AULA Nº 15 –AULA Nº 15 –Tecnologia do DNA recombinanteTecnologia do DNA recombinante

Fenómeno de restrição-modificação

As bactérias podem transferir fragmentos do seu DNA para outras bactérias

(fluxo genético horizontal); contudo este fenómeno tem restrições/barreiras para que

esta transferência se processe.

Barreiras à transferência horizontal de genes:

- Transformação: estado de competência, qualidade do DNA (o DNA que entra pode

não encontrar qualquer homologia com o da célula receptora).

- Transdução: receptores parietais (os fagos não infectam todas as células, o contacto e

consequente transferência de DNA depende da existência de receptores à superfície das

bactérias).

- Conjugação: receptores dos pili, exclusão de superfície (bactérias que são F+

apresentam este fenómeno, ou seja, modificam os receptores parietais para que a

conjugação com outras bactérias F+ não seja possível).

- Fenómeno de restrição-modificação: é a barreira mais importante, possibilitando à

bactéria a capacidade de reconhecer, ou não, como seu o DNA que é incorporado.

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Fig. 1 - Como exemplo tem-se o caso da infecção da E. coli K pelo fago λ. O fago

penetra na célula e incorpora o seu DNA no da bactéria, conduzindo à lise da mesma e a

produção de novos fagos (λK).

Colocando agora estes novos fagos em contacto com outras culturas de E. Coli

diferentes (B e C) é possível avaliar a sua eficiência de plaqueamento, ou seja, se existe

ou não restrição do novo hospedeiro (surgem placas de lise, pois ao formarem-se novos

fagos, as bactérias que os hospedaram são destruídas).

Eficiência de plaqueamento = nº de placas na estirpe em estudo/nº placas na estirpe

referência

Quanto maior este valor, menor a restrição.

Fig. 2 – Nesta figura avalia-se a eficência do plaqueamento (EP). É possível ver então

que a E.coli B hidrolisa o DNA do fago λK (veremos mais adiante que possui

endonucleases de restrição responsáveis por este fenómeno), enquanto a E. coli C não

impede a multiplicação deste fago.

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Fig. 3 – Esta figura serve apenas para demonstrar que a restrição neste caso é um

fenómeno recíproco (λB é restringido em E. coli K e o λK é restringido em E. coli B).

Fig. 4 – Este é mais um esquema do fenómeno mostrado na figura 3, em que 99,99% do

DNA dos fagos que entram nas bactérias são hidrolisados, mas 0,01% conseguem

incorporar-se, por um mecanismo de protecção que envolve metilação, que irá ser

explicado adiante.

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DNA recombinante

Este tipo de DNA combina material genético de duas ou mais fontes diferentes,

pela junção dos seus fragmentos, dando origem a uma nova sequência.

Uma das principais descobertas que levaram ao desenvolvimento da tecnologia

do DNA recombinante foi a existência de enzimas bacterianas que fazem cortes na

dupla cadeia do DNA. Estas enzimas, conhecidas com enzimas de restrição ou

endonucleases de restrição, reconhecem e digerem sequências específicas de 4 a 8

pares de bases. Normalmente, estas enzimas protegem a célula hospedeira, destruindo o

DNA do fago após a sua entrada na mesma. As células podem também proteger o seu

próprio DNA através da acção de metilases que, metilando nucleótidos específicos,

impedem a acção das enzimas de restrição que iriam actuar sobre esses nucleótidos.

As zonas de DNA reconhecidas pelas enzimas de restrição denominam-se locais

de restrição. Cada endonuclease tem o seu próprio sítio de reconhecimento.

As enzimas de restrição e as metilases funcionam pelo mecanismo de

competição enzimático.

Centenas de enzimas de restrição já foram purificadas e estão disponíveis

comercialmente. Os tipos I e III de endonucleases identificam o seu local de

reconhecimento e clivam o DNA alguns pares de bases antes ou depois deste. As

endonucleases tipo II, mais comuns, cortam o DNA directamente no local de

reconhecimento. Estas enzimas podem ser utilizadas para preparar fragmentos de DNA

contendo genes específicos ou porções destes. Por exemplo, a enzima de restrição

EcoRI, isolada da E. coli cliva o DNA entre G e A na sequência 5’ – GAATTC – 3’.

Como o DNA é antiparalelo esta sequência é invertida e oposta em ambas as cadeias.

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Fig. 5 – Do lado esquerdo mostra a acção da endonuclease EcoRI, ficando

separados os 2 fragmentos. Do lado direito encontra-se um fragmento que sofreu a

acção de uma metilase, que ao adicionar os grupos metilo protege o fragmento da acção

de uma endonuclease.

Tabela 15.1 - Exemplos de enzimas de restrição (classe II):

Muito cedo no desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, foi

evidente que a clonagem de DNA eucariótico em hospedeiros procariotas seria

preferível, no entanto, problemático. Isto porque o pré-mRNA eucariótico tem de ser

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processado e os procariotas não têm a maquinaria molecular necessária para tal função.

Em 1970, Howard Termin e David Baltimore resolveram este dilema, ao isolarem a

partir de retrovirus a enzima transcriptase reversa. Estes vírus têm um RNA genómico

que é copiado em DNA antes da replicação. Ao utilizar o mRNA processado como

molde para a síntese de cDNA, o processamento do RNA não é requerido enquanto, o

DNA clonado é expressado.

O próximo avanço foi conquistado em 1972 quando investigadores conseguiram

gerar, com sucesso, moléculas de DNA recombinante. Eles conseguiram que os

fragmentos emparelhassem as suas bases (annealing) e que estas fossem unidas

covalentemente através da DNA ligase. Assim, tornou-se possível a técnica de

introdução de DNA estrangeiro num vector de clonagem plasmídico.

Uma vez que os genes foram recombinados em vectores de clonagem, os

biólogos foram capazes de clonar genes específicos de vários organismos. Mas como se

pode distinguir os fragmentos de DNA que processam os genes de interesse dos

numerosos fragmentos cromossómicos produzidos pelas enzimas de restrição? Este

problema é resolvido por Southern blot. Esta técnica é capaz de detectar fragmentos de

DNA específicos de uma mistura de moléculas de DNA.

Vectores de clonagem e a criação de DNA recombinante

A tecnologia de DNA recombinante depende do aumento de muitas cópias da

sequência de nucleótidos escolhida. Para atingir este objectivo, genes ou outros

elementos genéticos são inseridos em vectores de DNA que se replicam no organismo

hospedeiro. Há 4 tipos principais de vectores: plasmídeos, bacteriófagos e outros vírus,

comídeos e cromossomas artificiais. Cada tipo tem as suas vantagens, pelo que a

selecção de um bom vector de clonagem é crítica para o sucesso de qualquer

experiência de clonagem. Todos os vectores sintetizados experimentalmente têm as

seguintes características: uma origem de replicação, locais únicos de restrição e um

marcador genético.

Plasmídeos (mais frequentemente utilizados)

Os plasmídeos são vectores de clonagem excelentes, uma vez que se replicam

autonomamente e são fáceis de purificar. Muitos plasmídeos diferentes são utilizados

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em biotecnologia, sendo que todos são originados de plasmídeos naturais que foram

modificados geneticamente.

- Origem de Replicação

A origem de replicação permite ao plasmídeo replicar-se no hospedeiro

microbiano independentemente do cromossoma. O pUC19, plasmídeo da E. coli, dá

origem a um grande número de cópias porque se replica 100 vezes numa geração. Um

número elevado de cópias é, normalmente, importante porque facilita a purificação dos

plasmídeos e consegue aumentar dramaticamente a quantidade de produtos clonados por

célula. Alguns plasmídeos têm duas origens de replicação, cada um reconhece um

hospedeiro diferente. Por exemplo, o YEP24 é um vector que se consegue replicar nas

leveduras e na E. coli.

- Marcador Genético

Seguidamente à incorporação dos vectores pelos hospedeiros temos de ser

capazes de discriminar entre aqueles que obtiveram o vector com sucesso e os que não.

Isto é conseguido pela presença do gene que codifica uma proteína que é necessária para

a sobrevivência da célula. Este gene denomina-se marcador selectivo. É o caso do

pUC19, este codifica o factor de resistência para a ampicilina.

- Local de restrição (sítio de multiclonagem ou “polilinker”)

A região contendo os sítios de clivagem das enzimas de restrição é encontrada

apenas uma vez no plasmídeo e é essencial para a inserção de DNA estrangeiro. A

clivagem de um único sítio de restrição gera um plasmídeo linear. Alternativamente,

dois locais diferentes e únicos nos sítios de multiclonagem podem ser clivados e a

sequência entre ambos substituída por DNA clonado. Em ambos os casos, o plasmídeo e

o DNA a serem inseridos são incubados na presença de DNA ligase para que as

terminações compatíveis formem ligações covalentes de hidrogénio e fosfodiéster entre

o fragmento de DNA clonado e o vector. Este passo necessita de energia, pelo que ATP

é adicionado a esta reacção de ligação in vitro.

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Fig. 6 – Plasmídeo pUC19

No pUC19 a zona “polilinker” está localizada na terminação 5’ do gene lacZ que

codifica para a β-galactosidase. Esta enzima corta o dissacarídeo lactose em glucose e

galactose. Quando o DNA clonado é inserido na zona “polilinker" o gene lacZ deixa de

estar intacto (é alterado), pelo que a enzima não é produzida. Isto pode ser detectado

pelas cores das colónias de bactérias que contenham este plasmídeo (Fig. 7): as colónias

ficam azuis quando a β-Gal degrada o seu substrato alternativo, X-Gal que é incluído no

meio. Isto é importante porque a ligação de DNA ao vector nunca é 100% eficiente,

pelo que quando uma mistura de ligações é introduzida nos hospedeiros, temos de ser

capazes de distinguir as células que transportam o plasmídeo no qual o DNA foi

inserido com sucesso. No caso do pUC19, todas as células de E.coli que incorporam o

plasmídeo são seleccionadas pela resistência à ampicilina. Entre estas colónias, as que

contêm o plasmídeo sem o DNA pretendido serão azuis (presença do gene LacZ),

enquanto que aquelas que contêm o pUC19 com o DNA clonado pretendido serão

brancas (gene da LacZ alterado). Este processo é o mais utilizado como forma de

reconhecer as células que transportam a sequência de DNA clonado a ser estudada.

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Fig. 7 – As bactérias que têm a enzima β-galactosidase, dão origem a colónias

azuis, as bactérias que não contêm a enzima dão origem a colónias brancas, estas

últimas, são as que têm no seu plasmídeo a sequência de DNA pretendido.

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Fig. 8 – No canto superior esquerdo da imagem encontra-se um plasmídeo que

apresenta resistência à tetraciclina e à ampicilina que é clivado na zona Tc, na qual é

introduzido um fragmento de DNA que fica integrado no plasmídeo pela acção de uma

DNA ligase, tornando-se este recombinante. O plasmídeo é introduzido na bactéria

através de choques. De seguida é cultivada num meio com ampicilina e noutro com

tetraciclina. Não sobrevive no 2º meio pois a sequência do plasmídeo que oferecia

resistência a este composto foi alterada pela introdução do novo fragmento de DNA.

Bibliotecas Genéticas

Há várias maneiras pelas quais o DNA pode ser clonado e obtido. Pode ser

sintetizado por PCR ou pode ser localizado no cromossoma através de Southern

Blotting. No entanto, a amplificação dos genes por PCR requer o conhecimento de

antemão da sua sequência nucleotídica e uma sonda adequada deve ser obtida para o

Southern Blotting. Em ambos os casos, uma vez que o fragmento de DNA é purificado

este é clonado utilizando um procedimento semelhante ao descrito para os plasmídeos

recombinantes.

No entanto, se os investigadores quisessem clonar um gene mas não tivessem

qualquer ideia de qual seria a sequência de DNA? Uma biblioteca de genómica tinha de

ser construída e monitorizada.

O objectivo da construção de uma biblioteca genómica é ter o genoma clonado

de um microorganismo em pequenos fragmentos separados em vectores. Idealmente o

genoma inteiro é representado, ou seja, a soma dos diferentes fragmentos é igual ao

genoma total. Assim, um grupo específico de genes pode ser analisado e isolado.

A construção de uma biblioteca genómica começa com a clivagem do genoma

em pequenos fragmentos pelas endonucleases de restrição. Estes fragmentos genómicos

ou são clonados em vectores e introduzidos numa bactéria ou são inseridos em

partículas de fagos que são utilizadas para infectar o hospedeiro. Em ambos os casos,

milhares de clones diferentes, cada um com um pedaço diferente de DNA genómico

introduzido, são criados. Para seleccionar o clone desejado da biblioteca é necessário

saber algo acerca da função do gene alvo ou do elemento genético. Se a biblioteca for

inserida num microrganismo que expressa os genes estranhos, é possível analisar cada

clone por uma proteína ou fenótipo específico. Por exemplo, se formos estudar uma

nova bactéria do solo e quisermos encontrar o gene que codifica a enzima necessária

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para a síntese do aminoácido alanina, a biblioteca pode ser expressada na E. coli ou

Bacillus subtilis que são auxotróficos para a alanina (necessitam desta no seu meio para

se desenvolverem). Seguidamente à introdução do vector da biblioteca nas células

hospedeiras, aqueles que agora crescerem sem alanina serão bons candidatos para o

fragmento da biblioteca que contém o gene biossintético da alanina. O sucesso deste

procedimento depende do pressuposto que a função do produto do gene clonado é

similar em ambos os organismos. Se este não for o caso, o hospedeiro tem de ser da

mesma espécie daquele a partir do qual a biblioteca foi construída.

Neste exemplo, a bactéria do solo mutante, que não tem o gene em questão, é

utilizada como hospedeira da biblioteca genómica. A completação genética da

deficiência de uma célula hospedeira é por vezes denominada de salvação fenotípica.

Fig 9 – Esta clonagem molecular baseia-se na separação de clones em que cada um

exprime um fragmento do DNA inicial, sendo este introduzido num vector, resultando

assim em várias copias diferentes após o cultivo do mesmo.

Para se proceder à detecção de um clone recombinante, utiliza-se uma sonda que

não é mais que um oligonucleótido com uma sequência bem definida, que será

“complementar” da sequência alvo de DNA. Para se utilizar esta técnica é necessário

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conhecer muito bem ambas as sequências. Se se juntar a sonda marcada a uma colónia e

esta apresentar o DNA com a sequência alvo, a sonda ficará retida.

Fig. 10 – Demonstra a ligação entre a sonda marcada e a sequência alvo. A colónia em

estudo é transferida para uma membrana de nitrocelulose e é posta em contacto com a

sonda. Após a lavagem, faz-se uma autoradiografia onde se evidenciam os clones que

hibridaram com a sonda.

PCR

É uma técnica que

permite a rápida síntese de

muitas cópias de fragmentos

específicos de DNA, a partir

de uma mistura complexa de

DNA. Os investigadores

obtêm grandes quantidades

de fragmentos de DNA para

fins experimentais e de

diagnóstico.

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O primeiro passo é sintetizar fragmentos de DNA com sequências idênticas às

sequencias alvo. Tal é possível utilizando um sintetizador de DNA. Estes

oligonucleótidos sintéticos contêm, normalmente, 20 nucleótidos e servem como

primers para a síntese de DNA. Os primers são um dos componentes da mistura de

reacção, que contém também o DNA alvo (normalmente, cópias inteiras de genoma),

uma DNA polimerase (termicamente estável), e cada um dos quatro

desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTPs). A PCR requer uma série de reacções

repetidas – ciclos. Cada ciclo contém 3 passos que são executados com precisão numa

máquina denominada termociclo (Fig. 11).

Fig. 11 – Fases do PCR.

No primeiro passo, o DNA alvo contendo a sequência a ser amplificada é

aquecido e desnaturado de forma a obter-se uma única cadeia de DNA. Seguidamente, a

temperatura é diminuída para que os primers formem ligações de hidrogénio (annealing)

com o DNA em ambos os lados da sequência alvo. Como os primers são muito

pequenos e estão presentes em excesso, as cadeias do DNA alvo emparelham

preferencialmente com estes do que novamente umas com as outras. Finalmente, a DNA

polimerase extende os primers e sintetiza cópias da sequência do DNA alvo usando os

dNTPs. Apenas as polimerases que são capazes de funcionar a temperaturas elevadas

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são empregadas na técnica de PCR. Duas das enzimas mais comuns são a Taq

polimerase originária da bactéria termofílica Thermus aquacticus e a vent polimerase

originária da Thermococcus litoralis. No fim de um ciclo, as sequências alvo em ambas

as cadeias foram copiadas. Quando o ciclo de 3 passos é repetido as duas cadeias do

primeiro ciclo são copiadas para produzir 4 fragmentos. Estes são amplificados no

terceiro ciclo para produzir 8 produtos. Assim, cada ciclo aumenta o número de

moléculas de DNA alvo, exponencialmente. Dependendo da concentração de moldes de

DNA e de outros parâmetros como a composição em G + C do DNA a ser amplificada,

é teoricamente possível obter um milhão de cópias de DNA alvo após 20 ciclos e um

bilião após 30 ciclos.

Fig. 12 – Amplificação exponencial de DNA.

A PCR é normalmente utilizada para obter grandes quantidades de uma

sequência especifica, daí que os produtos da reacção sejam retirados e purificados ao

fim de um determinado número de ciclos. Esta técnica não é quantitativa, ou seja, a

quantidade final de produtos nem sempre reflecte a quantidade de DNA molde presente,

antes da amplificação.

A técnica de PCR é uma ferramenta essencial para muitas áreas da biologia

molecular, medicina e biotecnologia. A PCR é também usada para gerar DNA para

sequenciação nucleótidica. Como a PCR amplifica DNA mesmo em quantidades

iniciais muito pequenas, é utilizada no diagnóstico de doenças como a SIDA,

tuberculose, hepatite, vírus do papiloma humano e outros agentes infecciosos e doenças.

Os testes são rápidos, sensíveis e específicos. A PCR é particularmente valiosa para a

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detecção de doenças genéticas como a fenilcetonúria e distrofia muscular. A técnica

também é empregue nas ciências forenses para a detecção de DNA “fingerprint”.

Fig. 13 – Exemplo da utilização de um plasmídeo como vector. Este é aberto com

BamHI e EcoRI e com estes dois também se cliva o gene da somatostatina. Dá-se assim

a fusão dos dois fragmentos. Mas para que o vector se possa expressar in vivo é

necessário adicionar na zona clivada pela EcoRI o lac control com a gene da β-

galactosidase. Assim dá-se a produção de somatostatina ligada à β-galactosidase, e estas

podem ser separadas por clivagem química com brometo de cianogénio.

Aplicação da tecnologia do DNA recombinante

São enormes e promissoras as aplicações desta tecnologia: 

1. Na identificação e tratamento de doenças condicionadas geneticamente;

2. No diagnóstico muito sensível de doenças infecciosas;

3. No diagnóstico pré-natal;

4. Na manipulação terapêutica de genes;

5. Na criação de organismos híbridos e transgénicos na medicina, agricultura e

pecuária;

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6. Na indústria farmacêutica;

7. Em estudos evolutivos e de descendência;

8. Na medicina legal, etc

Aplicações na industria farmacêutica

Tabela 15.2 - Exemplos de hormonas que podem ser produzidas pela tecnologia do

DNA recombinante e as suas aplicações.

No fim dos anos 70 as técnicas para clonar DNA foram utilizadas para produzir

insulina humana recombinante, e em 1982 teve inicio a produção comercial de insulina

por E.coli geneticamente modificada. Hoje em dia, apenas a insulina é produzida com

fins comercias. O resto dos exemplos apresentados no quadro, são apenas possibilidades

que estão a ser investigadas, de modo, a um dia estarem disponíveis a toda a população.

Aplicações Agrícolas

Os genes clonados

podem ser inseridos em

plantas tal como em células

animais. Uma forma bastante

popular de inserir genes nas

plantas, é com o plasmideo

recombinante Ti (plasmideo

indutor de tumores) isolado, a

partir da bactéria

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Fig 15 – Mostra a introdução de um gene de interesse no plasmídeo Ti e a inserção deste no genoma da planta

Agrobacterium tumefaciens. Também é possível doar genes formando protoplastos

(células vegetais desprovidas de parede celular) e tornando-os permeáveis ao DNA e

inserindo de seguida o DNA recombinante desejado. Este método é utilizado para a

produção de plantas transgénicas.

A engenharia genética tornou as plantas resistentes aos stresses ambientais. Por

exemplo, os genes utilizados para a desintoxicação de herbicidas glicofosfatados foram

isolados a partir da Salmonella, para serem introduzidos na planta do tabaco usando o

plasmideo Ti ficando, assim resistentes ao herbicida. São ainda encontradas variedades

de algodão resistentes aos herbicidas sendo possível desenvolver culturas transgénicas.

Isto tem uma importância considerável porque muitas culturas sofrem de stress quando

tratadas com herbicidas. As plantas resistentes não são afectadas pelos químicos

utilizados para controlar as plantações.

Outros exemplos de culturas geneticamente modificadas e comercializadas são

as batatas e tomate. O “Golden Rice” é uma cultura geneticamente manipulada que pode

causar um importante impacto no mundo desenvolvido. Comparado com o arroz não

modificado está espécie contêm duas vezes mais ferro, porque foi geneticamente

modificada de forma a expressar os seus genes numa maior magnitude. Também serve

como uma boa fonte de beta-carotenos devido a introdução de genes bacterianos.

Uma variedade de novas aplicações agrícolas está a ser explorada. Um grande

esforço tem sido aplicado para defender as plantas sem recorrer ao uso de pesticidas

químicos. Uma estirpe de Pseudomonas fluorescens contendo o gene para a toxina do

Bacillus thuringiensis está ser desenvolvida, de forma, a proteger as plantas dos insectos

responsáveis pelas pestes, uma vez que esta toxina os destrói.

Bibliografia usada para a aula 15: Slides das Teóricas

Apontamentos da aula

Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY , de Joanne M. Willey, Linda

M. Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 5ª edição,

McGrawHill, Cap. 15

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