universidade federal do ceará centro de ciências programa ... · mioglobina (a —); veneno (b...

Universidade Federal do Ceará

Centro de Ciências

Programa de Pós-Graduação em Química

TICYANO PEREIRA DE SOUZA

Estudo do efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus na reação de

transferência de elétrons da mioglobina

Fortaleza

2016


Estudo do efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus na reação de

transferência de elétrons da mioglobina

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Química. Área de Concentração: Química Inorgânica.

Orientadora: Profª. Drª. Izaura Cirino Nogueira Diógenes.

Coorientador: Prof Dr Tércio de Freitas Paulo

Fortaleza

2016


Estudo do efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus na reação de transferência

de elétrons da mioglobina

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Química, do Centro de Ciências da

Universidade Federal do Ceará, como

requisito parcial para obtenção do Título

de Mestre em Química. Área de

Concentração: Química Inorgânica.

Aprovado em: ____/____/_______.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________

Profª. Drª Izaura Cirino Nogueira Diógenes (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará (UFC).

______________________________________________

Prof. Dr. Eduardo Henrique Silva de Sousa


______________________________________________

Prof. Dr. Tércio de Freitas Paulo


A Deus.

A minha família, em especial aos meus

pais Mirza Helena Pereira de Souza e José

Mariano Filho.

AGRADECIMENTOS

Aos meus familiares, principalmente minha irmã Tatyane pelo o incentivo e

por todos os conselhos dados ao longo dessa jornada.

À Profª Drª Izaura Cirino Nogueira Diógenes, por sua dedicação na

orientação e pela a oportunidade que me foi dada para o desenvolvimento deste

trabalho.

Ao Prof Dr Tércio de Freitas Paulo, por todos os ensinamentos repassados

quando comecei a trabalhar no laboratório sob sua orientação.

Ao Prof Dr Eduardo Henrique Silva de Sousa, pela contribuição neste

trabalho.

À Drª Marta Carepo, por sua ajuda na realização e interpretação dos

resultados de eletroforese e dicroísmo circular

Aos meus companheiros de grupo mais especificamente os que trabalham

com Eletroquímicas, Dieric e Ramon, por suas amizades.

Aos professores do Laboratório de Bioinorgânica da Universidade Federal

do Ceará

Aos alunos do Laboratório de Bioinorgânica da Universidade Federal do

Ceará, pela amizade e companheirismo ao longo de todos esses anos.

Aos meus amigos de graduação.

À CAPES, pelo suporte financeiro e pela bolsa.

... e a todos que não foram citados, mas que foram da mesma forma

importantes no desenvolvimento deste trabalho.

RESUMO

O efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus sobre a reação de transferência de

elétrons (TE) da proteína mioglobina (Mb) foi estudado utilizando-se um eletrodo de

ouro modificado com cisteína (Au/Cys) seguido da imobilização da proteína

(Au/Cys/Mb). Para tanto, foram utilizadas as técnicas de voltametria cíclica,

ressonância de plásmons de superfície (SPR-Surface Plasmon Resonance),

espectroscopia de absorção na região do ultravioleta e visível (UV-Vis),

espectroscopia de dicroísmo circular (CD-Circular Dichroism) e eletroforese em gel

desnaturante. A reação de eletrodo atribuída ao par redox FeII/III da Mb foi observada

em 0,09V vs Ag/AgCl sendo consistente com a forma nativa da proteína. Após imersão

do eletrodo Au/Cys/Mb em solução contendo o veneno da cobra Crotalus basiliscus,

observou-se a diminuição da corrente. O efeito nocivo do veneno sobre a reação de

eletrodo da Mb foi corroborado com a observação da perda de atividade catalítica do

eletrodo Au/Cys/Mb frente a reação de oxidação do ácido ascórbico (AA). Os

aumentos sucessivos de massa observados por SPR quando das injeções de cisteína

(0,172 µg cm-2), mioglobina (0,410 µg cm-2) e veneno (0,151 µg cm-2) indicaram que as

moléculas adsorvidas de cisteína e mioglobina não experimentam desorção após

exposição ao veneno da cobra Crotalus basiliscus. Ao contrário, o aumento de massa

indicou que moléculas do veneno foram imobilizadas sobre o eletrodo Au/Cys/Mb. Tal

proposição foi reforçada pelos resultados de eletroforese que apresentaram uma

diminuição na mobilidade da Mb no gel após a mistura com a solução contendo

veneno da cobra Crotalus basiliscus. Os espectros eletrônicos UV-Vis não

apresentaram mudança significativa na banda Soret da Mb; banda esta sensível ao

grau de desnaturação da proteína. Da mesma forma, os espectros de Dicroísmo

Circular obtidos nas regiões do UV-distante, UV-próximo e Soret não apresentaram

mudanças no perfil espectral da proteína, indicando que a integridade física da Mb é

mantida após exposição ao veneno, ou seja, a proteína não foi desnaturada.

Palavras chave: Mioglobina. Veneno de cobra. Crotalus basiliscus.

ABSTRACT

The effect of the venom of the Crotalus basiliscus snake on the electron transfer (ET)

reaction of the myoglobin (Mb) protein was studied using a gold electrode modified

with cysteine (Au/Cys) followed by the immobilization of the protein (Au/Cys/Mb). For

that, the following techniques were used: cyclic voltammetry, surface plasmon

resonance (SPR), absorption spectroscopy in the ultraviolet and visible regions (UV-

Vis), circular dicroism (CD), and gel electrophoresis. The electrode reaction assigned

to the FeII/III redox pair of Mb was observed at 0.09V vs Ag/AgCl being consistent with

the native form of the protein. Upon immersion of the Au/Cys/Mb electrode in solution

containing the venom of the Crotalus basiliscus snake, it was observed a decrease in

the faradaic current. The deleterious effect of the venom on the electrode reaction of

Mb was corroborated by the observation of the loss of the catalytic activity of the

Au/Cys/Mb electrode towards the oxidation reaction of the ascorbic acid (AA). The

successive mass increments observed by SPR upon the injections of cysteine (0.172

µg cm-2), myoglobin (0.410 µg cm-2) and venom (0.151 µg cm-2) indicated that the

adsorbed molecules of cysteine and myoglobin were not desorbed from the gold

surface upon exposure to the solution of the venom of the Crotalus basiliscus snake.

Rather, the mass increase indicated the molecules of the venom were immobilized on

the the Au/Cys/Mb electrode. Such proposition was reinforced by the electrophoresis

results which showed a decrease in the mobility of Mb after mixing to the solution

containing the snake venom. The electronic UV-Vis spectra did not show meaningful

changes in the Soret band of Mb; a band sensitive to the level of protein denaturation.

Likewise, the CD spectra obtained in the far-UV, near-UV and Soret regions did not

present spectral profile changes indicating that the physical integrity of the protein was

maintained after the exposure to the snake venom, i.e. the protein was not

denaturated.

Keywords: Myoglobin. snake venom. Crotalus basiliscus.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Cobra Crotalus basiliscus, cascavel mexicana da costa oeste. ....... 16

Figura 2 - Estrutura Tridimensional da mioglobina, Fe(III) de músculo esquelético

de equinos. ...................................................................................... 18

Figura 3 - Estrutura do grupo heme da mioglobina. ......................................... 19

Figura 4 - (A) Voltamogramas cíclicos do eletrodo de ouro limpo a 0,10 V s1 em

PBS 0,1 mol L1, pH 6,5, contendo (1) Mb 0,1 mol L1, (2) Cys 2,0

mmol L1 e Au/Cys contendo (3) PBS 0,1 mol L1 e (4) Mb 0,1 mol L1

e Au/Cys/Mb contendo (5) PBS 0,1 mol L1. Influência da velocidade

de varredura sobre a densidade de corrente (B) e o potencial de pico,

Ep, (C) para o eletrodo Au/Cys/Mb em PBS 0,1 mol L1. ................. 20

Figura 5 - Voltamograma cíclico do eletrodo de ouro em H2SO4 0,5 mol L-1,

velocidade de varredura de 0,1 V s-1. .............................................. 25

Figura 6 -Instrumento AUTOLAB ESPRIT Eco Chemie B. V., Ultrech,

Neetherlands. .................................................................................. 28

Figura 7 – (A) Modelo esquemático para exemplificação do surgimento da onda

evanescente; (B) Perfil da curva cinética de adsorção de SPR. ..... 29

Figura 8 - Sistema de Mini-PROTEAN® Tetra Cell, Bio-Rad Laboratories, Inc.,

USA ................................................................................................. 32

Figura 9 - (A) Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys a 100mV s-1 em PBS

0,1 mol L-1, pH 7; (B) Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys a

100mV s-1 em PBS 0,1 mol L-1, pH 7, veneno Crotalus basiliscus (Vn)

1,0 mg mL-1 ..................................................................................... 33

Figura 10 - Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys/Mb a 100mV s-1 em PBS

0,1 mol L-1, pH 7, contendo veneno da cobra Crotalus basiliscus nas

concentrações (A) 1,0 mg mL-1, (B) 0,1 mg mL-1 em diferentes tempos

de exposição ao veneno. ................................................................. 35

Figura 11 - Voltamogramas ciclicos para o eletrodo modificado Au/Cys/Mb; pH

7, PBS 0,1 mol L-1; ácido ascórbico 5,0 mmol L-1; velocidade de

varredura 0,1 V s-1; (—) antes de expor ao veneno Crotalus basiliscus

(Vn); (—) após exposição ao veneno (Crotalus basiliscus) por 4 horas.

........................................................................................................ 37

Figura 12 - Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys/Mb em PBS 0,1 mol L-1,

pH 7, com ácido ascórbico (AA) 5,0 mmol L-1, em diferentes

velocidades de varredura (A) e após a exposição ao veneno (Crotalus

basiliscus) por 4 horas (B). .............................................................. 38

Figura 13 - Gráfico da corrente catalítica (о), i, vs. 1/2 e da (●) corrente

normalizada (dados obtidos da Figura 12 (A)), i.1/2 vs.. ................ 39

Figura 14 - Representação esquemática do mecanismo de eletrocatálise da

oxidação do ácido ascórbico pela mioglobina bloqueada pela ação do

veneno ............................................................................................. 40

Figura 15 - Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys/Mb a 100mV s-1 em PBS

0,1 mol L-1, pH 7, contendo 3,0 mol L-1 de cloridrato de guanidina (gnd)

após diferentes tempos de imersão. ................................................ 41

Figura 16 - Variação do ângulo SPR (SPR) durante a injeção de PBS 0,1mol L-1,

pH 7, contendo cisteína, mioglobina e veneno da cobra Crotalus

basiliscus em função do tempo, 25⁰C. Inset: Voltamogramas cíclicos

do eletrodo Au/Cys/Mb a 100mV s-1 em PBS 0,1mol L-1, pH 7, antes

(linha vermelha) e após 1h (linha preta) de exposição ao veneno. . 43

Figura 17 - Variação do ângulo SPR (θSPR) em função do tempo durante a injeção

de PBS 0,1mol L-1, pH 7, 25⁰C, contendo albumina de soro bovino e

veneno da cobra Crotalus basiliscus sobre o eletrodo Au/Cys. Inset:

estrutura planar da cisteína. ............................................................ 45

Figura 18 - Variação do ângulo SPR (θSPR) durante a injeção de PBS 0,1mol L-1,

pH 7, 25⁰C, contendo, cisteína e veneno da cobra Crotalus basiliscus

em função do tempo. ....................................................................... 47

Figura 19 - Espectros eletrônicos nas regiões do ultravioleta e visível da

mioglobina (Mb) com veneno de cobra (Vn) Crotalus basiliscus em

PBS, 0,1 mol L-1, pH 7, 25⁰C em diferentes tempos de medida de 1

min a 300 min. ................................................................................. 49

Figura 20 - Espectros de Dicroísmo Circular (CD) na região do UV-distante:

mioglobina (A —); veneno (B —); mioglobina mais veneno da cobra

Crotalus basiliscus com 1 minuto de reação (C —); com 195 minutos

(D —), e a subtração dos espectros com 195 minutos (D) do espectro

com 1 minuto (C) (E —); em PBS, 0,1 mol, pH 7, 25⁰C. .................. 50

Figura 21 - Espectros de Dicroísmo Circular (CD) na região do UV-próximo:


Crotalus basiliscus com 1 minuto de reação (C —), com 135 minutos


com 1 minuto (C) (E —), em PBS, 0,1 mol L-1, pH 7, 25⁰C. Entre as

linhas pontilhadas em verde a região de absorção da fenilalanina

(Phe), entre as linhas em vermelho região da tirosina (Tyr) e entre as

linhas pretas do triptofano (Trp)....................................................... 51

Figura 22 - Espectros de Dicroísmo Circular (CD) na região da banda Soret:


Crotalus basiliscus com 1 minuto de reação (C —), com 135 minutos


com 1 minuto (C) (E —), em PBS, 0,1 mol, pH 7, 25⁰C. .................. 53

Figura 23 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE) 12,5%.

Linha1: amostra com padrão de proteínas; Linha 2: Mioglobina; Linha

3: Veneno; Linhas 4 a 9: Mioglobina com Veneno nos tempos de 1

min, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h e 24 h. ........................................................... 54

Figura 24 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) não desnaturante 10%.

Linhas 1, 2 e 3 são respectivamente mioglobina (Mb), veneno (Vn) e

mistura mioglobina mais veneno (M) com 1 minuto; 4, 5 e 6 são

respectivamente Mb, Vn e M com 2hs de reação; 7, 8 e 9 são

respectivamente Mb, Vn e M com 6hs de reação; 10, 11 e 12 são

respectivamente Mb, Vn e M com 24 hs de reação......................... 55

Figura 25 - Representação esquemática do eletrodo modificado Au/Cys/Mb/Vn,

imagem fora das proporções reais. ................................................. 57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores de variação de ângulo SPR (∆θ), massa adsorvida (µg cm-2)

e fator de recobrimento (mol cm-2) para cisteína, mioglobina e

veneno. ............................................................................................ 44


e fator de recobrimento (mol cm-2), para BSA e Veneno. ............. 46


e fator de recobrimento (mol cm-2), para Cys e Veneno. .............. 48

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 14

1.1 Veneno Crotalus .................................................................................. 15

1.2 Crotalus basiliscus ............................................................................... 16

1.3 Mioglobina ........................................................................................... 17

1.4 Estudo Eletroquímico da Mioglobina ................................................... 18

2 OBJETIVO ........................................................................................... 22

2.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 22

2.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 22

3 PARTE EXPERIMENTAL .................................................................... 23

3.1 Reagentes e Soluções ......................................................................... 23

3.2 Materiais e Instrumentos ...................................................................... 24

3.2.1 Medidas Eletroquímicos ....................................................................... 24

3.2.2 Tratamento do Eletrodo de Ouro Policristalino ..................................... 24

3.2.3 Cálculo da Área Ativa do Eletrodo de Ouro e o Fator de Rugosidade . 25

3.2.4 Formação das Monocamadas de Cisteína e Mioglobina Sobre Eletrodo

de Ouro ................................................................................................ 26

3.2.5 Espectroscopia Eletrônica nas Regiões do Ultravioleta e Visível ......... 26

3.2.6 Espectroscopia de Dicroísmo Circular ................................................. 27

3.2.7 Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR) .................................. 27

3.2.8 Eletroforese Gel de Poliacrilamida (PAGE) Laemmli............................ 30

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................... 33

4.1 Estudo da Interação do Veneno da cobra Crotalus basiliscus com a

Mioglobina Imobilizada na SAM de Cisteína ....................................... 33

4.1.1 Voltametria Cíclica................................................................................ 33

4.1.2 Eletrocatálise da reação de oxidação ácido ascórbico (AA) com o

eletrodo Au/Cys/Mb antes e após exposição ao veneno Crotalus

basiliscus ............................................................................................. 36

4.1.3 Efeito do agente desnaturante, cloridrato de guanidina, na reação de

transferência de elétrons da mioglobina imobilizada no eletrodo

Au/Cys ................................................................................................. 41

4.1.4 Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR) .................................. 42


Mioglobina ........................................................................................... 48

4.2.1 Espectroscopia Eletrônica nas Regiões do Ultravioleta e Visível (UV-

Vis) ...................................................................................................... 48

4.2.2 Espectroscopia de Dicroísmo Circular ................................................. 49

4.2.3 Eletroforese Gel de Poliacrilamida (PAGE) Laemmli ........................... 53

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ................................. 56

REFERÊNCIAS .................................................................................... 59

ANEXO A ............................................................................................. 66

ANEXO B .............................................................................................. 68

14

1 INTRODUÇÃO

O envenenamento provocado por ataques de cobras é uma problemática

bastante importante na área da saúde pública, muitas vezes negligenciada pelos

governos. As principais regiões afetadas são zonas rurais de países tropicais e

subtropicais localizados na África, Ásia, Oceania e América Latina1.

Consequentemente, a Organização Mundial da Saúde (OMS) incorporou

envenenamento por picada de cobra na lista de doenças negligenciadas. Dados

obtido do ano de 2008 estimam que os casos de envenenamento por picada de cobra

variam de 421 mil a 1,8 milhões. Sendo que desses casos, 20 mil a 94 mil levam a

mortalidade no mundo todo ano2. As regiões que registram o maior número de casos

são o sul, sudeste asiático e a África subsaariana2. Picada de cobra é um problema

essencialmente das populações pobres dessas regiões e afeta, principalmente,

famílias que são envolvidas em atividades agrícolas2. O acesso precário aos serviços

de saúde, em alguns casos, e a escassez de antidoto, resulta em mortalidade elevada.

Além da mortalidade, algumas vítimas de acidentes ofídicos sobrevivem com sequelas

físicas permanentes devido à necrose do tecido local e, por vezes, sequelas

psicológicas. Por conta da maioria das vítimas serem jovens, o impacto econômico da

picada de cobra é considerável1.

Veneno de cobra é uma mistura complexa de vários componentes

diferentes. A composição, bem como os efeitos do veneno, varia consideravelmente

de espécie para espécie, mas pode ser dividida em categorias que incluem: I)

citotoxinas: causam danos no tecido, como edemas e necrose, II) proteases

hemorrágicas: caso danos aos vasos sanguíneos ocasionando hemorragia3,4, III)

neurotoxinas: provocam neurotoxidade, sendo a causa principal de óbitos5, IV)

miotoxinas: induzem a degradação muscular6.

Devido ao exposto, entende-se ser fundamental o estudo dos efeitos de

venenos de cobras no organismo humano. Estudo esse que passa, necessariamente,

pelo entendimento das interações entre as moléculas constituintes dos venenos e

moléculas biológicas. Nas seções seguintes serão apresentados alguns aspectos do

veneno da cobra do gênero Crotalus, objeto deste trabalho.

15

1.1 Veneno Crotalus sp

Nos Estados Unidos da América, em meados do século XIX, Mitchell7,8

tratou o veneno de uma cobra do gênero Crotalus com água fervente e, em seguida,

com etanol. Secou o precipitado que se formou e, em seguida, testou sua toxicidade

em animais nomeando-o de Crotalie. Esse é o primeiro registro de isolamento do

veneno de uma cobra Crotalus. No ano de 1878 houve um novo progresso nesta área

quando Pelder9 propôs que o veneno era uma substância proteica. Em colaboração

com Reichert, Mitchell10,11 estabeleceu que Crotalie não era uma substância

homogênea. Ele, então, separou da cobra Crotalus adamanteus o “veneno peptídeo”

e o “veneno globulina” submetendo o veneno a uma diálise com uma membrana

semipermeável. Atribuiu-se às neurotoxinas presentes nestes venenos, a perda da

contração muscular devido à perda do controle nervoso sendo, em geral, o principal

fator que leva a letalidade. Outro aspecto que causa intenso dano aos organismos

afetados diz respeito à atuação destas toxinas no sistema cardiovascular, seja

induzindo a coagulação do sangue, seja por hemorragia12. O termo “neurotóxico” é

frequentemente utilizado na literatura de venenos de cobra para descrever o veneno

ou uma fração do veneno que produz paralisia ou convulsão antes da morte. As

substâncias “neurotóxicas”, no entanto, podem ter efeitos secundários quando atuam

em outros órgãos. Com efeito, o principal grupo de neurotoxinas isoladas a partir dos

venenos das cobras das famílias Elapidae e Viperidea13 agem sobre o receptor da

acetilcolina da placa terminal motora na membrana muscular. Assim, o termo “toxina

pós-sináptica” é atribuído para esta classe de neurotoxinas14-16. Por décadas vem se

estudando os efeitos das neurotoxinas presente nos venenos de algumas cobras. A

neurotoxina mais estudada é a β-neurotoxina presente nos venenos das famílias

Elapidae e Viperidea. Estas enzimas, que usam íons Ca2+ para sua ativação, são

moléculas relativamente pequenas com massa molecular entre 13 e 19 kDa contendo

entre 5 a 8 pontes dissulfeto. Estudos experimentais em animais mostraram que o

bloqueio neuromuscular por β-neurotoxina resulta na flacidez dos músculos

esqueléticos5. O efeito da β-neurotoxina não afeta o transporte do neurotransmissor

acetilcolina (ACh). Alguns trabalhos da literatura relatam uma alta afinidade das

enzimas β-neurotoxinas por sítios específicos em membranas pré-sinápticas5,17.

16

1.2 Crotalus basiliscus

A espécie Caudisona basilisca18 foi catalogada primeiramente por Cope em

1864 e só posteriormente, em 1884, passou a ser chamada de Crotalus basiliscus19,

Figura 1. Popularmente conhecida como cascavel mexicana da costa oeste, esta

cobra é normalmente encontrada próxima ao estado de Colima no México. Cobras do

gênero Crotalus possuem, na composição do seu veneno, proteínas que variam de 4

a 115 kDa20. Os efeitos tóxicos provocados pela picada de cascavel, em grande parte,

são devidos às proteases presentes no veneno21. Algumas dessas substâncias

causam danos consideráveis ao tecido local com o surgimento de edemas, bolhas e

hemorragia. Dentre as proteases de cascavéis isoladas, algumas são chamadas de

toxinas hemorrágicas por induzirem a hemorragia em animais22-26, enquanto outras

são ditas neurotóxicas por serem bloqueadoras neuromusculares atuando através da

inibição da síntese ou liberação de acetilcolina (ACh)12.

Figura 1 - Cobra Crotalus basiliscus, cascavel mexicana da costa oeste.

Fonte: Alfonso Delgadillo27

Dentre as proteases que promovem hemorragia, duas foram isoladas e

testadas por Molina4 e colaboradores, as quais foram denominadas B1 e B2. As

toxinas B1 e B2 isoladas do veneno da Crotalus basiliscus tiveram seus pesos

moleculares e pontos isoelétricos determinados por Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida (PAGE). Sendo obtidos os valores de pesos moleculares de 27kDa e

17

27,5KDa, respectivamente, para B1 e B2. Apesar de pesos moleculares similares, os

valores obtidos para os pontos isoelétricos foram bastante distintos: um ponto

isoelétrico básico de 9,8 para a toxina B1 e outro ácido, de 5,2, para a toxina B2. As

toxinas B1 e B2 têm inúmeras propriedades em comum com outras toxinas

hemorrágicas de cascáveis4. A protease B1 se assemelha bastante com as proteases

HT-b e HT-3 isoladas, respectivamente, dos venenos das cobras Crotalus atrox28,

Crotalus ruber ruber29. Assim como a toxina B1, essas substâncias têm ponto

isoelétrico (pI) básico e peso molecular de aproximadamente 27kDa. Já a toxina B2,

tem propriedades similares às proteases HT-c (pI = 6,2), HT-d (pI = 6,1) e HT-e (pI =

5,6) isoladas do veneno da cobra Crotalus atrox28 e HT-2 (pI = 5,2) isolada do veneno

Crotalus ruber ruber29 que possuem peso molecular aproximadamente de 25kDa.

Todas essas proteases são hemorrágicas e degradaram o fibrinogênio ocasionando

a interrupção das etapas iniciais de coagulação. Onde o fibrinogênio é precursor da

formação dos monômeros de fibrina, um dos responsáveis pela coagulação

sanguínea4.

1.3 Mioglobina

A mioglobina (Mb) é uma proteína relativamente pequena, que se encontra

nas células dos músculos dos animais vertebrados, tendo como principal função

armazenar e facilitar o transporte de oxigênio nos músculos. Esta proteína encontra-

se no músculo cardíaco e músculo esquelético dos mamíferos e aumenta a

solubilidade efetiva do oxigênio molecular (O2) no músculo atuando como um

reservatório de oxigênio e facilitando a difusão de O2 dos capilares sanguíneos até a

mitocôndria.30 A mioglobina, Figura 2, é constituída por 153 aminoácidos e um grupo

prostético heme, sendo relativamente pequena. Além disso, contém

aproximadamente 1200 átomos (excluindo os de hidrogênio), apresenta-se como um

esferoide achatado de dimensões aproximadas de 45x35x25 Å, possui um peso

molecular de 17600 Da31 e ponto isoelétrico32 igual a 6,8. Duas moléculas de histidina

encontram-se próximas ao átomo de Ferro do grupo heme. Uma está diretamente

ligada, chamada de histidina proximal, e a outra, não ligada ao átomo metálico central,

histidina distal. Este resíduo, a histidina distal, tem um papel importante na ligação do

oxigênio com o grupo heme, pois forma ligações de hidrogênio com a molécula de

oxigênio. A Mb no estado oxidado, Fe(III), possui o átomo de Fe hexacoordenado com

18

água como sexto ligante. No estado reduzido, Fe(II), a Mb pode ser pentacoordenada

(deoxiMb) ou hexacoordenada com O2, CO ou NO como sexto ligante33.

Figura 2 - Estrutura Tridimensional da mioglobina, Fe(III) de músculo esquelético de equinos.

Fonte: figura adaptada da referência34

O músculo é, portanto, um tecido essencialmente aeróbio. Recentemente,

foi descoberto que a mioglobina também possui atividade catalítica como peroxidase

e nitrito redutase 35-39.

1.4 Estudos Eletroquímicos da Mioglobina

A mioglobina é classificada como uma heme proteína devido à presença do grupo

prostético heme, Figura 3, que consiste em um átomo de Ferro ligado nas posições

equatoriais a um anel porfirínico. Nas posições axiais, como comentado

anteriormente, tem-se um resíduo histidina (proximal) e um sexto ligante cuja

presença depende do estado de oxidação do átomo de ferro, do pH da solução da

proteína33. O estudo eletroquímico dessa heme proteína é possível devido à mudança

do estado de oxidação do átomo de Ferro, Fe2+/Fe3+ 36.

19 Figura 3 - Estrutura do grupo heme da mioglobina.

Fonte: figura adaptada da referência36

Os primeiros estudos eletroquímicos da Mb foram realizados com eletrodos

de mercúrio40, ouro modificado com metil viologênio41, e com eletrodo de óxido de

índio42,43. O comportamento eletroquímico foi inconstante e extremamente sensível à

pureza da amostra e às condições de tratamento da superfície do eletrodo44. Inúmeras

pesquisas vêm sendo desenvolvidas para acessar a reação de transferência de

elétrons, TE, de metaloproteínas com a utilização de mediadores, promotores, ou

substratos condutores modificados45-48. Paulo e colaboradores49 estudaram a reação

de TE da Mb sobre SAM (Self-Assembled Monolayer) de cisteína (Cys)50. Os

resultados desse estudo indicaram que a proteína adsorve sobre a monocamada de

cisteína, formando o eletrodo Au/Cys/Mb. De fato, a dependência linear da corrente

de pico (ip) com a velocidade de varredura (), Figura 4(B), observada em

experimentos de voltametria cíclica do eletrodo Au/Cys/Mb em solução de tampão

fosfato (PBS) (Figura 4(A)), indica um processo típico de espécies confinadas na

superfície do eletrodo51.

20

Figura 4 - (A) Voltamogramas cíclicos do eletrodo de ouro limpo a 0,10 V s1 em PBS 0,1 mol L1, pH

6,5, contendo (1) Mb 0,1 mol L1, (2) Cys 2,0 mmol L1 e Au/Cys contendo (3) PBS 0,1 mol L1 e (4)

Mb 0,1 mol L1 e Au/Cys/Mb contendo (5) PBS 0,1 mol L1. Influência da velocidade de varredura

sobre a densidade de corrente (B) e o potencial de pico, Ep, (C) para o eletrodo Au/Cys/Mb em PBS

0,1 mol L1.

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

-6.0

-4.0

-2.0

0.0

2.0

4.0

6.0

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-15

-10

-5

0

5

10

15

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(A) (B)

(C)

R2= 0.975

R2= 0.996

(5)

(4)

(3)

(2)

(1)

j /

A c

m-2

j /

A c

m-2

Potential / V vs Ag/AgCl

Anodic Cathodic

R2 = 0.9888

R2 = 0.9984

scan rate (V/s)

E /

V v

s. A

g/A

gC

l

log v

Fonte: Reimpresso com permissão de Paulo, T. F.; Diógenes, I. C. N.; Abruña, H. D. Langmuir2011,

27(5), 2052–2057 (DOI: 10.1021/la103505x). Copyright 2017, American Chemical Society49.

A quantidade de moléculas de mioglobina adsorvida ( = 6,10 x 10-11 mol

cm-2) foi calculada com base na Equação (1.1):

𝑖𝑝 =𝑛2𝐹2𝜐𝐴𝛤

4𝑅𝑇 (1.1)

onde, n e A são, respectivamente, o número de elétrons da reação de eletrodo e a

área ativa do eletrodo, R, T e F correspondem a constante dos gases ideais,

temperatura e constante de Faraday. Na Figura 4(C) é observado um deslocamento

nas direções positiva e negativa para os potenciais de pico (Ep) de oxidação e

redução, respectivamente, com o aumento da velocidade de varredura. Com base na

teoria de Laviron52 este comportamento é esperado para espécies redox que estão

21

presas na superfície do eletrodo. O gráfico de Ep vs log Figura 4(C), mostra duas

linhas com inclinações de -2,3RT/αnF e 2,3RT/(1-α)nF para os processos de redução

e oxidação, respectivamente. Da intersecção destas curvas, foi calculado o coeficiente

de transferência de elétrons, α = 0,53. A constante heterogênea de transferência de

elétrons, ks = 1,66 s-1, foi calculada de acordo com a Equação52 (1.2):

𝐸𝑝 = 𝐸0′ − 𝑅𝑇

𝛼𝑛𝐹𝑙𝑛 (

𝛼𝑛𝐹

𝑅𝑇𝑘𝑠) −

𝑅𝑇

𝛼𝑛𝐹𝑙𝑛 ( 𝜐) (1.2)

22

2 OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

O desenvolvimento deste trabalho tem como objetivo a realização do

estudo da interação do veneno da cobra Crotalus basiliscus com a proteína mioglobina

imobilizada sobre uma SAM de cisteína. Adicionalmente, pretende-se estudar a

interação do veneno com a mioglobina em meio homogêneo. Os resultados obtidos

serão analisados a fim de se avaliar a interferência do veneno na reação de

transferência de elétrons e na integridade física e química da proteína na sua forma

nativa.

2.2 Objetivos Específicos

Estudar a interação do veneno (Crotalus basiliscus) com a mioglobina

imobilizada na SAM de cisteína por voltametria cíclica, SPR (Ressonância de

Plásmons de Superfície), Eletroforese em gel de Poliacrilamida (PAGE) Laemmli,

Espectroscopia nas regiões do ultravioleta e visível (UV-Vis) e Espectroscopia de

Dicroísmo Circular (CD). Além disso, pretende-se avaliar o efeito do veneno da cobra

sobre a reação catalítica do eletrodo Au/Cys/Mb na reação de oxidação do ácido

ascórbico (AA).

23

3 PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Reagentes e Soluções

Ácido ascórbico (AA), ácido sulfúrico, acrilamida/bisacrilamida, azul de

bromofenol, cisteína (Cys), coomassie blue, dodecil sulfato de sódio (SDS), fosfato

dibásico de potássio (K2HPO4), fosfato monobásico de potássio (KH2PO4), glicerol,

hidróxido de potássio (KOH), mioglobina de músculo de equino (Mb), N’,N’,N’,N’-

tetrametilenodiamina (TEMED), persulfato de amônia, tris(hidroximetil)aminometano

(tris-base), tris(hidroximetil)aminometano-HCl (tris-HCl), veneno da cobra Crotalus

basiliscus, β-mercaptoetanol, todos de procedência Sigma Aldrich®; metanol,

permanganato de potássio e peróxido de hidrogênio, de procedência Synth®; e ácido

fosfórico de procedências Vetec® foram utilizados sem purificação prévia.

As soluções foram todas preparadas utilizando água purificada em sistema

Milli-Q da Millipore Inc., 18,2 MΩ cm, a 25 oC.

As soluções aquosas de 10KMnO4:1KOH (m:m) e 3H2SO4:1H2O2 (v:v),

solução “piranha”, foram utilizadas na limpeza das vidrarias para eliminar possíveis

contaminações com material orgânico.

As soluções de tampão fosfato (PBS) que foram utilizadas nas medidas

eletroquímicas como eletrólito de suporte foram preparadas a partir da mistura 1:1 de

soluções de K2HPO4 e de KH2PO4 com a mesma concentração desejada para o

tampão. O pH foi ajustado com H3PO4 ou KOH de acordo com a necessidade do

ajuste.

As soluções de mioglobina (Fe(III), MM = 17600 g mol-1) foram preparadas

em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7. As concentrações das soluções de Mb foram

calculadas espectroscopicamente, conforme procedimento reportado na literatura,35

utilizando o coeficiente de extinção de 188 L mmol-1 cm-1 para a banda em 409 nm.

As soluções do veneno da cobra Crotalus basiliscus empregadas nas

medidas, foram preparadas a partir da dissolução do pó do veneno em uma solução

de tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7. Foram preparadas soluções estoque em duas

concentrações 1,0 mg mL-1 e 2,0 mg mL-1.

24

Os experimentos que necessitaram de atmosfera inerte foram realizados

utilizando-se argônio de procedência White Martins®. O gás passou por um

tratamento prévio onde a saída do manômetro regulador de vazão foi conectada a um

sistema catalítico (BTS-R3-11, Fluka Chemika®) que, na presença de H2, retira traços

de oxigênio convertendo-o a água. Esta, por sua vez, é retirada do sistema por arraste

através da passagem do gás em colunas contendo agentes secantes (sílica gel e

cloreto de cálcio).

O manuseio das soluções “piranha” e do veneno de cobra foi realizado

mediante a utilização de luvas e óculos de proteção. A solução “piranha” é

extremamente oxidante ocasionando queimaduras quando em contato com a pele. Já

o veneno da cobra em contato com a corrente sanguínea pode levar à intoxicação e,

se não tratado corretamente, a óbito.

3.2 Materiais e Métodos

3.2.1 Medidas Eletroquímicas

As medidas eletroquímicas foram feitas utilizando substrato de ouro BAS

(Ageom = 0,0314 cm2), fio de platina e Ag/AgCl (3,5 mol L-1) como eletrodos de trabalho,

auxiliar e de referência, respectivamente, em uma célula convencional de vidro com

entrada para os três eletrodos e com entrada e saída de gases. O potenciostato

PGSTAT302N (Autolab) foi utilizado na obtenção destas medidas. As soluções

utilizadas como eletrólito suporte foram todas borbulhadas previamente com argônio

por 15 minutos antes das medidas, as quais foram realizadas a 25 ºC.

3.2.2 Tratamento do Eletrodo de Ouro Policristalino

O tratamento da superfície do eletrodo de ouro é uma etapa importante na

modificação deste substrato. Para que o processo de modificação seja eficiente e

reprodutível é importante que a superfície do eletrodo esteja limpa. Assim, o eletrodo

de ouro foi imerso em solução “piranha” por 2 minutos, lavado com água Milli-Q e

posteriormente polido com pasta de alumina até a obtenção de uma superfície com

aspecto especular. Em seguida, o eletrodo foi levado ao ultrassom com água Milli-Q

por 10 minutos para a retirada de possíveis partículas de alumina. Por último, o

eletrodo foi limpo eletroquimicamente por voltametria cíclica53 em solução de H2SO4

0,5 mol L-1, com varreduras de potencial no intervalo de -0,4V a 1,6V a 100mV s-1 até

25

a obtenção da curva voltamétrica característica do eletrodo de ouro policristalino

limpo54. O protocolo de limpeza apresentado foi utilizado antes de todos os

procedimentos de modificação.

3.2.3 Cálculo da Área Ativa do Eletrodo de Ouro e do Fator de Rugosidade

A área eletroquímica ativa (Aativa) do eletrodo de ouro policristalino e o fator

de rugosidade (fr = Aativa/Ageometrica) foram determinados a partir da carga decorrente

do processo de formação dos óxidos de ouro. Para o voltamograma ilustrado na Figura

5, os valores de 0,0443 cm2 e 1,41, respectivamente foram obtidos para área ativa do

eletrodo e fator de rugosidade.

Figura 5 - Voltamograma cíclico do eletrodo de ouro em H2SO4 0,5 mol L-1, velocidade de varredura de 0,1 V s-1.

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6

-1200

-800

-400

0

400

j,

A c

m-2

E, V vs Ag/AgCl

Fonte: elaborada pelo autor

Esta metodologia é aplicada para metais que mostram regiões definidas

para a formação e redução de uma monocamada de óxido. O oxigênio é adsorvido

em uma monocamada antes da evolução de O2 com uma correspondência atômica

26

de 1:1 com os átomos da superfície do metal. De acordo com a literatura55, o valor de

carga por unidade de área do ouro policristalino é de 390 µC cm-2. A carga (Q) do

processo de adsorção foi obtida através da razão entre a área correspondente ao

processo de formação do óxido (região hachurada em vermelho no voltamograma,

Figura 5) e a velocidade de varredura. O protocolo para a determinação da área ativa

foi realizado antes de cada experimento de modificação.

3.2.4 Formação das Monocamadas de Cisteína e Mioglobina sobre Eletrodo de Ouro

A modificação do eletrodo de ouro para a formação da monocamada de

cisteína (Cys) se deu pela imersão do eletrodo de ouro em uma solução 10 mmol L-1

de cisteína por 12h formando o eletrodo Au/Cys49. Em seguida, o eletrodo foi lavado

com água Milli-Q para a retirada de moléculas fracamente adsorvidas. Posteriormente,

o eletrodo Au/Cys foi imerso em uma solução 100µmol L-1 de mioglobina em tampão

fosfato 0,1mol L-1, pH 7, por 2 horas, resultando na formação do eletrodo49 Au/Cys/Mb.

Após as etapas de modificação, foram feitos os estudos eletroquímicos relativos ao

processo redox da Mb. Em seguida, o eletrodo modificado foi imerso na solução de

PBS contendo veneno de cobra (Crotalus basiliscus), nas seguintes concentrações

de veneno: 1,0 e 0,1 mg mL-1.

3.2.5 Espectroscopia Eletrônica nas Regiões do Ultravioleta e Visível (UV-Vis)

As medidas de Espectroscopia Eletrônica nas Regiões do Ultravioleta e

Visível foram realizadas utilizando um instrumento Espectrofotômetro CARY 5000 UV-

Vis-NIR (Varian, Agilent Technologies, USA). Todas a soluções foram preparadas em

PBS 0,1 mol L-1, pH 7. As concentrações das soluções de Mb foram calculadas pelo

coeficiente de extinção da banda Soret em 409 nm, como relatado na literatura35 e

previamente comentado nesta seção. Já as soluções do veneno (Crotalus basiliscus),

foram preparadas utilizando uma proporção massa/volume (veneno/PBS). As

soluções de Mb e do veneno foram adicionadas a uma cubeta de quartzo a fim de se

obterem os espectros UV-Vis e monitorar possíveis alterações espectrais,

particularmente, na região da banda Soret.

27

3.2.6 Espectroscopia de Dicroísmo Circular

As medidas de Dicroísmo Circular foram obtidas utilizando um

espectropolarímetro Jasco J-815, JASCO, Japão. Os espectros foram registrados

para três diferentes regiões do espectro: UV-distante (190-250 nm), UV-próximo (255-

325 nm) e região Soret (300-500 nm). Foi utilizado uma célula de quartzo de 1 mm

para as medidas no UV-distante e outra de 10 mm para as medidas no UV-próximo e

região Soret. Às concentrações 2,0 e 9,0 µmol L-1 de mioglobina foram utilizadas,

respectivamente, para as medidas nas regiões UV-distante e UV-próximo/Soret. As

soluções do veneno foram preparadas a partir de uma solução estoque 2,0 mg mL-1,

mantendo-se uma concentração final do veneno de 0,16 mg mL-1 para a região UV-

distante e 0,8 mg mL-1 para as regiões UV-próximo e Soret. As concentrações da

mioglobina, do veneno e da mistura mioglobina/veneno foram mantidas durante a

obtenção de todos os espectros. As medidas foram realizadas em três tempos

distintos, a saber: (i) logo após a adição do veneno à solução da proteína (t =t0); (ii)

em t = 3:15 h para as medidas na região UV-distante; (iii) t = 2:15 h para as medidas

nas regiões UV-próximo e Soret. A velocidade de varredura utilizada para os registros

na região UV-distante foi de 100 nm min-1 com três (3) acumulações e para as regiões

UV-próximo e Soret foi utilizada uma velocidade de varredura de 50 nm min-1 com

uma média de dez (10) acumulações. Todas as medidas foram realizadas a 25 oC.

3.2.7 Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR)

As medidas do ângulo SPR foram adquiridas utilizando um instrumento

AUTOLAB ESPRIT Eco Chemie B. V., Ultrech, Netherlands, equipado com um

sistema eletroquímico e injeção automática de amostras, Figura 6. Um laser de diodo

( = 670nm) foi empregado como fonte de radiação e um fotodiodo como detector. O

substrato para o suporte da amostra consta de um disco de vidro coberto com uma

fina camada titânio e recoberto com ouro (Espessura 50 nm, AGeométrica = 1,00 cm2).

28 Figura 6 - Instrumento AUTOLAB ESPRIT Eco Chemie B. V., Ultrech, Neetherlands.

Fonte: adaptada da referência56

A técnica de SPR se baseia nas propriedades ópticas (refletividade, índice

de refração) e pode ser empregada para estudos de fenômenos de superfície, devido

ao monitoramento da mudança do índice de refração ocasionado, por exemplo, pela

adsorção de moléculas sobre a superfície metálica57-59. O efeito de SPR é resultante

de uma oscilação da densidade de carga longitudinal ao longo da interface entre dois

meios com constantes dielétricas de sinais opostos, onde um é o metal e o outro um

meio dielétrico60. A escolha do metal a ser usado é bastante importante, pois este

deve apresentar comportamento de elétrons livres. Os metais mais empregados são

prata, ouro e cobre.

A Figura 7(A) ilustra a configuração de Kretschamann61 em equipamentos

de SPR que se baseia no fenômeno de reflexão interna total. O fenômeno ocorre

quando a luz polarizada atravessa um meio óptico denso, ex. vidro, alcança uma

interface entre este meio e um meio de densidade óptica menor, ex. ar, e é refletida

de volta para o meio mais denso. Apesar de a luz incidente ser totalmente refletida

internamente, uma componente desta radiação, denominada campo evanescente,

penetra na interface do meio menos denso. Em um determinado ângulo de incidência,

quando o vetor de onda do plásmon é igual ao vetor de onda do campo evanescente

(Ksp = Kev), parte da radiação acopla com os elétrons livres oscilantes (plásmon) no

29

filme metálico, gerando a ressonância de plásmon de superfície (Figura 6 A). Por meio

do monitoramento da variação deste ângulo, durante um processo de adsorção em

função do tempo, um perfil de adsorção pode ser obtido pela técnica de SPR60, tal

como ilustrado na Figura 7 (B).

As medidas de SPR foram realizadas com a intenção de avaliar se havia

adsorção de componentes do veneno da cobra Crotalus basiliscus na proteína

imobilizada no eletrodo de ouro com SAM de cisteína (Au/Cys/Mb). Todas as soluções

utilizadas neste estudo foram preparadas em tampão fosfato (PBS) 0,1mol L-1, pH 7,

a fim de minimizar as variações não desejadas de índices de refração.


As etapas 1, 2 e 3 exemplificam um processo de adsorção. O ponto 1 indica

a injeção de um fluxo contendo a espécie a ser adsorvida, o ponto 2 o instante da

lavagem e o 3 a estabilização após a retirada das espécies fracamente adsorvidas no

processo de lavagem. Na representação ilustrativa da Figura 7 (B), a diferença do

ângulo entre as etapas 3 e 1 corresponde a uma determinada variação de massa, de

acordo com a relação63 122mθ – 1ng mm-2.

0 750 1500 2250 3000 3750 4500

0

50

100

150

200

250

300

350

S

PR

, m

°

Tempo, s

SPR = SPR3- SPR1

(A)

(B)

1

2

3

Figura 7 – (A) Modelo esquemático para exemplificação do surgimento da onda evanescente; (B) Perfil da curva cinética de adsorção de SPR.

30

Inicialmente, foi injetada uma solução de PBS até obtenção de um sinal

estável de SPR quando, então, uma solução de cisteína 10mmol L-1 em PBS foi

injetada. Após lavagem com fluxo de PBS por 5 minutos para a remoção de moléculas

fracamente adsorvidas, a diferença de ângulo foi lida a fim de determinar, por

correlação, a variação de massa. O mesmo procedimento foi realizado para o

monitoramento da adsorção da mioglobina sobre a SAM de cisteína formada na etapa

anterior. Por último, foi adicionada uma solução do veneno da cobra Crotalus

basiliscus em PBS para avaliar a interação dos seus componentes com a proteína

imobilizada. Ao longo das medidas do sinal de SPR foram realizadas medidas

eletroquímicas para avaliar as consequências dessa interação na reação de

transferência de elétrons da proteína.

3.2.8 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

O termo eletroforese foi criado por Michaelis, em 1909, para descrever a

migração de coloides sob a influência de um campo elétrico64, ou seja, migração de

íons submetidos à corrente elétrica. Assim, moléculas com carga negativa migram

para polo positivo e moléculas com carga positiva migram para o polo negativo65. Para

entender como se dá a migração das partículas neste experimento, é necessário

entender algumas equações relacionadas à técnica. Quando uma diferença de

potencial é aplicada (Voltagem, V) através dos eletrodos, gera-se um gradiente de

potencial (E), que é numericamente igual à voltagem (V) dividida pela distância (d)

entre os eletrodos. Quando o gradiente de potencial, E, é aplicado, a força que age

sobre a molécula com uma determinada carga, q, em coulombs é E x q (N). Essa é a

força que guia a molécula carregada em direção ao eletrodo de carga oposta. Há,

entretanto, uma força contrária (resistência friccional) que retarda a migração da

molécula carregada. Esta força/resistência friccional é função do tamanho

hidrodinâmico da molécula, da forma da molécula, do tamanho do poro do gel e da

viscosidade da solução. A velocidade, , da molécula carregada no campo elétrico é

dada pela Equação 3.1:

= 𝐸𝑞

𝑓 (3.1)

onde f é igual ao coeficiente de fricção/friccional.

31

Mais comumente, o termo mobilidade eletroforética, µ, de um íon é

utilizado, o qual é a razão da velocidade do íon, , sobre força do campo elétrico, como

se pode ver na Equação 3.2:

µ =

𝐸 (3.2)

Quando uma diferença de potencial é aplicada, moléculas de diferentes

cargas líquidas serão separadas devido às diferenças na mobilidade eletroforética.

Mesmo as moléculas de mesma carga serão separadas devido às diferenças de

tamanho e força de fricção. As moléculas separadas são, então, reveladas no gel por

meio de coloração usando os corantes adequados para cada sistema66.

Amostras em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7, contendo 2,0µg µL-1 de

mioglobina, 10µg µL-1 do veneno (Crotalus basiliscus) e a mistura de Mb e veneno,

nas mesmas concentrações, foram adicionadas, em volume igual, a uma solução de

glicerol 10%, β-mercaptoetanol 5%, SDS 2,5% e Tris-HCl pH 6,8 0,125 M. As amostras

foram fervidas por três minutos, centrifugadas rapidamente e aplicadas nos géis

Em outro procedimento de preparo das amostras foram retirados os

reagentes β-mercaptoetanol e SDS para a realização de um gel nativo (sem

desnaturação das proteínas). Então as amostras em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7,

contendo 2,0µg µL-1 de mioglobina, 10µg µL-1 do veneno (Crotalus basiliscus) e a

mistura de Mb e veneno, nas mesmas concentrações, foram adicionadas, em volume

igual, a uma solução de glicerol 10% , Tris-HCl pH 6,8 0,125 M. As amostras foram

centrifugadas rapidamente e aplicadas nos géis (12,5% de poliacrilamida67 com 0,75

mm de espessura) e submetidas a uma voltagem de 150 V, com uma corrente

constante em um sistema de Mini-PROTEAN® Tetra Cell, Bio-Rad Laboratories, Inc.,

USA (Figura 8).

32 Figura 8 - Sistema de Mini-PROTEAN® Tetra Cell, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA


Após a realização da eletroforese, os géis foram corados com uma solução

contendo corante (Coomassie Blue 0,5%), ácido acético 7,5%, metanol 45% em água.

Em seguida, foram descorados com uma solução de ácido acético 7,5%, metanol 45%

em H2O. Os géis foram fotografados utilizando o scanner Gel Doc XR+ System, Bio-

Rad Laboratories, Inc., USA.

33

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO


Mioglobina Imobilizada na SAM de Cisteína

4.1.1 Voltametria Cíclica

A proteína Mb imobilizada no eletrodo de ouro modificado com a SAM (Self-

Assembled Monolayer) de cisteína foi exposta a uma solução contendo veneno da

cobra Crotalus basiliscus. A interação foi acompanhada, inicialmente, pela técnica

eletroquímica de voltametria cíclica. Antes, porém, de realizar os experimentos com a

proteína, foi verificada a existência de processos faradáicos associados ao veneno.

Ressalte-se o conhecimento prévio de que a SAM de cisteína não apresenta processo

redox na janela de potencial utilizada para estudar a proteína Mb (-0,3 a +0,3V)49. As

Figuras 9(A) e 9(B) ilustram os voltamogramas do eletrodo Au/Cys em solução

eletrolítica na presença e ausência de veneno, respectivamente.

Figura 9 - (A) Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys a 100mV s-1 em PBS 0,1 mol L-1, pH 7; (B) Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys a 100mV s-1 em PBS 0,1 mol L-1, pH 7, veneno Crotalus basiliscus (Vn) 1,0 mg mL-1

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6

-4

0

4

8

j,

A c

m-2

E, V vs Ag/AgCl

Au/Cys 2h de modificação Vn

Au/Cys 4h de modificação Vn

(A)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6

-15

-10

-5

0

5

10

15

j,

A c

m-2

E, V vs Ag/AgCl

Au/Cys

Au/Cys 4h modificação com Vn

(B)


Os voltamogramas apresentados na Figura 9(A) foram obtidos após

exposição de 2 e 4h do eletrodo Au/Cys em solução do veneno. Após o tempo de

exposição, o eletrodo foi lavado e colocado em uma célula eletroquímica contendo

34

apenas PBS. Já na Figura 9(B), curva preta, o eletrodo Au/Cys foi colocado em uma

célula eletroquímica contendo PBS e veneno (1,0 mg mL-1).

Resultados publicados na literatura para algumas heme-proteínas

(citocromo C) indicam que o acesso ao respectivo processo de transferência de

elétrons só ocorre após a adsorção prévia de uma camada não eletroativa da

proteína69. A fim de verificar se os componentes proteicos do veneno estudado

apresentam comportamento similar, obteve-se voltamogramas cíclicos do eletrodo

Au/Cys em solução contendo veneno, após modificação com o veneno, curva

vermelha na Figura 9(B).

Os voltamogramas apresentados nas Figuras 9(A) e 9(B) mostram a

inexistência de processos faradáicos associados à cisteína e ao veneno na janela de

potencial utilizada para estudar a proteína Mb (-0,3 a +0,3V).

A Figura 10 ilustra os voltamogramas obtidos para o eletrodo Au/Cys/Mb

após diferentes tempos de imersão em solução de PBS contendo veneno em

diferentes concentrações 1,0 mg mL-1 e 0,1 mg mL-1, respectivamente nas Figuras 10

(A) e 10 (B). A concentração de 0,01 mg mL-1 de veneno também apresentou após

exposição ao eletrodo modificado Au/Cys/Mb diminuição das correntes faradaicas

atribuídas a átomo de Fe presente na mioglobina.

O aumento do tempo de contato do eletrodo Au/Cys/Mb com a solução

contendo o veneno de cobra resulta em uma diminuição das correntes anódica e

catódica atribuídas ao par redox Fe3+/Fe2+ presente no grupo prostético heme da

mioglobina. Assim, os resultados indicam que os componentes do veneno têm uma

ação direta sobre o processo de transferência de elétrons da proteína. Ao longo do

tempo, a reação de eletrodo diminui até o ponto em que a corrente faradáica chega a

ser insignificante em relação à corrente capacitiva. A redução da corrente faradáica

atribuída ao grupo heme da Mb com o aumento do tempo de exposição do eletrodo

Au/Cys/Mb à solução do veneno indica que este atua bloqueando a reação de

transferência de elétrons da proteína. Assim foi calculado a quantidade de proteína

eletroquimicamente ativa no eletrodo. A quantidade de material adsorvido para a

mioglobina foi calculada a partir da integração da onda de oxidação, de acordo com a

equação (1.1) na página 21, Mb =.4,4 x 10-11 mol cm-2.

35 Figura 10 - Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys/Mb a 100mV s-1 em PBS 0,1 mol L-1, pH 7, contendo veneno da cobra Crotalus basiliscus nas concentrações (A) 1,0 mg mL-1, (B) 0,1 mg mL-1 em diferentes tempos de exposição ao veneno.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

-5

0

5

j,

A c

m-2

E, V Ag/AgCl

Tempo de

exposição ao Vn

0

1h

2hs

3hs

4hs

A

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

-6

0

6

Tempo de

exposição ao Vn

0

1 h

2 hs

3hs

4hs

j,

A c

m-2

E, V vs Ag/AgCl

B

36 Fonte: elaborada pelo autor

Pode-se sugerir, portanto, que a exposição ao veneno deve diminuir a

capacidade da proteína Mb de armazenar e facilitar o transporte oxigênio já que, para

exercer essa função, a proteína deve se encontrar no estado reduzido (Fe2+) com

oxigênio ligado ao átomo de ferro do grupo heme. Adicionalmente, pode-se sugerir

que a proteína não se encontra na condição nativa após exposição ao veneno70,

devido a mudança na forma dos voltamogramas ao longo do tempo de exposição a

solução do veneno.

4.1.2 Eletrocatálise da reação de oxidação do ácido ascórbico (AA) com o eletrodo

Au/Cys/Mb antes e após exposição ao veneno Crotalus basiliscus

Paulo e colaboradores49 utilizaram o sistema com a mioglobina ancorada

em uma SAM de cisteína, Au/Cys/Mb, no estudo da reação de oxidação do ácido

ascórbico (AA), uma vitamina solúvel em água presente em muitos sistemas

biológicos sendo essencial para a função cardiovascular71. A Figura 11 mostra os

voltamogramas obtidos em solução de PBS contendo AA para o eletrodo Au/Cys/Mb

antes e após exposição ao veneno de cobra (Au/Cys/Mb/Vn). A Figura 12 ilustra os

voltamogramas obtidos em diferentes velocidades de varredura.

Comparativamente à superfície de ouro não modificada, a reação de

oxidação do AA é deslocada em cerca de 0,4V para regiões menos positivas quando

da utilização do eletrodo Au/Cys/Mb49, indicando a atividade catalítica do eletrodo

modificado.

Os voltamogramas da Figura 11 ilustram o efeito da exposição do veneno

sobre os sítios catalíticos do eletrodo Au/Cys/Mb. As curvas em preto e vermelho,

respectivamente, foram obtidas antes e após a exposição do eletrodo Au/Cys/Mb à

solução do veneno. A curva em preto é consistente com os dados da literatura e indica

que a ação catalítica é promovida pelo átomo de Fe(III) da mioglobina imobilizada no

eletrodo49. Após exposição ao veneno, o potencial de oxidação da reação de oxidação

do AA apresenta uma forte diminuição da corrente faradáica atribuída a este processo.

De acordo com os resultados voltamétricos apresentados na seção anterior, a

exposição do eletrodo Au/Cys/Mb à solução do veneno resulta em uma diminuição da

37

corrente faradáica associada ao par redox FeIII/II da Mb adsorvida (ver Figura 10)

indicando possivelmente um bloqueio da reação de transferência de elétrons.

Figura 11 - Voltamogramas ciclicos para o eletrodo modificado Au/Cys/Mb; pH 7, PBS 0,1 mol L-1; ácido

ascórbico 5,0 mmol L-1; velocidade de varredura 0,1 V s-1; (—) antes de expor ao veneno Crotalus

basiliscus (Vn); (—) após exposição ao veneno (Crotalus basiliscus) por 4 horas.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

j, m

A c

m-2

E, V vs Ag/AgCl

Antes de expor ao Vn

Após expor ao Vn por 4hs

Admitindo que a catálise da reação de oxidação do AA (AA→AA2+) pelo

eletrodo Au/Cys/Mb é promovida através da redução dos íons Fe(III) das moléculas

de Mb (hemeFe3+→hemeFe2+) adsorvidas, os voltamogramas ilustrados na Figura 12

reforçam a conclusão de que as moléculas do veneno (ou componentes deste)

interagem com a proteína bloqueando a reação de transferência de elétrons.

A partir das curvas obtidas em diferentes velocidades de varredura, Figura

12, foram elaborados gráficos relacionando a corrente catalítica com a velocidade de

varredura, os quais encontram-se ilustrados na Figura 13.

Fonte : elaborada pelo autor

38 Figura 12 - Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys/Mb em PBS 0,1 mol L-1, pH 7, com ácido

ascórbico (AA) 5,0 mmol L-1, em diferentes velocidades de varredura (A) e após a exposição ao veneno

(Crotalus basiliscus) por 4 horas (B).

-0,2 0,0 0,2 0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

B

E, V vs Ag/AgCl

4mV

6mV

8mV

10mV

50mV

75mV

100mV

150mV

200mV

300mV

400mV

500mV

10 A

A

10 A


A partir das curvas obtidas em diferentes velocidades de varredura, Figura

12, foram elaborados gráficos relacionando a corrente catalítica com a velocidade de

varredura, os quais encontram-se ilustrados na Figura 13.

O perfil linear observado no gráfico de corrente catalítica vs a raiz quadrada

da velocidade de varredura, i vs. 1/2, indica um processo catalítico limitado por

transporte de massa72. Já o gráfico de corrente normalizada (i 1/2) vs 1/2 apresenta

um perfil atribuído a um processo ECcat (Eletroquímico-Químico catalítico)73 como

pode ser visto nas equações químicas abaixo:

39

Figura 13 - Gráfico da corrente catalítica (о), i, vs. 1/2 e da (●) corrente normalizada (dados obtidos da

Figura 12 (A)), i.1/2 vs..

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0

10

20

30

40

50

i cat (

A)

v1/2

(V s-1)

1/2

0,0 0,2 0,4 0,6

6

8

10

12

i v-1

/2x1

05(A

s1/2v

-1/2)

v (V s-1)


Os gráficos ilustrados na Figura 13 não foram obtidos após a exposição ao

veneno, uma vez que nesta condição, não há atividade eletrocatalítica.

No sistema em estudo ocorre, inicialmente, a oxidação do átomo de Ferro

da mioglobina a Fe3+. Em seguida os íons Fe3+ são reduzidos a Fe2+ oxidando o ácido

ascórbico, conforme esquema ilustrativo representado na Figura 14.

40 Figura 14 - Representação esquemática do mecanismo de eletrocatálise da oxidação do ácido

ascórbico pela mioglobina bloqueada pela ação do veneno

Fonte: elaborada pelo Autor

Andrieux and Saveant74 propuseram um modelo teórico para o mecanismo

catalítico limitado por transporte de massa, a partir do qual se deriva a relação entre

a corrente catalítica (icat) e a concentração do substrato (C*), Mb no caso em estudo,

para velocidades de varredura inferiores a 10 mV s-1, conforme descrito na Equação

(4.1):

𝑖𝑐𝑎𝑡 = 0,496𝑛𝐹𝐴𝐷1/2𝑣1/2𝐶∗(𝑛𝐹/𝑅𝑇)1/2 (4.1)

onde n é o número de elétrons envolvidos na reação, F constante de Faraday, A área

ativa do eletrodo, D a constante de difusão, a velocidade de varredura, R a constante

dos gases ideais e T a temperatura em K.

A partir do gráfico i 1/2 vs. , Figura 14 (●), foi possível calcular o valor

aproximado da constante de velocidade para uma reação49 de pseudo 1ª ordem, kf =

7,4 x 103 mol-1 s-1 para a reação AA→AA2+ considerando Mb = igual a 4,4 x 10-11 mol

cm-2 na presença de 5,0 mmol L-1.

Os estudos voltamétricos (seções 4.1.1 e 4.1.2) deixam em aberto, todavia,

quatro outras hipóteses, a saber: (i) interação da monocamada de cisteína com o

veneno resultando na degradação do eletrodo Au/Cys e consequente incapacidade

de manter a proteína Mb imobilizada sobre a superfície modificada; (ii) desnaturação

da proteína Mb com consequente perda de atividade redox; (iii) arraste das moléculas

adsorvidas de cisteína e mioglobina por ação do veneno; (iv) a adsorção do veneno

na camada de mioglobina do eletrodo modificado e consequentemente a perda da

capacidade redox da proteína. Os resultados de redução de corrente faradáica

41

atribuída ao par redox FeIII/II da proteína e os de diminuição da capacidade de

promover a eletrocatálise da reação de oxidação do AA após exposição do eletrodo

Au/Cys/Mb ao veneno de cobra podem ser justificados com base nestas hipóteses.

As quais foram investigadas afim de validar ou descartar essas hipóteses.

4.1.3 Efeito do agente desnaturante, cloridrato de guanidina, na reação de

transferência de elétrons da mioglobina imobilizada no eletrodo Au/Cys

A hipótese de desnaturação da proteína Mb no eletrodo Au/Cys/Mb foi

primeiramente estudada através da imersão deste eletrodo em solução de PBS

contendo cloridrato de guanidina (gnd), um agente desnaturante padrão75, por

diferentes tempos. Os voltamogramas obtidos encontram-se ilustrados na Figura 16

Figura 15 - Voltamogramas cíclicos do eletrodo Au/Cys/Mb a 100mV s-1 em PBS 0,1 mol L-1, pH 7,

contendo 3,0 mol L-1 de cloridrato de guanidina (gnd) após diferentes tempos de imersão.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

-0,4

-0,2

0,0

0,2

i,

A

E, V vs Ag/AgCl

Tempo de exposição a gnd

0 h

1h

2hs

24hs


As curvas voltamétricas obtidas para o eletrodo Au/Cys/Mb imerso em uma

solução de gnd e em seguida em solução de PBS e realizado a CV, com o aumento

42

do tempo de exposição, uma diminuição da corrente faradáica de oxidação e redução,

tal como observado quando da imersão em solução contendo o veneno de cobra

(Figura 10). Esse resultado, embora não conclusivo, indica que pode estar ocorrendo

a desnaturação da proteína Mb após exposição ao veneno da cobra Crotalus

basiliscus.

4.1.4 Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR)

Estudos com lisozima apresentaram uma relação linear entre a

concentração de proteína e o índice de refração da solução76 permitindo relacionar a

mudança do ângulo SPR com a quantidade de proteína adsorvida no sensor. Para a

superfície de sensores de hidrogéis com espessura de camada de 100 nm foi

estabelecido que uma mudança no ângulo SPR de 122 milligrau63 (mo) corresponde a

1,0 ng.mm-2 a 25 oC.

Com base nos princípios da técnica de SPR onde pode ser monitorado a

mudança de massa na superfície do eletrodo acoplado a um potenciostato, foram

realizados experimentos para elucidar a interação dos componentes do veneno com

a proteína Mb no eletrodo Au/Cys/Mb. As medidas de SPR nos fornecem informações

a respeito da adição de massa à superfície do substrato que, neste estudo, foi o

eletrodo de ouro modificado com SAM de cisteína e mioglobina (Au/Cys/Mb). O

sensorgrama apresentado na Figura 16 apresenta variações de ângulo SPR (SPR) em

função do tempo para injeções de PBS contendo cisteína, mioglobina e veneno de

cobra. Deve-se ressaltar que cada etapa de variação de SPR é seguida da injeção de

PBS a fim de retirar espécies não adsorvidas sobre a superfície. Seguindo-se este

protocolo, objetiva-se a análise de SPR correspondente exclusivamente à massa das

espécies adsorvidas.

43

Figura 16 - Variação do ângulo SPR (SPR) durante a injeção de PBS 0,1mol L-1, pH 7, contendo cisteína,

mioglobina e veneno da cobra Crotalus basiliscus em função do tempo, 25⁰C. Inset: Voltamogramas

cíclicos do eletrodo Au/Cys/Mb a 100mV s-1 em PBS 0,1mol L-1, pH 7, antes (linha vermelha) e após 1h

(linha preta) de exposição ao veneno.

0 1 2 3 4 5 6 7 8

-400

-200

0

200

400

600

800

S

PR

tempo, h

Cys

Mb

Vn

0,15 A cm-2

PBS

PBS

PBS

-0,3 0,0 0,3

E, V vs Ag/AgCl


Os dois primeiros aumentos de SPR indicam as imobilizações sucessivas

de cisteína e mioglobina sobre a superfície de ouro. Os dados obtidos a partir do

sensorgrama ilustrado na Figura 16 encontram-se resumidos na Tabela 1 e são

consistentes com os valores publicados na literatura56. O terceiro aumento de SPR

indica a imobilização do veneno (ou partes deste) sobre a mioglobina.

Após 5h de modificação (lavagem de PBS após fluxo com Mb), obteve-se

uma curva voltamétrica (linha preta, inset na Figura 16) onde se pode observar as

ondas de oxidação e redução atribuídas ao par redox FeIII/II da proteína Mb na forma

nativa49. Após a injeção do veneno (terceiro aumento de ângulo SPR), o

voltamograma obtido (linha vermelha, inset na Figura 16) indica um bloqueio na

cinética da reação de TE, conforme previamente discutido. Este resultado poderia

44

estar associado a um arraste das moléculas de Mb da superfície como resultado da

interação com o veneno. Os sucessivos aumentos de massa após as etapas de

limpeza (injeção de PBS) indicam, todavia, a imobilização efetiva de cisteína sobre

ouro, de mioglobina sobre cisteína e, finalmente, do veneno sobre a proteína.

Tabela 1 - Valores de variação de ângulo SPR (∆θ), massa adsorvida (µg cm-2) e fator de

recobrimento (mol cm-2) para cisteína, mioglobina e veneno.

O aumento de massa correspondente à imobilização do veneno sobre a

mioglobina adsorvida sugere uma interação irreversível, possivelmente entre os

peptídeos constituintes do veneno e a porção externa da proteína. De acordo com os

resultados eletroquímicos, esta interação pode ser a causa da perda da atividade

redox característica da proteína no estado nativo podendo, ainda, estar associada à

desnaturação da mesma.

De modo a saber se a interação entre os componentes do veneno e a

mioglobina visto anteriormente na Figura 16 é uma interação especifica para a

mioglobina, foi realizado experimento de SPR nas mesmas condições da Figura 16

alterando a mioglobina por outra proteína, a albumina de soro bovino (BSA). A

albumina soro (SA) é a mais abundante proteína no plasma de mamíferos. A classe

da proteínas Albumina soro é considerada uma proteína multifuncional por ter uma

extraordinária capacidade de se ligar a diversos ligantes atuando como agente

transportador para uma diversificada gama de metabólitos, drogas, nutrientes, dentre

outras moléculas77. A albumina de soro bovino é uma proteína cujo peso molecular é

de aproximadamente 66KDa e possui um ponto isolétrico de 4,9.

O sensorgrama apresentado na Figura 17 apresenta as variações de SPR

em função do tempo durante as injeções de BSA e veneno sobre superfície de ouro

Espécie Adsorvida θ(m°) Massa Adsorvida

(µg cm-2)

(mol cm-2)

Cys 209 0,171 1,41 x 10-9

Mb 513 0,420 2,47 x 10-11

Veneno 218 0,178 -


45

previamente modificada com cisteína (Au/Cys). Os dados de variação de massa

encontram-se resumidos na Tabela 2.

As variações de SPR ilustradas na Figura 17 indicam as imobilizações da

proteína BSA e do veneno da Crotalus basiliscus sobre o eletrodo Au/Cys. A

imobilização da proteína BSA sobre cisteína é consistente com os resultados de SPR

publicados por Silin78 e colaboradores que estudaram a adsorção de BSA sobre

superfícies de ouro modificadas com ligantes contendo diferentes grupos terminais.

De acordo com os autores78, a proteína BSA apresentou afinidade decrescente pelas

superfícies modificadas com ligantes contendo os seguintes grupos funcionais:

C6H4OH, CH3, COO-, NH2, nessa ordem. Considerando que a cisteína contém os

grupos terminais COO- e NH2, é razoável considerar uma forte interação entre este

aminoácido e a proteína BSA.

Figura 17 - Variação do ângulo SPR (θSPR) em função do tempo durante a injeção de PBS 0,1mol L-1,

pH 7, 25⁰C, contendo albumina de soro bovino e veneno da cobra Crotalus basiliscus sobre o eletrodo

Au/Cys. Inset: estrutura planar da cisteína.

0 1 2 3 4

0

200

400

NH2

OH

SH

O

PBS

Vn

PBS

S

PR

tempo, h

BSA

Cisteína


46 Tabela 2 - Valores de variação de ângulo SPR (∆θ), massa adsorvida (µg cm-2) e fator de

recobrimento (mol cm-2), para BSA e Veneno.


Após a imobilização da proteína BSA, o aumento de SPR em resposta à

injeção de PBS contendo veneno indica a interação entre estas espécies. Este

resultado indica que o veneno não apresenta afinidade exclusiva pela mioglobina.

Outras proteínas, como observado para BSA, são passíveis de interação com o

veneno da cobra Crotalus basiliscus.

De modo a elucidar a dúvida se as moléculas de cisteína interagem

diretamente com os componentes do veneno da cobra Crotalus basiliscus ou se são

retiradas da superfície de ouro, foi obtido um sensorgrama, Figura 18, onde se

monitorou as variações de SPR em função do tempo durante as injeções de PBS

contendo cisteína e veneno. Os dados de massa encontram-se resumidos na Tabela

3.


(µg cm-2)

(mol cm-2)

BSA 173 0,142 2,15 x 10-12

Veneno 167 0,137 -

47 Figura 18 - Variação do ângulo SPR (θSPR) durante a injeção de PBS 0,1mol L-1, pH 7, 25⁰C, contendo,

cisteína e veneno da cobra Crotalus basiliscus em função do tempo.

0 2 3

0

350

700

PBSVn

PBS

S

PR

tempo, h

Cys


O sensorgrama ilustrado na Figura 18 mostra um aumento do ângulo de

refração indicando que houve adição de massa proveniente do veneno na SAM de

cisteína e não a retirada de moléculas de cisteína previamente adsorvidas. Embora

este resultado indique a adsorção direta do veneno sobre a SAM de cisteína, não é

possível inferir que tal processo ocorra quando a SAM de cisteína está recoberta por

moléculas de Mb. Considerando o diâmetro da mioglobina igual a 3,0 nm sua área foi

estimada em aproximadamente 7,07 x 10-14 cm2 por molécula. De acordo com a

informação da área ocupada por uma molécula de Mb, são necessárias 1,41 x 1013

moléculas para o recobrir 1 cm2. O recobrimento de moléculas de Mb sobre a SAM de

cisteína obtido por SPR foi de 2,455 x 10-11 mol cm-2. Transformando esse valor em

quantidade de moléculas de Mb por cm2 tem-se o valor de 1,47 x 1013 que corresponde

aproximadamente a uma monocamada. Com esse resultado pode se inferir que a

monocamada da Mb é compacta e não possibilita a difusão dos componentes do

veneno para a superfície do eletrodo.

48

A Tabela 3 mostra os valores de ângulo SPR θ (m°), massa adsorvida (µg

cm-2) e fator de recobrimento (, mol cm-2) para os componentes do sistema estudado

da Figura 19.

Tabela 3 - Valores de variação de ângulo SPR (∆θ), massa adsorvida (µg cm-2) e fator de

recobrimento (mol cm-2), para Cys e Veneno.



Mioglobina

4.2.1 Espectroscopia Eletrônica nas Regiões do Ultravioleta e Visível (UV-Vis)

A banda Soret de heme-proteínas (de 400 a 450nm), atribuída a transições

* do anel porfirínico do grupo heme35, tem sido utilizada como indicador do estado

destas substâncias por ser sensível a variações no estado de oxidação do átomo de

Ferro (grupo heme) e a mudanças do sexto ligante coordenado a este átomo. Em

geral, quando ocorre desnaturação da proteína, ocorre diminuição de intensidade e/ou

deslocamento de energia da banda Soret. Estudos de desnaturação da mioglobina

por espectroscopia eletrônica UV-Vis utilizando agentes desnaturantes padrões79,

ureia e cloridrato de guanidina, mostraram diminuição na intensidade da banda Soret

ao longo do tempo de exposição75.

A Figura 19 apresenta o espectro eletrônico nas regiões UV-Vis da proteína

Mb em PBS contendo o veneno da cobra Crotalus basiliscus em diferentes tempos da

mistura. A mistura foi preparada com a adição de 1,5 mL de Mb 5,32 µmol L-1 e 500

µL de veneno 1 mg mL-1


(µg cm-2)

(mol cm-2)

Cys 110 0,090 7,43 x 10-10

Veneno 449 0,368 -

49

300 400 500 600 700

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Ab

s

comprimento de onda, nm

Tempo de reação

1min

30min

60min

90min

120min

150min

180min

210min

240min

270min

300min

Na Figura 19, a banda Soret da mioglobina, observada em 409nm, não

apresenta deslocamento de energia após exposição à solução contendo o veneno da

cobra Crotalus basiliscus sugerindo que a proteína não experimentou desnaturação e

nem proteólise. Este resultado, porém, não é conclusivo, uma vez que a literatura

reporta70 que existem graus de desnaturação onde a estrutura da proteína não é

alterada. O fator principal para se inferir sobre a desnaturação da proteína diz respeito

à sua atividade biológica que, no caso da Mb, é afetado pelo estado redox.

4.2.2 Espectroscopia de Dicroísmo Circular

A técnica de Dicroísmo Circular pode ser usada para monitorar mudanças

na conformação de biopolímeros e alterações nas estruturas secundárias e terciárias

de proteínas. Existem até três regiões espectrais no Dicroísmo Circular em

hemeproteínas, a saber: UV-distante, UV-próximo e a região do visível. Na região UV-

distante, de 180 a 240 nm, é possível monitorar mudanças na estrutura secundária da

proteína. A região UV-próximo, faixa de 240 a 320nm, permite estudar os cromóforos

Figura 19 - Espectros eletrônicos nas regiões do ultravioleta e visível da mioglobina (Mb) com veneno de cobra (Vn) Crotalus basiliscus em PBS, 0,1 mol L-1, pH 7, 25⁰C em diferentes tempos de medida de 1 min a 300 min.

Fonte: elaborada pelo autor.

50

que são os resíduos de aminoácidos aromáticos das proteínas: triptofano, tirosina e

fenilalanina. No caso de hemeproteínas, como a mioglobina, na região visível do

espectro são observadas as absorções atribuídas ao grupo heme. Assim, tal como

observado no espectro eletrônico nas regiões do UV-Vis, banda Soret da Mb em

409nm também pode ser estudada por Dicroísmo Circular 80,81.

Os espectros de Dicroísmo Circular na região UV-distante da proteína Mb

em solução de PBS contendo o veneno da cobra Crotalus basiliscus encontram-se

ilustrado na Figura 20. Foram utilizados no preparo da mistura reacional as

concentrações de 2 µmol L-1 e 1,0 mg mL, respectivamente para a mioglobina e

veneno.

Figura 20 - Espectros de Dicroísmo Circular (CD) na região do UV-distante: mioglobina (A —); veneno

(B —); mioglobina mais veneno da cobra Crotalus basiliscus com 1 minuto de reação (C —); com 195

minutos (D —), e a subtração dos espectros com 195 minutos (D) do espectro com 1 minuto (C) (E —); em PBS, 0,1 mol, pH 7, 25⁰C.

190 200 210 220 230 240 250

-20

-10

0

10

20

30

40

,

md

eg


A-Mb

B-Vn

C-MbVn

D-MbVn 195 min

E-(D-C)

As absorções na região UV-distante são provenientes das ligações

peptídicas82. No espectro da proteína observa-se uma banda em aproximadamente

Fonte elaborada pelo autor

51

210 nm e outra mais intensa em aproximadamente 190 nm atribuídas,

respectivamente, às transições do tipo *n e *.

Os espectros da solução contendo mioglobina e veneno mostram um perfil

espectral semelhante a adição das absorções dos espectros das espécies separadas.

Após 195 min de reação não houve alteração do perfil do espectro, seja na energia ou

intensidade. Este comportamento é um indício de que não houve alteração da

estrutura secundária da proteína após a exposição ao veneno da cobra Crotalus

basiliscus.

A Figura 21 apresenta os espectros de Dicroísmo Circular da proteína Mb

em solução de PBS contendo o veneno da cobra Crotalus basiliscus na região UV-

próximo. Foram utilizados no preparo da mistura reacional as concentrações de 9

µmol L-1 e 1,0 mg mL, respectivamente para a mioglobina e veneno.

Figura 21 - Espectros de Dicroísmo Circular (CD) na região do UV-próximo: mioglobina (A —); veneno

(B —); mioglobina mais veneno da cobra Crotalus basiliscus com 1 minuto de reação (C —), com 135

minutos (D —), e a subtração dos espectros com 135 minutos (D) do espectro com 1 minuto (C) (E —), em PBS, 0,1 mol L-1, pH 7, 25⁰C. Entre as linhas pontilhadas em verde a região de absorção da fenilalanina (Phe), entre as linhas em vermelho região da tirosina (Tyr) e entre as linhas pretas do triptofano (Trp).

260 270 280 290 300 310 320

-1

0

1

2

3

4

Phe Tyr

,

md

eg


A-Mb

B-Vn

C-Mb-Vn

D-Mb-Vn 135 min

E- (D-C)

Trp


52

O comportamento observado na Figura 21 é bastante semelhante ao da

região UV-distante, Figura 20, no sentido de que o espectro resultante é, na verdade,

o somatório das absorções das espécies separadas. Ao longo do tempo de reação,

mesmo após 2hs e 15min, não foram observadas alterações no perfil espectral

indicando que não houve alteração na estrutura terciária da proteína após exposição

ao veneno da cobra Crotalus basiliscus.

A mioglobina possui três aminoácidos aromáticos: triptofano (2 unidades),

tirosina (2 unidades) e fenilalanina (7 unidades)83. Na Figura 21, a banda fina em

aproximadamente 290 e outra banda de 290 a 305nm indicam a presença do

triptofano82. A banda entre 275 e 282nm, muitas vezes sobreposta pela banda do

triptofano, é uma absorção referente a presença da tirosina 82. A presença da

fenilalanina82 se caracteriza pela absorção na forma de uma banda fina entre 255 e

270nm.

O espectro de Dicroísmo Circular na região do visível, Figura 22, apresenta

uma absorção de forte intensidade em 409nm, denominada banda Soret, conforme

previamente comentado. As concentrações utilizadas na mistura reacional foram as

mesmas utilizadas para o UV-próximo.

53

Figura 22 - Espectros de Dicroísmo Circular (CD) na região da banda Soret: mioglobina (A —); veneno

(B —); mioglobina mais veneno da cobra Crotalus basiliscus com 1 minuto de reação (C —), com 135

minutos (D —), e a subtração dos espectros com 135 minutos (D) do espectro com 1 minuto (C) (E —), em PBS, 0,1 mol, pH 7, 25⁰C.

300 350 400 450 500

0

2

4

6

8

10

,

md

eg


A-Mb

B-Vn

C-MbVn

D-MbVn 135min

E-(D-C)

A banda Soret, após a exposição ao veneno da cobra Crotalus basiliscus,

não apresenta alteração na energia nem na intensidade, mesmo após 135 min da

mistura. Esse resultado corrobora com os resultados para esse mesmo estudo

utilizado a técnica de espectroscopia eletrônica UV-Vis indicando integridade da Mb,

Figura 19.

4.2.3 Eletroforese gel de Poliacrilamida (PAGE) Laemmli

Neste trabalho, foram realizados experimentos de eletroforese (PAGE) em

meio desnaturante (SDS - dodecil sulfato de sódio) e redutor (β-mercaptoetanol), onde

a migração das moléculas ocorre pela diferença de tamanho e peso molecular. A

interação do veneno da cobra Crotalus basiliscus com a mioglobina foi analisada ao

longo de 24 horas durante as quais, alíquotas foram retiradas e congeladas para


54

análise posterior. A Figura 23 ilustra o gel SDS PAGE desnaturante revelado contendo

os resultados da interação do veneno com a mioglobina ao longo do tempo.

Pode ser visto que ao longo do tempo de exposição da proteína ao veneno,

houve uma mobilidade menor na banda referente a mioglobina indicando aumento de

massa e, portanto, interação de algum componente do veneno com a proteína. Como

o veneno é composto, majoritariamente, por peptídeos e enzimas, sugere-se que o

retardamento da banda referente a mioglobina no gel de eletroforese se deu pela

adição de massa proveniente de alguns peptídeos presentes no veneno, corroborando

com o resultado de SPR que indicou adsorção de massa do veneno sobre a camada

de Mb, Figura 16. Foi possível notar que pelos resultados de SPR que a massa de

veneno adsorvido foi aproximadamente um terço da massa da mioglobina (5 kDa).

Correlacionando com os dados observados por eletroforese, Figura 23, o aumento de

massa da mioglobina no gel foi também de aproximadamente um terço. Assim os

Figura 23 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE) 12,5%. Linha1: amostra com padrão de proteínas; Linha 2: Mioglobina; Linha 3: Veneno; Linhas 4 a 9: Mioglobina com Veneno nos tempos de 1 min, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h e 24 h.


55

resultados corroboram entre si. No gel de eletroforese para o veneno pode ser visto

bandas entre 25 e 30 kDa as quais são atribuídas, majoritariamente, a duas toxinas

hemorrágicas, B1 e B2, tal como identificadas por Molina e colaboradores4.

De modo a complementar os resultados de eletroforese em meio

desnaturante e redutor, foi realizado eletroforese em meio não desnaturante e não

redutor, isto é, sem a presença de SDS (agente desnaturante) e β-mercaptoetanol

(agente redutor). O gel revelado encontra-se ilustrado na Figura 24.

Os resultados da Figura 24 mostram que houve uma pequena mudança na

banda da amostra com mioglobina e veneno ao longo do tempo de mistura. Esses

resultados, porém, não são conclusivos em relação à afirmação de que houve adição

de alguma espécie, como por exemplo um peptídeo presente no veneno, ou a

desnaturação e consequente perda de massa da proteína. Na Figura 23, a mudança

de mobilidade da banda ou longo do tempo foi bem mais significativa

comparativamente aos dados apresentados na Figura 24. Admitindo que o gel

apresentado na Figura 24 foi obtido na ausência de agente desnaturante e redutor,

pode se concluir que a proteína não apresentou desnaturação ao ser misturada ao

veneno. Esse resultado reforça, portanto, aqueles obtidos por espectroscopia de

dicroísmo circular e por espectroscopia de absorção da região UV-Vis.

Figura 24 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) não desnaturante 10%. Linhas 1, 2 e 3 são respectivamente mioglobina (Mb), veneno (Vn) e mistura mioglobina mais veneno (M) com 1 minuto; 4, 5 e 6 são respectivamente Mb, Vn e M com 2hs de reação; 7, 8 e 9 são respectivamente Mb, Vn e M com 6hs de reação; 10, 11 e 12 são respectivamente Mb, Vn e M com 24 hs de reação.


56

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS

O efeito do veneno da cobra Crotalus basiliscus sobre a reação de

transferência de elétrons (TE) da proteína mioglobina (Mb) foi estudado utilizando-se

um eletrodo de ouro modificado com cisteína (Au/Cys) seguido da imobilização da Mb

(Au/Cys/Mb). Os resultados eletroquímicos obtidos para o eletrodo Au/Cys/Mb em

meio fisiológico (tampão fosfato, pH 7) foram consistentes com trabalhos publicados

previamente e apresentaram processos de oxidação e redução atribuídos ao par

redox FeII/III da proteína Mb na forma nativa. Após exposição à solução contendo o

veneno da cobra Crotalus basiliscus, observou-se uma diminuição na corrente

faradáica e um afastamento entre os potenciais de pico anódico e catódico que

indicaram uma redução na cinética da reação de eletrodo da proteína Mb. Sabendo

que o eletrodo Au/Cys/Mb catalisa a reação de oxidação do ácido ascórbico (AA) em

relação ao eletrodo de ouro limpo e que tal efeito é atribuído a um mecanismo ECcat,

onde a etapa química consiste na redução das moléculas de Mb que posteriormente

oxidam as moléculas de AA em solução, fez-se a análise desta reação antes e após

exposição do eletrodo Au/Cys/Mb ao veneno da cobra Crotalus basiliscus. A corrente

atribuída a reação de oxidação do AA é fortemente diminuída após exposição ao

veneno indicando alterações nos sítios ativos do eletrodo Au/Cys/Mb. Indiretamente,

este resultado sugere a atuação do veneno da cobra sobre a reação de TE da Mb. Os

estudos voltamétricos permitem a consideração de que o veneno da cobra em estudo

(ou componentes deste) atua (de forma concomitante ou não): (i) interagindo com a

monocamada de cisteína de modo a degradar o eletrodo Au/Cys e liberar as moléculas

de Mb adsorvidas; (ii) desnaturando a proteína Mb com consequente perda de

atividade redox; (iii) retirando as moléculas adsorvidas de cisteína e mioglobina da

superfície; (iv) adsorção do veneno no eletrodo modificado e a consequente perda da

capacidade redox da mioglobina. Os resultados de SPR descartaram a primeira e a

terceira hipótese, uma vez que mostraram um aumento de massa para cada etapa de

modificação do eletrodo de ouro indicando, portanto, a imobilização de moléculas de

Mb sobre a SAM de cisteína e de veneno sobre as moléculas de Mb.

A Figura 25 mostra a proposição de uma representação esquemática do

eletrodo modificado após contato com o veneno da cobra Crotalus basiliscus.

57 Figura 25 - Representação esquemática do eletrodo modificado Au/Cys/Mb/Vn, imagem fora das proporções reais.

Tal proposição foi reforçada pelos resultados de eletroforese que

apresentaram uma diminuição na mobilidade da Mb no gel após a mistura com a

solução contendo veneno da cobra Crotalus basiliscus. Os resultados de

eletroquímica, SPR e eletroforese, todavia, não apontam de forma conclusiva para

alterações estruturais na Mb após exposição ao veneno não permitindo inferir sobre o

grau de desnaturação da proteína. De fato, os espectros eletrônicos UV-Vis não

apresentaram mudança significativa na banda Soret da Mb; banda esta sensível ao

grau de desnaturação da proteína. Da mesma forma, os espectros de Dicroísmo

Circular obtidos nas regiões near-UV, far-UV e Soret não apresentaram mudanças no

perfil espectral da proteína, indicando que a integridade física da Mb é mantida após

exposição ao veneno. Os espectros eletrônicos UV-Vis e de dicroísmo circular

descartaram, portanto, a segunda hipótese onde se considerou que a perda de

atividade redox estaria associada à desnaturação da proteína.

A correlação entre os resultados obtidos em meio heterogêneo (eletrodo

Au/Cys/Mb) e homogêneo (Mb em solução) permitiu concluir que o veneno da cobra


58

Crotalus basiliscus, ou componentes deste, tem como ação o bloqueio da reação de

transferência de elétrons da proteína mioglobina, mesmo sem afetar a integridade

física desta espécie, ou seja, não desnaturando a proteína e nem degradando-a

proteoliticamente. Sabidamente, o processo de transferência de elétrons em

moléculas biológicas ocorre através de mecanismos que incluem várias etapas e que

envolvem a participação de resíduos com baixos valores de potencial de ionização.

Sendo assim, tem-se como perspectiva, proceder a identificação dos componentes do

veneno que interagem com a proteína Mb no eletrodo Au/Cys/Mb utilizando a técnica

de Espectrometria de Massa. Tal estudo será realizado em colaboração com a

Professora Dávila Zampiere do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da

Universidade Federal do Ceará.

59

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66

ANEXO A – CERTIFICADO DE PARTICIPAÇÃO E APRESENTAÇÃO DE

TRABALHO NO CONGRESSO XVII BRAZILIAN MEETING ON INORGANIC

CHEMISTRY (BMIC)

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ANEXO B - COPYRIGHT FIGURA 4

universidade federal do ceará centro de ciências programa ... · mioglobina (a —); veneno (b...

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