AULA Nº 4 – Nutrição Microbiana;AULA Nº 4 – Nutrição Microbiana; Meios de CulturaMeios de Cultura

Para obter energia e formar ou renovar os componentes celulares, os organismos

necessitam de ser fornecidos de nutrientes ou outros materiais que o permitam fazê-lo.

Estes nutrientes são todas as substâncias usadas em processos de biossíntese e obtenção

de energia e que, por isso, contribuem para o crescimento microbiano.

Para além dos nutrientes, outros factores ambientais, como a temperatura, níveis de

oxigénio e a concentração osmótica do meio, são cruciais para o desenvolvimento e

crescimento microbiano.

Composição elementar da célula microbiana

O peso de uma célula microbiana seca é da responsabilidade dos seus elementos

fundamentais: carbono, oxigénio, hidrogénio, azoto, enxofre, fósforo, potássio, cálcio,

magnésio e ferro. Estes são chamados de macronutrientes (ou macroelementos) já que

são necessários à célula em quantidades relativamente abundantes.

Composição aproximada de uma célula

Elementos% peso seco

célulaLocalização/Função

Carbono 50

Componentes dos glícidos, lípidos, proteínas e ácidos núcleicos.

Oxigénio 20

Azoto 14

Hidrogénio 8

Fósforo 3

Enxofre 1

Potássio 1Actividade de proteínas, algumas das quais envolvidas na

síntese proteicaCálcio 0,5 Responsáveis pela resistência dos endosporos ao calor

Magnésio 0,5Co-factor, complexação com ATP e estabilização de

ribossomas e da membrana celular

Ferro 0,2Co-factor enzimático e de proteínas transportadoras de

electrões e estrutura dos citocromos.Manganês, Zinco,

Molibdénio, Cobre, Cobalto

~0,3Zn2+: regulação enzimática; Mn2+: transferência de grupos

fosfato; Mo2+: fixação de azoto; Co2+: componente da vitamina B12

Tabela 4.1 – Elementos constituintes da célula e respectivas funções.

Todos os microorganismos necessitam dos chamados micronutrientes ou

elementos residuais, para além dos mais abundantes macroelementos. Apesar de serem

necessários na maioria das células, estes elementos não parecem limitar o crescimento

bacteriano. Geralmente, integram a estrutura de cofactores ou mesmo de enzimas.

As funções e localização destes elementos estão discriminadas na tabela da página

anterior.

Apesar da composição em nutrientes ser tão variada, a célula não pode dispensar a

presença de nenhum deles. Assim, se apenas um dos nutrientes essenciais estiver em

deficiência, o crescimento será afectado, mesmo que as concentrações dos restantes

elementos estejam em valores apropriados.

Necessidades em Carbono, Hidrogénio e Oxigénio

Muitas vezes, as necessidades nestes três elementos são satisfeitas em simultâneo. O

carbono é necessário para o esqueleto dos compostos orgânicos, sendo que as

substâncias que fornecem o carbono contribuem igualmente com átomos de oxigénio e

hidrogénio. Para além de suprirem a célula com os átomos, os nutrientes orgânicos

funcionam igualmente como fontes de energia já que se encontram usualmente na forma

reduzida, possuindo electrões que podem doar a outras moléculas. Daí que, quanto mais

reduzido um composto orgânico está, mais energia contém, já que a transferência de

electrões de dadores reduzidos, com potencias de redução mais negativos, para

aceitadores oxidados com potencias mais positivos, leva à libertação de energia.

Uma fonte importante de carbono que, no entanto, não fornece hidrogénio à célula é

o CO2. Pensa-se que todos os microorganismos conseguem fixar o dióxido de carbono,

ou seja, reduzi-lo e incorporá-lo em moléculas orgânicas. No entanto, apenas os

organismos autotróficos podem usar o CO2 como fonte única ou principal de carbono.

Muitos organismos são autotróficos e grande parte deles realiza a fotossíntese, usando a

luz solar como fonte de energia. Outros obtêm energia a partir da oxidação de

compostos inorgânicos pela transferência dos seus electrões.

A redução do dióxido de carbono é energeticamente muito dispendiosa e nem todos

os organismos o usam como fonte de carbono quando na presença de compostos mais

reduzidos e complexos como a glicose. Os organismos que usam como fonte de carbono

moléculas orgânicas mais reduzidas são designados de heterotróficos, usando essas

moléculas tanto como fonte de carbono como de energia (a via glicolítica, por exemplo,

fornece tanto o esqueleto carbonado, como energia na forma de ATP e NADH).

Existem ainda alguns microorganismos com um metabolismo tão flexível quanto a

fontes de carbono, que poderão degradar o álcool amilico, a parafina e até mesmo a

borracha, como é o caso dos Actinomicetes. A Burkholderia cepacia pode utilizar mais

de 100 compostos carbonados enquanto que as bactérias metilotróficas podem

metabolizar compostos de um carbono, como o metano, metanol e ácido fórmico. Há

ainda evidências de que alguns microorganismos conseguem metabolizar substâncias

indigestíveis pelo humano, como pesticidas.

Classificação dos organismos quanto ao tipo de nutrição

Como visto anteriormente, os organismos são designados de autotróficos ou

heterotróficos, quanto às fontes de carbono que utilizam. Na tabela abaixo, encontram-

se as restantes classificações, de acordo com as fontes de energia e electrões

(hidrogénio).

Fontes de carbono, Energia e Electrões

Fontes de CarbonoAutotróficos Apenas CO2 ou como principal fonte

Heterotróficos Compostos orgânicos

Fontes de EnergiaFototróficos Luz solar

Quimiotróficos Oxidação compostos orgânicos e inorgânicos

Fontes de Electrões

Litotróficos Moléculas inorgânicas reduzidas

Organotróficos Moléculas orgânicas reduzidas

Tabela 4.2 – Classificação de organismos quanto às fontes de carbono, energia e

electrões

Apesar dos organismos poderem apresentar diversas formas de suprirem as suas

necessidades metabólicas, estes são organizados de acordo com a fonte principal de

carbono, energia e electrões. Maioritariamente, estes apresentam-se como

fotolitoautotróficos ou quimioorganoheterotróficos. As outras duas classes, com

menos organismos, são importantes ecologicamente, na medida em que habitam lagos

poluídos, utilizando os compostos orgânicos lá depositados para o seu metabolismo,

como é o caso dos seres fotoorganoheterotróficos. Os seres quimiolitoautotróficos

contribuem para as transformações químicas que continuamente ocorrem nos

ecossistemas como é o caso da conversão da amónia em nitratos ou da transformação do

enxofre em sulfatos.

Categorias Nutricionais

Tipo NutricionalFontes Energia – Electrões –

Carbono

Microorganismos

Representativos

Fotolitoautotróficos Luz – Compostos Inorgânicos – CO2 Cianobactérias, Algas

Fotoorganoheterotróficos Luz – Compostos OrgânicosBactérias fotossintéticas, Arqueas

halófitas

QuimiolitoautotróficosEnergia Química (inorgânica) – Compostos

Inorgânicos – CO2

Bactérias oxidificantes do Enxofre,

Bactérias Nitrificantes

QuimioorganohetrotróficosEnergia Química (orgânica) – compostos

Orgânicos

Protozoários, Fungos, Bactérias

Patogénicas com interesse industrial.

Tabela 4.3 – Categorias Nutricionais e características principais.

Como referido anteriormente, a propósito das necessidades elementares das

bactérias, há microorganismos com metabolismo bastante flexível. Assim, há

organismos que se apresentam como fotoorganotróficos na ausência de oxigénio, mas

na presença de níveis adequados de oxigénio, oxidam moléculas orgânicas, utilizando

energia química nelas contidas, actuando como quimioorganotróficos, como é o caso

das bactérias não sulfúricas. Em condições de oxigénio intermédias, tanto podem

realizar a fotossíntese ou o metabolismo oxidativo. Por seu turno, as Beggiatoa, são

capazes de degradar moléculas orgânicas e inorgânicas (CO2) como fontes de carbono.

Estes últimos são chamados de mixotróficos por combinarem os processos

quimiolitoautotróficos e o metabolismo heterotrófico.

Necessidades em Azoto, Fósforo e Enxofre

Para o crescimento normal, a célula microbiana precisa estar fornecida de outros

elementos, para além dos que obtém a partir dos compostos anteriormente discutidos. A

célula tem de incorporar em quantidade igualmente razoável átomos de azoto, fósforo e

enxofre, que apesar de poderem ser obtidos da mesma fonte que o carbono, oxigénio e

hidrogénio, têm normalmente fontes inorgânicas distintas.

Vejamos cada elemento mais detalhadamente.

Azoto: É necessário na síntese de aminoácidos, purinas e primidinas, alguns

glícidos e lípidos, cofactores enzimáticos e outras substâncias. Para ser assimilado, o

azoto, tal como os outros dois elementos, deve encontrar-se na forma reduzida, no

caso, na forma de NH3 (amónia). O principal destino deste elemento é a sua

incorporação em aminoácidos e tal é conseguido através da acção de enzimas como

a glutamato desidrogenase, glutamina sintetase (gasto de ATP) – ver reacção 4.1 –

ou glutamato sintase. A amónia pode ser obtida por dois processos distintos, a

redução assimilatória de nitratos ou a redução e assimilação atmosférica de

azoto (N2), usando o sistema da nitrogenase. O primeiro processo é realizado pela

maioria dos seres fototróficos e por alguns quimiotróficos, que reduzem o nitrato a

amónia, incorporando-a de seguida na redução assimilatória. O segundo processo é

realizado por variadas bactérias como as cianobactérias e a bactéria simbiótica

Rhizobium.

Reacção 4.1

Fósforo: Existe na constituição dos ácidos núcleicos, fosfolípidos, nucleótidos,

variados cofactores, proteínas e outros componentes celulares. Quase todos os

microorganismos utilizam o fosfato inorgânico como fonte de fósforo, sendo

capazes de o integrar directamente no seu interior. A incorporação de fosfato tem

sido extensamente estudada nas E. coli, bactérias que conseguem utilizar fosfato

orgânico e inorgânico. Alguns organofosfatos como a hexose – 6 – fosfato, são

capturados directamente, através da presença de proteínas transportadoras. Outros

organofosfatos são muitas vezes hidrolisados no periplasma pela acção da fosfatase

alcalina, levando à produção final de fosfato inorgânico, transportado depois através

da membrana. Quando existe à disposição da célula fosfato inorgânico, este

ATP ADP + Pi

Glutamina SintetaseNH3 + Ácido Glutamico Glutamina

atravessa a membrana através de canais proteicos. Esse transporte pode ser de

natureza passiva, quando o fosfato se encontra em grandes concentrações, sendo

transportado por sistemas Pit, ou de natureza activa, quando as concentrações

exteriores de fosfato são baixas, entrando na célula por meio de sistemas de

transporte PST (phosphate-specific transport) que apresentam grande afinidade

para o fosfato. Os sistemas PST são do tipo ABC, especificados mais abaixo.

Enxofre: Requerido na síntese de substâncias como os aminoácidos cisteína e

metionina, alguns glícidos, biotina e tiamina. Como no caso do azoto, a maioria dos

organismos utiliza o enxofre na forma reduzida, obtido a partir de sulfatos, na

redução assimilatória de enxofre.

Factores de Crescimento

Na presença das fontes dos seus elementos fundamentais como carbono, fósforo,

azoto e enxofre e de energia, os microorganismos têm a capacidade de crescer e de se

reproduzirem. Os microrganismos possuem as enzimas e as vias metabólicas que

necessitam para a síntese dos componentes celulares requeridos para a sua

sobrevivência. No entanto, muitos microrganismos não possuem uma ou várias enzimas

essenciais, não podendo sintetizar os seus componentes indispensáveis, devendo obtê-

los ou aos seus precursores através do ambiente externo. Os compostos orgânicos que

não podem ser sintetizados na célula e são essenciais ou percursores de essenciais, são

designados de factores de crescimento. Estes englobam-se em três grupos principais,

considerados clássicos: 1) aminoácidos – síntese de proteínas, 2) purinas e

pirimidinas – síntese de ácidos núcleicos e 3) vitaminas – parte integrante ou os

próprios cofactores enzimáticos – que existem em pequenas quantidades. Alguns

microorganismos necessitam de mais de uma vitamina como é o caso da Entrococcus

faecalis, que precisa de 8 vitaminas diferentes.

As bactérias que necessitam de factores de crescimento, já que não têm a capacidade

de os sintetizar, são designadas vulgarmente de auxotróficas, enquanto que a

Escherichia coli é prototrófica já que é capaz de se desenvolver num meio simples,

sendo que a única fonte de carbono é a glicose, pois possui uma maquinaria enzimática

muito desenvolvia que lhe permite obter todas as outras substâncias que necessita, a

partir desta. Algumas bactérias têm a capacidade de fornecer factores de crescimento a

outras colónias diferentes da sua, como observado na figura abaixo.

Figura 4.1 – Staphylococcus aureus fornece NAD ao Haemophilus influenzae

O conhecimento da especificidade dos factores de crescimento permite quantificar a

contribuição para o crescimento de determinada substância. Através da realização de

uma curva de calibração realizada a partir de diferentes culturas de uma determinada

bactéria (pode ser Lactobacillus ou Streptococcus) com diferentes concentrações de

factor de crescimento, observa-se o crescimento total da cultura. Assim, para determinar

a quantidade de factor de crescimento numa cultura problema, compara-se o valor com

os da curva de calibração, através de extrapolação de valores. Estes ensaios de

quantificação são simples, sensíveis e específicos, sendo usados em substituição a

métodos mais avançados, no caso da biotina e da vitamina B12.

Muitos microorganismos são capazes de sintetizar vitaminas, o que tem sido

utilizado na indústria. Muitas vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis são obtidas

através de fermentações industriais, como é o caso da riboflavina (Cândida, Ashbya),

coenzima A (Brevibacterium), vitamina B12 (Pseudomonas), vitamina C (Erwinia), β-

caroteno (Dunaliella) e vitamina D (Saccharomyces).

Mecanismos de Transporte de Nutrientes

O primeiro passo no uso dos nutrientes é a sua captura pela célula. Este processo

deve ser específico, na medida em que nutrientes sem interesse para a célula não devem

ser assimilados, o que é conseguido pelo facto de a membrana ser selectiva e ser

permeável apenas a alguns tipos de substâncias. Como os microorganismos se

encontram normalmente em ambientes com concentrações baixas de nutrientes,

usualmente diluídos, é necessário que estes sejam transportados activamente, isto é,

contra o gradiente de concentração.

Existem diversos nutrientes que a célula tem de assimilar e já que este é um

processo específico, não é de estranhar que a célula possua diversos meios de captura

dessas mesmas substâncias. Os mais importantes mecanismos de transporte são a

difusão facilitada, o transporte activo e a translocação de grupo, sendo que os dois

últimos se realizam com gasto de energia e contra o gradiente de concentração.

Difusão facilitada

Algumas substâncias como o glicerol conseguem atravessar a membrana por

difusão passiva. Este é o processo no qual as moléculas se movem de uma zona de

concentrações mais elevadas para uma zona de concentrações mais baixas, ou seja, a

favor do gradiente de concentração. Como demonstrado na figura 4.2, a taxa de difusão

é proporcional à diferença de concentrações entre o interior e o exterior da célula e, por

isso, à medida que os nutrientes vão entrando, se não forem usados de imediato, essa

taxa de difusão diminui, já que a concentração no interior da célula aumenta. Moléculas

pequenas como H2O, O2 e CO2, atravessam a membrana por este processo simples.

Figura 4.2 – Relação entre gradiente de concentração e a taxa de difusão, nos processos

de difusão simples e facilitada.

Gradiente de Concentração

Taxa

de

Dif

usão

Moléculas maiores como iões e substâncias polares não conseguem atravessar a

membrana pelo processo anterior. Ao invés, a taxa de difusão é aumentada pela

presença de proteínas transportadores, designadas de permeases, que se encontram

integradas na membrana plasmática, sendo este novo processo designado de difusão

facilitada. Ao contrário da difusão simples, este mecanismo permite que pequenas

diferenças no gradiente de concentração aumentem o transporte de nutrientes. Neste

caso, os valores da taxa de transporte e do gradiente de concentração não são

proporcionais, sendo que, como observado na figura 4.2, o gráfico atinge um patamar

em que o transporte é constante, correspondendo ao momento em que todas as

permeases estão saturadas com nutrientes, não aumentado a taxa de transporte, mesmo

que se aumente a quantidade de nutrientes disponíveis, o que acontece com gráficos de

cinética enzimática. Esta não é a única semelhança com reacções enzimáticas, já que

também as permeases são específicas para determinadas substâncias. O que acontece é

que assim que o nutriente se liga

à parte exterior da proteína,

provoca uma mudança de

conformação na mesma, havendo

libertação da substância para o

interior. A proteína irá

eventualmente regressar à sua

conformação inicial, permitindo

a captura de novas substâncias,

sendo então um processo

reversível. (figura 4.3)

Apesar da existência de proteínas de membrana, este processo só é possível na

presença de um gradiente de concentração. Assim que este desaparece o transporte

cessa, podendo ser mantido, no entanto, no caso dos eucariotas, com a passagem dos

nutrientes para outros compartimentos celulares ou, no caso dos procariotas, ser

utilizado rapidamente no metabolismo.

Transporte activo

Quando os nutrientes já se encontram em concentrações elevadas dentro da célula,

apesar da difusão facilitada ser um processo bastante eficiente, este não tem a

capacidade de transportar moléculas contra o seu gradiente de concentração. Esta

Figura 4.3 – Modelo da Difusão Facilitada

situação ocorre na maioria das vezes já que, como foi referido, as bactérias encontram-

se variadas vezes em ambientes muito diluídos. Neste caso, dois processos são vitais, o

transporte activo propriamente dito e a translocação de grupo.

O transporte activo permite a passagem de nutrientes para um compartimento de

concentração superior, tendo, para o efeito, de gastar energia metabólica. Este é um

processo em muito semelhante à difusão facilitada, já que faz igualmente uso de

permeases, tão especificas quanto as anteriores, diferindo no gasto de energia e na

capacidade dos últimos em desenvolverem gradientes de concentração mais definidos.

Assim, qualquer inibidor que bloqueie a produção de energia vai igualmente impedir o

transporte de substâncias para o interior da célula.

Os sistemas de transporte activo são do tipo ABC (ATP-binding cassette), existente

nas bactérias, archae e nos eucariotas. Normalmente, estes sistemas são constituídos por

dois domínios membranares, hidrofóbicos, associados na sua face citosólica a dois

domínios de ligação ao ATP (ver figura 4.4). Os domínios intramembranares formam

um poro enquanto que os domínios de ligação do ATP se ligam a este, hidrolizando-o,

permitindo então, o transporte da substância. Estes transportadores utilizam ainda

proteínas de ligação ao substrato que se localizam no periplasma em bactérias gram-

negativas ou que se encontram associadas aos lípidos membranares da face externa das

bactérias gram-positivas. As substâncias que entram nas bactérias garm-negativas têm

de atravessar a membrana externa antes de passarem pelos transportadores ABC,

podendo neste espaço ocorrer outros tipos de transporte activo. Se a molécula for

pequena pode ser usada uma porina vulgar como as OmpF enquanto que se a molécula

for de maiores dimensões devem passar por meio de porinas especializadas.

Figura 4.4 – Esquema de transportadores ABC

As bactérias podem também dispor de energia para este tipo de transporte, a partir

de gradientes protónicos através da membrana. Um exemplo muito estudado é o da

permease de lactose da E. coli que transporta uma molécula de lactose para o interior da

célula, ao mesmo tempo que um protão entra dentro da célula (este gradiente protónico

é conseguido pela actividade da cadeia respiratória – figura 4.5, (1)). Este tipo de

transporte em que duas moléculas são transportadas na mesma direcção é designado de

simporte. Pensa-se igualmente, que a ligação de um protão a uma proteína

transportadora muda a sua forma, aumentando a afinidade para a substância que é co-

transportada. A E. coli usa este simporte para transportar aminoácidos e ácidos

orgânicos como o succinato e o malato.

O gradiente protónico pode ser usado no transporte activo de forma indirecta,

quando associado à formação de um

gradiente de iões sódio. Por exemplo, o

transporte de sódio nas E. coli liberta

sódio para o exterior enquanto existe

movimento de protões para o interior,

transporte designado de antiporte. (figura

4.5, (2)) Este gradiente de sódio formado à

custa do movimento de protões é que vai

permitir o transporte de glícidos e

aminoácidos, já que a sua ligação às

proteínas transportadores (figura 4.5, (3))

provoca uma mudança de conformação

das mesmas fazendo com que as

moléculas se orientem na direcção do

interior da célula (figura 4.5, (4)). Como a

concentração em sódio no interior é baixa,

este irá dissociar-se da proteína, passando

para o interior da célula, assim como a

molécula a transportar. (figura 4.5, (5)) Figura 4.5 – Transporte activo, usando

gradientes de protões e sódio

Muitas vezes os microorganismos possuem mais de um sistema de transporte para o

mesmo nutriente, como é mais uma vez o caso da E. coli que possui 5 sistemas de

transporte para a galactose, 3 para os aminoácidos leucina e glutamato e 2 para o

potássio. A importância desta variedade reside na possibilidade de competição que

promove a adaptação a vários ambientes já que podem diferir a nível da afinidade, da

energia gasta ou mesmo na regulação.

A translocação de grupo é um mecanismo de transporte activo no qual as

moléculas a transportar sofrem alterações químicas enquanto são levadas para o interior

da célula. O grupo mais estudado é o sistema fosfoenolpiruvato: açúcar

fosfotransferase (PTS) que transporta uma grande variedade de açúcares nas células

procarióticas através da sua fosforilação usando o fosfoenolpiruvato (PEP) como dador

de fósforo, segundo a reacção abaixo:

Reacção 4.2 – PEP + Açúcar (fora célula) Piruvato + Açúcar – P (dentro célula)

O sistema PTS consiste em duas enzimas, EI e EII e uma proteína de baixo peso

molecular, estável ao calor, HPr.

Figura 4.6 – Translocação de grupo: o sistema de transporte PTS

A HPr e a EI são citoplasmáticas, enquanto que a EII é mais variável na sua

estrutura, composta frequentemente por três domínios: EIIA (ou EIII) que é

citoplasmática e solúvel, podendo estar ou não ligada ao domínio seguinte consoante o

açúcar que é transportado, a EIIB, hidrofilica, mas frequentemente associada ao terceiro

domínio e EIIC, uma proteína hidrofóbica inserida na membrana. O processo de

transporte, exemplificado na figura 4.6, consiste na passagem de um fósforo altamente

energético, do fosfoenolpiruvato, com auxílio da EI e da HPr, para a EII, através dos

seus domínios hidrofílicos (1). Assim, a molécula de açúcar atravessa a membrana

através do domínio EIIC (2), sendo depois fosforilada pelo domínio EIIB (3). A enzima

EII é específica para alguns açúcares variando em cada sistema PTS, enquanto que a

enzima EI e a proteína HPr são comuns a todos os sistemas PTS.

Este sistema está largamente distribuído nos procariotas, à excepção de alguns

Bacillus que possuem o sistema PTS e ainda o glicolítico, enquanto que algumas

bactérias aeróbias parecem não apresentar PTS. As famílias Escherichia (as E. coli

transportam glicose, frutose, manitol, sacarose e outros por este mecanismo),

Salmonella, Staphylococcus e outras bactérias anaeróbias facultativas possuem estes

sistemas, assim como algumas aeróbias obrigatórias.

Estas proteínas do sistema fosfoenolpiruvato: açúcar fosfotransferase actuam

também como quimioreceptores para a quimiotaxia.

Transporte do ferro

A assimilação de ferro nos microorganismos está dificultada, já que o ião férrico

(Fe3+) e os seus derivados são extremamente insolúveis, o que o torna pouco disponível

para ser capturado. Assim, os microorganismos (bactérias e fungos) desenvolveram

mecanismos de assimilação de ferro, através da secreção de sideróforos – moléculas de

baixo peso molecular que são capazes de complexar o ferro férrico, provendo a célula

com esse ião.

Estas moléculas podem ser hidroxamatos ou fenolatos-catecolatos. Muitos fungos

produzem ferricromo (figura 4.7, (a)), um hidroxamato, enquanto que as E. coli

produzem um catecolamato designado de enterobactina. (figura 4.7, (b)) Pensa-se que

cada ião ferro é complexado por três sideróforos formando um complexo octaédrico

(figura 4.7, (c)) (número de coordenação igual a seis).

Assim que o complexo ferro-sideróforo atinge a superfície da célula liga-se ao seu

receptor podendo ser transportado inteiramente para o interior da célula por

transportadores do tipo ABC ou libertar o ferro directamente. Nas E. Coli o ião ferro

libertado no espaço periplasmático é transportado pela membrana com auxílio de um

transportador. Após entrar na célula é

reduzido à sua forma ferrosa (Fe2+) para

ser incorporado em citocromos e enzimas.

O ferro é tão importante para a célula

que podem existir vários meios de

aquisição de maneira a que a célula seja

abastecida de acordo coma s suas

necessidades.

Meios de Cultura

Os estudos de microbiologia dependem largamente na habilidade para crescer e

manter os microorganismos em laboratório, o que apenas é possível quando existem

meios de cultura apropriados.

Um meio de cultura pode ser definido como uma preparação líquida ou sólida

usada para o crescimento, transporte e preservação de microorganismos em laboratório.

Para ser efectivo deve conter os nutrientes necessários ao crescimento do

microorganismo em questão, sendo que meios específicos são bastante importantes para

a identificação, isolamento e estudos acerca de um determinado microorganismo. O

conhecimento de habitat de uma bactéria permite a aproximação da constituição do

respectivo meio de cultura.

Classificação dos meios de cultura quanto à composição

Meios sintéticos: estes meios são quimicamente definidos, já que todos os seus

componentes são conhecidos. São usados em culturas de microorganismos

fotolitoautotróficos que conseguem crescer em meios relativamente simples

contendo CO2 como fonte de carbono (sob a forma de Na2CO3 ou HCO3-), nitrato ou

amónia como fonte de azoto, sulfato, fosfato e outros minerais. (tabela 4.4) Alguns

Figura 4.7 – Sideróforos: (a) Ferricromo –

evidenciado o grupo hidroxamato; (b) Enterobactina

– evidenciado o grupo catecol; (c) Complexo Ferro-

Enterobactina

organismos quimioorganoheterotróficas podem crescer em meios constituídos

apenas por glicose como fonte de carbono e sais de amónia como fonte de azoto.

Meio de Cultura Sintético

Substância Função Quantidade (grama)

Glucose Fonte Carbono e Energia 1

NH4PO4 Fonte de Azoto; Tampão 5

K2HPO4 Fonte de Fósforo; Tampão 1

NaCl Sal Inorgânico 5

MgSO4.7H2O Fonte de Magnésio e Enxofre 0,2

Água destilada Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

Tabela 4.4 – Exemplo de um meio de cultura sintético

Meios complexos: ao contrário dos meios sintéticos, estes são constituídos por

substâncias acerca das quais não se conhece a composição química exacta. Entre

elas encontram-se as peptonas – fracções de proteínas hidrolisadas, contendo, por

isso, aminoácidos e péptidos, resultante da digestão proteolítica de fontes de

proteínas, extractos de carne – contêm aminoácidos, nucleótidos, minerais,

vitaminas e extractos de leveduras – fontes de vitamina B assim como de

compostos carbonados e nitrogenados. Os meios complexos mais comuns são o

caldo nutritivo (tabela 4.5), o caldo de soja triptica e o agar de MacConkey (tabela

4.6).

Caldo Nutritivo Vulgar

Substância Função Quantidade (grama)Extracto de carne Fonte de péptidos, glícidos e vitaminas 3

Peptona Fonte de péptidos e aminoácidos 5

NaCl Mantém equilíbrio osmótico 5

Água Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

Tabela 4.5 – Constituição de um caldo nutritivo vulgar

Meios enriquecidos: meios aos quais são adicionados sangue ou soro e outras

substâncias nutritivas, cujo objectivo é promoverem o desenvolvimento de bactérias

com crescimento lento.

Classificação dos meios de cultura quanto ao estado físico

Os meios podem ser classificados como líquidos, sólidos ou semi-sólidos. Quando

se deseja um meio sólido, um meio líquido pode ser solidificado através da adição de

agar – polímero sulfatado composto principalmente por D-galactose, 3,6-anidro-L-

galactose e ácido D-glucorónico, extraído das algas vermelhas – usando-se

normalmente agar a 1,5%. O agar é muito popular para este fim, pois após ter sido

fundido em água fervida pode ser arrefecido sem endurecer até aos 40º C. É também um

bom agente endurecedor pois não é degradado pela maioria das bactérias.

Para solidificação pode usar-se igualmente sílica gel para o crescimento de bactérias

autotróficas em meios sem substâncias orgânicas ou para determinar as fontes de

carbono de seres heterotróficos em meios com diferentes substâncias orgânicas.

Para meios semi-sólidos acrescentam-se menores quantidades de agar,

normalmente, agar a 7%.

Classificação dos meios de cultura quanto à função

Meios selectivos: Como o próprio nome indica, estes meios promovem o

crescimento de uma espécie específica. Por exemplo, os sais biliares ou corantes

como a fucsína e o cristal violeta inibem o crescimento das bactérias gram-positivas,

não afectando, no entanto, o desenvolvimento das gram-negativas. Vários tipos de

agar são utilizados na detecção das E. coli e outras bactérias relacionadas contendo

substâncias que inibem o crescimento de bactérias gram-positivas. Esta

selectividade também pode ser conseguida usando nutrientes que determinada

cultura metaboliza, como o caso da celulose, usada no isolamento de bactérias que

digerem celulose.

Meios diferencias: estes são meios que permitem a distinção entre diferentes

tipos de bactérias, permitindo identificar determinado microorganismo de acordo

com as suas características biológicas. O agar sanguíneo é simultaneamente um

meio enriquecedor e diferencial. Permite a distinção entre bactérias hemolíticas ou

não hemolíticas. As primeiras produzem zonas limpas à volta das suas colónias,

resultando na destruição das hemácias (figura 4.8). Por seu turno o agar de

MacConkey (tabela 4.6) é ao mesmo

tempo um meio diferencial e selectivo.

Como contém lactose, as colónias que

fermentam a lactose surgem rosadas –

também podem ser identificadas com

indicador de pH (ácido láctico) – podendo

ser distinguidas facilmente das restantes

colónias, já a presença de sais biliares

confere-lhe características de um meio

selectivo.

Agar MacConkey

Substância Função Quantidade (grama)

Digesto pancreático de gelatina Fonte péptidos e aminoácidos 17

Digesto pancreático de caseína Fonte péptidos e aminoácidos 1,5

Digesto de carne animal Fonte péptidos, vitaminas e nucleótidos 1,5

Lactose Indicador diferencial 10

Sais biliares Inibidor gram-positivas 1,5

NaCl Mantém equílibrio osmótico 5

Vermelho neutro Indicador pH 0,03

Cristal violeta Inibidor gram-positivas 0,001

Agar Agente solidificante 14

Água destilada Solvente; Fonte de Hidrogénio 1000 mL

Tabela 4.6 – Constituição do Agar de MacConkey

Isolamento de culturas puras

No meio natural, as bactérias crescem em populações complexas e misturadas,

contendo várias espécies diferentes. Para o estudo de uma cultura individual é

fundamental que essa espécie esteja isolada das restantes, isto é, uma cultura pura. As

técnicas de purificação são de grande importância, pois muitos agentes patogénicos

causadores das principais doenças bacterianas humanas foram isolados, o que permitiu o

estudo aprofundado dessas culturas específicas.

Placas de cultura espalhadas

Quando as culturas estão suficientemente espalhadas numa superfície de agar que

permita que todas as células cresçam em colónias completamente separadas, cada

colónia representa uma cultura pura. A chamada cultura espalhada é uma maneira fácil

e simples de obter culturas puras (figura 4.9). São conseguidas através da transferência

de um pequeno volume (deve conter entre 30 e 300 células) de uma solução diluída

(figura 4.9, (2)), de uma mistura microbiana, para o centro de uma placa de agar, sendo

depois espalhada igualmente em toda a sua dimensão (figura 4.9, (4)), com uma ansa

esterilizada (figura 4.9, (3)). As células dispersas na placa irão desenvolver-se me

colónias separadas, podendo ser usada para a contagem da população microbiana.

Figura 4.9 – Técnica das placas de cultura espalhadas

Placas de cultura: método das estrias

Nesta técnica, a mistura microbiana é transferida

para uma caixa de petri, coberta de agar, com uma ansa

esterilizada, desenhando bandas na superfície, com

diversos padrões. Durante o processo, células isoladas,

libertadas durante a dispersão da mistura, irão

desenvolver-se em colónias separadas (figura 4.10).

Em ambos os processos descritos, o sucesso do

isolamento depende da distância entre as células.

Culturas em placas inoculadas

Figura 4.10 – Colónias bacterianas

em agar, fixadas pelo método das

placas de cultura em bandas

É uma técnica usada largamente em colónias de bactérias e fungos. A amostra

original é diluída várias vezes (de acordo com a figura 4.11), de maneira a reduzir a

população microbiana para obter colónias separadas quando colocadas na placa.

Pequenos volumes das amostras diluídas são misturadas com agar liquido, arrefecido

aproximadamente aos 45º C, sendo vertidas directamente para caixas de petri estéreis.

Após o endurecimento do agar, cada célula é fixada e forma uma colónia individual. As

placas que contêm entre 30 a 300 colónias são contadas.

Figura 4.11 – Técnica das placas estéreis

Morfologia e crescimento das colónias

As diferentes formas e tamanho das colónias (figura 4.12), permitem a sua

identificação de uma maneira

simples mesmo quando existem

diversas colónias na mesma

cultura, servindo igualmente para

o seu isolamento. No ambiente

natural, muitas bactérias e fungos

parecem crescer em biofilmes,

podendo, no entanto, formar

colónias discretas.

Figura 4.12 – Morfologia de Colónias Bacterianas

Normalmente, o crescimento mais rápido das células ocorre na periferia da colónia

podendo mesmo ocorrer autólise nas antigas porções centrais das colónias. Estas

diferenças de velocidade estão relacionadas com os

gradientes de nutrientes, oxigénio e os próprios

produtos tóxicos produzidos pelas colónias. Assim,

à periferia existem quantidades perfeitas de

oxigénio e nutrientes, enquanto que no centro, que é

mais denso, a difusão está dificultada, assim como a

eliminação de produtos tóxicos levando ao

afrouxamento ou mesmo paragem do crescimento

no centro da colónia.

As bactérias a crescer me meios sólidos de agar

podem formar colónias de formas complexas. Esses

padrões dependem da disponibilidade dos nutrientes

e da dureza da superfície. Ainda é desconhecido o

mecanismo exacto da formação de tão distintos

padrões, no entanto julga-se estar relacionado com a

concentração de nutrientes, a quimiotaxia bacteriana

e mesmo a presença de liquido à superfície da

colónia, assim como a comunicação celular.

Bibliografia usada para a aula nº 4:

Slides das Teóricas

Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY , de Joanne M. Willey, Linda M.

Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 5ª edição, McGrawHill,

Cap. 5

Figura 4.13 – Exemplos de colónias de Bacillus subtillis