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Vera Andradehttp://histologiavvargas.wordpress.com/

Microscópio• O microscópio é um instrumento que permite

observar objetos não visíveis a olho nu.

• Isto se consegue através de um sistema óptico composto por lentes de cristal que aumentam a imagem do objeto.

Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

• Galileu Galilei inventou o telescópio no século XVI – duas lentes num tubo

• Zacarias Jansen (holandês) inventou o primeiro microscópio composto, em 1660 Século XVII, formado por três tubos encaixados

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Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

Leeuwenhoek, final de 1600

Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

Robert Hooke

Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

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Microscópio óptico, Microscópio composto ou Microscópio de Campo claro

• Instrumento usado pelo estudante de citologia, histologia, microbiologia e outras disciplinas que estudam microrganismos ou objetos com medidas micrométricas

• Constituído por uma parte mecânica e uma parte óptica

Parte Mecânica

Base ou pé

Coluna ou braço

Tubo

Revólver

PlatinaParafuso Macrométrico

Parafuso Micrométrico

• Parte Mecânica– Base ou pé suporte– Coluna ou braço apoio paras as estruturas– Tubo peça de ligação entre a ocular e o revólver– Revólver peça giratória que contém as lentes

objetivas– Platina suporta a preparação– Parafuso Macrométrico, de passo largo, é para

movimento de grande amplitude– Parafuso Micrométrico, de pequeno passo, é

destinado a focar o material

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Parte Óptica

Condensador

Lentes objetivas

Lentes oculares

Parte Óptica

– Condensador, concentra os raios luminosos objeto

• possui um diafragma de diâmetro modificável, proporciona uma maior ou menor intensidade luminosa

– Lentes objetivas, próximas do objeto, projetam a imagem ampliada do objeto em direção a ocular

– Lente ocular, funciona como uma lupa, amplia a imagem fornecida pela objetiva

Parte Óptica

• CONDENSADOR – geralmente negligenciado - não interfere no aumento da imagem, mas ele influencia em sua nitidez e riqueza de detalhes

• Age no LIMITE DA RESOLUÇÃO do sistema óptico, embora esta propriedade dependa principalmente das lentes objetivas

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LIMITE DE RESOLUÇÃO• LR de um microscópio é a

capacidade de:

– Separar detalhes

– Produzir imagens separadas de partículas muito próximas

– É a menor distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam separado

Limite de Resolução

LR = K . AN

– K é uma constante 0,612– é o comprimento de onda luz branca (verde-

amarelo) = 0,55 m– AN é a abertura numérica da lente objetiva

LR = 0,612 . 0,55AN

– O limite e resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda e inversamente proporcional a abertura numérica.

• ABERTURA NUMÉRICA (AN), vem gravado na lente objetiva e sua determinação cabe ao fabricante da lente.

• Indica a resolução de uma lente objetiva• Capacidade de captar a luz• Fornecer detalhes da amostra

AN = n. sen

– n = menor índice da refração– = semi-ângulo de abertura

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• As objetivas trazem outras informações

– 160 ou 170, indica em milímetro o comprimento do tubo do microscópio, onde devem ser usadas as objetivas para que dêem melhores resultados.

– 0,17, distância de trabalho, que significa o tamanho da lamínula, para a qual as aberrações são corrigidas.

Códigos de cores das lentes objetivas

Aumento Cores4X ou 5X Vermelho

10X Amarelo40 ou 50X Azul claro

100XImersão – óleo

Branco

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Imagem real ampliada e invertida

• Outros tipos de microscópios

–Microscópios Ópticos – MO • Microscópio de Contraste de Fase• Microscópio de Campo Escuro• Microscópio de Fluorescência• Microscópio de Polarização

–Microscópio Eletrônico – ME

Microscópio de contraste de fase – células vivas

• Usa as propriedades da refração da luz– Refração é a passagem da

luz de um meio para outro.

• Microscópio de contraste de fase transforma diferentes fases luminosas em diferentes intensidade luminosa

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Microscopia de luz convencional Microscopia de contraste de fase

Microscópio de campo escuro• Condensador é

substituído por um condensador de fundo escuro

• A preparação é iluminada por raios oblíquos

• A célula fica com aparência brilhante e o fundo escuro

CONDENSADOR

LUZ

Objetiva

Microscopia de campo escuro - células de sangue.

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Microscópio de Polarização

• Quando um raio de luz atravessa certas substâncias do nosso corpo acontece uma dupla refração

• Substâncias como dentes, ossos, fibras de colágeno e outras possuem um estado cristalino, arranjo molecular interno

• Prisma utiliza as propriedades de um único raio eliminando o outro

2 raios de luz = Raios polarizados

Microscópio de luz polarizada: Fibras de colágeno exibem birrefringência (brilhantes ou amarelas).

Microscópio de luz polarizada: da dentina (dente).

Microscópio de Fluorescência

Utiliza luz fluorescente –permite detectar proteínas ou estruturas marcadas com compostos fluorescentes

Similar ao MO, exceto pela luz empregada Luz ultra-violeta e pelos 2 conjuntos de filtros que desviam os raios do olho do observador.

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Cultivo de astrócitos. Imunofluorescência verde contra GFAP (proteína de filamentos intermediários) e azul (união com DNA)

Alberts et al. Biología Molecular de la célula. (1996) p. 856.

Microscopia Eletrônica

Microscopia Eletrônica• Inventado em 1932,

na Alemanha, Ernest Ruska e Max Knoll

• Utiliza elétrons, comprimento de onda muito pequeno, limite de resolução 1.000Xmenor que microscópio de luz

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Microscopia eletrônica, músculo estriado cardíaco.

Medidas

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MedidasUnidade de medida Símbolo ValorMicrômetro m 0,001 mm

Nanômetro nm 0,000001 mm (10-6 mm) ou 10-3 m

Medidas

Discuta com seus colegas e responda:• Para transportar um microscópio, qual a melhor maneira de segurá-

lo?• Que peça é movimentada quando giramos o parafuso

macrométrico?• Para que serve o parafuso micrométrico? O que ocorre quando o

giramos? O movimento é tão nítido quanto o do parafuso macrométrico?

• Como calcular o aumento que o microscópio fornece? • Onde deve ser colocada a lâmina contendo a preparação para

observação? Qual objetiva deve ser inicialmente usada para o procedimento de focalização?

• Qual parafuso deve ser usado inicialmente para focalizar o material?

• Acoplado ao condensador existe um diafragma. Descrever o que ocorre quando se move a alavanca do diafragma.

• O que é limite de resolução de um microscópio.• Quais as diferenças que existem entre o MO e ME?