) ,1 222 RC

RZre ω+

= (2.36)

( ) ( ) .11 222

2

222

2

RC

CRZ

RC

CRZ imim ω+

ω=−⇔

ω+ω−

= (2.37)

Combinando-se essas relações com a Equação (2.12) obtém-se o ângulo de fase

para este circuito:

,

1

1arctg

222

222

2

ω+

ω+ω−

=φ

RC

R

RC

CR

(2.38)

,arctg2

ω=φ

R

CR (2.39)

( ) .arctg CRω=φ (2.40)



51

A impedância Z do circuito R(RC), mostrado na Figura 9, é dada pela Equação

(2.41).

R2

C R1

Figura 9: Circuito elétrico tipo R(RC).

( ) .1 2

21 CRj

RRZ

ω++= (2.41)

A Equação (2.41) pode ser reescrita como

ω+ω

−

ω++=

22

22

22

22

222

1 11 RC

CRj

RC

RRZ (2.42)

Na Equação (2.42), é possível identificar as relações:

ω++= 2

222

21 1 RC

RRZre (2.43)

ω+ω−

= 22

22

22

1 RC

CRZim (2.44)



52

Combinando-se essas relações com a Equação (2.12) obtemos o ângulo de fase

desse circuito:

ω++

ω+ω

=φ

22

222

1

22

22

22

1

1arctg

RC

RR

RC

CR

(2.45)

+ω=φ

21

22

1

RRCR (2.46)

+ω

=φ21

22

RR

CR (2.47)

Verifica-se que para associações em série e em paralelo de impedâncias, valem

as mesmas relações para resistências, embora na forma complexa, ou seja:

Circuito em série: nZZZZZ ++++= L321

Circuito em paralelo: nZZZZZ

11111

321

++++= L

Portanto, a impedância (Z) equivalente de duas associadas em série é

simplesmente a soma das impedâncias. Assim, a admitância (Y), equivalente a duas

impedâncias associadas em paralelo é a soma das admitâncias (Tabela 2). A

demonstração destas afirmações é idêntica ao caso de resistores e corrente contínua.



53

Tabela 2: Associação de impedâncias em série e em paralelo

Associação em série Associação em paralelo

21 ZZZ +=

2121

111YYY

ZZZ+=⇔+=

Pode-se, agora, melhor definir o método de impedância eletroquímica ou método

de impedância AC como sendo a aplicação de uma perturbação de potencial ou de

corrente no sistema de investigação, onde a perturbação do sistema é feita mediante a

aplicação de um potencial contínuo (potencial aplicado) sobre a qual é imposta uma

variação senoidal de potencial com pequena amplitude, tendo sido proposto por

Mansfeld em 1988 [127] o nome de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica.

Este método de aplicação do potencial possibilita a utilização de sinais muito

pequenos que não perturbam as propriedades do eletrodo, de forma a tornar possível a

investigação de fenômenos eletroquímicos próximos ao estado de equilíbrio e, numa

mesma medida, podem ser determinadas a resistência de polarização e a capacitância da

dupla camada. Além disso, é possível perturbar o sistema usando-se diferentes valores

de freqüência, pois a onda de potencial é senoidal, ou seja, a resposta da aplicação de

um pequeno sinal AC, feita em uma ampla faixa de freqüências e em vários potenciais,

possibilita diferenciar processos com tempos característicos distintos, que na maioria

das técnicas tradicionais eletroquímicas seriam vistos como contribuições simultâneas à

resposta total.



54

2.4.1.2 Circuito equivalente de um sistema eletroquímico

O conceito de impedância, inicialmente introduzido para descrever a resposta de

sistemas compostos por resistências, capacitâncias e indutâncias, estendeu-se aos

sistemas eletroquímicos, uma vez que diversos processos podem contribuir para a

relação entre a corrente e o potencial do sistema. A representação de uma interface

polarizada simples, isto é, quando a interface se comporta até certo ponto analogamente

a uma combinação em paralelo de um resistor e um capacitor, pode ser feita por um

modelo de circuito equivalente.

A aplicação de circuitos equivalentes tem como fundamento as similaridades

entre o comportamento da célula eletroquímica e um circuito elétrico composto por

resistores, capacitores e indutores. O circuito equivalente típico que melhor apresenta

equivalência com um sistema eletroquímico (interface eletrodo/solução) é o circuito de

Randles, ilustrado na Figura 10.

Rct W

Cd

RΩ

Figura 10: Circuito de Randles.

Este circuito possui componentes que representam os processos que ocorrem nos

eletrodos e na solução, tais como: a dupla camada elétrica (Cd), que possui um

comportamento similar a de um capacitor de placas paralelas (modelo de Helmholtz

[125], ver Figura 11); a resistência ôhmica da solução (RΩ) ao transporte de íons entre

os eletrodos, uma vez que a corrente que passa na interface eletrodo/solução é

conduzida pelos íons em solução; e a impedância faradaica (Zf), a qual está subdividida

em uma resistência (Rct), que mede a resistência à transferência de carga na interface

eletrodo/solução, e a impedância de Warburg (W), que corresponde à resistência no

transporte de massa.



55

Potenciostato/ Galvanostato

Capacitor

Equivalente El

Eletrodo Solução

Equivalente elétrico

Figura 11: Analogia entre um capacitor de um circuito elétrico e a interface eletrodo/solução de um sistema eletroquímico com o modelo proposto por Helmholtz, onde uma das placas representa o eletrodo e a outra placa do capacitor, a solução.

Portanto, uma vez escolhido o circuito elétrico que melhor descreve os processos

interfaciais, obtidos com auxílio da avaliação de curvas de Bode e diagramas de

Nyquist, também conhecido como representação de Argand ou Cole-Cole (ambas as

representações são as mais utilizadas, logo serão descritas com maiores detalhes na

seção 2.4.1.3 deste capítulo.), pode-se relacionar as propriedades físicas ou químicas

com elementos do circuito e extrair valores numéricos de todos os elementos, através de

simulações dos dados experimentais, geralmente utilizando-se o método de mínimos

quadrados não-lineares, com o auxílio de um programa de computador adequado.



56

2.4.1.3 Gráficos de impedância

Os resultados dos parâmetros experimentais de impedância Z podem ser

analisados pelo gráfico Nyquist, no qual são observados os valores da parte imaginária

(Zim) em função dos valores da parte real (Zre) e pelo gráfico Bode, que mostra a

dependência direta do ângulo de fase com a freqüência. A vantagem desse gráfico é que

a dependência com a freqüência é visualizada claramente, além do espaçamento

logarítmico permitir uma observação melhor dos processos. A Figura 12 ilustra os

aspectos dos gráficos Nyquist e Bode para o circuito de Randles e a Tabela 3 exibe a

representação dos gráficos Nyquist e Bode para os circuitos teóricos resistivo e

capacitivos puros, RC seriado e em paralelo, circuito R(RC).

Figura 12: Circuito de Randles e os respectivos gráficos Nyquist e Bode.

No gráfico Nyquist, para o circuito de Randles, os componentes do circuito e as

diferentes regiões de resposta em freqüência representam o processo eletroquímico

global.



57

Tabela 3: Gráficos Nyquist e Bode para circuitos R em série, C em série. RC em série, RC em paralelo e R em série com RC em paralelo.

Circuito Gráfico Nyquist Gráfico Bode

0,0 2,0x101 4,0x101 6,0x101 8,0x101 1,0x102

0,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

1,0x105

1,2x105

Grلfico Nyquist

Zim

(ohm

)

Zre (ohm)

***

0,0 2,0x101 4,0x101 6,0x101 8,0x101 1,0x102

0,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

1,0x105

1,2x105

Zim

(ohm

)

Zre (ohm)

***

9,0x101 9,5x101 1,0x102 1,1x102 1,1x102

0,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

1,0x105

1,2x105

Zim

(ohm

)

Zre (ohm)

10 100 1000 10000 100000

0

15

30

45

60

75

90

ângu

lo d

e fa

se (

grau

s)

frequência (Hz)

0,0 2,0x101 4,0x101 6,0x101 8,0x101 1,0x102

0

1x101

2x101

3x101

4x101

5x101

6x101

µ

Zim

(ohm

)

Zre (ohm)

10 100 1000 10000 100000

0

15

30

45

60

75

90

ângu

lo d

e fa

se (

grau

s)

frequência (Hz)

0,0 2,0x102 4,0x102 6,0x102 8,0x102 1,0x103 1,2x103

0,0

2,0x102

4,0x102

6,0x102

8,0x102

Zim

(ohm

)

Zre (ohm)

0,1 1 10 100 1000 10000 100000

0

15

30

45

60

75

90

ângu

lo d

e fa

se (

grau

s)

frequência (Hz)



58

A região de alta freqüência está associada à resistência da solução eletrolítica,

RΩ. A região de freqüências intermediárias está associada com a transferência de carga

na interface, Rct. O efeito de relaxação correspondente é apresentado no plano complexo

com um semicírculo, cuja constante de tempo é dada pelo produto RctCd. Em baixas

freqüências, a impedância é caracterizada por processos de transporte de massa por

difusão. Duas regiões podem ser identificadas no plano de impedância complexa: uma

região linear com ângulo de fase π/4, correspondendo à difusão semi-infinita e

representada pela impedância de Warburg, W; e a segunda região linear ainda em baixas

freqüências com um ângulo de fase igual a π/2, associada a uma resposta puramente

capacitiva. Considerando uma reação de eletrodo onde a etapa mais lenta está

relacionada ao transporte iônico em direção a interface, é razoável considerar que a

cinética da reação é limitada por difusão.

O circuito de Randles descreve adequadamente os processos que ocorrem na

região de altas freqüências. Contudo, na região de baixa freqüência, para eletrodos

porosos (grande área superficial), a análise é complexa e a interpretação física da C não

pode ser descrita como uma capacitância pura, sendo representada por um elemento de

fase constante (CPE) [129].

2.4.2 Ressonância de Plásmons de Superfície

Sensores baseados em dispositivos ópticos do tipo multicamadas (vidro/filme

metálico/solução, por exemplo), geralmente, utilizam campo evanescente na

caracterização, isto é, componente do campo eletromagnético da luz que não se propaga

para longe das camadas, chegando apenas até a parte externa próxima à interface. Este

campo evanescente decai exponencialmente com o aumento da espessura das camadas.

As mudanças nas propriedades ópticas de algumas das camadas podem influenciar os

modos a serem guiados. Tais mudanças são observadas devido a variações da

intensidade, obtidas em medições ópticas apropriadas. Diversos fatores físicos podem

modificar as características de uma ou mais camadas, como por exemplo, a mudança do

índice de refração (n) ocasionado pela ligação de uma camada orgânica com a superfície



59

do filme metálico [130]. Portanto, é possível guiar a luz, através de espelhos planos,

para a área interfacial de interesse e efetuar a análise óptica, com a vantagem do

tamanho reduzido do dispositivo e um baixo custo de implementação.

Quando se incide luz em uma superfície metálica, esta luz pode ser acoplada aos

plásmons de superfície (SP – oscilação coletiva longitudinal dos elétrons de condução

da camada metálica, restrita a uma fina camada na superfície; um modo ou quanta dessa

oscilação é chamado de plásmon), satisfazendo as condições de energia.

Os primeiros pesquisadores do efeito da excitação óptica de plásmons de

superfície, Otto [131] e Kretschmann [132], propuseram técnicas para investigá-lo,

considerando que o mesmo não poderia ser observado pela iluminação direta da

superfície. As propostas de ambos fazem uso de campos evanescentes, que são

acoplados aos modos de oscilação (plásmons), com auxílio de um prisma de vidro, cuja

função é criar ângulos de incidência superior ao da reflexão interna total, logo,

contornando a restrição de incidir luz diretamente sobre a superfície. Esta é a razão pela

qual muitos autores posteriores referem-se à técnica como reflexão interna total

atenuada ou ATR (attenuated total reflection). Neste método, faz-se incidir uma luz

sobre um filme fino metálico, utilizando-se um prisma de alto índice de refração como

acoplador óptico, e observa-se a luz, atenuada, refletida pelo filme. Embora a luz

incidente seja totalmente refletida internamente, uma componente desta radiação, onda

ou campo evanescente, penetra na interface do meio menos denso, até a distância de um

comprimento de onda (1λ). Atingidas as condições críticas de acoplamento de luz aos

modos ópticos do filme, parte da radiação se acopla aos elétrons livres oscilantes do

filme metálico, ocorrendo a Ressonância de Plásmons de Superfície.

Conseqüentemente, uma atenuação no sinal refletido é observada, podendo também ser

detectada.

A Ressonância de Plásmons de Superfície é um fenômeno que se tem mostrado

como uma das ferramentas mais eficientes na obtenção de constantes ópticas de filmes

finos metálicos ou dielétricos, bem como parâmetros termodinâmicos e cinéticos de

processos superficiais. O potencial da SPR pode ser utilizado em uma série de estudos,

envolvendo cinéticas de adsorção-desorção, interações proteína/ligante, receptor/ligante,

proteína/DNA, DNA/DNA, antígeno/anticorpo, etc [130, 133-139]. O método de SPR

acoplado a métodos eletroquímicos (como por exemplo, medidas de impedância),

mostra um grande potencial para o desenvolvimento de biosensores de afinidade,



60

permitindo análises em tempo real de interações bio-específicas sem uso de marcadores

químicos. A quantificação da espécie em interesse pode ser realizada monitorando as

modificações estáveis nas superfícies dos eletrodos que podem exibir mudanças no

índice de refração, concomitantemente com reações redox ou modificações elétricas

[136, 140-142]. Algumas aplicações comerciais de emprego dessa oscilação na área de

biotecnologia já foram disponibilizadas no mercado por grandes empresas, como a

BIACORE [143, 144] e a Texas Instruments [145].

Nesta Dissertação de Mestrado foi desenvolvido um arranjo experimental

baseado no fenômeno de plásmons superficiais, tendo como objetivo melhorar

substancialmente a sensibilidade de detecção da SPR, com benefícios diretos para o

desenvolvimento de novas gerações e equipamentos de análise de reações biológicas e

também verificar a extensão, SPR associada a técnicas eletroquímicas na caracterização

da adsorção induzida (ou não) eletroquimicamente de proteínas. Portanto, na próxima

seção serão discutidos os princípios físicos associados às oscilações de plásmons de

superfície em interfaces e as técnicas experimentais de observação.

2.4.2.1 Plásmons de Superfície

Plásmons de superfície são oscilações localizadas da densidade eletrônica em

metais. Os elétrons da banda de condução do metal são cargas móveis negativas,

formando um gás denso de elétrons, imersos entre os núcleos fixos dos átomos do

metal. Como as cargas positivas são bem mais pesadas que os elétrons do gás, logo, são

consideradas fixas. O bombardeio desse gás por um laser, por exemplo, pode causar

uma mudança transiente na sua distribuição, levando a que certas regiões se tornem

ligeiramente mais densas que outras. A repulsão coulombiana nas regiões de alta

densidade leva os elétrons a se afastarem uns dos outros, diminuindo, assim, a

densidade. A dinâmica deste sistema é similar à de um oscilador harmônico. A força

restauradora, nesse caso as interações coulombianas, que tendem a levar o sistema de

volta ao equilíbrio dá origem às oscilações, neste caso, os plásmons, com freqüências

bem definidas [147].



61

Os plásmons também podem ser visualizados como ondas eletromagnéticas

propagando-se através do sólido (descrição clássica). Uma onda gerada pelos plásmons

superficiais podem se propagar para fora da superfície. A amplitude dessa onda,

também chamada de onda evanescente, diminui exponencialmente com o aumento da

distância em relação à superfície. Utilizando a descrição clássica, a maioria de suas

propriedades pode ser derivada diretamente das equações de Maxwell.

2.4.2.2 Conceitos fundamentais

A Figura 13 exemplifica um feixe de luz interceptado por uma superfície plana

de vidro onde, parte da luz incidente é refletida, isto é, propaga-se, em feixe, para fora

da superfície. A outra parte do feixe é refratada, isto é, propaga-se através da superfície

para dentro do vidro. A luz sempre muda a direção de sua trajetória quando atravessa

uma interface, a menos que o feixe incidente seja perpendicular ao vidro, ou que,

ambos, tenham o mesmo índice de refração.

aarr

vviiddrroo

Figura 13: Uma representação usando raios que mostram a reflexão e a refração de um feixe de luz incidente numa superfície plana de vidro. Estão assinalados os ângulos de incidência (θ1), de reflexão (θ1`), e de refração (θ2).



62

Portanto, observa-se experimentalmente que a reflexão e a refração obedecem às

seguintes leis:

Lei da Reflexão – O raio refletido está contido no plano de incidência, e

1´1 θ=θ (2.48)

Lei da Refração – O raio refratado está contido no plano de incidência, e

2211 sennsenn θ=θ (2.49)

onde n1 é uma constante adimensional chamada índice de refração do meio 1, e n2 é o

índice de refração do meio 2.

A Equação (2.49) é chamada de lei de Snell-Descartes. O índice de refração de

uma substância é igual a c/v, onde c é a velocidade da luz no vácuo e v é a sua

velocidade na substância considerada. No vácuo, por definição, n é exatamente igual a 1

e, no ar, muito próximo de 1.

Uma onda eletromagnética em um meio pode ser descrita por um vetor campo

elétrico E e um vetor campo magnético B . As equações mais fundamentais que

descrevem esses campos são as equações de Maxwell, fornecendo uma descrição das

intensidades com que os fenômenos em questão ocorrem, bem como importantes

conseqüências, para eles, do caráter vetorial das ondas eletromagnéticas, ou seja, da

polarização da luz. No tratamento clássico da refração, por exemplo, determina-se a

direção do raio refratado (pela lei de Snell), mas não se dá qualquer informação sobre a

intensidade da luz refratada em relação à intensidade da luz incidente.



63

As equações de Maxwell em um meio simples (homogêneo, linear, isotrópico e

estacionário), no sistema CGS de unidade são dadas por:

,0=•∇ E (2.50)

,0=•∇ H (2.51)

,01

=∂

∂+×∇

t

H

cE (2.52)

,0=∂∂µε

−×∇t

E

cH (2.53)

onde o meio é caracterizado pela permeabilidade magnética µ, e sua função dielétrica

ε(ω). E é o campo elétrico e H é o vetor indução magnética. Das equações de

Maxwell se obtêm equações de onda. Tomando o rot da Equação (2.52), tem-se:

Bc

E .1

.. ∇−=∇∇ (2.54)

t

H

c ∂∂µ

−= (2.55)

∂∂

+π

∂∂µ

−=t

D

cj

ctc

14 (2.56)



64

Supondo que ε e µ sejam constantes, e que 0=j . Então, como ,0. =∇ E

tem-se

2

2

2

2

t

D

cE

∂

∂µ=∇ (2.57)

ou, usando ,ED ε=

02

2

2

2=

∂

∂µε=∇

t

D

cD (2.58)

Verifica-se na Equação (2.58) que a onda possui uma velocidade de propagação

dada por:

εµ=

cv (2.59)

Um cálculo análogo para o campo magnético obtém-se,

01

2

2

2

2=

∂

∂−∇

t

HH

v (2.60)

Nos meios transparentes e não magnéticos, tem-se, em geral, 1≈µ . Portanto,

será omitido µ , a seguir.

As soluções das equações para E e H são:



65

−ε

ωε

=t

e

rk

ieea

E

.

(2.61)

−ε

ω=

te

rk

iehaH

.

(2.62)

onde a é uma constante (amplitude da onda), e e h são os vetores (unitários) de

polarização dos campos elétrico e magnético, respectivamente. k é um vetor unitário na

direção e sentido da propagação da onda. Logo, k , e e h , nessa ordem, formam um

triedro ortogonal dextrógiro. E e H estão exemplificados na Figura 14.

ε1

ε2

x meio 1

meio 2

→

Ht

z

→

Hr →

ki

→

kr

→

Hi

→

Ei →

Er

→

Et

→

kt

θθ1´

θ2

Figura 14: Geometria utilizada na análise de reflexão e refração em uma interface simples.



66

As soluções apresentadas nas Equações (2.61) e (2.62) são ondas planas e

monocromáticas que se propagam na matéria. Os campos incidentes são:

−εω

ε=

te

rki

i eea

E

.

1

11

11

(2.63)

−ε

ωε

ω=

te

rk

ie

ii ehaH

.11

1

11 (2.64)

onde a1 é a amplitude da onda incidente, 1e e 1h são os vetores unitários de

polarização dos campos elétrico e magnético incidentes, respectivamente. 1k é um

vetor unitário na direção e sentido da propagação da onda incidente.

Os campos refletidos podem ser escritos como:

−εω

ε=

te

rki

r eea

E

.´

1

11

11´´

(2.65)

−ε

ωε

ω=

te

rk

ie

ir ehaH

.11

1

11 ´´ (2.66)

onde a´1 é a amplitude da onda refletida, 1e e 1h são os vetores unitários de

polarização dos campos elétrico e magnético refletidos, respectivamente. 1k é um

vetor unitário na direção e sentido da propagação da onda incidente.



67

Finalmente, os campos refratados:

−εω

ε=

te

rki

t eea

E

.

2

22

22

(2.67)

−

ε

ω=

trke

it ehaH

22

22 (2.68)

onde a2 é a amplitude da onda refratada, 2e e 2h são os vetores unitários de

polarização dos campos elétrico e magnético refratados, respectivamente. 2k é um

vetor unitário na direção e sentido da propagação da onda refratada.

A conexão entre as soluções para o meio 1 e 2 é feita através das fórmulas

conhecidas do eletromagnetismo, que devem ser satisfeitas nos pontos da superfície de

separação dos meios. Nos meios 1 e 2, os campos elétricos e magnéticos totais são:

ri EEE +=1 (2.69)

tEE =2 (2.70)

21 HH = (2.71)

2.4.2.3. Condições de existência de oscilações de plásmons de superfície

Uma vez que os plásmons de superfície ocorrem na direção perpendicular à

interface, o acoplamento de energia eletromagnética com essas oscilações requer que o

campo elétrico de excitação tenha uma componente normal à interface. Para demonstrar



68

a existência dos plásmons de superfície, bem como determinar as suas características,

pode-se considerar a interface entre dois meios semi-infinitos e uma onda incidente na

interface como mostrado na Figura 14. Admite-se que a onda incidente esteja polarizada

no plano de incidência. Conforme indicado na Figura 14, há interesse em determinar

sob que condições é possível obter apenas uma onda de saída do meio 2.

Das Equações (2.69) à (2.71) pode-se extrair uma simples relação entre a

permissividade relativa e a componente normal do vetor de onda, admitindo-se z = 0:

2

2

1

12112 ..

kkkk

ε=

ε⇔ε=ε (2.72)

Tem-se que o vetor de onda associado à onda plana no meio 1 ou 2 e com as

componentes nas direções x e z, pode ser expresso na forma [148]:

,2

121

2

=+c

kk zx

ωε (2.73a)

e, para o meio 2:

2

222

2

ωε=+

ckk zx (2.73b)

onde ( )2cω é o número de onda no vácuo na freqüência angular .ω

Substituindo a Equação (2.72) em (2.73) tem-se,

21

21ε+ε

εε= kkx (2.74)



69

A Equação (2.74) é a equação de dispersão das ondas de superfície, ou seja, do

plásmon. Pode-se observar que o vetor de onda de um SP depende das constantes

dielétricas dos dois meios. Esta propriedade leva ao uso dos plásmons de superfície em

sensores. A utilização da Equação (2.74) nas equações (2.73a) e (2.73b) permite obter

valores específicos para a componente z do vetor de onda em cada meio, ou seja,

21

21

1 ε+ε

ε= kk (2.75)

21

22

2 ε+ε

ε= kk (2.76)

Para um metal, ε é menor que zero nas freqüências dadas na Equação (2.74) e,

portanto, k é imaginário puro para xk real. Como xk é real a onda se propaga na

direção x. O fato de k1 e k2 serem imaginários puros leva à conclusão de que a

intensidade da onda cresce ou decresce exponencialmente na medida em que se aumenta

a distância da interface z = 0. A situação em que a intensidade da onda cresce

infinitamente levaria à condição de energia infinita, o que é fisicamente impossível.

Portanto, a escolha fisicamente realizável é aquela na qual a intensidade de campo decai

exponencialmente em ambos os sentidos da direção z [149].

Portanto, nas Equações (2.75) e (2.76), para assegurar a propagação da onda

eletromagnética é necessário impor que o vetor xk seja real, a 2ε negativa, tal que

12 ε⟩ε ou 02 ⟨ε . Onde, ir i 222 ε+ε=ε . Esta é a uma condição necessária para

a existência de um modo de superfície, ou seja, temos que ter um meio com ε positivo

(dielétrico), e um meio com ε negativo (metal ou semicondutor), conforme ilustrado na

Figura 15.



70

Paralelamente, a Equação (2.74) pode ser assim re-escrita:

( ) 21

221

221

ε+ε+εε+εε

=ir

irx i

ikk (2.77)

- + - + - + - + - + - Metal

εar

ε2

Figura 15: Ilustração das oscilações na densidade da carga de superfície, junto com as linhas do campo.

2.4.2.5. Modelos práticos de observação de plásmons de superfície

Como foi visto anteriormente, são necessárias algumas condições para excitar

plásmons de superfície. Primeiramente é necessário trabalhar em uma faixa de

comprimentos de onda em que o meio metálico tenha permissividade negativa, e que a

soma das permissividades dos dois meios seja negativa, ou equivalentemente e que o

módulo da permissividade do dielétrico seja menor que aquela do metal. Obedecendo a

essas condições, os campos, em ambos os lados da interface, tornam-se evanescentes.

Porém, não é possível acoplar luz a um modo de superfície incidindo luz diretamente

sobre a interface entre os dois meios, pois a componente x do vetor de onda do plásmon

de superfície satisfaz a condição:

(2.78)

,21

21 kkkk SPx ⟩ε+ε

εε==



71

Uma vez que o número de onda do campo incidente pela interface externa da

estrutura é sempre inferior ao parâmetro kSP, ou seja, kx será sempre maior que o valor

máximo do vetor de onda k no meio iin ε= de uma onda incidindo diretamente na

interface. Pode-se observar na Figura 16 que a linha de luz, que representa a relação de

dispersão linear da onda eletromagnética, incide no meio positivo (dielétrico) e não

corta a curva de dispersão do plásmon. Logo, estes modos de superfície são não

radiativos, ou seja, eles não podem ser irradiados como fótons e a luz incidindo

diretamente na interface não pode ser acoplada ao plásmon de superfície.

Conseqüentemente, deve-se utilizar algum tipo de acoplador óptico que nos possibilite

excitar os plásmons de superfície.

De acordo com a Figura 16, a linha de luz deve ser mais inclinada de forma a

cruzar a curva de dispersão do plásmon. Faz-se então necessário aumentar o valor do

vetor de onda da luz incidente de um valor ∆kx. Este aumento é possível utilizando

geometrias com prismas como acopladores ópticos. Os primeiros investigadores do

efeito de SPR, Otto [131] e Kretschmann [132], propuseram técnicas que utilizavam

prismas.

Ene

rgia

fóton

Plásmons de superfície (SP)

λ

Ene

rgia

fóton

Plásmons de superfície (SP)

λ

Figura 16: Plásmons de superfície em um metal. Curva da dispersão dos plásmons se encontra abaixo da linha tracejada.



72

2.4.3.5.1. Configuração de Otto

A configuração proposta por Otto [131] para excitação de plásmons de

superfície está ilustrada na Figura 17. Como é possível observar na figura, Otto utilizou

uma fina camada de ar com espessura típica de um comprimento de onda entre o prisma

de vidro e o filme fino metálico. Nesta configuração, é necessário que o meio

transparente entre o filme e o prisma tenha índice de refração menor que o do prisma,

permitindo que a onda incidente, na face superior do prisma, possa sofrer reflexão

interna total, o que produz um campo evanescente através do qual a radiação se acopla.

Prisma

Filme metálico Meio dielétrico

Meio externo

Figura 17: Configuração de Otto para excitação de SPR.

Portanto, ajustando o ângulo de incidência em um valor acima do ângulo critico

(kx = n1k sen θ) obtém-se acoplamento máximo entre o feixe incidente e o plásmon de

superfície na condição de ressonância kx = kSP , podendo ser observada uma forte

absorção de luz pela oscilação.



73

2.4.3.5.2. Configuração de Kretschmann

A configuração de Kretschmann [132], Figura 18, também se baseia no

fenômeno de reflexão interna total. A diferença entre esta configuração e a proposta por

Otto é que o filme metálico está em contato direto com a superfície do prisma e, nesta

condição, uma onda evanescente é naturalmente criada quando a luz polarizada

atravessa o meio óptico denso (prisma) e alcança a interface entre o metal e o meio de

densidade óptica menor (ar), sendo refletida de volta para o meio mais denso.

θθ

Prisma

Filme metálico

Meio externo

Figura 18: Configuração de Kretschmann para excitação de plásmons superficiais.

No instante em que o vetor de onda do plasma é igual ao vetor de onda do

campo evanescente (kSP = kev), (Equações 2.74 e 2.79) deve ser verificada uma queda

na refletividade, devido à formação da onda evanescente, que se propaga através da

superfície metálica e se acopla com os plásmons, como pode ser verificado através das

Equações (2.80) e (2.81):

θεω

= senc

k px (2.79)



74

( )arm

armp cc ε+ε

εεω=θε

ωsen (2.80)

( )

εε+εεε

=θparm

arm 1xarcsen (2.81)

onde θ é o ângulo de incidência da luz com a superfície do metal, εp, εm, εar é a constante

dielétrica do prisma, do filme metálico e do ar, respectivamente, ω é a freqüência

angular da luz incidente e c, a velocidade da luz.

2.4.3. Eletroquímica acoplada à Ressonância de Plásmons de Superfície

A combinação de métodos eletroquímicos com o fenômeno de SPR no processo

de caracterização de superfícies suscita informações muito úteis para o desenvolvimento

de biosensores, eletrodos modificados, processos de eletropolimerização, etc [142, 150-

153]. Há um número razoável de modificações estáveis nas superfícies de eletrodos que

podem exibir mudanças no índice de refração, concomitantemente com eventos redox

e/ou capacitivo [154-156].

Como foi visto na seção 2.4.2, o ângulo de ressonância depende da constante

dielétrica do filme metálico e das propriedades dielétricas dos meios adjacentes às

interfaces do filme. Conseqüentemente, a aplicação de um potencial elétrico muda as

propriedades dielétricas, resultando na variação do sinal de SPR. Kotz e colaboradores

[157] mediram o deslocamento do ângulo de SPR quando o potencial no filme fino de

ouro variou, por um ciclo, com valores abaixo e acima do potencial de oxidação do

metal, mostrando que a formação da dupla camada de Helmholtz influencia

significativamente na resposta da SPR. As variações no ângulo de SPR com a mudança

do potencial elétrico são importantes não somente porque podem afetar as medidas com

sensores de SPR: A possibilidade de medir localmente o campo elétrico com a técnica



75

de SPR pode definir o arranjo espacial e temporal, podendo ser utilizado em várias

aplicações em biociência. Como por exemplo, na elucidação de estruturas de proteínas

[158] e/ou na determinação da orientação da proteína adsorvida.

Schlereth e colaboradores [159], caracterizaram por voltametria cíclica acoplada

à SPR a obtenção de monocamadas de hemoproteínas em superfícies modificadas de

ouro, com uma orientação que permite uma reação direta de transferência do elétron

entre o centro redox da proteína e a superfície do eletrodo.

Offennhausser e colaboradores [160] investigaram propriedades de

monocamadas auto-organizadas de alcanotiois e tiolipídeos sobre ouro. Empregando

SPR e Espectroscopia de Impedância Eletroquímica, foram avaliadas as espessuras

médias da monocamada e a cinética de transferência de elétrons e de adsorção.

Suzuki e colaboradores [161] combinaram sensores eletroquímicos com a SPR e

quantificaram IgG, por ressonância de plásmons e, glicose, juntamente com lactato, por

medidas eletroquímicas. Portanto, dois tipos de detectores foram utilizados para analitos

diferentes. Semelhantemente, Kei Toda [162] e colaboradores, elaboraram um sistema

imunoensaio que foi conduzido sobre um filme fino de ouro e analisado por ambas as técnicas,

SPR e eletroquímica. A imobilização do anticorpo, as reações antígeno-anticorpo e a

seletividade do anticorpo adsorvido foram monitoradas utilizando SPR, e o filme de ouro, com

os produtos finais no interior da célula do equipamento de SPR, foi conectado a uma célula

eletroquímica, e assim, determinado. Como neste trabalho foi utilizado um filme fino de ouro

como uma sustentação para a imobilização, o sistema não requereu longo tempo de incubação,

quando comparado com métodos convencionais que utilizam diversas horas de incubação [163].

As potencialidades analíticas da EIS e SPR, bem como a importância de suas aplicações

às investigações e caracterizações de processos superficiais e interfaciais, estão intimamente

ligadas ao desenvolvimento de métodos confiáveis. Neste contexto, o emprego combinado

dessas técnicas tem sido explorado com o propósito de disponibilizar informações

complementares que possibilitem interpretações seguras sobre o sistema avaliado.

Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III


CAPÍTULO III

MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Reagentes e limpeza de vidrarias

Os reagentes NaCl (VETEC), CaCl2.H2O (Merck), MnCl2.4H2O (Carlo Erba),

KCl (Merck), HNO3 (Synth), Nujol (Aldrich), H2SO4 (Synth) e sílica (Aldrich) eram de

grau analítico e foram utilizados como recebidos e os que foram empregados na sala

limpa (acetona, metanol e tricloroetileno) eram isentos de íons metálicos (MIF – “metal

íon free”).

Em todas as etapas experimentais como: lavagem dos eletrodos e materiais,

preparação e caracterização da amostra, foi utilizada água purificada obtida pelo sistema

de purificação MilliQ-Plus (Millipore Inc.), com resistividade de 18 MΩ.cm. A

temperatura do meio em que foram realizados os experimentos era de 23 ± 2 ºC.

Todas as vidrarias utilizadas nas análises passaram por um processo prévio de

descontaminação química. A vidraria foi lavada com água MilliQ-plus e detergente

neutro. Em seguida, enxaguada e imersa em ácido sulfúrico concentrado até a sua

utilização, momento em que foi lavada com água MilliQ-plus e seca em estufa.

3.2 Proteína

A proteína Concanavalina A, ou ConA, (Canavalia ensiformis; Sigma – tipo IV)

foi utilizada no processo de adsorção sobre o filme fino de ouro, na concentração de 200

µg.mL-1 em NaCl 0,15 M (configuração desativada), em NaCl 0,15 M, CaCl2.H2O 3

mM e MnCl2.4H2O 3 mM (configuração ativada). Ambas as soluções apresentaram

índice de refração (n) de 1,5 (medida realizada através de refratômetro de Abbe).



Para testar a sensibilidade e a seletividade das proteínas adsorvidas (desativada e

ativada) foram utilizados os carboidratos galactose (Merck) e glicogênio (Sigma – tipo

II), nas concentrações de 120 µg. mL-1 em NaCl 0,15 M.

As concentrações utilizadas na imobilização e na observação da reação

proteína/carboidrato foram selecionadas com base em valores publicados [111-113,

163].

3.2.1 Teste de Atividade Biológica da Concanavalina A

A atividade biológica da Concanavalina A foi verificada pela presença de

turbidez da solução, causada pela ligação de glicogênio a um sítio específico da proteína

[164-165]. A reação foi monitorada pelo espectrofotômetro de UV-visível de marca

Perkin Elmer e modelo Lambda 6, onde o caminho óptico foi de 1 cm e a temperatura

de 25 ºC.

Inicialmente, foi realizado um espectro de absorção numa faixa de comprimento

de onda de 190 a 900 nm para a solução de Concanavalina A 200 µg.mL-1 em NaCl 0,3

M, MnCl2 3 mM e CaCl2 3mM. Da análise do espectro gerado, foi selecionado o

comprimento de onda 460 nm por não ter apresentado banda de absorção, portanto, não

mascarando a absorção relacionada à reação entre a proteína e o glicogênio na próxima

etapa.

Realizou-se uma medida da variação da absorção em função do tempo, no

comprimento de onda de 460 nm, da reação entre 1,5 mL da solução ativada de ConA

200 µg.mL-1 a 1,5 mL de 120 µg.mL-1 da solução de glicogênio, em uma cubeta de

quartzo. Este experimento foi realizado 24 horas após a confecção das soluções e

repetido após sete dias.



3.3 Células e Eletrodos

3.3.1 Eletrodos

Durante o desenvolvimento de todos os experimentos eletroquímicos, foi

utilizado um sistema convencional de três eletrodos: eletrodo de referência (ER),

eletrodo auxiliar (EA) e eletrodo de trabalho (ET).

3.3.1.1 Eletrodo de referência

Como eletrodo de referência, foi utilizado o eletrodo de Ag/AgCl em KCl

saturado, fabricado no Laboratório de Eletroquímica da UFPE (Figura 19).

O eletrodo consiste em um fio de prata (Ag) de 40 mm de comprimento e 1 mm

de diâmetro, envolvido em uma camada de cloreto de prata (AgCl) (obtida por

eletrodeposição), imerso em uma solução de KCl (Merck) saturado, no interior de um

corpo de vidro de 60 mm de comprimento, com 6 mm de diâmetro na extremidade

superior e 4 mm de diâmetro na inferior. Na extremidade superior, o fio de prata foi

fundido a um fio de cobre de mesmas dimensões e essa conexão foi revestida por uma

resina epóxi (Polipox – CMR029-N) que tem a dupla função de isolar o eletrodo e

proteger a união entre os dois fios metálicos. Na extremidade inferior do corpo de

vidro, utilizou-se uma junção porosa Vycor (Bioanalytical Systems), afixada com auxílio

de um tubo termoretrátil de teflon. Após a confecção, o eletrodo foi armazenado em

uma solução de KCl saturada, garantindo-lhe uma maior vida útil.

A limpeza do eletrodo foi efetuada somente com enxágüe em água para eliminar

qualquer resíduo da solução de cloreto de potássio utilizado no armazenamento,

permitindo assim sua posterior utilização experimental.



Fio de Cu

Fio de Ag recoberto com

Vycor

Solução de KCl, sat.

Figura 19: Eletrodo de referência de Ag/AgCl, KCl saturado.

3.3.1.2 Eletrodo auxiliar

Utilizou-se como eletrodo auxiliar um fio de platina (Pt) com 40 mm de

comprimento e 1 mm de diâmetro, conectado a um fio de cobre (30 mm de

comprimento e 1 mm de diâmetro), cujo ponto de conexão foi revestido com resina

epóxi, como ilustra esquematicamente a Figura 20.

O eletrodo então confeccionado foi armazenado em uma caixa de acrílico,

depositada no interior de um dessecador com sílica ativada, e, antes da utilização foi

imerso durante 5 minutos em ácido nítrico concentrado, seguido de enxágüe em água

MilliQ-plus.

Figura 20: Eletrodo auxiliar de platina (Pt).



3.3.1.3 Eletrodo de trabalho

Lâminas de vidro comum (n = 1,515 em λ = 632,8 nm) [166], tendo

aproximadamente 1 mm de espessura e medindo 25 mm x 75 mm, foram utilizadas

como substratos para crescimento do filme de 50 nm de ouro (99,99% de pureza), para

posterior utilização como eletrodo de trabalho e como interface para obtenção dos

plásmons superficiais na detecção da proteína adsorvida. O processo de confecção do

eletrodo de trabalho de filme fino de ouro é descrito na seção 3.4 deste capítulo.

3.3.2 Célula eletrolítica EIS-SPR

Foi necessária a construção de uma célula, especialmente projetada para

realização das medidas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS), que

pudesse ser aplicada simultaneamente ao sistema óptico de Ressonância de Plásmons de

Superfície (SPR) na caracterização da adsorção de biomoléculas. A Figura 21 mostra o

desenho técnico da célula EIS-SPR.

A célula foi confeccionada em teflon, com dimensões de 50 mm x 45 mm x 25

mm (C x L x A). A parte superior possui uma abertura circular de 30 mm de diâmetro.

Para garantir a vedação da célula no sistema montado foi confeccionada na borda de

cada orifício uma ranhura, onde é encaixado o anel de vedação (o-ring). A abertura

superior da célula foi vedada com uma tampa em teflon (36 mm x 40 mm x 17 mm)

parafusada no corpo da célula. Na região central da tampa, foram abertos dois orifícios

de 5 mm de diâmetro e mais dois orifícios de 4 mm de diâmetro. O centro da lateral de

menor comprimento da célula possui uma abertura circular com 10 mm de diâmetro,

que é vedado com um anel de borracha ao substrato metalizado, e a superfície do filme

fino de ouro forma a tampa lateral da célula em conjunto com o prisma de BK7

(SCHOTT).



Figura 21: Desenho técnico da célula EIS-SPR.

Antes do uso, a célula EIS-SPR foi enxaguada com água MilliQ-plus e, após sua

utilização, lavada novamente em água MilliQ-plus, em seguida, foi imersa em acetona e

submetida a agitação de ultra-som por 10 minutos. Finalmente, a célula foi lavada

novamente com água MilliQ-plus por mais cinco minutos e guardada imersa em ácido

sulfúrico concentrado até a utilização seguinte.



3.3.2.1 Conjunto integrado prisma-célula

A Figura 22 ilustra como foi realizada a fixação do conjunto prisma/eletrodo de

filme fino de Au/célula EIS-SPR. O anel de borracha (o-ring) da cavidade superior é

pressionado pela tampa de teflon, que é parafusada ao corpo da célula. O anel de

borracha da cavidade lateral da célula pressiona e faz contato físico com a superfície do

filme fino de ouro (eletrodo). A face do substrato de vidro, sem filme metálico, faz

contato óptico com a face de maior comprimento (hipotenusa) do prisma de vidro de

BK7 (SCHOTT), com cada face medindo 25 mm x 25 mm x 35 mm (n = 1,516 em λ =

670 nm), através de um óleo casador de índice de refração (Nujol, n = 1,48; medido

experimentalmente através de um refratômetro de Abbe, t = 22 ± 2 ºC). O prisma é

fixado no centro da abertura lateral da célula com auxilio de uma peça em aço, cujo

formato é semelhante a uma prensa (Figura 23).

Figura 22: Ilustração da montagem do conjunto prisma/ eletrodo de filme fino de ouro/célula EIS-SPR.



a b

c d

Figura 23: Foto do processo de acoplamento das partes integrantes da célula EIS-SPR. a) peça em aço para fixar o prisma na célula com o eletrodo; b) célula EIS-SPR em teflon; c) conjunto peça em aço, célula e prisma e d) eletrodo de filme fino de ouro.

3.3.3 Eletrólito Suporte e Solvente

Foi utilizada uma solução de cloreto de sódio (n = 1,333 em λ = 670 nm) como

eletrólito suporte numa concentração de 0,15 M. Esta concentração é a mesma de uma

solução fisiológica adequada para testes com lectinas. No entanto, em função de sua

estabilidade eletroquímica, o potencial de trabalho ficou limitado à faixa de -100 mV à

400 mV vs. Ag/AgCl, KCl saturado.

3.4 Confecção de Eletrodos de Filme Fino

O processo de confecção do eletrodo de trabalho de filme fino de ouro foi

dividido em três etapas distintas:



1ª Etapa: Limpeza do substrato

Um dos procedimentos mais importantes na obtenção de filmes finos metálicos

pelo método de evaporação metálica a baixa pressão é a limpeza do substrato. A

importância desta etapa se deve ao fato de que a presença de dopantes (impurezas),

como óxidos, gorduras, pós, etc, na superfície do substrato diminui a aderência do filme

evaporado, e, conseqüentemente, acarreta um comportamento falho no dispositivo e/ou

diminui o seu tempo de vida útil.

Os procedimentos de limpeza descritos a seguir foram realizados em uma sala

limpa classe 1000, sala na qual iluminação, filtragem e distribuição do ar, materiais de

construção e procedimentos operacionais correspondem a exigências de controle na

concentração de partículas aerotransportadas. A classe deste tipo de laboratório se refere

à quantidade de partículas em suspensão no ambiente, isto significa que esta sala possui,

em suspensão em sua atmosfera, em média 1000 partículas de até 0,3 µm por pé cúbico.

1. As lâminas foram inicialmente lavadas com água MilliQ-plus e deixadas

por 24 horas em ácido sulfúrico concentrado. Em seguida, foram

enxaguadas novamente com água MilliQ-plus e secadas com um jato de

nitrogênio (White Martins);

2. Na seqüência, foram imersas em um béquer contendo tricloroetileno por

cinco minutos e sob agitação de um ultra-som;

3. Em seguida, foram transferidas para um outro béquer contendo água

MilliQ-plus e submetidas à agitação de um ultra-som por 3 minutos;

4. Após a lavagem com água, foram deslocadas para um outro béquer,

contendo acetona, por mais cinco minutos e sob agitação de um ultra-som;

5. Posteriormente, repetiu-se a etapa da lavagem com água MilliQ-plus (item

3);

6. As lâminas foram transferidas para um novo béquer contendo álcool

metílico, por mais cinco minutos e sob agitação de um ultra-som;

7. A limpeza foi finalizada com a repetição do item “3” pela terceira vez e

pela secagem das lâminas utilizando um jato de nitrogênio.



Após a secagem, os substratos foram acondicionados em um suporte

apropriado para lâminas de microscópio, armazenado no interior de uma dessecador

com sílica ativada, até o dia da evaporação.

2ª Etapa: Evaporação

A deposição do filme fino por evaporação foi realizada pelo aquecimento do

material (ouro), fonte dos filmes, em um ambiente de vácuo elevado (∼ 10-6 torr). Como

ilustrado na Figura 24, o ouro foi aquecido próximo a sua temperatura de pressão de

vapor, em ambiente de alto vácuo, provocando a irradiação de seus átomos da fonte a se

condensarem na superfície do substrato e nas paredes da câmara, formando, deste modo,

o filme fino desejado. Os átomos de Au em alto vácuo viajam em linhas retas porque há

poucas moléculas de gás para colidir em seu trajeto.

Figura 24: Ilustração do método de Evaporação térmica a baixa pressão.

O equipamento utilizado para atingir as pressões necessárias ao experimento,

foi uma Evaporadora modelo 980 da Varian (Figura 25). Para atingir um ambiente de

alto vácuo, a evaporadora possui um sistema de bombas e válvulas que diminuem a

pressão no interior de sua câmara, na ordem de décimos de “microtorr”.



Figura 25: Foto do equipamento Evaporador (Modelo 980 da Varian) utilizado na confecção de filmes finos de ouro.

A Figura 26 ilustra esquematicamente o sistema de bombeamento responsável

por este efeito. Na parte inferior do equipamento, localizam-se duas bombas e três

válvulas: a bomba difusora, que gera o alto-vácuo no interior da campânula; a bomba

mecânica, responsável pelo vácuo na ordem de 10-2 torr, produzido no interior da

campânula e na base da bomba difusora; a válvula dianteira (foreline valve),

responsável pelo controle do vácuo produzido na base da bomba difusora pela bomba

mecânica; a válvula de vácuo-intermediário (rough valve), que controla o vácuo gerado

no interior da campânula pela bomba mecânica; e a válvula de alto-vácuo (high-vacuum

ou HiVac), responsável pelo controle do alto-vácuo produzido pela bomba difusora.



Figura 26: Esquema simplificado do sistema de evaporação utilizado na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro. 1) bomba difusora. 2) bomba mecânica. 3) válvula dianteira “foreline valve”. 4) válvula de vácuo-intermediário “rough valve”. 5) válvula de alto-vácuo “HiVac”. 6) entrada de ar ou nitrogênio. 7) campânula. 8) cadinho. 9) Shutter (auxilia no controle da espessura do filme depositado).

O processo foi iniciado primeiramente com a ligação da bomba mecânica, com a

finalidade de baixar suficientemente a pressão no interior da campânula, a qual não

poderia ser operada sob pressão atmosférica no momento em que a bomba de alto-vácuo

fosse ligada. Conseqüentemente, foi necessário atingir a pressão de ∼10-2 torr antes que

a bomba difusora entrasse em ação.

Em seguida, as válvulas iniciaram a evacuação, alternando entre o interior da

campânula e a base da bomba difusora. Após quinze minutos dessa operação, ligou-se a

bomba difusora, porém, sem que a mesma evacuasse a campânula. Após trinta minutos,

quando a pressão na base da difusora atingiu ~10-2 torr, a válvula “HiVac” foi aberta,

dando início à evacuação da campânula, enquanto a bomba mecânica procedeu com a

evacuação na base da difusora. Após alguns minutos, foi obtida uma pressão na ordem

de ~10-6 torr no interior da campânula. Com isso, o processo de evacuação se

completou, esquematicamente como ilustra a Figura 27, e foi repetido por dois dias

consecutivos antes da evaporação do material (ouro), ficando as bombas ligadas por

cerca de 6 horas em cada dia, com o intuito de limpar todo o sistema interno de

evaporação de contaminantes que põem em riso o substrato e a fonte metálica.



ATMOSFERA

Figura 27: Diagrama esquemático do sistema de evacuação da evaporadora utilizada na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro.

No dia previsto para evaporação do material, a campânula foi aberta e lá foi

colocada 1 moeda de ouro pesando 0,78 gramas, com pureza de 99,99% (material a ser

evaporado). Este procedimento ocorreu durante o processo de evacuação da

evaporadora descrito anteriormente:

1. Após o acionamento das bombas mecânica e difusora e o bombeamento

com a bomba mecânica na base da difusora, o dispositivo mecânico

destinado a controlar a entrada de nitrogênio gasoso para o interior da

campânula foi aberto, ocasionando o aumento da pressão interna até ter

atingido a pressão ambiente;

2. A campânula foi aberta e, rapidamente, o cadinho de tungstênio (W) com o

material (1 moeda de ouro) foi posicionado e conectado com os eletrodos

(Figura 28a);

3. Na seqüência, posicionaram-se 16 (dezesseis) lâminas de vidro no porta-

substrato de alumínio (confeccionado especialmente para este

experimento), e o conjunto, acomodado na parte superior da campânula

(Figura 28b);

4. A campânula foi fechada e, em seguida, o dispositivo mecânico destinado a

controlar a entrada de nitrogênio;

5. Voltou-se a evacuar a campânula até atingir a pressão da ordem de 8 x 10-6

torr;



6. Foi aplicada uma tensão nos eletrodos conectados ao cadinho, a uma taxa

de 5 Volts/minuto até 60 V, com uma corrente de 300 A, dando início à

evaporação do ouro (Figuras 28c e 28d);

7. Após o filme ter atingido a espessura de 50 nm, reduziu-se até zero a

tensão e foram desligadas as bombas. Trabalhando tipicamente com estes

valores, a uma pressão de 8 x 10-6 torr, foi obtida uma taxa de evaporação

de 0,5 nm/s. O crescimento da espessura do filme de ouro foi monitorado

por um medidor de espessura que utiliza um sensor de cristal piezelétrico

de quartzo;

8. Após trinta minutos, o dispositivo mecânico destinado a controlar a entrada

de nitrogênio gasoso e a campânula foram abertos para retirada dos filmes

do porta-substratos, os quais foram acondicionados em um porta-filmes

(Figura 28e) e guardados no interior de um dessecador com sílica ativada,

até o início da terceira etapa da confecção do eletrodo de filme fino de

ouro.



a) b)

c) d)

e)

Figura 28: Fotos da segunda etapa do processo de confecção do eletrodo de trabalho de filme fino de ouro por evaporação a baixa pressão. a) posicionamento do material no cadinho da campânula. b) posicionamento das lâminas de vidro no porta-substrato, na parte superior da campânula; c - d) processo de evaporação do ouro; d) filmes finos de ouro após o processo de crescimento e acomodados em porta-filmes de PVC.



3ª Etapa: Contato elétrico do eletrodo de filme fino de ouro

O contato elétrico foi realizado pela simples colagem de uma das extremidades

desencapadas de um fio de cobre (40 mm) revestido com PVC (0,8 mm2) na superfície

do filme fino de ouro, com auxílio de 1 gota de cola de prata (Delta Technologies) e,

após a secagem, a junção foi revestida por uma fita de teflon sob pressão, conferindo

resistência mecânica ao conjunto (Figura 29).

O processo de limpeza, que foi aplicado antes das medidas, consistiu em aplicar

um jato de nitrogênio ou argônio a ∼ 2 cm da superfície do filme, por três minutos.

a) b)

Figura 29: Foto ilustrando o processo de construção do contato elétrico no eletrodo de filme fino de ouro. a-1) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro e a-2) em um substrato de vidro sem filme. b) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro, cuja junção foi revestida com fita de teflon.

3.5 Análise Topográfica por Microscopia de Força Atômica (AFM)

A morfologia superficial do eletrodo de filme fino de ouro foi verificada por

Microscopia de Força Atômica (AFM) utilizando um microscópio da Molecular

Imaging Corporation, modelo PicoScan 2500. As micrografias superficiais foram feitas

sem que as amostras (15 mm x 15 mm) sofressem quaisquer tipos de tratamentos



químicos anteriores, mas com apenas um jato de nitrogênio por 1 (um) minuto em

direção a sua superfície (Figura 30). Na análise, escolheu-se uma pequena área de 1 µm2

que não apresentava qualquer particularidade em sua superfície. Este experimento foi

realizado em três regiões distintas de cada uma das 3 amostras obtidas.

Figura 30: Amostras do eletrodo de filme fino de ouro utilizadas na caracterização da morfologia superficial por AFM.

3.6 Voltametria Cíclica

Os experimentos de voltametria cíclica foram realizados para verificar a limpeza

do sistema (soluções, eletrodo de filme fino de ouro, etc). Esses dados, quando

analisados concomitantemente com os resultados de AFM, fornecem um estudo

detalhado da interface.

As análises foram realizadas através de um potenciostato/galvanostato de

modelo 263A da PAR (Princenton Applied Research). A faixa de potencial se estendeu

de – 300 a 700 mV vs Ag/AgCl, saturado, para o filme fino de ouro em solução de NaCl

0,15 M e de –300 a 1500 mV para o eletrodo em solução de ácido sulfúrico 0,1 M. A

velocidade de varredura foi de 50 mV.s-1.



3.7 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS)

As medidas de impedância eletroquímica foram realizadas através do

potenciostato/galvanostato ligado a um Lock-in (modelo 5210 da PAR), numa faixa de

freqüência de 100 KHz a 10 Hz, sendo a amplitude de perturbação de 10 mVrms.

O potenciostato aplica um potencial dc entre o eletrodo de trabalho e o de

referência, além de gerar a onda senoidal. O Lock-in compara dois sinais senoidais e

gera uma resposta que é usada para se obter a diferença de fase entre os sinais e a razão

entre as amplitudes dos picos. Portanto, o Lock-in envia através do potenciostato um

sinal senoidal de pequena amplitude e mantém um sinal interno como referência. A

resposta da célula eletroquímica à excitação é comparada com o sinal de referência do

Lock-in.

Os resultados da Espectroscopia de Impedância foram modelados através do

programa Equivalent Circuit (Equivcrt.Pas), escrito por Bernard A. Boukamp [167].

Essa modelagem permitiu a extração dos valores dos elementos do circuito equivalente

para cada interface, que são comparáveis às grandezas físico-químicas dessas interfaces.

3.7.1 EIS Aplicada na Caracterização da Adsorção de Biomoléculas

Com o sistema descrito anteriormente (seção 3.7.), foram realizadas medidas de

Espectroscopia de Impedância Eletroquímica no processo de caracterização da adsorção

da Concanavalina A na superfície do eletrodo de filme fino de ouro, utilizando a célula

EIS-SPR. O protocolo utilizado neste experimento pode ser assim descrito:

1. Após a limpeza dos eletrodos, inicia-se o procedimento de limpeza da

célula EIS-SPR com solução de NaCl 0,15 M. O processo é repetido cinco

vezes;

2. Após a lavagem, a célula é preenchida com 10 mL da solução de NaCl 0,15

M;



3. Em seguida, acopla-se o sistema de desoxigenação à célula, o qual efetuou

o borbulhamento com nitrogênio durante 5 minutos, mantendo-se a

atmosfera inerte durante o restante do experimento;

4. Os eletrodos de referência e auxiliar são fixados na célula e conectados ao

potenciostato/galvanostato (Figura 31);

5. Realiza-se a medida de impedância eletroquímica para a interface

ouro/NaCl 0,15 M, com potencial de circuito aberto;

6. Após a medida de impedância da interface ouro/NaCl, adiciona-se 1 mL da

solução de ConA desativada (2200 µg.mL-1), alcançando, dessa forma,

uma concentração final no interior da célula de 200 µg.mL-1 de ConA em

NaCl 0,15 M;

7. Agita-se por 1 minuto a solução no interior da célula, com a mesma

micropipeta utilizada na adição da ConA. Em seguida, o sistema é mantido

em repouso por 30 minutos;

8. Após o tempo de repouso, a solução do interior da célula é retirada e

descartada, com auxílio de uma seringa. Efetua-se novamente a lavagem e,

em seguida, a célula é preenchida com 10 mL da solução de NaCl 0,15 M;


ouro/ConA/NaCl 0,15 M, com potencial de circuito aberto;

10. Após a medida de impedância da interface ouro/ConA/NaCl, adiciona-se 1

mL da solução de glicogênio (1320 µg.mL-1), atingindo, dessa forma, uma

concentração final no interior da célula de 120 µg.mL-1 de glicogênio em

NaCl 0,15 M;

11. Agita-se por 1 minuto a solução no interior da célula, com a mesma

micropipeta utilizada na adição do glicogênio. Em seguida, o sistema é

mantido em repouso por 30 minutos;

12. Repete-se o item 8;


ouro/ConA/glicogênio/NaCl 0,15 M, com potencial de circuito aberto.



O protocolo foi repetido, porém, com a aplicação de um potencial fixo durante

os 30 minutos de repouso do sistema, após a adição da ConA ativada e desativada na

célula EIS-SPR. O procedimento também foi testado com a utilização da galactose em

substituição ao glicogênio, com o intuito de verificar a especificidade e seletividade da

Concanavalina A em ambas as formas. Para cada interface (ouro/NaCl;

ouro/ConA/NaCl; ouro/ConA/glicogênio/NaCl, ouro/ConA/galactose/NaCl), foram

aplicados potenciais na faixa de -100 mV à 400 mV vs. Ag/AgCl, KCl saturado em

intervalos de 50 mV, faixa esta determinada previamente por voltametria cíclica.

Figura 31: Célula EIS-SPR com os eletrodos fixados. Sistema utilizado na caracterização da adsorção da ConA e da reação ConA e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por EIS.



3.8 Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR)

Para a excitação dos plásmons de superfície nos eletrodos de filme fino de ouro,

foi utilizada a configuração de refletividade total atenuada (ATR), desenvolvida por

Kretschmann-Raether [132], que é normalmente usada na maior parte dos instrumentos

de SPR [133-143].

3.8.1 Sistema Óptico

A Figura 32 ilustra a montagem utilizada na investigação da Ressonância de

Plásmons de Superfície acoplado ao sistema eletroquímico (potenciostato) e, na Tabela

4 encontra-se uma descrição dos componentes ópticos utilizados.

Chopper

Osciloscópio

E2 Filtro

Polarizador

Íris

Lente Estágio de rotação

Fotodetector 1 (F1)

Lente

Espelho

Espelho

E1

Feixe E

E1

E3

Fotodetector 2 (F2)

Laser

Argônio

Potenciostato

Figura 32: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção de biomoléculas na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR.



Tabela 4: Relação dos componentes utilizados na montagem experimental do sistema óptico.

Componentes ópticos

Função e/ou descrição

Laser de diodo Utilizado como fonte de luz para a excitação dos plásmons superficiais no filme metálico; λ = 670 nm; potência de saída de 3,8 mW;

Polarizador Fixa o plano de vibração do vetor elétrico do feixe de luz no plano de incidência; Peça com 20 mm de diâmetro e giro de 360º.

Obturador eletromecânico

(chopper)

Tem a finalidade de alternar a passagem da radiação, gerando ondas quadradas e pulsadas do feixe luminoso; foi operado com uma freqüência fixa de 46 Hz.

Espelhos Utilizado para guiar a trajetória do laser até o prisma, por reflexão regular.

Filtro Utilizado para atenuar o feixe de luz, evitando a saturação dos fotodetectores. O filtro utilizado, NG4, atenua ∼30% do sinal.

Divisor de feixe Espelho parcialmente transmissivo utilizado para refletir uma amostra do feixe incidente para o fotodetector de referência (F1).

Fotodetector 1 (F1)

Utilizado para monitorar a intensidade de radiação laser de forma a eliminar efeitos decorrentes de flutuações.

Fotodetector 2 (F2)

Mede a intensidade do feixe de luz (E3) que é refletida pelo prisma.

Íris É um diafragma circular com abertura variável que impede a passagem de ruído espacial do feixe de luz.

Lentes Lente do tipo convergente com distância focal de 5 cm.

Estágio de rotação

Elemento de suporte da célula EIS-SPR, utilizado para ajustar o ângulo de incidência do feixe de luz em relação à direção normal da superfície do prisma.

Prisma Prisma BK7 (SCHOTT) na forma de um triângulo retângulo isóscele (45º, 45º, 90º) com cada face medindo (25 mm x 25mm x 35 mm). Utilizado para permitir o acoplamento do feixe de luz incidente com os plásmons superficiais.

Osciloscópio Filtra o sinal elétrico enviado pelos fotodetectores em sincronismo com o chopper. O valor absoluto da refletividade pode ser medido pela razão entre os sinais gerados nos fotodetectores.

Um laser de diodo (λ = 670 nm) com potência de 3,8 mW foi fixado ao suporte

ajustável, com translado na horizontal e vertical, possibilitando um fácil ajuste da

direção do feixe incidente (E). O polarizador definiu a direção de polarização paralela

ao plano de incidência. O feixe foi então modulado mecanicamente em uma freqüência

fixa de 46 Hz, com a utilização de um obturador eletromecânico (chopper) modelo

SR540 (Stanford Research Systems) e, em seguida, dividido em duas componentes E1 e



E2 através do divisor de feixe. O feixe E1 incide sobre o prisma fixado na célula EIS-

SPR que, por sua vez, está fixada a um suporte com translado X-Y-Z, montado em uma

base horizontal que pode girar nos sentidos horário e anti-horário, através de um

parafuso micrométrico (Figura 33a). Nessa configuração, o sistema opera com a face

superior do prisma posicionada horizontalmente, facilitando assim a inserção e

aspiração de soluções e sua desoxigenação com argônio, garantindo a ausência de

bolhas de ar no interior da célula. Dois fotodetectores de silício, F1 e F2, foram

utilizados para medir as potências ópticas dos feixes E2 e E3. Os sinais gerados pelos

fotodetectores foram coletados pelo osciloscópio modelo 54601da HP (Hewlett

Packard), a partir do qual obtêm-se os dados necessários para a caracterização de

plásmons superficiais. A Figura 33b ilustra a visão do sistema óptico montado.

Antes do início das análises experimentais os componentes ópticos foram limpos

com uma gaze embebida em álcool iso-propílico, sem excesso, para remover mancha

e/ou poeira eventualmente grudadas.

a) b)

Figura 33: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção da ConA e da reação ConA e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR. a) foto do suporte ajustável com a célula EIS-SPR fixada; b) foto do sistema óptico completo.



3.8.2 SPR Aplicada na Caracterização da Adsorção de Biomoléculas

O procedimento experimental para realização de medidas de SPR das interfaces

ouro/ar, ouro/NaCl, ouro/ConA/NaCl e ouro/ConA/glicogênio/NaCl foi iniciado com a

criação de um protocolo sistemático visando estabelecer uma seqüência de etapas a

serem adotadas durante o experimento. Essas etapas incluíram a realização de medidas

de refletividade para definir as condições de operação do sistema, o processo de

imobilização das moléculas de concanavalina A ao filme de ouro, as concentrações das

soluções de glicogênio e galactose, o tempo de incubação em cada fase da reação, etc.

O protocolo adotado nos experimentos, que segue basicamente alguns passos do

protocolo do método de Imunoabsorção por Ligação Enzimática (ELISA – “Enzyme

Linked Immunosorbent Assay”), pode ser assim descrito:

Etapa 1: Curva de SPR da interface ouro/ar

1. Montagem e limpeza do aparato (componentes ópticos, célula, eletrodo de

filme fino, etc.);

2. O feixe foi ajustado para incidir a 90º com o filme de ouro;

3. Foi medida a curva de SPR, através de uma varredura da interface e

comparada com a curva teórica (ver apêndice A).

Etapa 2: Curva de SPR da interface ouro/NaCl 0,15 M

1. Lavagem da célula EIS-SPR com solução de NaCl 0,15 M. O processo é

repetido cinco vezes. Após a lavagem, a célula é preenchida com 10 mL da

mesma solução de NaCl;



2. Em seguida, o sistema de desoxigenação foi acoplado a célula, o qual

efetuou o borbulhamento com argônio ou nitrogênio durante 5 minutos,

mantendo-se a atmosfera inerte durante o restante do experimento;


comparada com a curva obtida da interface ouro/ar.

Etapa 3: Curva de SPR da interface ouro/ConA/NaCl 0,15 M

1. Após a varredura da interface ouro/NaCl, foi adicionado 1 mL da solução

de ConA desativada (2200 µg.mL-1), fornecendo, dessa forma, uma

concentração final no interior da célula de 200 µg.mL-1 de ConA em NaCl

0,15 M;

2. A solução no interior da célula foi agitada por 1 minuto, com a mesma

micropipeta utilizada na adição da ConA. Em seguida, o sistema foi


3. Após o tempo de repouso, a solução do interior da célula foi retirada e

descartada, com auxílio de uma seringa;

4. Foram repetidos os itens “1” e “2” da etapa 2, respectivamente;


comparada com a curva obtida da interface ouro/NaCl.

Etapa 4: Curva de SPR da interface ouro/ConA/glicogênio/NaCl 0,15 M

1. Após a varredura da interface ouro/ConA/NaCl, foi adicionado 1 mL da

solução de glicogênio (1320 µg.mL-1), atingindo, dessa forma, uma

concentração final no interior da célula de 120 µg.mL-1 de glicogênio em

NaCl 0,15 M;



2. A solução no interior da célula foi agitada por 1 minuto, com a mesma

micropipeta utilizada na adição do glicogênio. Em seguida, o sistema foi


3. Foi repetido o item “3” da etapa 3 e os itens “1” e “2” da etapa 2,

respectivamente;

4. A curva de SPR foi medida, através de uma varredura da interface e

comparada com a curva obtida da interface ouro/ConA/NaCl.

O protocolo descrito na seção 3.7.2 foi repetido, com a adição de 1 mL de

galactose (1320 µg.mL-1 ) em substituição ao glicogênio (etapa 4), com o intuito de

testar a especificidade e seletividade da Concanavalina A na forma desativada. O

protocolo foi também repetido para a proteína Concanavalina A na forma ativada e para

a Concanavalina A ativada junto ao glicogênio. Também foram verificadas as interfaces

ouro/glicogênio/NaCl e ouro/galactose/NaCl.

Cada medida de refletividade foi obtida da média de 3 amostras da razão entre

o sinal E3 e a referência E2. Para obter a curva de SPR, que corresponde à razão E3/E1,

antes de cada experimento, mediu-se a razão E1/E2, que é invariável,

independentemente de flutuações no nível de potência do laser. A partir dessa medida, a

refletividade (R) (relação entre a luz refletida e a luz incidente) da face hipotenusa do

prisma foi dada pela razão:

13

21

23

E

ER

EE

EE

=

= (3.1)



3.8.2.1 Evolução Temporal da Refletividade

Com a obtenção das curvas de ressonância das interfaces ouro/ar, ouro/NaCl,

ouro/Com A/NaCl, ouro/ConA/glicogênio/NaCl, ouro/ConA/galactose/NaCl, foi

possível criar um protocolo para observações em tempo real da reação Concanavalina A

(ativada e desativada) com o glicogênio, utilizando a Ressonância de Plásmons de

Superfície. Neste protocolo, o fotodetector permanece fixo no ângulo de plásmons

característico de cada interface, obtendo-se um gráfico da variação da refletividade (R)

versus tempo (h):

1. Montagem e limpeza do aparato (componentes ópticos, célula, eletrodo de

filme fino, etc.) e o feixe foi ajustado para incidir a 90º com o filme de

ouro;

2. Foram repetidos os itens “1” e “2” da etapa 2 da seção 3.7.2,

respectivamente;

3. Foi determinado o ângulo de máxima declividade (θp) para a interface

ouro/NaCl. Este ponto passa a ser tempo zero (h);

4. (FASE I) - Com o ângulo de incidência fixado no ponto de máxima

declividade para o sistema ouro/ConA desativada (determinado a partir da

execução do protocolo do item 3.7.2), foi adicionado a solução de ConA

desativada, alcançando uma concentração final de 200 µg. mL-1. Em

seguida, iniciou-se o processo de monitoramento da refletividade no ângulo

de plásmons da interface;

5. (FASE II) – Depois de atingido um regime permanente (sem variação), foi

iniciado novamente o processo de lavagem da célula (por cinco vezes),

usando-se a solução NaCl 0,15 M. Em seguida, a célula é novamente

preenchida com 10 mL dessa solução;



6. (FASE III) – Foi acrescentado à solução de glicogênio e continuado o

processo de monitoramento da refletividade em função do tempo;

7. (FASE IV) - Ao final da fase (momento em que a variação da refletividade

se estabilizou), repetiu-se o procedimento de lavagem e preenchimento da

célula com NaCl 0,15 M e continuado o processo de monitoramento até a

estabilização da refletividade.

O protocolo descrito foi repetido, com a utilização da galactose, em substituição

ao glicogênio, com o intuito de testar a especificidade e seletividade da Concanavalina

A na forma desativada. O protocolo foi também repetido para a proteína Concanavalina

A na forma ativada e para a Concanavalina A ativada junto ao glicogênio.

3.9 Eletroquímica Acoplada a SPR

Nas análises de caracterização da adsorção da Concanavalina A na superfície do

eletrodo de filme fino de ouro, sob efeito da aplicação de um potencial fixo, foi

utilizado o potenciostato modelo CV-27 da BAS (Bioanalytical Systems), acoplado ao

sistema óptico descrito anteriormente (Figura 14). Os eletrodos de referência (Ag/AgCl,

KCl sat), auxiliar (Pt) e o de trabalho (filme fino de ouro) foram inseridos

separadamente nos compartimentos da célula EIS-SPR, montada no sistema óptico e,

em seguida, conectados ao potenciostato. Foi realizada à desoxigenação da solução com

o uso de argônio, para eliminar tanto as bolhas no interior da célula, como também, o

oxigênio dissolvido na solução.



3.9.1 Técnicas Eletroquímicas Acopladas a SPR na Caracterização da Adsorção de

Biomoléculas

Foi analisado o comportamento da adsorção da Concanavalina A ativada e

desativada e de sua reação com glicogênio e galactose, em função do potencial aplicado,

através do sistema descrito na seção 3.8. O protocolo desenvolvido para este

experimento é similar ao protocolo descrito da seção 3.7.2, onde a única diferença é

que, após a adição da Concanavalina A na célula EIS-SPR, foi aplicado um potencial

fixo durante os 30 minutos de repouso do sistema.

O protocolo foi repetido para cada potencial aplicado em cada interface (ouro/

NaCl; ouro/ConA/NaCl; ouro/ConA/glicogênio/NaCl; ouro/ConA/galactose/NaCl).

Foram aplicados potenciais na faixa de -100 mV à +400 mV vs. Ag/AgCl, KCl

(saturado) a intervalos de 50 mV.

3.9.1.1 Estabilidade do sistema EIS-SPR

Foi verificada a estabilidade do sistema EIS-SPR, com base na variação do

ângulo de plásmons das interfaces: ouro/NaCl, ouro/ConA-desativada/glicogênio e

ouro/ConA-ativada/glicogênio. Foram realizadas, para cada interface, quatro medidas

diárias de SPR (iniciando às 08h e finalizando às 17h do mesmo dia, com intervalos,

entre as medidas, de 3 horas), durante sete dias consecutivos.

Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV


CAPÍTULO IV

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No estudo do processo de adsorção da Concanavalina A ativada e desativada e

de sua reação com glicogênio e galactose na superfície do eletrodo de filme fino de ouro

foram utilizadas duas técnicas: a Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) e a

Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR), como já mencionado. Inicialmente,

serão apresentados estudos sobre a atividade biológica da proteína e, em seguida, os de

limpeza da superfície do eletrodo, do processo de adsorção da Concanavalina A e de sua

reação com carboidratos. Por fim, será apresentado o estudo que verifica a estabilidade

do sistema EIS-SPR.

4.1 Caracterização da Concanavalina A

A Figura 34 ilustra o espectro de absorção da solução de Concanavalina A

ativada 200 µg. mL-1, após 24 horas e 7 dias do preparo da solução. Nesses resultados

observa-se que a região de comprimento de onda com aproximadamente 280 nm

corresponde à banda de absorção característica da proteína [28-30, 165]. Essa banda é

uma superposição de transições vibracionais com transições eletrônicas dos vários

cromóforos (grupos funcionais que contêm elétrons de valência com energias de

excitação baixas), presentes na proteína, como por exemplo, o grupo carbonila ⟩C=O,

que absorve luz visível no comprimento ~ 280 nm. A transição responsável por essa

absorção é a excitação eletrônica de um par isolado do átomo de oxigênio (um elétron

não-ligante, n) a um orbital vazio antiligante π* da ligação dupla C=O. Esta transição é

do tipo n→π* (n-pi estrela).



200 300 400 500 600 700 800 9000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abs

orbâ

ncia

λ (nm)

Figura 34: Espectro de absorção no UV-visível, numa região de 190 a 900 nm para a Concanavalina A ativada 200 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC, preparada após 24 horas (linha contínua) e 7 dias (linha pontilhada).

A região de comprimento de onda entre 305 e 900 nm corresponde à faixa em

que a Concanavalina A não apresenta absorção. Deste modo, no comprimento de onda

de 460 nm, não há influência da proteína no experimento de variação da absorção em

função do tempo, (Figura 35), da reação entre 1,5 mL da solução de ConA 200 µg. mL-1

ativada e 1,5 mL de glicogênio 120 µg. mL-1 (Figura 36).

a b c

Figura 35: Solução de Concanavalina A ativada 200 µg/mL (a) e glicogênio 60 µg/mL(b) em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC; (c) reação as soluções a e b.



0 2 4 6 8 10 12

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

Abs

orbâ

ncia

(46

0nm

)

Tempo (min) Figura 36: Solução de Concanavalina ativada 200 µg/mL e glicogênio 60 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC. Resultados da absorção no visível a um comprimento de onda de 460 nm, um dia após a confecção () e 7 dias após a confecção da solução (+).

A partir dos resultados da Figura 36, pode-se verificar um aumento da absorção

em ambas as soluções. Este aumento é resultado da turvação gerada pela reação entre a

proteína e o açúcar (Figura 35c), o que provoca uma maior perda de radiação devido à

reflexão e espalhamento de luz nas várias interfaces. Além disso, observa-se que a

proteína mantém sua atividade biológica por, no mínimo, uma semana, pois existe uma

sobreposição entre os resultados de um dia e de sete dias, após a confecção da solução.

Portanto, pode-se garantir que, no período de investigação do processo de adsorção, a

proteína manteve sua estrutura inalterada.

4.2 Caracterização topográfica do eletrodo de filme fino de ouro

Um conhecimento prévio da superfície do eletrodo é importante para a

determinação de grandezas, tal como a concentração de espécies adsorvidas no filme,

pois a corrente detectada pelo sensor, referente às análises de impedância eletroquímica,

é função da área efetiva exposta à solução. Portanto, a superfície do eletrodo de filme



fino foi caracterizada por Microscopia de Força Atômica (AFM), para que qualquer

alteração na corrente fosse provocada por uma alteração da espessura da camada

protéica adsorvida e não por alterações da área exposta à solução, como por exemplo,

alta rugosidade no filme.

A micrografia em 3D da superfície da área de 1 µm2 do filme fino de ouro

(Figura 37), obtida por AFM com resolução de 512 x 512 pixels , revelou alto grau de

limpeza do filme, baixa rugosidade e boa continuidade, devido principalmente à

presença de pequena quantidade de protusões (hillocks) na sua superfície e pela grande

área dessas protusões, o que reduz a rugosidade do mesmo.

Figura 37: Imagem topográfica em 3D obtida por AFM do filme fino de ouro (50 nm) depositado em substrato de vidro comum.

4.3 Caracterização eletroquímica e SPR do eletrólito de suporte

4.3.1 Técnicas eletroquímicas

O estudo eletroquímico da solução de NaCl 0,15 M foi realizado com o objetivo

de verificar a presença de espécies eletroativas na solução e a influência da aplicação do

potencial. A princípio, este estudo foi efetuado no eletrodo de filme fino de ouro através

da técnica de voltametria cíclica. No voltamograma cíclico, gerado no intervalo de

varredura de – 0,3 V a 0,7 V vs Ag/AgCl saturado (Figura 38), foi possível verificar que



entre os potenciais 0,0 V a -0,2 V ocorre a redução de oxigênio dissolvido na solução,

caracterizada pela formação do pico de redução. Além desta análise, entre os potenciais

de ~ 0,6 V a 0,1 V, não se observam picos de correntes que indiquem a ausência de

possíveis contaminantes, tanto na solução como na superfície do filme.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

-3,0x10-6

-2,5x10-6

-2,0x10-6

-1,5x10-6

-1,0x10-6

-5,0x10-7

0,0

5,0x10-7

1,0x10-6

1,5x10-6

2,0x10-6

I (A

)

E (V) vs. Ag/AgCl, KCl saturado

Figura 38: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em solução de NaCl 0,15M, v = 50 mV s-1, 25° C.

Com o intuito de verificar adicionalmente a limpeza da superfície do filme, um

típico voltamograma cíclico foi obtido para o eletrodo de ouro em ácido sulfúrico 0,1 M

(Figura 39). O voltamograma gerado no intervalo de varredura de -0,2 V a 1,5 V vs.

Ag/AgCl saturado apresenta um pico (A1) referente à primeira transferência de elétrons

do processo de formação de uma monocamada de óxido [168, 169]. A formação do

óxido prossegue em duas etapas, cada uma relacionada à transferência de um elétron

(Equação 4.1). O segundo pico, A2, é referente à transferência do segundo elétron.



Au + nH2O Au(OH)n + nH+ + ne- (4.1a)

Au(OH)n AuO + nH+ + ne- (4.1b)

Au + nH2O AuO + nH+ + ne- (4.1c)

A1

A2

B1 B2

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

-1,0x10-3

-5,0x10-4

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

I (A

)

E (V) vs. Ag/AgCl, KCl saturado

Figura 39: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em H2SO4 0,1M, velocidade de varredura de 50 mV s-1, 25° C.

A redução da camada de óxido foi caracterizada pelos picos B1 e B2,

relacionados à transferência de dois elétrons, convertendo a camada de óxido em ouro

metálico. A região desses picos é de 0,7 a 1,0 V, onde se observa uma concordância

entre este intervalo e o da literatura [168]. Em função dos resultados apresentados até o

momento, pode-se descartar a presença de qualquer impureza no sistema eletroquímico

estudado.



A Figura 40 apresenta os resultados da EIS para o eletrodo de filme fino de ouro

em NaCl 0,15 M, na forma de gráfico de Nyquist, que ilustra os valores da parte real da

impedância, Zre, no eixo x e os valores da parte imaginária, Zim, no eixo y. Este

resultado irá servir para comparação com os dados obtidos no processo de adsorção da

Concanavalina A. Pode-se observar, ainda na Figura 40, a existência de uma pequena

curvatura, estendida por toda a região de trabalho, que representa o indício da formação

de um semicírculo e está além da região de investigação. Como já foi visto no Capítulo

II, a formação de tais semicírculos nos gráficos de Nyquist está associada à presença de

componentes resistivos e capacitivos na interface [124-126]. Deste modo, esta curvatura

associa-se à existência de um componente de alta resistência. O valor do potencial de

circuito aberto (ECA) registrado para este experimento pelo equipamento foi de -0,143

V.

0,0 5,0x103 1,0x104 1,5x104 2,0x104 2,5x104 3,0x104 3,5x104 4,0x104

0,0

5,0x103

1,0x104

1,5x104

2,0x104

2,5x104

Z im

(oh

m)

Z re (ohm)

Figura 40: Gráfico de Nyquist, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.

A Figura 41 apresenta o gráfico do ângulo de fase, φ, em função da freqüência e

o gráfico de admitância. Como visto também no Capítulo II, o gráfico de Bode é uma

outra maneira para apresentação dos mesmos dados da Figura 40. As vantagens desta

forma de apresentação residem no fato do ângulo de fase não depender da área do

eletrodo, como ocorre com os valores no gráfico de Nyquist e que através deste gráfico

pode-se estudar a contribuição de cada componente da interface, como as alterações na



capacitância da dupla camada, que são visualizadas a partir das variações do ângulo de

fase, de maneira mais clara. Já os gráficos de admitância Y auxiliam na interpretação

dos gráficos de impedância, pois podem ser especialmente úteis na análise de circuitos

paralelos, visto que admitâncias para elementos em paralelo podem ser somadas

diretamente, ou seja, da mesma maneira que as impedâncias para elementos em série e

vice–versa [126, 128].

Observa-se no gráfico de Bode (Figura 41a) que na região de baixa freqüência o

ângulo de fase se aproxima de 90°, logo ele possui um caráter capacitivo e, nas regiões

de alta freqüência o ângulo se aproxima de 0°, semelhante a um resistor.

Portanto, verifica-se que os gráficos que melhor permitem uma possível análise

são os gráficos de Bode e admitância. Portanto, os próximos resultados de EIS serão

apresentados sob a forma do gráfico de Bode e/ou admitância.

101 102 103

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

φ (

grau

s)

f (Hz)0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yim

(S)

Yre (S)

(a) (b)

Figura 41: (a) Gráfico de Bode e de (b) admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.

Foram realizados experimentos de impedância para averiguar se os açúcares

utilizados no processo de especificidade e seletividade da ConA adsorvida também

interagiam com a superfície do filme. Na Figura 42, pode-se observar uma diminuição

sutil no valor da admitância real (Yre) para as interfaces Au/galactose e Au/glicogênio,

em relação à interface controle Au/NaCl 0,15 M. As diminuições do valor de Yre para



estas interfaces estão relacionadas ao aumento da impedância do sistema. Deste modo, a

presença dos açúcares promove apenas um pequeno aumento na resistência dos

sistemas, não apresentando, portanto, interações fortes com a superfície do ouro. Este

resultado era esperado, pois os açúcares utilizados não possuem grupos funcionais que

apresentem especificidade para interagir com a superfície do substrato. Os valores do

potencial de circuito aberto registrados para as interfaces Au/galactose e Au/glicogênio

foram -0,162 V e –0,154 V, respectivamente.

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yim

(S)

Yre (S)

Figura 42: Gráfico de admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.

Os resultados apresentados na Figura 43 confirmam que os açúcares

praticamente não adsorveram na superfície do filme, pois, observa-se que o ângulo de

fase não sofreu grande alteração, comparando-se os três sistemas entre si.



101 102 103 100

10

20

30

40

50

60

70

80

90

φ (

grau

s)

f (Hz)

Figura 43: Gráfico de Bode, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.

4.3.2 Resultados utilizando a técnica de SPR

A técnica de Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR), fornece informações

que dependem da natureza do feixe incidente, bem como das propriedades ópticas do

meio em questão. Neste contexto, com o sistema óptico descrito anteriormente na seção

3.8.1, foram realizadas medidas de refletividade tanto para verificar a limpeza do

eletrodo de filme fino de ouro, como para caracterizar o eletrólito suporte e,

conseqüentemente, definir as condições de operação do sistema EIS-SPR. Contudo,

deve-se levar em consideração que as constantes ópticas (como por exemplo, índice de

refração e/ou permissividade elétrica) não podem ser identificadas diretamente no

gráfico. Para tal fim, conta-se com análises matemáticas complexas para a obtenção de

dados qualitativos e quantitativos, a partir das características estruturais das curvas de

refletividade obtidas [78, 79, 108, 132].

Inicialmente, a Figura 44 ilustra o ajuste de curvas teórica e experimental,

usando as Equações (2.75) (2.76) (2.77) (3.1) e os resultados experimentais para a

interface Au/ar (célula vazia). Os parâmetros obtidos desse ajuste para o sistema

experimental estão listados na Tabela 5. Na Figura 44, foi destacado o ângulo crítico

(θC) a partir do qual ocorre a reflexão interna total, o ângulo de ressonância θPS, para o



qual ocorre o mínimo de refletividade e a largura de linha a meia altura ∆θPS. Pode-se

observar (Figura 44) que os resultados obtidos experimentalmente para θPS (44,2 ±

0,01º) e ∆θPS (1,9°) estão de acordo com os valores previstos teoricamente para θPS

(44,2º) e ∆θPS (1,7°).

Na Tabela 6, pode-se observar que os valores medidos das constantes ópticas do

eletrodo de filme fino de ouro são muito próximos daqueles obtidos em filmes de boa

qualidade com permissividade ε = -10,333 – j1,685 [170]. Esses dados, em conjunto

com os valores dos ângulos de plásmons obtidos (Figura 44), refletem a boa qualidade

do filme e precisão do aparato experimental, pois a curva característica da refletividade

é fortemente influenciada pelos parâmetros típicos da estrutura do filme metálico, como

por exemplo, a espessura do filme, a rugosidade da superfície metálica, as constantes

ópticas dos meios envolvidos, etc. Modificações nesses parâmetros (o índice de

refração, por exemplo) podem afetar a posição de ressonância, a largura da curva e o

valor mínimo da refletividade.

θPS (graus)

Ref

letiv

idad

e

37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

0.2

0.4

0.6

0.8

@ DθC

θPS

∆θPS

Figura 44: Curvas teórica (linha contínua) e experimental (pontilhada) da refletividade na interface Au/ar, com n(ar) = 1, ε (Au) = -10,333-j1,685 e d(Au) = 50nm e λ = 670 nm.



Tabela 5: Resultados experimentais obtidos com ajuste de curva teórica/experimental para a interface Au/ar.

λλλλ (nm) n(prisma) εεεε´ εεεε´´ d(nm)

670 1,516 -10,164 -1,735 50

Para a interface Au/NaCl 0,15 M (Figura 45), pode-se observar que houve um

deslocamento do ângulo de ressonância θPS (72,7°), quando comparado com o da

interface Au/ar (44,2°) (Figura 44). Ao adicionar os açúcares ao sistema,

individualmente, praticamente não houve grandes alterações do ângulo de plásmons e

da largura angular (média entre os pontos de meia altura da curva) em relação à

interface Au/NaCl (Tabela 6). É importante notar que a largura da linha de ressonância

aumenta com a absorção do campo incidente pelos plásmons superficiais, que é

provocada pelo aumento da permissividade elétrica do meio em contato com o eletrodo

metálico [171]. Portanto, confirmando os resultados obtidos por impedância

eletroquímica, a galactose e o glicogênio praticamente não adsorveram na superfície do

eletrodo de filme fino de ouro. Essa informação será útil na análise do processo de

adsorção da ConA, pois desta forma pode-se concluir que grandes alterações nas

medidas eletroquímicas e/ou ópticas serão ocasionadas somente pela adsorção da

proteína ao filme.

68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ref

letiv

idad

e

θPS

(graus) Figura 45: Refletividade. () É o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. d(Au) = 50nm e λ = 670 nm (laser). Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.



Tabela 6: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 45.

Interface Intensidade (u.a) Largura angular (°) Ângulo de plásmons (°)b

Au/NaCla 0,040 2,90 72,70 ± 0,01

Au/galactose/NaCla 0,051 3,10 72,81 ± 0,01

Au/glicogênio/NaCla 0,050 3,02 72,75 ± 0,01 a Média de três experimentos

b Intervalo de confiança de 95 %.

Assim, a técnica de SPR constitui de fato uma ferramenta extremamente

importante na caracterização óptica e estrutural envolvendo filmes metálicos. Portanto,

a partir desses resultados, foi possível utilizar o sistema SPR para observações do

processo de adsorção da Concanavalina A e de sua interação com carboidratos.

4.4 Caracterização da adsorção da Concanavalina A

4.4.1 Resultados de impedâncias

A modificação da superfície do eletrodo de filme fino de ouro foi detectada pela

Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e Ressonância de Plásmons de Superfície

(seção 4.4.2). Foram realizadas diversas medidas de acordo com o procedimento

descrito na seção 3.7.1 do Capítulo III. Deve ser destacado que, embora a etapa de

adsorção de proteína tenha sido realizada em diferentes potenciais, as medidas de

impedância foram realizadas em um potencial aplicado igual ao potencial de circuito

aberto (ECA).

Para uma análise mais quantitativa dos resultados experimentais foram propostos

vários circuitos equivalentes. O circuito apresentado na Figura 46 apresentou melhor

ajuste com os resultados experimentais. Este modelo considera a resistência da solução,

RΩ, em série com a interface, constituída de um elemento de fase constante CPE em



paralelo com uma resistência de transferência de elétrons, Rct. A impedância ZCPE (F.

cm-2. sn-1) é definida na Equação (4.2), onde ω é a freqüência (rad/s), Q (µF.cm-2) é

uma constante que reflete simultaneamente as propriedades das superfícies e das

espécies eletroativas e é diretamente proporcional a capacitância. O caráter de ZCPE

depende dos valores do expoente n [71], que se encontram no intervalo de -1 a 1,

apresentando um caráter capacitivo para n=1, resistivo para n=0, indutivo para n=-1 e é

a impedância de Warburg para n=1/2. Este parâmetro pode ser facilmente extraído

através da inclinação dos dados do gráfico de log(|Z|) versus o log(f) [71].

( )nCPEQ

-

ω=

jZ (4.2)

RΩ

Rct

CPE

Figura 46: Circuito equivalente à interface eletrodo/proteína/solução.

Para ilustrar a qualidade do ajuste obtido com o circuito acima (Figura 46), são

apresentados os resultados para as interfaces Au/NaCl, Au/ConA-desativada/NaCl e

Au/ConA-ativada/NaCl na Figura 47. Observa-se que a utilização do modelo possibilitou

um ótimo ajuste para todas as interfaces estudadas, com exceção da região de alta

freqüência. No entanto, isto não afeta a análise dos resultados, uma vez que esta região

não traz informações sobre a presença da proteína adsorvida.



101 102 1030

10

20

30

40

50

60

70

80

90

f (Hz)

φ (

grau

s)

Figura 47: Ajuste utilizando o modelo apresentado na Figura 48, sendo () a interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl, () interface Au/ConA-ativada/NaCl e (____) são os ajustes, nas respectivas cores das interfaces. Experimento realizado em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C e pH 5,5. Gráfico registrado na região de 9 a 3000 Hz para uma melhor visualização.

A adsorção da proteína, em ambas configurações, também foi avaliada em

função do potencial aplicado durante o processo de adsorção, com o intuito de averiguar

o potencial no qual a proteína apresenta uma melhor adsorção (Figura 48). Para cada

interface estudada, foram aplicados potenciais na faixa de -100 mV à 400 mV vs.

Ag/AgCl, KCl sat. a intervalos de 50 mV, determinada em função dos resultados

obtidos por voltametria cíclica (seção 4.3.1).

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yre (S)

Yim

(S)

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yre (S)

Yim

(S)

(a) (b)

Figura 48: Gráficos de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl, (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.



Os gráficos de admitâncias apresentados na Figura 48 evidenciam que houve

mudanças significativas ao variar o potencial no processo de adsorção da Concanavalina

A, em ambas configurações. Observa-se na Figura 48b uma interface com a proteína

ativada, em que os potenciais –0,10 e -0,05 V comportam-se de maneira muito diferente

dos demais, provavelmente devido a algum erro durante a execução, logo, esses

potenciais negativos serão desprezados na análise desse gráfico. Pode-se observar que a

interface Au/ConA-desativada/NaCl, em todos os potenciais apresentou valores de

admitância menores quando comparado com o sistema Au/ConA-ativada/NaCl, com

exceção dos potenciais +0,20 e +0,35V.

Através dos gráficos de Bode (Figuras 49), não é possível distinguir facilmente o

comportamento da proteína em diferentes potenciais, mas apenas que a proteína, na

forma ativada, sofre um aumento mais rápido no ângulo de fase na região de alta

freqüência, porém, apresenta um φ menor, quando comparada com a proteína

desativada. Este aumento mais intenso na região de alta freqüência e um menor valor do

ângulo de fase, podem ser relacionados a uma menor resistência (Rct) e capacitância (Q)

apresentada pela interface.

A Figura 50 apresenta os parâmetros extraídos do ajuste com o modelo de

circuito equivalente.

101 102 103 104

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

f (Hz)

φ (

grau

s)

101 102 103 104

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

φ (g

raus

)

f (Hz)

(a) (b)

Figura 49: Gráficos de Bode, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.



-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,46,0x104

9,0x104

1,2x105

1,5x105

1,8x105

6,6x106

6,6x106

6,7x106R

ct (

ohm

s)

E (V)

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,43,0x10-7

6,0x10-7

9,0x10-7

1,2x10-6

1,5x10-6

1,8x10-6

2,1x10-6

Q (

µF.c

m-2

)

E (V)

(a) (b)

Figura 50: Parâmetros (a) Rct e (b) Q, versus potencial (E) aplicado durante a etapa de adsorção, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.

Os valores de Rct (Figura 50a) extraídos permitem avaliar o efeito do potencial

aplicado durante a etapa de adsorção, sobre os resultados de impedância. Uma análise

geral desse gráfico indica que os valores obtidos para Rct da interface Au/ConA-

desativada/NaCl foram maiores em todos os potenciais aplicados, quando comparados

aos valores de Rct da proteína ativada, inclusive nos potenciais +0,20 e +0,35 V, em que

não foi possível ser observado essa tendência no gráfico de admitância da Figura 49.

Portanto, torna-se claro a necessidade do ajuste com base em um circuito equivalente na

interpretação dos resultados. Pode-se observar também que ambas interfaces apresentam

um comportamento com dois máximos. Um na região de –0,10 a +0,15 V e outro na

região de +0,25 a +0,35 V. O segundo máximo é sutil para a proteína ativada e bastante

acentuado para a proteína desativada. Os valores de Q (Figura 50b) oscilam bastante e

não apresentam uma tendência clara. Uma vez que o valor de Rct pode ser associado à

adsorção da proteína, pode-se dizer que a tendência de adsorção é maior para potenciais

mais positivos, o que sugere a presença de cargas negativas na proteína, nas áreas de

interação com a superfície do eletrodo de filme fino de ouro.

Como já mencionado anteriormente, as medidas de impedância em que foram

aplicados potenciais, durante a adsorção da proteína ao eletrodo, foram realizadas em

um potencial aplicado igual ao potencial de circuito aberto. Portanto, de maneira



análoga pode-se tentar estabelecer uma correlação do ECA obtido durante a medida de

impedância. A Figura 51 apresenta o gráfico de admitância para o filme de ouro limpo e

para o filme modificado com a Concanavalina A nas configurações desativada e

ativada. As curvas para as interfaces Au/ConA-desativada/NaCl e Au/ConA-

ativada/NaCl apresentam um valor menor de Yre e Yim, quando comparadas com a

interface Au/NaCl. Ao avaliar este comportamento, é possível inferir que tanto Yim

(componentes capacitivos) como Yre (componentes resistivos) dos sistemas foram

mudados, sendo esta mudança observada com mais intensidade para a interface com a

Concanavalina A na configuração desativada, lembrando-se que um decréscimo nos

valores de Yre e Yim significa um aumento da resistência e diminuição da capacitância,

respectivamente.

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yre (S)

Yim

(S)

Figura 51: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-desativada/NaCl e () Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.

A Figura 52 ilustra os parâmetros Rct, Q e n, em função do potencial de circuito aberto aplicado durante a medida de impedância apresentada na Figura 51.



-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,086,0x104

9,0x104

1,2x105

1,5x105

1,8x105

6,6x106

6,6x106

6,7x106

Rct (

ohm

s)

ECA (V)-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,08

3,0x10-7

6,0x10-7

9,0x10-7

1,2x10-6

1,5x10-6

1,8x10-6

2,1x10-6

Q (

µF.c

m-2

)

ECA (V)

(a) (b)

-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,088,1x10-1

8,4x10-1

8,7x10-1

9,0x10-1

9,3x10-1

9,6x10-1

n

ECA (V)

(c)

Figura 52: Parâmetros (a) Rct, (b) Q e (c) n, versus potencial de circuito aberto (ECA) aplicado durante a medida de impedância, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.

Na análise dos resultados da Figura 52a, nota-se-se que os valores de Rct para a

interface Au/ConA-ativada/NaCl, apresentam uma tendencia de queda a medida em que

os potencias tornam-se mais positivos. Como a proteína na configuração ativada possui

cátions metálicos divalentes (Mn2+, Ca2+ e Mg2+) ligados aos seus aminoácidos, ela deve

apresentar uma carga mais positiva, quando comparada com a sua configuração

desativada. Portanto, o potencial de circuito aberto assumido pelo sistema, quando

ocorre a maior adsorção da proteína (maiores valores de Rct), é mais negativo, o que é

justificado pela carga mais positiva na proteína ativada. As interfaces Au/NaCl e

Au/ConA-desativada/NaCl, não apresentam uma tendência clara, contudo, observa-se

um agrupamento dos seus valores de Rct em ECA mais positivos Nota-se que a ConA



desativada assumiu um intervalo de potencial de circuito aberto menor e mais positivo

em relação a sua configuração ativada. Isto reforça as diferenças de cargas entre as duas

formas de proteína, já que a proteína desativada deve apresentar cargas mais negativas

em relação à proteína ativada. Além disso, verifica-se que a interface ConA desativada

apresentou valores de Rct maiores, em seus ECA, quando comparada a proteína ativada.

Este fato pode ser relacionado a uma maior dificuldade na transferência de elétrons na

interface, causada pela presença da proteína, sendo este bloqueio maior para a

Concanavalina A desativada do que em sua configuração ativada. Comportamento

semelhante foi observado para adsorção de Concanavalina A em eletrodo de platina

[70]. O bloqueio da interface é atribuído à quantidade de proteína adsorvida.

Ambas as configurações da proteína apresentam Q e n (Figuras 52b e 52c)

crescente com o potencial da interface estabelecido. O mesmo comportamento é

observado para interface Au/NaCl 0,15 M. Contudo, no caso da solução salina, o ânion

Cl- é quem deve adsorver. Isso ocorre porque os ânions são fracamente solvatados pelas

moléculas de H2O, devido aos seus raios maiores, quando comparados com os cátions

(quanto menor o raio ou a valência do íon, mais positiva será a energia de solvatação -

∆Gi-sΦ). Conseqüentemente, o ânion consegue chegar mais próximo do eletrodo e perder

a sua camada de solvatação para interagir diretamente com a superfície do eletrodo, ou

seja, adsorvendo. Portanto, pode-se concluir a existência de cargas negativas na proteína

e uma dupla camada mais compacta com potenciais mais positivos. Deste modo, a

presença da ConA, independente da forma, promove uma dispersão heterogênea na

capacitância [71].

A dispersão pode estar relacionada com a natureza do eletrodo e/ou a

distribuição de tempos de relaxação, quando não há homogeneidade da interface [68]. O

tempo de relaxação depende da cinética do deslocamento das cargas que estabelecem a

polarização do meio, logo, a relaxação provoca no meio uma queda da polarização

induzida, isto é, reduz o deslocamento da carga positiva em relação à carga negativa no

dielétrico. Portanto, com base nessa dispersão, a análise dos dados foi realizada em

função do elemento de fase constante CPE (Equação 4.2), que representa estes

fenômenos físico-químicos [68, 71], além de substituir a capacitância da dupla camada.




Com o intuito de verificar os resultados obtidos pela EIS, foram realizadas

análises utilizando-se a técnica de Ressonância de Plásmons de Superfície, acoplada ou

não ao sistema eletroquímico, como caracterização.

4.4.2.1 Análise em potencial de circuito aberto

De acordo com a Figura 53, a adsorção da Concanavalina A, em ambas as

formas e em ECA, também pôde ser detectada por SPR. Pode-se observar claramente o

deslocamento dos picos de absorção (θPS), no sentido positivo, ao se adicionar a

proteína ao sistema Au/NaCl. Como já discutido anteriormente, o deslocamento do

ângulo de plásmons está relacionado à mudança da permissividade elétrica e do índice

de refração do meio adjacente ao filme. Conseqüentemente, o crescimento no valor do

θPS nas interfaces com a proteína está relacionado com o aumento do índice de refração

do meio adjacente, que deixou de ser a solução salina (n=1,332) para ser a proteína

(n=1,5) [171].

68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ref

letiv

idad

e

θPS

(graus)

Figura 53: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5.



A Tabela 8 fornece os valores experimentais obtidos das curvas de SPR da

Figura 53. Pode-se examinar que houve um aumento sutil no θPS para a interface ConA

desativada, em relação a ConA ativada. Mas, como a diferença é pequena, não se pode

afirmar, somente com este parâmetro, que a Concanavalina A desativada adsorveu mais

que a ConA ativada. Contudo, analisando os dados do θPS em conjunto com a largura

angular dos picos de absorção e com os resultados obtidos pela EIS, pode-se afirmar

com mais clareza que a Concanavalina A desativada adsorveu mais prontamente que a

ConA ativada, em potencial de circuito aberto.


Interface Intensidade (u.a)

Largura angular (°)

Ângulo de plásmons (°)b

Au/NaCla 0,040 2,90 72,70 ± 0,01

Au/ConA-desativada/NaCla

0,035 3,46 74,30 ± 0,02

Au/ConA-ativada/NaCla 0,047 3,40 74,10 ± 0,01 a Média de três experimentos

b Intervalo de confiança de 95 %.

Esses resultados confirmam que a ativação da proteína, pelos cátions metálicos,

torna-a mais ordenada estruturalmente que a configuração sem íons [36, 43, 111-113].

Portanto, a proteína ativada difere da desativada no sentido da orientação dos

aminoácidos em torno dos cátions. Com isto, pode-se afirmar que a proteína desativada

possui um maior número de grupos livres capazes de interagir com a superfície do

eletrodo de ouro [164]. E ainda, conforme citado em literatura [50-59], acredita-se que a

proteína esteja recobrindo toda a área do eletrodo. Portanto, quando a ConA se encontra

na forma desativada, há a formação de um maior número de camadas do que quando

ela está na forma ativada, isto se a adsorção ocorrer com a mesma orientação para as

duas condições.



4.4.2.2 Análise em diferentes potenciais

A análise do efeito da ativação da proteína ConA em diferentes potenciais é

exibida na Figura 54. Percebe-se nitidamente o crescimento do ângulo de plásmons a

medida em que o potencial torna-se mais positivo. Este resultado torna inteligível que a

proteína adsorve mais quando existe um grande contraste entre a carga da mesma e da

superfície. De maneira análoga, Schlereth e colaboradores [159], caracterizaram por

voltametria cíclica acoplada a SPR a obtenção de monocamadas de citocromo-c e

citocromo-c oxidase adsorvidas em superfícies modificadas de ouro. Neste trabalho, os

autores evidenciaram que as hemoproteínas adsorvem em maior quantidade em

potenciais mais positivos.

Similarmente, Moulton e colaboradores [68] verificaram que as proteínas

humanas, soro albumina (HSA) e imunoglobulina G (Ig.G) adsorvem mais facilmente

em superfícies de eletrodos de ouro, quando submetidas a potenciais mais positivos ou

em potenciais de circuito aberto. Os autores relacionaram o aumento da camada

adsorvida ao decréscimo da capacitância da dupla camada (Cd) e ao crescimento do

valor da resistência, à transferência de elétrons (Rct) determinados.

68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ref

letiv

idad

e

θPS

(graus)

68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ref

letiv

idad

e

θPS

(graus)

(a) (b)

Figura 54: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/NaCl e (b) interface Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.



O gráfico da Figura 55 apresenta o resumo do ângulo de plásmons em função do

potencial aplicado para as interfaces Au/NaCl, Au/ConA-desativada/NaCl e Au/ConA-

ativada/NaCl. Através deste gráfico, verifica-se com mais clareza a relação entre a carga

da proteína com o potencial aplicado. Percebe-se que, entre os potenciais mais negativos

(-0,10 a 0,05 V), a Concanavalina A ativada adsorve mais do que a configuração

desativada, ou seja, devido aos cátions metálicos em sua estrutura, a ConA ativada

apresenta uma carga mais positiva. Deste modo, verifica-se que a proteína na

configuração desativada, submetida a potenciais mais positivos, adsorve mais que na

forma ativada. Além disso, observa-se um aumento sutil do θPS para a interface que

contém somente a solução salina, confirmando uma pequena adsorção dos íons Cl-.

Essas observações confirmam a análise dos parâmetros extraídos do circuito

equivalente, ilustrados na Figura 52.

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,471

72

73

74

75

76

77

θ PS (

grau

s)

E (V) Figura 55: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5.

Quando comparados os resultados do θPS da ConA desativada com os valores

dos ângulos de plásmons da proteína na mesma forma, porém, submetida a potencial de

circuito aberto, verifica-se que o potencial que se aproxima do ângulo de plásmons

obtido em ECA (74,30°) corresponde, para a mesma interface, ao potencial +0,15 V.



Considerando que se pode estimar a carga do eletrodo através do potencial de

carga zero (PZC), onde o eletrodo terá a sua carga positiva quando for submetido a um

potencial acima do PZC; e, considerando para o eletrodo de ouro o PZC equivalente a

0,117 V vs Ag/AgCl, KCl sat. em uma solução de cloreto de sódio [172], a superfície do

eletrodo no potencial de +0,15 V encontrar-se-á com carga positiva, aumentando a

possibilidade da proteína, que possui carga negativa, de adsorver no filme de ouro.

4.5 Caracterização da interação entre a Concanavalina A adsorvida e açúcares

4.5.1 Resultados de Impedâncias


Um dos objetivos desta dissertação foi verificar se a Concanavalina A, em

ambas as configurações, quando adsorvida ao eletrodo, permanecia com a capacidade

de seletividade e especificidade, ou seja, com a capacidade de reconhecer carboidratos e

distinguí-los. Deste modo, verificou-se se a ConA adsorvida ao eletrodo interagia com

os açúcares glicogênio e galactose, recordando que a ConA não é específica a esse

último carboidrato.

O monitoramento da reação lectina-carboidrato através de um biosensor

impedimétrico se dá freqüentemente pelo acompanhamento do parâmetro capacitância.

Contudo, outros componentes impedimétricos também podem ser monitorados. No

processo de caracterização da interação entre a ConA adsorvida e açúcares, a resistência

e a capacitância foram os parâmetros que se mostraram mais eficientes.

Através do gráfico de admitância apresentado na Figura 56, verifica-se que a

interface Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl apresentou um Yre menor, quando

comparado com as demais interfaces, apresentando, dessa forma, uma maior resistência

à passagem de elétrons devido à presença da proteína na superfície do eletrodo. Nota-se

que a ConA ativada não interagiu com a galactose, pois o seu Yre foi maior que os das

interfaces Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl e Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e



que o seu valor foi próximo ao obtido na análise da seção 4.4.1. Além disso, percebe-se

que a ConA ativada interagiu mais com o glicogênio que a ConA desativada.

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yre (S)

Yim

(S)

Figura 56: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.

Para uma melhor quantificação dos resultados, foi realizado o ajuste, utilizando-

se o circuito ilustrado na Figura 48. Os respectivos ajustes para o sistema ConA ativada

e desativada interagindo com o glicogênio são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9: Parâmetros extraídos da modelagem de circuitos equivalentes dos resultados da interação entre a Concanavalina A adsorvida e açúcares por EIS.

Parâmetros Eletrodo sem proteínaa

Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCla

Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCla

RΩ (kΩ) 0,430 ± 0,032 0,513 ± 0,019 0,495 ± 0,070

Rct (kΩ) 92,291 ± 0,001 126,0 ± 25,030 117,655 ± 15,311

Q (µF.cm-2) 1,122 ± 0,084 0,851 ± 0,197 0,768 ± 0,064

n 0,934 ± 0,004 0,922 ± 0,013 0,938 ± 0,032 a Média de dois experimentos. Nota: intervalo de confiança de 95 %.



Na análise dos resultados da Tabela 9, observa-se que os valores de Rct das

interfaces Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl

aumentaram 28% e 37%, respectivamente, em relação ao valor de Rct do eletrodo limpo

(Au/NaCl). Este aumento reflete a maior dificuldade na transferência de elétrons na

interface, causada pela presença da proteína ligada ao açúcar, sendo este bloqueio maior

para a interface Au/ConA-ativada/glicogênio do que em sua configuração desativada. O

bloqueio da interface é atribuído à quantidade de glicogênio ligado a Concanavalina A

adsorvida ao eletrodo.

Além da variação de Rct, observa-se uma diminuição no valor de Q ao se passar

do sistema com proteína ativada/glicogênio para com proteína desativada/glicogênio.

Esses dados confirmam a análise do parâmetro Q da Figura 52b (seção 4.4.1), ou seja, a

presença dos cátions metálicos confere uma forma mais compacta à Concanavalina A na

configuração ativada, aumentando o número de interações entre a proteína ativada e o

carboidrato. Conseqüentemente, uma maior quantidade de glicogênio liga-se aos sítios

da proteína, localizados em uma depressão no topo da superfície de cada subunidade.

Também se pode observar uma diminuição no valor de n quando adicionado o

açúcar ao eletrodo com a proteína adsorvida, sendo a diminuição maior para o sistema

Au/ConA-ativada/glicogênio. Pode-se deduzir que, com a diminuição do valor de n, a

interface passa a ser menos capacitiva, indicando um aumento na resistência à

transferência de elétrons entre a solução e o eletrodo de ouro.

Esses resultados mostram que a ativação da proteína com os íons metálicos é de

fato importante para o reconhecimento dos carboidratos e que a Concanavalina A reteve

a sua capacidade de reconhecimento, mesmo após adsorvida ao eletrodo de filme de

ouro.


Os resultados da execução de ambas configurações da ConA, em diferentes

potenciais, frente a carboidratos, podem ser verificados pelo gráfico de admitância na

Figura 57. Observa-se uma maior variação dos valores de admitância para a interface



ConA-desativada/glicogênio/NaCl, quando comparada com a interface ConA-

ativada/glicogênio/NaCl, ao se variar o potencial. Nota-se que houve uma inversão ao

adicionar o glicogênio, em ambas interfaces, quando se comparam as Figuras 48 e 57,

pois, após a adição do glicogênio, a interface com a proteína ativada passou a variar

menos e a interface com a proteína desativada passou a ter uma maior variação. na

admitância.

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yim

(S)

Yre (S)

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3

0,0

5,0x10-4

1,0x10-3

1,5x10-3

2,0x10-3

2,5x10-3

Yre (S)

Yim

(S)

(a) (b)

Figura 57: Gráfico de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/Glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/Glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.

Na Figura 58, relaciona-se Rct com o potencial aplicado durante o processo de

adsorção da Concanavalina A no eletrodo de filme fino de ouro, seguida pela interação

com glicogênio. Uma análise geral indica que os valores obtidos para Rct da interface

Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl foram maiores em todos os potenciais aplicados,

quando comparados aos valores de Rct da proteína na configuração desativada,

comprovando que, em potenciais mais positivos, a Concanavalina A desativada adsorve

mais, porém, é a ConA ativada que reconhece de maneira mais eficaz o glicogênio.



Verifica-se também, uma redução nos valores de Rct da interface com a proteína

desativada, em potenciais mais positivos. Esta redução no valor de Rct pode ser

ocasionado por uma menor ordenação das camadas de ConA desativada adsorvidas, a

medida que o potencial torna-se mais positivo, o que dificultaria a interação com o

açúcar. Os valores de Q (Figura 58b) variam bastante e não apresentam uma tendência

clara.

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,46,0x104

9,0x104

1,2x105

1,5x105

1,8x105

2,1x105

2,4x105

2,7x105

E (V)

Rct (

ohm

s)

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,43,0x10-7

6,0x10-7

9,0x10-7

1,2x10-6

1,5x10-6

1,8x10-6

2,1x10-6

Q (

µF.c

m-2

)

E (V)

(a) (b)

Figura 58: Parâmetro Rct (a) e Q (b) versus potencial (E) aplicado, para as interfaces () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.



De acordo com os resultados da Ressonância de Plásmons de Superfície (Figura

59), o θPS para a interface Au/ConA-desativada/galactose/NaCl, foi de 74,20°, igual ao

obtido para a interface Au/ConA-ativada/galactose/NaCl. Portanto, ambas

configurações da ConA não interagiram com a galactose. O ângulo de plásmons para a

interface Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl foi de 75,52°, enquanto da interface



Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl foi igual a 75,92°. Logo, confirmando os resultados

obtidos por EIS, a interface com a proteína ativada interagiu mais eficazmente com o

glicogênio, em relação à proteína desativada. Portanto, a Concanavalina A adsorvida

manteve sua especificidade e seletividade frente a carboidratos. O resumo dos dados

experimentais é exibido na Tabela 10.

68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ref

letiv

idad

e

θPS (graus)

Figura 59: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para a interface () Au/ConA-desativada/galactose/NaCl, ()Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em ECA, a 25° C e pH 5,5.


Interface Intensidade (u.a)

Largura angular (°)

Ângulo de plásmons (°)b

Au/ConA-desativada/galactose/NaCla

0,06 3,30 74,20 ± 0,01

Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCla

0,07 4,05 75,52 ± 0,03

Au/ConA-ativada/galactose/NaCla 0,051 3,49 74,20 ± 0,01

Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCla

0,076 4,22 75,92 ± 0,02

a Média de três experimentos b Intervalo de confiança de 95 %.




Verificou-se na seção 4.4.2.2, que a proteína na configuração desativada adsorve

mais facilmente a superfície do eletrodo ao se variar o potencial para valores mais

positivos. Porém, a Figura 60 mostra que, ao se variar o potencial para valores mais

positivos, é a forma ativada que interage com o glicogênio mais eficazmente. A Figura

61 apresenta o resumo do ângulo de plásmons em função do potencial aplicado. A partir

deste gráfico, pode-se confirmar mais uma vez os dados obtidos pela EIS, ou seja, a

proteína na configuração ativada submetida a potenciais mais positivos, reconhece mais

facilmente o glicogênio do que a sua forma desativada.

68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ref

letiv

idad

e

θPS

(graus)68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ref

letiv

idad

e

θPS

(graus)

(a) (b)

Figura 60: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.



-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,471

72

73

74

75

76

77

78

θ PS (

grau

s)

E (V)

Figura 61: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para interface () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5.

4.6 Evolução temporal da refletividade

De posse das curvas de ressonância medidas para várias interfaces, foram

realizadas observações em tempo real da reação lectina-carboidrato, semelhante à

interação antígeno-anticorpo. O procedimento experimental para a realização de

medidas de SPR em meios biológicos inicia com a criação de um protocolo sistemático

visando determinar uma seqüência de 4 fases, que devem ser adotadas durante o

experimento em tempo real. A Fase 1 compreende a adição da ConA fornecendo uma

concentração final de 200 µg/mL; após atingido um regime permanente, inicia-se

novamente um processo de lavagem da célula (Fase 2). Na Fase 3, acrescenta-se o

glicogênio e continua-se com o processo de monitoramento da refletividade em função

do tempo. Finalmente, na Fase 4, repete-se o procedimento de lavagem da célula. Para

maiores detalhes ver a seção 3.8.2.1 do capítulo sobre materiais e método.



De acordo com a literatura [114-116, 142-149], a proteína desativada forma um

maior número de camadas na superfície do filme do que quando está na forma ativada.

Portanto, na Figura 62, a ConA na configuração ativada, por adsorver menos, ocasiona

uma menor variação da refletividade, pois não provoca grandes modificações nas

propriedades dielétricas do filme. A proteína desativada, por adsorver mais, provoca

maiores mudanças nas propriedades dielétricas do filme, acarretando uma maior

variação da refletividade. Porém, ao adicionar o glicogênio, a interface com a

Concanavalina A ativada adsorve mais que a interface com a ConA desativada, fato este

já discutido anteriormente.

0 20 40 60 80 100 120 140

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10Fase 4

Fase 3

Fase 2

Fase 1

Var

iaçã

o da

Ref

letiv

idad

e

Tempo (min)

Figura 62: Cinética da reação lectina-carboidrato para uma solução com concentração final de 200mg/mL. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5.



4.7 Estabilidade do Sistema EIS-SPR

Com base na variação do θPS, verificou-se a estabilidade do sistema EIS-SPR. A

Figura 63a mostra que a estabilidade de operação do sistema EIS-SPR foi de apenas três

dias, pois, a partir do quarto dia, iniciou-se uma variação do ângulo de plásmons em

todas as três interfaces. Porém, através do ângulo relativo em função do tempo, Figura

63b, foi possível verificar que a interface Au/NaCl é a que se manteve mais estável pelo

período de sete dias. A interface Au/ConA-ativada/Glicogênio foi a que sofreu maior

alteração no valor do ângulo de plásmons.

Percebe-se ainda que, a interface Au/NaCl é a única em que o seu ângulo de

plásmons foi crescente ao longo dos sete dias. Este fato pode estar relacionado com o

aumento da concentração de íons na solução, devido à evaporação da solução, e

conseqüentemente aumentando a adsorção de íons Cl- no eletrodo, que por sua vez

ocasiona o aumento do índice de refração, logo, aumenta o valor de θPS.

0 1 2 3 4 5 6 7 872

73

74

75

76

77

θ PS

(gr

aus)

Dia

0 1 2 3 4 5 6 7 897

98

99

100

101

102

103

Âng

ulo

rela

tivo

(%)

Dia

Figura 63: Estabilidade do sensor EIS-SPR. (a) variação do ângulo de plásmons em função do tempo e (b) ângulo relativo em função do tempo. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5.



Nas interfaces com a proteína adsorvida, verifica-se que o ângulo de plásmons

diminui em função do tempo. Este resultado indica que a proteína adsorvida e ligada ao

carboidrato deve sofrer algum tipo de desnaturação em função do tempo, devido a uma

possível modificação do pH e da força iônica da solução, lembrando que o pH é

responsável por controlar as repulsões laterais entre as proteínas e/ou provocar a

desnaturação das mesmas [54]. Com a evaporação significativa da solução no interior

da célula, conseqüentemente, a solução salina ficou mais concentrada. Sabe-se que os

sais desidratam as proteínas, atraindo as moléculas de água do meio, de modo a ficar

menos água disponível para as moléculas protéicas. Portanto, além da alteração do pH, a

força iônica da solução foi alterada. Logo, essas mudanças em conjunto contribuíram

para uma degradação da interface lectina/carboidrato.

Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo V


CAPÍTULO V

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

5.1 CONCLUSÕES

As técnicas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica juntamente com a

técnica de Ressonância de Plásmons de Superfície, aqui apresentadas, permitem a detecção

da presença de proteína na superfície do eletrodo de filme fino de ouro, além de diferenciar

as duas configurações da proteína Concanavalina A. A EIS detecta a proteína através da

variação da impedância do sistema, que possibilita uma distinção quanto à sua natureza de

bloqueio, possibilitando uma descrição mais detalhada da superfície. Um perfil de adsorção

pode ser obtido pela técnica de SPR através do monitoramento do ângulo de plásmons no

qual ocorre a ressonância, durante um processo de adsorção em função do tempo.

Desta forma, a aplicação conjunta da EIS e SPR constitui uma poderosa ferramenta

no estudo de um grande número de propriedades relacionadas aos processos interfaciais e

superficiais, de forma a implicar maior confiabilidade às investigações desses processos.

Essas técnicas apresentam-se promissoras para aplicação, tanto em configurações

individuais como de forma conjunta ou mesmo simultânea, in situ dos sistemas

investigados.

A reação lectina-carboidrato quando monitorada por um biosensor impedimétrico é

realizada, em geral, pela detecção da capacitância, contudo outros componentes

impedimétricos também podem ser usados, seja de forma separada ou em conjunto. Neste

trabalho, o parâmetro resistência foi o que melhor caracterizou a adsorção da ConA e sua

interação com carboidratos.

Através da EIS e SPR foi possível identificar uma maior adsorção da proteína na

forma desativada sobre a superfície do eletrodo de ouro e que, quando o glicogênio foi



exposto sobre a superfície com proteína desativada e ativada, percebeu-se que a proteína na

forma ativada era mais sensível ao glicogênio. Esses resultados mostram que a ativação da

proteína com os cátions metálicos são de fato importantes para o reconhecimento do

carboidrato. A proteína (em ambas as formas) reteve a sua capacidade de seletividade (não

reconheceu a galactose), mesmo adsorvida na superfície do eletrodo.

É importante ressaltar que o sucesso obtido nas análises se deve, em parte, a

excelente qualidade dos eletrodos de filmes finos de ouro confeccionados através da técnica

de evaporação por baixa pressão, visto que análises do filme por AFM, voltametria cíclica e

SPR produziram resultados satisfatoriamente concordantes.



5.1. PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos com os estudos impedimétricos e por SPR do sistema filme

fino de ouro/proteína trouxeram uma série de informações quanto a adsorção da

Concanavalina A. No entanto, em um próximo desenvolvimento dessa linha de pesquisa,

seria importante obter e confrontar alguns resultados utilizando-se outras técnicas. Por

exemplo, utilizar a Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM) e a Microscopia de Força

Atômica para obter a espessura da camada protéica adsorvida e também se a ativação altera

a conformação da proteína.

A adsorção da Concanavalina A foi observada em ouro, porém, também seria

importante verificar se esse comportamento é semelhante para o metal prata, já que é

possível obter espectros de SPR com filmes de prata, o que reduziria o custo de análise.

Verificar se a Concanavalina A quando adsorvida sobre o filme de ouro consegue

interagir com outros carboidratos, como por exemplo, glicose.

Finalmente, é importante que seja implementado um sistema de fluxo laminar de

reagentes na célula EIS-SPR e incorporado um sistema automático de varredura do prisma,

controlado por computador, de forma a permitir o monitoramento simultâneo de várias

reações. Tornando, dessa forma, as análises mais sensíveis, seletivas e principalmente mais

estáveis.

Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Referências


REFERÊNCIAS

[1] ANRAKU, Y.; TAKAHASHI, Y.; KITANO, H.; HAKARI, M. Recognition of sugars on surface-bound cap-shaped gold particles modified with a polymer brush. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 1 (2007) 61-68.

[2] MISLOVICOVA, D.; MASAROVA, J.; HOSTINOVA, E.; GASPERÍK, J.; GEMEINER, P. Modulation of biorecognition of glucoamylases with concanavalin A by glycosylation via recombinant expression. International Journal of Biological Macromolecules, 39 (2006) 286-290.

[3] CHOWDHURY, M. H.; MALYN, S. N.; ASLAN, K.; LAKOWICZ J. R.; GEDDES, C. D. First observation of surface plasmon-coupled chemiluminescence (SPCC). Chemical Physics Letters, 1-3 (2007) 114-118.

[4] ASLAN, K.; LAKOWICZ, J. R.; GEDDES, C. D. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensing approaches, visions and perspectives. Current Opinion in Chemical Biology, 9 (2005) 538-544.

[5] ASLAN, K.; GRYCZYNSKI, I.; MALICKA, J.; MATVEEVA, E.; LAKOWICZ, J. R.; GEDDES, C. D. Metal-enhanced fluorescence: an emerging tool in biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 16 (2005) 55-62.

[6] ZHANG, J.; GRYCZYNSKI, Z.; LAKOWICZ, J. R. First observation of surface plasmon-coupled electrochemiluminescence. Chemical Physics Letters, 393 (2004) 483-487.

[7] ASLAN, K.; LAKOWICZ, J. R.; GEDDES, C. D. Nanogold-plasmon-resonance-based glucose sensing. Analytical Biochemistry, 330 (2004) 145-155.

[8] ROGERS, D. J.; HORI, K. Marine alga lectins: new developments. Hidrobiologia, 260 (1993) 589-593.

[9] LANDSTEINER, K.; LEVINE, P. A new agglutinable factor differentiating individual human bloods. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine (New York), 24 (1907) 600–602.

[10] SUMNER, J. B.; HOWELL, S. F. Identification of hemagglutinin of jack bean with concanavalin A. Journal of Bacteriology, 32 (1936) 227–237.

[11] RENKONNEN, K. O. Studies on hemagglutinins present in seeds of some representatives of leguminoseae. Annales Medicinae Experimentalis et Biologiae Fenniae, 26 (1948) 66-72.

[12] BOYD, W. C.; REGUERA, R. M. Hemagglutinating substances for human cells in various plants. The Journal of Immunology, 62 (1949) 333-339.

[13] BOYD, W. C.; SHYLEIGH, E. Specific precipitating activity of plant agglutinins (lectins). Science, 119 (1954) 419.



[14] GOLDSTEIN, I. J.; HUGHES, R. C.; MONSIGNY, M.; OZAWA, T.; SHARON N. What should be called a lectin? Nature, 285 (1980) 66.

[15] PEUMANS, W. J.; DAMME, E. J. M. The role of lectins in plant defense. Histochemical Journal, 27 (1995) 71.

[16] CUMMINGS, R. D. Lectins as tools for glycoconjugate purification and characterization. In Glyco-science, status and perspectives. H. J. Gabius and S. Gabius, eds., (1997) 191-199.

[17] SHARON, N.; LIS, H. The structural basis for carbohydrate recognition by lectins. Advance Experimental Biology Medical, 491 (2001) 1-16.

[18] DAMME, E. J. M.; PEUMANS, W. J.; BARRE, A.; ROUGÉ, P. Plant Lectin: A composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles. Critical Reviews in Plant Sciences, 17 (1998) 575-692.

[19] MOREIRA, R. A.; MONTEIRO, A. C. O.; HORTA, A. C. G.; OLIVEIRA, J. T. A.; CAVADA, B. S. Isolation and characterization of Dioclea altissima var. Megacarpa seed lectin. Phytochemistry, 46 (1997) 139-144.

[20] MOREIRA, R. A.; CASTELO-Branco, C. C.; MONTEIRO, A. C. O.; TAVARES, R. O.; BELTRAMINI, L. M. Purification and partial characterization of a lectin from Artocarpus incisa L. seeds. Phytochemistry, 47 (1998) 1183-1188.

[21] MAKELA, D. Studies on hemagglutinins of Leguminous seeds. Annals of Medical and Experimental Biology Fenniae, 35 (1957) 1-156.

[22] LIS, H.; SHARON, N. Lectins: Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular recognition. Chemical Reviews, 98 (1998) 637-674.

[23] LIS, H.; SHARON, N. Lectins in higher plants. The Biochemistry of Plants, 6 (1981) 371-447.

[24] HEYWOOD, V. H. The leguminosae – a systematic purview, In: Chemotaxonomy of the Leguminosae. Harbone, J. B., Turner, B. L., eds., (1971) 1-29. Academic Press, London and New York.

[25] KENNEDY, J. F.; PALVA, P. M. G.; CORELLA, M. T. S.; CAVALCANTI, M. S. M.; COELHO, L. C. B. B. Lectins, versatile proteins of recognition: a review. Carbohydrate Polymers, Great Yarmouth, 26 (1995) 219-230.

[26] ALLEN, A. K.; NEUBERGER, A. The purification and properties of the lectin from Potato Tubers, a hydroxyproline-containing glycoprotein. The Biochemical Journal, 135 (1973) 307-314.

[27] MOREIRA, R. A.; AINOUZ, I. L.; OLIVEIRA, J. T. A.; CAVADA, B. S. Plant lectins, chemical and biological aspects. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 86 (suppl. II) (1991) 211-218.

[28] TAN, L.; XIE, Q.; YAO, S. Electrochemical piezoelectric quartz crystal impedance study on the interaction between concanavalin A and glycogen at Au electrodes. Bioelectrochemistry, 70 (2007) 348-355.

[29] PILLAI, B.; CHERNEY, M. M.; HIRAGA, K.; TAKADA, K.; KOHEI, O. K.; MICHAEL, J. N. G. Crystal structure of scytalidoglutamic peptidase with its first potent inhibitor provides



insights into substrate specificity and catalysis. Journal of Molecular Biology, 365 (2007) 343-361.

[30] GUNNARSSON, C. L.; DEXLIN, L.; NORDBERG, K. E.; HOLST, O.; OHLIN, M. Evolution of a carbohydrate binding module into a protein-specific binder. Biomolecular Engineering, 23 (2006) 111-117.

[31] ZEM, G. C.; BADALI, O.; GAYTAN, M.; HEKMATJOU, H.; ALVAREZ, M.; NNOLI, J.; KATUS, E.; OPPENHEIMER, S. B. Microbead analysis of cell binding to immobilized lectin: an alternative to microarrays in the development of carbohydrate drugs and diagnostic tests. Acta Histochemica, 108 (2006) 311-317.

[32] BLAGOI, G.; ROSENZWEIG, N.; ROSENZWEIG, Z. Design, synthesis, and application of particle-based fluorescence resonance energy transfer sensors for carbohydrates and glycoproteins. Analytical Chemistry, 77 (2005) 393-399.

[33] BREESE, J. D.; CARL, O. J. Some proteins from the jack bean, Canavalia ensiformis. The Journal of Biological Chemistry, 28 (1916) 67-75.

[34] SUMNER, J. B. The globulins of the jack bean, Canavalia ensiformis. The Journal of Biological Chemistry, 37 (1919) 137-142.

[35] SUMNER, J. B.; HOWELL, S. F.; ZEISSIG, A. Concanavalin A and hemagglutination. Science, 82 (1935) 65-66.

[36] BOUCKAERT, J.; DEWALLEF, Y.; POORTMANS, F.; WYNS, L.; LORIS, R. The structural features of concanavalin A governing non-proline peptide isomerization. The Journal of Biological Chemistry, 275 (2000) 19778-19787.

[37] REEKE, G. N.; BECKER, J. W.; EDELMAN, G. M. The covalent and three-dimensional structure of concanavalin A. IV. Atomic coordinates, hydrogen bonding, and quaternary structure. The Journal of Biological Chemistry, 250 (1975) 1525–1547.

[38] EDELMAN, G. M.; CUNNINGHAM, B. A.; REEKE, G. N.; BECKER, J. W.; WAXDAL, M. J.; WANG, J. L. The Covalent and Three-Dimensional Structure of concanavalin A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 69 (1972) 2580–2584.

[39] FINK, A. L.; CALCIANO, L. J.; GOTO, Y.; KUROTSU, T.; PALLEROS, D. R. Classification of acid denaturation of proteins: intermediates and unfolded states. Biochemistry, 33 (1994) 12504–12511.

[40] AGRAWAL, B. B.; GOLDSTEIN, I. J. Specific binding of concanavalin A to cross-linked dextran gels. Biochemical Journal, 96 (1965) 23c–25c.

[41] PORETZT, R. D.; GOLDSTEIN, I. J. An Examination of the topography of the saccharide binding sites of concanavalin A and of the forces involved in complexation. Biochemistry, 9 (1970) 2890.

[42] MCKENZIE, G. H.; SAWYER, W. H.; NICHOL, L. W. The molecular weight and stability of concanavalin A. Biochemical Biophysical Acta, 263 (1972) 283–293.

[43] GOLDSTEIN, I. J. Carbohydrate binding specificity of concanavalin A. John Wiley and Sons Ltd., London, (1976) pp. 17–24.



[44] AGRAWAL, B. B. L.; GOLDSTEIN, I. J. Protein-carbohydrate interaction: VI. Isolation of concanavalin A by specific adsorption on cross-linked dextran gels. Biochemical Biophysical Acta, 147(1967) 262-271.

[45] OLSON, M. O.; LIENER, I. E. Some physical and chemical properties of concanavalin A, the phytohemagglutinin of the jack bean. Biochemistry, 6 (1967), 105–111.

[46] NAISMITH, J. H.; EMMERICH, C.; HABASH, J.; HARROP, S. J.; RAFTERY, J.; KALB, A. J.; YARIV, J. Refined structure of concanavalin-A complexed with methyl α-D-mannopyranoside at 2.0 Å resolution and comparison with the saccharide-free structure. Acta Crystallographica Section D, 50:6 (1994) 847–858.

[47] ARLTOFT, D.; MADSEN, F.; IPSEN, R. Screening of probes for specific localization of polysaccharides. Food Hydrocolloids, 21:7 (2007) 1062-1071.

[48] LIU, L.; XIN, X.; YANG, S.; CHEN, Z.; LIN, X. A highly sensitive biosensor with (Con A/HRP)n multilayer films based on layer-by-layer technique for the detection of reduced thiols. Biosensors and Bioelectronics, 22:12 (2007) 3210-3216.

[49] QIU, R.; ZHANG, X.; REGNIER, F. E. A method for the identification of glycoproteins from human serum by a combination of lectin affinity chromatography along with anion exchange and Cu-IMAC selection of tryptic peptides. Journal of Chromatography B, 845:1 (2007) 143-150.

[50] HAYNES, C. A.; NORDE, W. Globular proteins at solid/liquid interfaces: A comprehensive overview on the driving forces involved in protein adsorption. The basic physical processes determining the conformation of a protein and its interaction with interfaces are evaluated using a thermodynamic approach. Colloids Surfaces B, 2 (1994) 517-566.

[51] OSTUNI, E.; CHAPMAN, R. G.; HOLMLIN, R. E.; TAKAYAMA, S.; WHITESIDES, G. M. A Survey of Structure-Property Relationships of Surfaces that Resist the Adsorption of Protein. Langmuir, 17:18 (2001) 5605-5620.

[52] CASTNER, D. G.; RATNER, B. D. Biomedical surface science: Foundations to frontiers. Surface Science, 500 (2002) 28–60.

[53] NYLANDER, T.; KÉKICHEFF, P.; NINHAM, B. W. The effect of solution behavior of insulin on interactions between adsorbed layers of insulin. Journal of Colloid and Interface Science, 164 (1994) 136-150.

[54] ELOFSSON, U. M.; PAULSSON, M. A.; ARNEBRANT, T. Adsorption of β-lactoglobulin A and B in relation to self-association: Effect of concentration and pH. Langmuir, 13 (1997) 1695-1700.

[55] MUNGIKAR, A. A.; FORCINITI, D. Conformational changes of peptides at solid/liquid interfaces: A Monte Carlo study. Biomacromolecules, 5 (2004) 2147-2159.

[56] NAKANISHI, K.; SAKIYAMA, T.; IMAMURA, K. On the adsorption of proteins on solid surfaces, a common but very complicated phenomenon. Journal of Bioscience and Bioengineering, 91:3 (2001) 233-244.

[57] HÖÖK, F.; RODAHL, M.; KASEMO, B.; BRZEZINSKI, P. Structural changes in hemoglobin during adsorption to solid surfaces: Effects of pH, ionic strength, and ligand binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95 (1998) 12271–12276.



[58] MOLLMANNA, S. H.; JORGENSENA, L.; BUKRINSKYB, J. T.; ELOFSSONC, U.; NORDED, W.; FROKJAERA, S. Interfacial adsorption of insulin conformational changes and reversibility of adsorption. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 27 (2006) 194–204.

[59] HLADY, V.; BUIJS, J. Protein adsorption on solid surfaces. Current Opinion in Biotechnology, 7 (1996) 72-77.

[60] MALMSTEN, M.; BURNS, N.; VEIDE, A. Electrostatic and Hydrophobic Effects of Oligopeptide Insertions on Protein Adsorption. Journal of Colloid and Interface Science, 204:1 (1998) 104-111.

[61] HILDEBRAND, A.; SCHAEDLICH, A.; ROTHE, U.; NEUBERT, R. H. H. Sensing specific adhesion of liposomal and micellar systems with attached carbohydrate recognition structures at lectin surfaces. Journal of Colloid and Interface Science, 249:2 (2002) 274-281.

[62] TURNER, N. W.; WRIGHT, B. E.; HLADY, V.; BRITT, D. W. Formation of protein molecular imprints within Langmuir monolayers: A quartz crystal microbalance study. Journal of Colloid and Interface Science, 308:1 (2007) 71-80.

[63] LORD, M. S.; COUSINS, B. G.; DOHERTY, P. J.; WHITELOCK, J. M.; SIMMONS, A.; WILLIAMS, R. L.; MILTHORPE, B. K. The effect of silica nanoparticulate coatings on serum protein adsorption and cellular response. Biomaterials, 27:28 (2006) 4856 – 4862.

[64] LAOS, K.; PARKER, R.; MOFFAT, J.; WELLNER, N.; RING, S. G. The adsorption of globular proteins, bovine serum albumin and β-lactoglobulin, on poly-l-lysine–furcellaran multilayers. Carbohydrate Polymers, 65:3 (2006) 235-242.

[65] HOVEN, V. P.; TANGPASUTHADOL, V.; ANGKITPAIBOON, Y.; VALLAPA, N.; KIATKAMJORNWONG, S. Surface-charged chitosan: Preparation and protein adsorption. Carbohydrate Polymers, 68:1 (2007) 44-53.

[66] TANTIPOLPHAN, R.; RADES, T.; MCQUILLAN, A. J.; MEDLICOTT, N. J. Adsorption of bovine serum albumin (BSA) onto lecithin studied by attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopys. International Journal of Pharmaceutics, 337:1-2 (2007) 40-47.

[67] BRANDES, N.; WELZEL, P. B.; WERNER, C.; KROH, L. W. Adsorption-induced conformational changes of proteins onto ceramic particles: Differential scanning calorimetry and FTIR analysis. Journal of Colloid and Interface Science, 299:1 (2006) 56-69.

[68] MOULTON, S. E.; BARISCI, J. N.; BATH, A.; STELLA, R.; WALLACE, G. G. Studies of double layer capacitance and electron transfer at a gold electrode exposed to protein solutions. Electrochimica Acta, 49:24 (2004) 4223-4230.

[69] HELI, H.; SATTARAHMADY, N.; JABBARI, A.; MOVAHEDI, A. A. M.; HAKIMELAHI, G. H.; TSAI, F. Y. Adsorption of human serum albumin onto glassy carbon surface – Applied to albumin-modified electrode: Mode of protein–ligand interactions. Journal of Electroanalytical Chemistry, 610:1 (2007) 67-74.

[70] UETA, R. R.; DINIZ, F. B. Adsorption of concanavalin A and lentil lectin on platinum electrodes followed by electrochemical impedance spectroscopy: Effect of protein state. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, In Press, Corrected Proof, Available online 27 August 2007.



[71] COSMAN, N. P.; FATIH, K.; ROSCOE, S. G. Electrochemical impedance spectroscopy study of the adsorption behaviour of α-lactalbumin and β-casein at stainless steel. Journal of Electroanalytical Chemistry, 574:2 (2005) 261-271.

[72] AROTIBA, O. A.; IGNASZAK, A.; MALGAS, R.; AL-AHMED, A.; BAKER, P. G. L.; MAPOLIE, S. F.; IWUOHA, E. I. An electrochemical DNA biosensor developed on novel multinuclear nickel(II) salicylaldimine metallodendrimer platform. Electrochimica Acta, 53:4 (2007) 1689-1696.

[73] ARORA, K.; PRABHAKAR, N.; CHAND, S.; MALHOTRA, B. D. Ultrasensitive DNA hybridization biosensor based on polyaniline. Biosensors and Bioelectronics, 23:5 (2007) 613-620.

[74] SHERVEDANI, R. K.; MEHRJARDI, A. H. Electrochemical characterization of directly immobilized glucose oxidase on gold mercaptosuccinic anhydride self-assembled monolayer. Sensors and Actuators B, 126:2 (2007) 415-423.

[75] SUGAWARA, K.; HIRABAYASHI, G.; KAMIYA, N.; KURAMITZ, H. Evaluation of concanavalin A–mannose interaction on the electrode covered with collagen film. Talanta 68:4 (2006) 1176–1181.

[76] KUMAR, S. A.; CHEN, S. M. Myoglobin/arylhydroxylamine film modified electrode: Direct electrochemistry and electrochemical catalysis. Talanta, 72 (2007) 831-838.

[77] CUNHA, F. G. C.; MORAES, I. R.; NART, F. C. 5-Halogen substituted uracil: General trends for adsorption behavior studied by cyclic voltammetry and in situ STM. Acta Microscópica, 12 (2003) 24-28.

[78] MORROW, R.; MCKENZIE, D. R.; BILEK, M. M. M.; MACDONALD, C. L.; STINDT, M.; ANETSBERGER, G.; MARTIN, A. S. Electric field effects on adsorption/desorption of proteins and colloidal particles on a gold film observed using surface plasmon resonance. Physica B: Condensed Matter, 394:2 (2007) 203-207.

[79] GOBI, K. V.; KIM, S. J.; TANAKA, H.; SHOYAMA, Y.; MIURA, N. Novel surface plasmon resonance (SPR) immunosensor based on monomolecular layer of physically-adsorbed ovalbumin conjugate for detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and atomic force microscopy study. Sensors and Actuators B: Chemical, 123:1 (2007) 583-593.

[80] LOPEZ, P. H. H.; SCHNAAR, R. L. Determination of glycolipid–protein interaction specificity. Methods in Enzymology, 417 (2006) 205-220.

[81] WANG, Y.; KNOLL, W. In situ electrochemical and surface plasmon resonance (SPR) studies of aniline-carboxylated aniline copolymers. Analytica Chimica Acta, 558 (2006) 150–157.

[82] DAHINT, R.; TRILEVA, E.; ACUNMAN, H.; KONRAD, U.; ZIMMER, M.; STADLER, V.; HIMMELHAUS, M. Optically responsive nanoparticle layers for the label-free analysis of biospecific interactions in array formats. Biosensors and Bioelectronics, 22:12 (2007) 3174-3181.

[83] HOA, X. D.; KIRK, A. G.; TABRIZIAN, M. Towards integrated and sensitive surface plasmon resonance biosensors: A review of recent progress. Biosensors and Bioelectronics, 23:2 (2007) 151-160.



[84] HOLMBERG, M.; STIBIUS, K. B.; NDONI, S.; LARSEN, N. B.; KINGSHOTT, P.; HOU, X. L. Protein aggregation and degradation during iodine labeling and its consequences for protein adsorption to biomaterials. Analytical Biochemistry, 361:1 (2007) 120-125.

[85] LIU, G.; DOU, S.; HE, J.; YIN, D.; GUPTA, S.; ZHANG, S. WANG, Y.; RUSCKOWSKI, M.; HNATOWICHET, D. J. Radiolabeling of MAG3-morpholino oligomers with 188Re at high labeling efficiency and specific radioactivity for tumor pretargeting. Applied Radiation and Isotopes, 64:9 (2006) 971-978.

[86] HALLIWELL, C. M.; SIMON, E.; TOH, C. S.; BARTLETT, P. N.; CASS, A. E. G. A method for the determination of enzyme mass loading on an electrode surface through radioisotope labeling. Biosensors and Bioelectronics, 17:11-12 (2002) 965-972.

[87] BOUZIOTIS, P.; PSIMADAS, D.; FANI, M.; GOURNI, E.; LOUDOS, G.; XANTHOPOULOS, S.; ARCHIMANDRITIS, S. C.; VARVARIGOU, A. D. Radiolabeled biomolecules for early cancer detection and therapy via angiogenesis targeting. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A, 569:2 (2006) 492-496.

[88] TZANG, B. S.; TSAY, G. J.; LEE, Y. J.; LI, C.; SUN, Y. S.; HSU, T. C. The association of VP1 unique region protein in acute parvovirus B19 infection and anti-phospholipid antibody production. Clinica Chimica Acta, 378:1-2 (2007) 59-65.

[89] LIBJAKOVÁ, L.; BYSTRICKÝ, S.; LIŽIČÁROVÁ, I.; PAULOVIČOVÁ, E.; MACHOVÁ, E. Evaluation of different mannan polysaccharide usage in enzyme-linked immunosorbent assay for specific antibodies determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45:3 (2007) 521-525.

[90] TRIANTAPHYLLIDOU, I. E.; SKLAVIADIS, T.; VYNIOS, D. H. Detection, quantification, and glycotyping of prion protein in specifically activated enzyme-linked immunosorbent assay plates. Analytical Biochemistry, 359:2 (2006) 176-182.

[91] MACIEL, J. S.; KOSAKA, P. M.; DE PAULA, R. C. M.; FEITOSA, J. P. A.; PETRI, D. F. S. Formation of cashew gum thin films onto silicon wafers or amino-terminated surfaces and the immobilization of concanavalin A on them. Carbohydrate Polymers, 69:3 (2007) 522-529.

[92] POKSINSKI, M.; ARWIN, H. Total internal reflection ellipsometry: ultrahigh sensitivity for protein adsorption on metal surfaces. Optics Letters, 32 (2007) 1308-1310.

[93] KARLSSON, L. M.; SCHUBERT, M.; ASHKENOV, N.; ARWIN, H. Protein adsorption in porous silicon gradients monitored by spatially-resolved spectroscopic ellipsometry. Thin Solid Films, 455 (2004) 726 – 730.

[94] ELOFSSON, U. M.; PAULSSON, M. A.; SELLERS, P.; ARNEBRANT, T. Adsorption during heat treatment related to the termal unfolding/aggregation of lactoglobulins A and B. Journal of Colloid Interface Science, 183 (1996) 408-415.

[95] POPP, D.; YAMAMOTO, A.; MAÉDA, Y. Crowded surfaces change annealing dynamics of actin filaments. Journal of Molecular Biology, 368:2 (2007) 365-374.

[96] KAPPEL, N. D.; PROLL, F.; GAUGLITZ, G. Development of a TIRF-based biosensor for sensitive detection of progesterone in bovine milk. Biosensors and Bioelectronics, 22 (2007) 2295-2300.

[97] BALLERSTADT, R.; EVANS, C.; MCNICHOLS, R.; GOWDA, A. Concanavalin A for in vivo glucose sensing: A biotoxicity review. Biosensors and Bioelectronics, 22 (2006) 275–284.



[98] PARIDA, S. K.; DASH, S.; PATEL, S.; MISHRA, B. K. Adsorption of organic molecules on silica surface. Advances in Colloid and Interface Science, 121 (2006) 77-110.

[99] MOLLMANN, S. H.; JORGENSEN, L.; BUKRINSKY, J. T.; ELOFSSON, U.; NORDE, W.; FROKJAER, S. Interfacial adsorption of insulin: Conformational changes and reversibility of adsorption. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 27 (2006) 194-204.

[100] XU, L. C.; SIEDLECKI, C. A. Effects of surface wettability and contact time on protein adhesion to biomaterial surfaces. Biomaterials, 28:22 (2007) 3273-3283.

[101] ZHU, L. P.; ZHANG, X. X.; XU, L.; DU, C. H.; ZHU, B. K.; XU, Y. Y. Improved protein-adsorption resistance of polyethersulfone membranes via surface segregation of ultrahigh molecular weight poly(styrene-alt-maleic-anhydride). Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 57:2 (2007) 189-197.

[102] TLILI, A.; ABDELGHANI, A.; AGUIR, K.; GILLET, M.; RENAULT, N. J. Adsorption characteristics of self-assembled thiol and dithiol layer on gold. Materials Science and Engineering C, 27:4 (2007) 620-624.

[103] LOUSINIAN, S.; LOGOTHETIDIS, S. Optical properties of proteins and protein adsorption study. Microelectronic Engineering, 84:3 (2007) 479-485.

[104] MITSAKAKIS, K.; LOUSINIAN, S.; LOGOTHETIDIS, S. Early stages of human plasma proteins adsorption probed by Atomic Force Microscope. Biomolecular Engineering, 24:1 (2007) 119-124.

[105] VELASCO, G. M.; MOTTRAM, T. Biosensor technology addressing agricultural problems. Review paper. Biosystems Engineering, 84:1 (2003) 1-12.

[106] ROGERS, K. R. Recent advances in biosensor techniques for environmental monitoring. Analytica Chimica Acta, 568:1-2 (2006) 222-231.

[107] JANEWAY, C. A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M.; CAPRA, J. D. Imunobiologia: O sistema imunológico na saúde e na doença. 2ª edição, Porto Alegre: Artes médicas, 1997.

[108] Damos, F. S.; Mendes, R. K; Kubota, L. T. Aplicações de QCM, EIS e SPR na investigação de superfícies e interfaces para o desenvolvimento de biosensores. Química Nova, 27:6 (2004) 970-979.

[109] THAVARUNGKUL, P.; DAWAN, S.; KANATHARANA, P.; ASAWATRERATANAKUL, P. Detecting penicillin G in milk with impedimetric label-free immunosensor. Biosensors and Bioelectronics, 23:5 (2007) 688-694.

[110] XIAO, Y.; LI, C. M.; LIU, Y. Electrochemical impedance characterization of antibody–antigen interaction with signal amplification based on polypyrrole–streptavidin. Biosensors and Bioelectronics, 22:12 (2007) 3161-3166.

[111] DINIZ, F. B.; UETA, R. R. Platinum oxidation and its effect on concanavalin A adsorption. Electrochemica Acta, 49 (2004) 250-255.

[112] UETA, R. R. A Espectroscopia de impedância eletroquímica aplicada ao estudo da interface platina/lectina. Recife: UFPE, 2002. 127 p. Tese de doutorado – Programa de Pós-Graduação, Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco.

[113] RIBEIRO, R. T. Caracterização impedimétrica da adsorção de concanavalina A sobre



eletrodos sólidos. Recife: UFPE, 2005. 68 p. Dissertação de Mestrado - Programa de Pós-Graduação, Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco.

[114] MARTINS Jr., R. R.; ARAÚJO, C. B.; DINIZ, F. B. Caracterização eletroquímica da adsorção de proteína em eletrodo de filme fino de ouro. XVI Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica. Águas de Lindóia-SP, 15 a 19 de abril de 2007. p. 133.

[115] MARTINS Jr., R. R.; ARAÚJO, C. B.; DINIZ, F. B. Impedância eletroquímica e ressonância de plásmons na investigação de interfaces para o desenvolvimento de biosensores. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ), Águas de Lindóia-SP, 31/05 a 03 de junho de 2007. QM-012.

[116] MARTINS Jr., R. R.; DINIZ, F. B. Investigação sobre a adsorção da Concanavalina A em eletrodo de filme fino por impedância eletroquímica. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ), Águas de Lindóia-SP, 31/05 a 03 de junho de 2007. EQ-087.

[117] BISQUERT, J.; BELMONTE, G. G.; SANTIAGO, F. F.; FERRIOLS, N. S.; BOGDANOFF, P.; PEREIRA, E. C. Doubling exponent models for the analysis of porous film electrodes by impedance. Relaxation of TiO2 nanoporous in aqueous solution. Journal of Physical Chemistry B, 104:10 (2000) 2287.

[118] CAO, F.; OSKAM, G.; SEARSON, P. C.; HEIMER, T. A.; STIPKALA, J. M.; FARZAD, F.; MEYER, G. J. Electrical and optical properties of porous nanocrystalline Ti02 Films. Journal of Physical Chemistry B, 99 (1995) 11974-11980.

[119] BUENO, P. R.; LEITE, E. R.; GIRALDI, T. R.; BULHÕES, L. O. S.; LONGO, E. Nanostructured Li ion insertion electrodes. 2. Tin dioxide nanocrystalline layers and discussion on "nanoscale effect". Journal of Physical Chemistry B, 107 (2003) 8878-8883.

[120] ALVES, V. A.; DA SILVA, L. A.; BOODTS, J. F. C. Impedance study of the oxygen evolution on the IrO2/TiO2/CeO2 system in acidic medium. Polish Journal of Chemistry, 74:3 (2000) 421-428.

[121] ALVES, V. A.; DA SILVA, L. A.; BOODTS, J. F. C.; TRASATTI, S. Kinetics and mechanism of oxygen evolution on IrO2 based electrodes containing Ti and Ce acidic solutions. Electrochimica Acta, 39:11-12 (1994) 1585-1589.

[122] ANDRADE, A. R.; BOODTSA, J. F. C. Electrochemical Behavior of 4 keto Isophorone in Non Aqueous Medium in the Presence of Carbon Dioxide. Journal of the Brazilian Chemical Society, 9 (1998)157-161.

[123] RENISK, R.; HALLIDAY, D. Física 3. Livros Técnicos e Científicos Editora, 4ª ed., Rio de Janeiro, 1984. 322p

[124] BARD, V.; FAULKENER, L. R. Electrochemical Methods – Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, New York, 1980. 718p.

[125] WOLYNEC, S. Técnicas eletroquímicas em corrosão. Editora da Universidade de São Paulo, 2003. 115-143p.

[126] BOCKRIS, J. O. M.; REDDY, A. K. N. Modern Electrochemistry: An Introduction to an interdisciplinary area, v.2, A Plenum/Rosetta edition, New York, 1973. 623-841p.

[127] MANSFELD, F. Don’t be afraid of electrochemical techniques – but use them with care! Corrosion, 44:12 (1988) 856-868.



[128] MACDONALD, J. R. Impedance Spectroscopy; Emphasizing Solid Materials and Systems. New York: John Wiley & Sons, 1987.

[129] BRUCE, P. G., Solid State Electrochemistry. Cambridge University Press, Cambridge, 1ªed, 1995. 360p.

[130] TAKESHITA, T.; ASAO, H.; OHTANI, K.; ISHII, N.; KUMAKI, S.; TANAKA, N.; MUNAKATA, H.; NAKAMURA, M.; SUGAMURA, K. Cloning of the gamma chain of the human IL-2 receptor. Science, 257 (1992) 379 – 382.

[131] OTTO, A. Spectroscopy of surface polaritons by attenuated total reflection. Optical properties of Solids, New Developments, B. O. Seraphin. Ed, North-Holland, Amsterdam (1975), Ch. 13.

[132] KRETSCHMANN, E. Die bestimmung optischer konstanten von metallen durch anregung von oberflächenplasmaschwingungen. Zeitschrift Für Physik, 241 (1971) 313-324.

[133] WANG, H.; WU, Y.; LASSITER, B.; NEHL, C. L.; HAFNER, J. H.; NORDLANDER, P.; HALAS, N. J. Symmetry breaking in individual plasmonic nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences USA - PNAS, 103 (2007) 10856-10860.

[134] REINHARD, B. M.; SHEIKHOLESLAMI, S.; MASTROIANNI, A.; ALIVISATOS, A. P.; LIPHARDT, J. Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA - PNAS, 104 (2007) 2667-2672.

[135] YOSHIDA, K.; MUNAKATA, H. Connective tissue growth factor binds to fibronectin through the type I repeat modules and enhances the affinity of fibronectin to fibrin. Biochimica et Biophysica Acta, 1170:4 (2007) 672-680.

[136] NANDURI, V.; BHUNIA, A. K.; TU, S. I.; PAOLI, G. C.; BREWSTER, J. D. SPR biosensor for the detection of L. monocytogenes using phage-displayed antibody. Biosensors and Bioelectronics, 23:2 (2007) 248-252.

[137] CSETE, M.; SIPOS, Á.; KŐHÁZI-KIS, A.; SZALAI, A.; SZEKERES, G.; MATHESZ, A.; CSÁKÓ, T.; OSVAY, K.; BOR, Zs.; PENKE, B.; DELI, M. A.; VESZELKA, Sz.; SCHMATULLA, A.; MARTI, A. Comparative study of sub-micrometer polymeric structures: Dot-arrays, linear and crossed gratings generated by UV laser based two-beam interference, as surfaces for SPR and AFM based bio-sensing. Applied Surface Science, 254: 4 (2007) 1194-1205

[138] TANG, Q.; SU, X.; LOH, K. P. Surface plasmon resonance spectroscopy study of interfacial binding of thrombin to antithrombin DNA aptamers. Journal of Colloid and Interface Science, 315:1 (2007) 99-106.

[139] CHOU, S. F.; HSU, W. L.; HWANG, J. M.; CHEN, C. Y. Development of an immunosensor for human ferritin, a nonspecific tumor marker, based on surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics, 19:9 (2004) 999-1005.

[140] WANG, J.; WANG, F.; ZOU, X.; XU, Z.; DONG, S. Surface plasmon resonance and electrochemistry for detection of small molecules using catalyzed deposition of metal ions on gold substrate. Electrochemistry Communications, 9:2 (2007) 343-347.

[141] WANG, Q.; BOHN, P. W. Surface composition gradients of immobilized cell signaling molecules. Epidermal growth factor on gold. Thin Solid Films, 513 (2006) 338-34.



[142] PARK, J. E.; MOMMA, T.; OSAKA, T. Spectroelectrochemical phenomena on surface plasmon resonance of Au nanoparticles immobilized on transparent electrode. Electrochimica Acta, 52:19 (2007) 5914-5923.

[143] NGUYEN, B.; TANIOUS, F. A.; WILSON, W. D. Biosensor surface plasmon resonance: Quantitative analysis of small molecule–nucleic acid interactions. Methods, 42:2 (2007) 150-161.

[144] WEAR, M. A.; WALKINSHAW, M. D. Thermodynamics of the cyclophilin-A/cyclosporin-A interaction: A direct comparison of parameters determined by surface plasmon resonance using Biacore T100 and isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry, 359:2 (2006) 285-287.

[145] CHINOWSKY, T. M.; SOELBERG, S. D.; BAKER, P.; SWANSON, N. R.; KAUFFMAN, P.; MACTUTIS, A.; GROW, M. S.; ATMAR, R.; YEE, S. S.; FURLONG, C. E. Portable 24-analyte surface plasmon resonance instruments for rapid, versatile biodetection. Biosensors and Bioelectronics, 22 (2007) 2268-2275.

[146] NARAOKA, R.; OKAWA, H.; HASHIMOTO, K. KAJIKAWA, K. Surface plasmon resonance enhanced second-harmonic generation in Kretschmann configuration. Optics Communications, 248 (2005) 249-256.

[147] ALENCAR, M. A. R. C.; GOMES, A. S. L.; ARAUJO, C. B. Surface plasmon assisted directional laserlike emission from a highly scattering dye doped polymeric gain medium. In: Quantum Electronics and Lasers Science Conference, 2001, Baltimore. Technical Digest of CLEO- 2001. Washington: Optical Society of America, 2001.

[148] JACKSON, J. D. Classical Electrodynamics. 3rd edition, John Wiley and Sons, New York (1998). 832p.

[149] CARDONA, M. Fresnel reflection and surfaces plasmons, American Journal of Physics, 39:10 (1971) 1277-1277.

[150] LI, A.; YANG, F.; MA, Y.; YANG, X. Electrochemical impedance detection of DNA hybridization based on dendrimer modified electrode. Biosensors and Bioelectronics, 22:8 (2007) 1716-1722.

[151] NANDURI, V.; BALASUBRAMANIAN, S.; SISTA, S.; VODYANOY, V. J.; SIMONIAN, A. L. Highly sensitive phage-based biosensor for the detection of β-galactosidase. Analytica Chimica Acta, 589:2 (2007) 166-172.

[152] ZHANG, N.; SCHWEISS, R.; ZONG, Y.; KNOLL, W. Electrochemical surface plasmon spectroscopy: Recent developments and applications. Electrochimica Acta, 52:8 (2007) 2869-2875.

[153] TANG, H.; WANG, Q.; XIE, Q.; ZHANG, Y.; TAN, L.; YAO, S. Enzymatically biocatalytic precipitates amplified antibody–antigen interaction for super low level immunoassay: An investigation combined surface plasmon resonance with electrochemistry. Biosensors and Bioelectronics, 23:5 (2007) 668-674.

[154] ASSIONGBON, K. A.; ROY, D. Electro-oxidation of methanol on gold in alkaline media: Adsorption characteristics of reaction intermediates studied using time resolved electro-chemical impedance and surface plasmon resonance techniques. Surface Science, 594 (2005) 99-119.



[155] CUI, X.; PEI, R.; WANG, Z.; YANG, F.; MA, Y.; DONG, S.; YANG, X. Layer-by-layer assembly of multilayer films composed of avidin and biotin-labeled antibody for immunosensing. Biosensors and Bioelectronics, 18:1 (2003) 59-67.

[156] BART, M.; Van-Os, P. J. H. J.; KAMP, B.; BULT, A.; Van-BENNEKOM, W. P. Development of a confined wall-jet flow-through cell for simultaneous electrochemical and surface plasmon resonance applications. Sensors and Actuators B: Chemical, 84 (2002) 129-135.

[157] KOTZ, R.; KOLB, D. M.; SAAS, J. K. Electron density effects in surface plasmon excitation on silver and gold electrodes. Surface Science, 69 (1977) 359–364.

[158] DRONOV R.; KURTH, D. G.; MÖHWALD, H.; SCHELLER, F. W.; LISDAT, F. A self-assembled cytochrome c/xanthine oxidase multilayer arrangement on gold. Electrochimica Acta, 53: 3 (2007) 1107-1113.

[159] SCHLERETH, D. D. Characterization of protein monolayers by surface plasmon resonance combined with cyclic voltammetry ‘in situ’. Journal of Electroanalytical Chemistry, 464 (1999) 198–207.

[160] LINGLER, S.; RUBINSTEIN, I.; KNOLL, W.; OFFENHAUSSEN, A. Fusion of small unilamellar lipid vesicles to alkanethiol and thiolipid self-assembled Monolayers on Gold. Langmuir, 13 (1997) 7085-7091.

[161] SUZUKI, M.; NAKASHIMA, Y.; MORI, Y. SPR immunosensor integrated two miniature enzyme. Sensors and Actuators, B 54 (1999) 176-181.

[162] TODA, K.; TSUBOI, M.; SEKIYA, N.; IKEDA, M.; YOSHIOKA, K. I. Electrochemical enzyme immunoassay using immobilized antibody on gold film with monitoring of surface plasmon resonance signal. Analytica Chimica Acta, 463 (2002) 219–227.

[163] WANG, J.; PAMIDI, P. V. A.; ROGERS, K. R. Sol-Gel-Derived thick-film amperometric immunosensors. Analytical Chemistry, 70:6 (1998) 1171-1175.

[164] BECKER, J. W. The Covalent and Three – Dimensional Structure of Concanavalin A: III. Structure of Monomer and its Interactions with Metals and Saccharides. The Journal of Biological Chemistry, 275 (2000) 19778-19787.

[165] PAI, C. M.; JACOBS, H.; BAE, Y. H; KIM, S. W. Synthesis and characterization of soluble concanavalin A oligomer. Biotechnology Bioengineering, 41:10 (1993) 957-963.

[166] OPTICAL SOCIETY OF AMERICA. Handbook of Optics. Mcgraw-Hill Trade Publisher, 1st edition, N.Y., 1978. 1000p.

[167] BOUKAMP, B. A. Equivalent Circuit Users Manual; University of Twentw; The Netherlands, 1989. 38p.

[168] PIELA, B.; WRONA, P. K. Capacitance of the gold electrode in 0.5 M H2SO4 solution: a.c. impedance studies. Journal of Electroanalytical Chemistry, 388 (1995) 69-79.

[169] HAMELIN, A. Cyclic voltammetry at gold single-crystal surfaces. Part 1. Behaviour ay low-index faces. Journal of Electroanalytical Chemistry, 407 (1996) 1-11.

[170] MACIEL, J. O. N. Ressonância de plásmons de superfície: relação de dispersão, otimização de parâmetros e observação experimental. Recife: UFPE, 2000. 79-81. Dissertação de



Mestrado – Programa de Pós-graduação, Departamento de Engenharia Elétrica, Universidade Federal de Pernambuco.

[171] FONTANA, E.; PANTELL, R. H.; STROBER, S. Surface plasmon immunoassay. Applied Optics, 31 (1990) 4694-4704.

[172] PERETZ, Y.; YARNITZKY, C. N. Determination of the PZC at solid electrodes with a dropping electrolyte electrode. Journal of Electroanalytical Chemistry, 498 (2001) 87-89.



Apêndice A

Código Mathematica para Cálculo do Ângulo de Plásmons, Utilizando a Configuração de Kretschmann, da Interface Ouro/Ar

Programa ângulo de ressonância e refletância mínima Parâmetros utilizados: Índice de refração do prisma: n(670 nm) = 1,516 Permissividade elétrica do filme de ouro [11]: ε = - 10,333 -j1,685 Código escrito:

eletroquímica acoplada à ressonância de plásmons de ......figura 28: fotos da segunda etapa do...

Documents