AULA nº 7 – Metabolismo bacteriano:AULA nº 7 – Metabolismo bacteriano:

Metabolismo EnergéticoMetabolismo Energético

Bactérias Quimiorganotróficas e as oxidações

biológicas

O termo metabolismo refere-se à soma das reacções bioquímicas requeridas

para a produção de energia e para o uso dessa energia na síntese de material celular a

partir de moléculas ambientais. Assim, temos uma componente geradora de energia –

catabolismo e outra consumidora de energia – anabolismo. No catabolismo há

produção de energia sob a forma de ATP, que é utilizada nas reacções anabólicas para

construir o material celular. Esta relação pode verificar-se na figura seguinte:

Fig.7.1 – Relação entre anabolismo e catabolismo

As bactérias quimiorganotróficas usam os compostos orgânicos reduzidos

como fonte de carbono e energia. Vivem, muitas vezes, em associação com os animais,

sendo mestres da decomposição e biodegradação ambiental. O metabolismo

quimiorganotrófico é conduzido por dois processos fundamentais: fermentação e

respiração.

Fig. 7.2 – Reacções gerais do metabolismo quimiorganotrófico

Podem dividir-se em:

Categoria NutricionalFonte de

CarbonoFonte de energia Exemplos

Quimiorganoautotrófico CO2 Orgânica

Eubactérias

metilotróficas

autotróficas

QuimiorganoheterotróficoComposto

OrgânicoOrgânica

Maior parte das

eubactérias

A Oxidação Biológica ou Desidrogenação

ATP

Durante o catabolismo, a energia útil é temporariamente conservada na ligação

altamente energética do ATP. Não importa qual a forma de energia que a célula usa

como fonte primária, porque ela será sempre transformada e conservada sob a forma de

ATP.

Devido ao papel central do

ATP no catabolismo, é de

esperar que ele esteja presente

como coenzima na maioria dos

processos celulares produtores

de energia.

NAD

O NAD é outra coenzima comummente envolvida no catabolismo. A base da

transformação química normalmente envolve reacções redox. Para que algo se torne

oxidado, os electrões devem ser removidos por um agente oxidante - um aceitador de

electrões que se reduz na reacção. Durante a reacção, o agente oxidante é convertido em

agente redutor e pode adicionar os seus electrões a outra molécula, reduzindo-a, e

reoxidando-se a si mesmo. O NAD é a molécula que funciona como transportador de

electrões nestas reacções acopladas de oxidação-redução, assim como o NADP, o seu

derivado fosforilado. Estes compostos podem oxidar-se ou reduzir-se pela perda ou

ganho de 2 electrões. A forma oxidada do NAD simboliza-se NAD+ e a reduzida

NADH, NADH2, ou NADH + H+.

Fig.7.3 – Estrutura do ATP

Fig.7.4 – Estrutura do NAD

Fig.7.5 – Fosforilação ao nível do substrato.

Síntese de ATP nos Procariotas

As bactérias podem sintetizar ATP através de dois mecanismos:

Fosforilação ao nível do substrato – degradação da glucose a ácido pirúvico;

Fosforilação pelo transporte de electrões – fosforilação oxidativa.

A fosforilação ao nível do substrato é o mecanismo mais simples, antigo e

menos evoluído de produzir ATP. Nela, o ATP é produzido durante a conversão de uma

molécula orgânica. A energia libertada é parcialmente conservada durante a síntese da

ligação de alta energia do ATP. Este tipo de fosforilação ocorre durante a fermentação e

respiração (ciclo de Krebs).

A degradação da glucose a ácido pirúvico: fosforilação

ao nível do substrato

Existem 3 vias utilizadas pelos microrganismos para catabolizar a glucose:

Glicólise ou Embden-Meyerhof

Via das pentoses fosfato

Via Entner-Doudoroff

Nota: Neste Ponto vou referir-me apenas à via correspondente à fosforilação ao nível do substrato. Mais

à frente encontrarás as restantes vias.

Glicólise ou Embden Meyerhof

É a via mais comum de

degradação da glucose a ácido

pirúvico. Funciona tanto em condições

aeróbias como anaeróbias. Pode ser

dividida em duas partes:

1) No estado inicial, com 6

carbonos, a glucose é

fosforilada duas vezes e

convertida em frutose 1,6 -

difosfato. Este passo não

fornece energia e consome 2

moléculas de ATP. É ele que

inicia o processo através da

adição de grupos fosfato a cada

porção terminal do açúcar.

Estes fosfatos serão usados

para produção de ATP.

2) O passo com 3 carbonos da

glicólise dá-se quando a

enzima frutose 1,6-bifosfato aldolase cataliza a clivagem da frutose 1,6-bifosfato

em duas partes, cada uma contendo um grupo fosfato. Um dos produtos é o

Fig.7.6 - Glicólise

gliceraldeído 3-fosfato, que é directamente convertido em piruvato num

processo com 5 passos. O outro produto, a dihidroxiacetona fosfato, é facilmente

convertida em gliceraldeído 3- fosfato, pelo que ambos os produtos da clivagem

da frutose 1,6-bifosfato são usados no passo com 3 carbonos. O gliceraldeído 3-

fosfato começa por ser oxidado com o NAD+ como aceitador de electrões, e um

fosfato é simultaneamente incorporado para dar uma molécula altamente

energética, o 1,3-bifosfoglicerato. O fosfato de alta energia no carbono é

subsequentemente doado ao ADP para produzir ATP. Este processo é

denominado fosforilação ao nível do substrato porque a fosforilação do ADP

está acoplada à quebra exergónica de uma molécula de substrato altamente

energética. Um processo semelhante gera um segundo ATP por fosforilação ao

nível do substrato. O grupo fosfato no 3-fosfoglicerato muda-se para o carbono

2, e o 2-fosfoglicerato é desidratado para formar outra molécula de alta energia,

o fosfoenolpiruvato. Esta molécula doa o seu grupo fosfato ao ADP formando

ATP + Piruvato, o produto final da via.

A via glicolítica degrada uma glucose em 2 piruvatos e produz ATP e NADH. O

balanço de ATP e NADH pode calcular-se considerando as duas fases separadamente.

Na fase com 6 carbonos, dois ATP são usados para formar a frutose 1,6-bifosfato. Por

cada gliceraldeído 3-fosfato transformado em piruvato, forma-se um NADH e dois

ATP. Dado que dois gliceraldeído 3-fosfato surgem a partir de uma molécula de glucose

(um por via da dihidroxiacetona fosfato), o estadio de 3 carbonos gera 4 ATP e 2

NADH por molécula de glucose. A subtracção do ATP usado na fase de 6 carbonos

daquele produzido na fase de 3 carbonos dá um balanço de 2 ATP por glucose. Assim, o

catabolismo da glicose a piruvato na glicólise pode ser representado por:

Glucose +2ADP +2Pi + 2NAD+ 2 piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+

O transporte de electrões e a fosforilação oxidativa. O

fenómeno de quimiosmose. Os inibidores da síntese

aeróbia do ATP.

A maior parte do ATP provém da oxidação do NADH e do FADH2 na cadeia

transportadora de electrões.

A cadeia Transportadora de Electrões

A cadeia transportadora de electrões da mitocôndria é composta por uma série

de transportadores que operam em conjunto para transferir os electrões de dadores,

como o NADH e o FADH2, para aceitadores, como o O2.

Os electrões

passam de

transportadores com

potenciais de redução

mais negativos para

aqueles com

potenciais mais

positivos e

combinam-se com o

O2 e o H+ para formar

água. Os electrões

movem-se no sentido

descendente do

gradiente de

potencial. A diferença

entre os potenciais de redução do O2 e NADH é ampla, cerca de 1.14 V, e torna possível

a libertação de uma grande quantidade de energia. As mudanças de potencial em vários

pontos da cadeia são amplas o suficiente para fornecer energia suficiente para a

produção de ATP. A cadeia transportadora de electrões divide a energia total libertada

em pequenos passos. Alguma desta energia é armazenada sob a forma de ATP. O

Fig. 7.7 – Potenciais de Redução

transporte de electrões nestes pontos pode gerar gradientes protónicos e eléctricos, que

podem conduzir à síntese de ATP. Os transportadores residem na membrana interna da

mitocôndria e na membrana plasmática da bactéria. O sistema mitocondrial está

organizado em 4 complexos de transportadores, cada um capaz de transportar os

electrões parte do caminho até ao O2. A coenzima Q e o citocromo c ligam os

complexos uns aos outros. A fosforilação oxidativa é o processo pelo qual a energia

proveniente do transporte de electrões é usada para produzir ATP. 3 moléculas de ATP

podem ser sintetizadas a partir de ADP e Pi quando um par de electrões passa do NADH

para o O2.

Apesar de algumas cadeias bacterianas se assemelharem à cadeia mitocondrial,

na generalidade são muito diferentes. Variam nos transportadores (citocromos, p.e.) e

podem ser extensamente ramificadas. Os electrões podem entrar em vários pontos e sair

através de várias oxidases terminais. As cadeias bacterianas podem ainda ser mais

curtas e ter razões P/O mais baixas que as cadeias de transporte mitocondriais. Assim,

as cadeias transportadoras de electrões procariotas e eucariotas diferem nos detalhes da

construção apesar de operarem segundo os mesmos princípios fundamentais. As cadeias

transportadoras de electrões da E.Coli servirão como exemplo destas diferenças.

A cadeia transportadora da E.Coli é bastante diferente da cadeia mitocondrial

apesar de transportar electrões do NADH para aceitadores e mover protões através da

membrana plasmática. É ramificada e contém citocromos diferentes. A coenzima Q doa

os electrões para ambos os ramos mas estes operam sob condições de crescimento

diferentes. O ramo do citocromo d tem alta afinidade para o oxigénio e funciona em

condições com baixos níveis do mesmo. Não é tão eficiente como o ramo do citocromo

o porque não bombeia activamente protões. O ramo do citocromo o tem afinidade

moderadamente alta para o oxigénio, é uma bomba protónica e opera a condições

elevadas de oxigénio.

Fig.7.8 – Membrana Plasmática da E.Coli

A fosforilação oxidativa

A hipótese mais aceite para o funcionamento da fosforilação oxidativa é o

fenómeno da quimiosmose. De acordo com esta hipótese, formulada em 1961 pelo

bioquímico inglês Peter Mitchel, a cadeia transportadora de electrões está organizada de

modo a que os protões se movam para o exterior da matriz mitocondrial e os electrões

sejam transportados para o interior.

O movimento protónico resulta de loops

transportadores ou da acção de bombas de protões que recebem energia do transporte de

electrões. O resultado é a força motriz protónica (FMP), composta por um gradiente

de protões e um potencial de membrana devido à desigual distribuição de cargas.

Quando os protões regressam à matriz mitocondrial conduzidos pela FMP, o

ATP é sintetizado numa reacção inversa à da sua hidrólise. Um processo semelhante

tem lugar nos procariotas, com o fluxo de electrões a causar o movimento dos protões

para o exterior através da membrana plasmática. A síntese de ATP ocorre quando estes

protões se difundem de volta ao interior da célula. A FMP também pode conduzir o

transporte de moléculas através das membranas e a rotação do flagelo, tendo assim um

papel central na fisiologia procariota.

A hipótese quimiosmótica é aceite pela maioria dos microbiólogos. Existem

provas consideráveis da geração de protões e gradientes de carga através das

membranas. No entanto, a prova de que são os gradientes de protões a força condutora

directa da fosforilação oxidativa não é conclusiva. Seja qual for o mecanismo preciso, a

síntese de ATP tem lugar na F1F0 ATPase ou ATP sintase. O componente mitocondrial

F1 aparece como uma estrutura esférica ligada à superfície da membrana interior por

Fig.7.9 – O fenómeno da quimiosmose

uma haste e pelo componente F0, que se encontra inserido na membrana. A F1F0 ATPase

encontra-se na superfície interior da membrana plasmática bacteriana. O F0 participa no

movimento de protões através da membrana, e acredita-se que este movimento através

de um canal no F0 conduza a fosforilação oxidativa. F1 é um grande complexo em que

três subunidades α alternam com três subunidades β. A subunidade γ estende-se no

sentido descendente a partir do complexo α3β3; este compõe parte da haste e interage

com o F0. A subunidade δ também se localiza na haste. A maior parte da subunidade γ

está posicionada no centro de F1, rodeada pelas subunidades α e β. A subunidade γ roda

rapidamente no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio dentro do complexo α3β3 e

causa as mudanças conformacionais que conduzem a síntese do ATP aos sítios activos

das subunidades β.

Inibidores da Síntese de ATP

Muitos compostos inibem a síntese aeróbia do ATP e podem mesmo matar as

células quando em concentrações elevadas.

Estes inibidores dividem-se em duas categorias:

1) Alguns bloqueiam directamente o transporte de electrões. O antibiótico

Piericidina compete com a coenzima Q; a Antimicina A bloqueia o

transporte de electrões entre os citocromos b e c; o cianeto e azida sódica

Fig.7.10 – A quimiosmose e a fosforilação oxidativa

param a transferência de electrões entre o citocromo a e o O2 porque são

estruturalmente semelhantes a este último.

2) Um outro grupo de inibidores são os chamados desacopladores, que

param a síntese de ATP sem inibirem o transporte de electrões em si.

Aliás, podem mesmo melhorar o fluxo de electrões. Normalmente, o

transporte de electrões está intimamente ligado à fosforilação oxidativa,

sendo que o balanço da síntese de ATP controla o balanço do transporte

de electrões. Quanto mais rápido for sintetizado o ATP durante a

fosforilação oxidativa, mais rapidamente opera a cadeia transportadora

de electrões para fornecer a energia requerida. Os desacopladores

desligam a fosforilação oxidativa do transporte de electrões, pelo que a

energia produzida pela cadeia é libertada sob a forma de calor e não de

ATP. Muitos desacopladores, como o dinitrofenol e a valinomicina

permitem que iões hidrogénio, potássio e outros atravessem a membrana,

sem activar a F1F0 ATPase. Assim sendo, destroem os gradientes iónicos

e de pH. A valinomicina pode ainda ligar-se directamente à F1F0 ATPase,

inibindo a sua actividade.

Tipos de metabolismo energético

Fermentação

A Fermentação é uma forma anciã de metabolismo, que evoluiu com o

aparecimento de material orgânico no planeta. A energia deriva da oxidação parcial de

um composto orgânico usando intermediários orgânicos como dadores e aceitadores de

electrões. Não estão envolvidos electrões exteriores à via e não é necessário sistema de

transporte de electrões - todo o ATP é produzido por fosforilação ao nível do substrato.

A fermentação é, por definição teórica, tão simples quanto o ilustrado na figura

7. . No entanto, na realidade, as vias da fermentação são um pouco mais complexas,

envolvendo normalmente alguns passos preliminares para fornecer a energia iniciadora

para a oxidação e fosforilações ao nível do substrato.

Figura 7.11 - Fermentação Modelo. (E) O substrato é oxidado num intermediário

orgânico, em que o agente oxidante é o NAD. Alguma da energia libertada pela

oxidação é conservada durante a síntese do ATP pela fosforilação ao nível do substrato.

Finalmente, o intermediário oxidado é reduzido aos produtos finais. O NADH2 é um

agente redutor, balançando a sua habilidade redox para conduzir as reacções produtoras

de energia. (D) Na fermentação láctica, pelo Lactobacillus, a glucose é oxidada a

piruvato e este é reduzido a lactato. O balanço redox é mantido pelas oxidações

acopladas a reduções durante a via. Por exemplo, na fermentação láctica via Embden-

Meyerhof, a oxidação do gliceraldeído fosfato a ácido fosfoglicérico está acoplada à

redução do piruvato a lactato.

Em bioquímica, por uma questão de conveniência, as vias fermentativas iniciam-

se com a glucose. Isto porque se trata de uma molécula bastante simples, que requer

poucos passos catalíticos. Como referido anteriormente, existem 3 vias de degradação

da glucose:

i. Glicólise ou Embden-Meyerhof - descrita acima (vide pag. 5)

ii. Via da Pentose-Fosfato

iii. Via Entner-Doudoroff

Quer uma bactéria seja ou não fermentadora, ela degradará os açúcares através

de uma destas vias ou mais.

3 glucose 6-phosphate + 6NADP+ + 3H2O 2 fructose 6-phosphate + glyceraldehyde 3-phosphate +3CO2 + 6NADPH + 6H+

Via da Pentose-Fosfato

Também designada via da hexose monofosfato, pode ser utilizada ao mesmo

tempo que a glicólise. Funciona tanto em condições aeróbias como anaeróbias e é

importante tanto na biossíntese como no catabolismo. Inicia-se com a oxidação da

glucose 6-fosfato a 6-fosfogluconato seguindo-se a oxidação deste a ribulose 5-fosfato e

CO2. Durante estas oxidações há a produção de NADPH. A ribulose 5-fosfato é

convertida numa mistura de 3 através

de açúcares fosfatados com 7

carbonos. Existem 2 enzimas

exclusivas desta via que desempenham

um papel central nestas

transformações:

Transcetolase – cataliza

a transferência de

grupos cetol com 2

carbonos;

Transaldolase –

transfere um grupo

propilo da

sedoheptulose 7-fosfato para o gliceraldeído 3-fosfato.

O resultado final é que 3 glucose 6-fosfato são convertidas em 2 frutose 6-

fosfato, gliceraldeido 3-fosfato e 3 CO2:

Estes intermediários são usados de duas maneiras:

A frutose 6-fosfato pode ser convertida em glucose 6-fosfato;

O gliceraldeido 3-fosfato é convertido em piruvato por enzimas

glicolíticas. Este pode ainda ser devolvido à via da pentose-fosfato

através da formação da glucose 6-fosfato. Isto resulta na degradação

completa da glucose 6-fosfato em CO2 e na produção de uma grande

quantidade de NADPH:

Glucose 6-phosphate +12NADP+ + 7H2O 6CO2 + 12NADPH + 12H+ + Pi

Fig.7.12

A via da pentose-fosfato tem várias funções catabólicas e anabólicas:

1. O NADPH serve como fonte de electrões para a redução de moléculas durante

a biossíntese.

2. A via sintetiza açúcares com 4 e 5 carbonos porque: o açúcar com 4 carbonos

eritrose 4-fosfato é usado para a síntese de aminoácidos aromáticos e vit. B6. A pentose

ribose 5-fosfato é um componente major dos ácidos nucleicos e a ribulose 1,5-bifosfato

é um aceitador principal de CO2 na fotossíntese. De notar que quando um

microrganismo cresce com uma pentose como fonte de carbono, a via pode fornecer

carbono para a produção de hexose (a glucose é necessária para a produção de

peptidoglicano).

3. Os intermediários desta via podem ser usados para produzir ATP. O

gliceraldeído 3-fosfato pode entrar na fase de 3 carbonos da glicólise e ser convertido a

ATP e piruvato. O piruvato pode ser oxidado no ciclo de Krebs, para fornecer mais

energia. Além disso, algum NADPH pode ser convertido em NADH, que origina ATP,

quando este é oxidado pela cadeia transportadora de electrões. Uma vez que as pentoses

são intermediários na via, esta pode ser usada para catabolisar pentoses e hexoses.

Ainda que a via da pentose-fosfato seja fonte de energia em muitos

microrganismos, é mais importante na biossintese.

Via Entner-Doudoroff

Esta via inicia-se com as

mesmas reacções que as da via da

pentose-fosfato: a formação de

glucose 6-fosfato e 6-

fosfogluconato. Ao invés de ser

mais oxidado, o 6-fosfogluconato é

desidratado, formando 2-cet-3-

deoxi-6-fosfogluconato (KDPG), o

intermediário chave nesta via. O

KDPG é clivado pela KDPG

aldolase em piruvato e gliceraldeído

3-fosfato. Este último é convertido

em piruvato na porção terminal da

glicólise. O balanço é de 1 ATP, 1

Fig.7.13 – A Via da Pentose Fosfato

Fig.7.14 – Via Entner-Doudoroff

NADPH e 1 NADH por glucose metabolizada. A maioria das bactérias contêm a via

glicolítica e da pentose fosfato, mas algumas substituem a via Entner-Doudoroff pela

glicólise. A Entner-Doudoroff é geralmente encontrada nas Pseudomonas, Rhizobium,

Azotobacter, Agrobacterium, e outros géneros Gram negativos. Muito raras são as

bactérias Gram positivas a possuir esta via, sendo a Enterococcus faecalis rara

excepção.

Fig.7.15 – Distribuição das vias de degradação da glucose

Fig.7.16 – Reoxidação do

NADH durante a fermentação.

Tipos de fermentação

Na ausência de respiração, aeróbia ou anaeróbia, o NADH não é oxidado pela

cadeia transportadora já que não estão disponíveis aceitadores externos de electrões.

Ainda assim, o NADH produzido na glicólise durante a oxidação do gliceraldeído 3-

fosfato a 1,3-bifosfoglicerato pode ser oxidado a NAD+. Se o NAD+ não for regenerado,

a oxidação do gliceraldeído 3-fosfato cessará e a glicólise pára. Muitos microrganismos

resolvem este problema abrandando ou parando a actividade da piruvato desidrogenase

e usando o piruvato ou um dos seus derivados como aceitador de electrões, e hidrogénio

para a reoxidação do NADH num processo de fermentação. Isto pode levar à produção

de mais ATP.

O processo é tão eficaz que alguns quimiorganoheterotróficos não fazem a

respiração mesmo quando o oxigénio está disponível. Existem vários tipos de

fermentação, sendo que cada um é característico de um determinado grupo microbiano.

Em todos eles, o NADH é oxidado a NAD+ e o aceitador de electrões é o piruvato ou

Fig.7.17 – Tipos de fermentação

um seu derivado. O substrato é parcialmente oxidado, o ATP é apenas formado por

fosforilação ao nível do substrato e não é necessário oxigénio.

Algumas bactérias fermentam os açúcares a CO2 através da fermentação

alcoólica. O piruvato é descarboxilado a acetaldeído, que depois é reduzido a etanol

pela álcool desidrogenase com o NADH como dador de electrões.

Na fermentação láctica o piruvato é reduzido a lactato. É a mais comum e está

presente nos Bacillus. Os fermentadores do ácido láctico podem dividir-se em

fermentadores homolácticos, que usam a via da glicólise e reduzem directamente quase

todo o seu piruvato a lactato, através da lactato desidrogenase. Os fermentadores

heterolácticos formam quantidades substanciais de outros produtos que não o lactato;

muitos produzem lactato, etanol e CO2 pela via da fosfocetolase.

Muitas bactérias, especialmente as enterobactérias, conseguem metabolizar o

piruvato para originar ácido fórmico e outros produtos num processo denominado

fermentação do ácido fórmico. Este ácido pode ser convertido em H2 e CO2 pela

hidrogenoliase fórmica:

HCOOHCO2+H2

Existem dois tipos de fermentação do ácido fórmico:

1) Fermentação ácida mista, que resulta na excreção do etanol e de uma

mistura complexa de ácidos como o acético, láctico, succínico e fórmico.

Se a hidrogenoliase fórmica estiver presente, o ácido fórmico será

degradado a H2 e CO2. Esta via é verificada na Escherichia, Salmonella e

Proteus, entre outros.

2) O outro tipo é a fermentação butano-glicólica, característica dos géneros

Enterobacter, Serratia, Erwinia e algumas espécies de Bacillus. O

piruvato é transformado em acetoína, que é reduzida a 2,3-butanodiol

pelo NADH. Forma-se uma grande quantidade de etanol, juntamente

com uma pequena quantidade dos ácidos encontrados na fermentação

ácida mista.

Estes tipos de fermentação do ácido fórmico são muito úteis na identificação de

membros das Enterobacteriaceae. Os fermentadores ácido-mistos podem ser

distinguidos dos fermentadores butano-glicólicos de 3 maneiras:

1. Teste Voges-Proskauer, um procedimento colorimétrico que detecta a

acetoína, precursora do butanodiol, e que é positivo com fermentadores butano-

glicolíticos e não com os ácido-mistos. É utilizado para a identificação de

enterobactérias p.e.

Fig. 7.18 – O Teste Vogues Proskauer

2. Os fermentadores ácido-mistos produzem 4 vezes mais produtos ácidos do

que neutros, enquanto os outros formam maioritariamente produtos neutros. Assim, os

fermentadores ácido-mistos acidificam o meio de incubação em muito maior extensão.

Esta é a base do teste do vermelho de metilo. Este teste é positivo apenas para

fermentadores ácido-mistos porque o pH desce abaixo de 4.4 e a cor do indicador muda

de amarelo para vermelho.

Fig.7.19 – Teste do Vermelho de Metilo

3. O CO2 e H2 surgem em quantidades iguais da actividade da hidrogenoliase

fórmica durante a fermentação ácida mista. Na fermentação butano-glicólica produz-se

um excesso de CO2, sendo que a razão CO2 /H2 é de 5:1.

Os fermentadores do ácido fórmico por vezes geram ATP enquanto reoxidam o NADH.

Utilizam o acetil CoA para sintetizar acetil fosfato, que doará o seu fosfato ao ADP:

Acetyl-CoA + Pi CoASH + acetyl-P

Acetyl-P + ADP acetate+ ATP

Respiração

A respiração é um meio de oxidação de compostos orgânicos mais complicado

que a fermentação. Resulta na oxidação completa do substrato por um aceitador de

electrões externo. Em adição a uma via da glicólise, 4 componentes metabólicos ou

estruturais são necessários:

1. O Ciclo de Krebs: quando um composto orgânico é utilizado como substrato,

o ciclo de Krebs é utilizado para a completa oxidação desse substrato. O produto final

resultante é sempre o CO2.

2. Uma membrana e um Sistema Transportador de Electrões associado. O STE é

uma sequência de transportadores de electrões na membrana plasmática que transportam

os electrões do substrato através da cadeia até ao aceitador final dos mesmos. Os

electrões entram no STE num potencial redox muito baixo e saem a um potencial redox

relativamente elevado. Esta queda nos potenciais liberta energia que pode ser captada

pelas células durante a síntese de ATP pelo mecanismo da fosforilação por transporte de

electrões. O trabalho do STE estabelece uma força motriz protónica devido à formação

de um gradiente protónico ao longo da membrana.

3. Um aceitador de electrões exterior (“exterior” significa que não faz parte da

via). Para a respiração aeróbia o aceitador de electrões é o O2. O oxigénio molecular é

reduzido a H2O no último passo do sistema transportador de electrões. No processo

bacteriano de respiração anaeróbia, os aceitadores finais de electrões podem ser SO4 ou

S, NO3 ou NO2 ou outros compostos inorgânicos ou orgânicos, como o fumarato.

4. Uma ATPase transmembranar (ATP sintetase). Esta enzima utiliza a força motriz

protónica estabelecida na membrana (pelo STE) para sintetizar ATP na fosforilação por

transporte de electrões.

O diagrama da respiração aeróbia, abaixo representado, integra estes processos

metabólicos num esquema que representa o processo total do metabolismo respiratório.

Um substrato como a glucose é completamente oxidado a CO2 pelas vias combinadas da

glicólise e ciclo de Krebs. Os electrões removidos da glucose pelo NAD são inseridos

no STE da membrana. Com os electrões a atravessar o STE, uma FMP é estabelecida ao

longo da membrana. Os electrões reduzem o aceitador exterior, O2, a H2O. A FMP na

membrana é utilizada pela ATPase para sintetizar ATP na fosforilação oxidativa.

Fig.7.20 - Modelo da respiração aeróbia.

A reacção global para a respiração aeróbia a partir da glucose é:

Glucose + 6 O2 6 CO2 + 6 H20 + 688 kcal (total)

Que pode escrever-se:

Glucose 6 CO2 + 10 NADH2 + 2 FADH2 + 4 ATP

(2 NADH2 da glicólise, 8 NADH2 das duas voltas do ciclo de Krebs, 2 FADH2 das duas

voltas do ciclo de Krebs; 2 ATP da glicólise, 2 ATP (GTP) das duas voltas do ciclo de

Krebs)

Na E. coli, 2 ATP são produzidos por cada par de electrões introduzidos no STE

pelo NADH2. 1 ATP é produzido pelo par de electrões introduzido pelo FADH2. Assim,

a equação será:

Glucose + 6 O2 6 CO2 + 6 H20 + 20 ATP (ETP) + 2 ATP (ETP) + 4 ATP (SLP) + 688 kcal (total)

Dado que um total de 26 ATP são formados, com a libertação de 688 kcal de

energia, a eficiência da respiração é 26x8/688 - cerca de 30%.

Nas Pseudomonas, devido à natureza exacta do STE, 3 ATP são produzidos por

cada par de electrões introduzidos no STE pelo NADH2 e 2 ATP são produzidos por

cada par de electrões introduzido pelo FADH2. Assim, a reacção geral nas

Pseudomonas, utilizando as mesmas vias que a E. coli, é:

Glucose + 6 O2 6 CO2 + 6 H20 + 38 ATP + 688 kcal (total)

Dando uma eficiência correspondente de cerca de 45%.

Fig.7.21 – Respiração aeróbia na E.Coli

A respiração em alguns procariotas é possível utilizando aceitadores de electrões

que não o O2. É a designada respiração anaeróbia, realizada na ausência de oxigénio. Na

sua forma mais simples, representa a substituição ou uso de um composto que não o O2

como aceitador final de electrões na cadeia transportadora. Os aceitadores de electrões

utilizados pelos procariotas são descritos na figura seguinte.

electron

acceptor

reduced end

productname of process organism

O2 H2O aerobic respirationEscherichia,

Streptomyces

NO3 NO2, N2O or N2

anaerobic respiration:

denitrification

Bacillus,

Pseudomonas

SO4 S or H2Sanaerobic respiration: sulfate

reductionDesulfovibrio

fumarate succinate

anaerobic respiration:

using an organic e- acceptor

Escherichia

Fig.7.22 – Aceitadores de electrões nos procariotas

Fig.7.23 – O oxigénio é o aceitador de e- mais eficiente

A desnitrificação é um processo importante na agricultura por remover o NO3 do

solo. O NO3 é a maior fonte de fertilizantes de azoto. O uso do nitrato como aceitador

de electrões na respiração é uma alternativa usual ao uso de oxigénio. Bactérias do solo,

como as Pseudomonas  utilizam o O2 como aceitador se este estiver disponível,

desprezando o NO3. A E. coli utiliza o NO3 (assim como o fumarato) como aceitador,

sendo capaz de respirar no habitat intestinal, anaeróbio.  Fig.7.24 –

Bactérias desnitrificantes

As bactérias

anaeróbias têm um papel

fundamental nos ciclos

biológicos do carbono,

azoto e enxofre. No geral, convertem as suas formas oxidadas num estado mais

reduzido.

O teste da oxidase

Detecta a presensa da citocromo c oxidase, que é capaz de reduzir o O2 e

aceitadores de electrões artificiais. Importante na distinção das espécies Neisseria e

Moraxella (+) das Acinetobacter (-), e entero (todas -) das pseudomonas (+).Utiliza-se

para diferenciar os bacilos Gram -.

Fig.7.25 – O teste da Oxidase

O papel de filtro é humedecido com algumas gotas de tetrametil-p-

fenilenediamina 1%. Com um aplicador de madeira, as colónias de um meio de agar são

transferidas para o papel. Um teste positivo é o desenvolvimento de uma cor púrpura.

Teste de Hugh e Leifson

As bactérias utilizam a glucose e outros hidratos de carbono no seu

metabolismo. Algumas vias são oxidativas e outras fermentativas.

O teste de Hugh e Leifson, ou teste de oxidação-fermentação, é usado para

determinar qual a via utilizada. Aplica-se na diferenciação entre espécies,

principalmente de bacilos Gram -.

O produto final do metabolismo de um hidrato de carbono é um ácido. Este

método consiste num meio semi sólido em tubos, contendo glucose (ou outro HC) e um

indicador de pH.

Dois tubos são inoculados e um é imediatamente selado para ficar sob condições

anaeróbias. Os organismos oxidantes, como as Pseudomonas, produzem uma reacção

ácida apenas no tubo aberto. Os organismos fermentativos, como as

Enterobacteriaceae, produzem uma reacção ácida em ambos os tubos.

Os organismos que não conseguem quebrar a glucose aerobia nem

anaerobiamente, como a Alcaligenes faecalis, produzem uma reacção alcalina no tubo

aberto e não se verificam mudanças no tubo selado.

Fig.7.26 – Teste de Hugh e Leifson

Fig.7.27 Produção de energia nos quimiotróficos

Bibliografia da AULA nº7 PRESCOTT, Lansing M; “Microbiology”; 5th Edition; The McGraw−Hill Companies; 2002 Slides das aulas teóricas 2007/2008 http://textbookofbacteriology.net/metabolism.html http://www.hpa-standardmethods.org.uk/documents/bsopTP/pdf/bsoptp27.pdf

Sites consultados a 5 e 6 de Abril de 2008