aspectos fundamentais de em ionizar é preciso: (a ... · espectro de massas pela técnica de...
TRANSCRIPT
Aspectos fundamentais de EM
• Ionizar é preciso:(a) ionização da amostra direta ou indiretamente;(b) método tradicional: ionização por impacto de elétrons resultando na formação de M+ seguida de fragmentação induzida por excesso de energia interna do íon molecular;(c) ionização química: método mais suave de ionização resultante de uma reação, em fase gasosa, entre íons e moléculas neutras;(d) outros métodos mais recentes.
• Analisar m/z é preciso:Cenas dos próximos capítulos!!
• Analito depositado
numa “matriz” orgânica,
que possui absorção
intensa no do laser (
= 337 nm para laser de
N2);
• Dessorção por um laser
pulsado (ns) de alta
intensidade;
• Matrizes típicas: ácido
2,5-dihidroxibenzóico;
ácido 3,5-dimetóxi-4-
hidroxicinámico; ácido
5-clorosalicílico;
• Espectro resultante
inclui íons (M+H)+, e
outros com prótons
adicionais, retirados da
matriz.
MALDI
Espectro de um anticorpo monoclonal
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
Mass (m/z)
0
10000
20000
30000
40000
50000 100000 150000 200000
MH+
(M+2H)2+
(M+3H)3+
MALDI TOF spectrum of IgG
Espectro (MALDI) de poli-metil metacrilato <M> = 7100 Da
Espectro de
complexo de
Pt obtido por
ionização
MALDI
Positive-ion (a) and negative-ion (b) MALDI mass spectra of CS-D tetra with pmg.
Polysulfated-Derived Oligosaccharides
Aplicações de MALDI
• Identificação de proteínas de elevada massa molecular
( > 100.000 Da).
• Espectros apresentam proteínas grandes com íons
[M+H]+, [M+2H]2+, e [M+3H]3+.
• Proteínas pequenas apresentam espectros apenas
com [M+H]+.
• Alta sensibilidade.
• Espectros de polímeros sintéticos.
• Imagem por espectrometria de massas!!
IMS allows for distinction of different molecular species of β-amyloid plaques in an
Alzheimer's disease model.
Seeley E H , and Caprioli R M PNAS 2008;105:18126-18131
©2008 by National Academy of Sciences
Métodos de ionização a pressão atmosférica
• APCI: ionização química a pressão atmosférica.
• APPI: ionização química por fotoionização.
• ESI: electrospray
• DESI: electrospray por dessorção
• DART: (direct analysis in real time).
APCI (atmospheric pressure chemical ionization)
Formação de íons em APCI (atmospheric pressure chemical ionization)
Aplicações de APCI
Tipo de amostras
• Substancias de polaridade e massa molecular
mediana: PAH, PCB, ácidos graxos,
esteroides, ftalatos,...
• Substancias sem sítios ácidos ou básicos.
• Substancias contendo heteroátomos: uréias,
carbamatos, ..
• Substancias a serem evitadas: substancias
instáveis a temperaturas mais altas, massa
molecular elevada,...
Exemplos de
espectros obtidos
por APCI no modo
positivo e no
modo negativo
Positive APCI spectra
of n-octane in synthetic
air at
30 °C, Vcone 1 V and at
different n-octane
concentrations of (a) 6
ppm, (b) 30 ppm, (c) 65
ppm, (d) 90 ppm, and
(e) 150 ppm
APPI (atmospheric pressure photoionization)
Espectro de
massas obtido no
modo negativo por
APPI
Espectro de massas de íons positivos obtido por APPI de petróleo
venezuelano (cortesia do líder imortal HC)
Comparação entre métodos de ionização:
exemplo da cafeína
Comparação entre métodos de ionização:
exemplo da budesonida (anti-inflamatório)
Extraindo íons da solução...
ESI – electronspray ionization
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +++
+
+
+ +
+
++
+
++
++
+
++
+ +
+
++
++
+
++++
+
+
++
++
+++
+
++
+
++++
+
+ ++++
++
+++++++
+++
++ +++ ++
+ ++
+
++
+
+
+
+++
+
++
++++
++++++
+++
+
+
++
+
++
+
+
+++
++++
+++
+
++
++++++
+++
++++++
++++
++++++
++++
++
+++++
+++
++
+ + + + + + + + +++
++ +
+++
++
++
+ + + + + + + + +++
++
1-10 kV
Solução
~10-5M
Capilarborossilicato
N2 paradessolvatação
Regiões de vácuoPressão atmosférica
Cone deTaylor
fissão
íonssolvatados
íonssem
solvente
ver
CRM (charge residue) vs. IDM (ion desorption)
IDM - Íons desorvidos da
superfície da gotícula
CRM - Íons perdem
solventes até
dessolvatarem
completamente
Procedimento típico em ionização “electrospray”
• Substancia dissolvida numa mistura, p.ex. agua-metanol, é injetada diretamente, ou por HPLC, ou por eletroforese capilar.
• Íons são formados a partir das gotas a pressão atmosférica e formam um jato por expansão livre. O mecanismo exato ainda é objeto de especulações. Amostragem ocorre através de um “skimmer”, e introduzidos no alto vácuo do espectrômetro.
• Íons provenientes de macromoléculas possuem freqüentemente um numero elevado de cargas.
• Espectros de massa medem a relação m/z e portanto íons com carga múltipla podem ser detectados mesmos com instrumentos menos sofisticados.
• A medida de distribuição de cargas não é sempre trivial. O número de cargas pode depender do pH, da presença de sais, desnaturação da proteína, quebra de ligações S-S, etc.
Solução NaBF4 em metanol/água
Fe(CN)64- e Fe(CN)6
3-
Fe(CN)64- e Fe(CN)6
3-
ESI de macromoléculas
Espectro de massas pela técnica de “electrospray” de uma enzima: espectro indica as cargas dos íons e M = 17828 2.0
Da
MHnn+
M=?
n=?
Variação do espectro de massa por electrospray, em função do pH, da mioglobina
Múltiplas cargas
carga
ms mr
Múltiplas cargas
ms mr
MH1414+ M = 16954 Da
r =14
Determinação do número de cargas e de M em espectros contendo íons com cargas múltiplas
a) Em espectros “electrospray”, a massa de um íon m1 com carga z1 pode ser equacionada em termos da massa da molécula (M) e da massa do próton (mp)
m1z1 = M + z1mp
b) Escolhendo outro pico no espectro, separado por (j-1) picos em ordem crescente de m/z, podemos equacionar a massa m2 como
m2(z1 – j) = M + (z1 – j) mp
c) Resolvendo as duas equações,
)(
)(
)(
11
12
2
1
p
p
mmzM
mm
mmjz
DESI (desorption electrospray ionization)
DESI (desorption electrospray ionization)
Métodos muito recentes
DESI
Espectro de massas obtido por DESI de traços de urina em
papel
DART (direct analysis in real
time)
Ionização DART: distinguindo entre a amostra autentica e o “genérico”
Comparação dos métodos de ionização
pola
ridad
e
n-hexano
CH2Cl2
metanol
H2O