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DraDra. . FernandaFernanda CanduriCanduriLaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares..DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. UNESP. UNESPSãoSão José do Rio José do Rio PretoPreto. SP.. SP.

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Introdução à Bioquímica

Função das Proteínas

Tópicos

! Mioglobina! Hemoglobina! Miosina e actina! Anticorpos


Mioglobina - Estrutura

! Primeira proteína a ter sua estruturadeterminada por cristalografia de raios X (1959).

! Pequena proteína intracelular do músculo dos vertebrados com função de ligar oxigênio (O2).

! Possui 153 resíduos de aminoácidos, sendoque a maioria faz parte de oito hélices α.

! Possui um único grupamento heme.



O grupo heme

Mioglobina

Estrutura da mioglobina

! O heme está encaixado em uma concavidadehidrofóbica

! Duas cadeias laterais hidrofóbicas auxiliam namanutenção da posição do heme.

! O sistema de anel heterocíclico do heme é um derivado porfirínico, contendo 4 grupos pirrólicos


! O átomo de Fe(II) do grupo heme, quandoexposto ao O2 é oxidado de maneirairreversível a Fe(III), forma que não liga O2.

! A porção protéica da mioglobina impede essaoxidação e torna possível a ligação reversíveldo O2 ao heme.

! A oxigenação leva a mudança de coloração damolécula de mioglobina.


Estrutura da mioglobina

Outras moléculas se ligam ao heme

! Além do O2, outras moléculas podem se ligarao grupo heme: CO, NO e H2S

! A afinidade destes compostos é muito maiordo que o O2.


Função da mioglobina

Somente uma proteína armazenadora de O2?

Sua principal função fisiológica consiste em facilitar o transporte de oxigênio nos músculos.

A mioglobina aumenta a solubilidade efetiva do O2 no músculo, atuando como um carregador / descarregador molecular para aumentar a velocidadede difusão do O2.



! Função de armazenar O2:Importante nos mamíferos aquáticos.

Nesses animais, a concentração de mioglobinanos músculos é aprox. 10x maior do que nosmamíferos terrestres.



A ligação reversível do O2 à mioglobina (Mb) é descrita por uma equação de equilíbrio

Mb + O2 ↔ MbO2

A constante de dissociação (K) para essaequação é:

K = [Mb][O2] / [MbO2]


A dissociação do O2 da mioglobina é caracterizada porsua saturação fracional YO2, que é definida como a fração dos sítios de ligação ocupados pelo O2.

YO2 = [MbO2] / [Mb] + [MbO2] = [O2] / K +[O2]

Desde que o O2 é um gás, sua concentração é expressa por sua pressão parcial (pO2)

YO2 = pO2 / K + pO2

Essa equação descreve uma hipérbole



! Numa pO2 baixa, pouco O2 se liga à mioglobina (YO2 é muito baixa).

! A medida que a pO2 aumenta, mais O2 liga-se a Mb.

! Numa pO2 muito alta, quase todos os sítiosestão ocupados - diz-se que a Mb estásaturada de O2.



! A inclinação da hipérbole aumenta à medida quediminui o valor de K.

! Quando pO2 é igual a K, metade da Mb estarásaturada com O2

! Isso pode ser mostrado substituindo-se K por pO2 naequação anterior:se pO2 = K, YO2 = pO2/K + pO2 " YO2 = 0,5

Então, K pode ser definido como o valor de pO2, no qualY=0,5



! É conveniente definir K como p50, ou seja, a pressãode O2 na qual Mb está 50% saturada

! A p50 para a Mb é de 2,6 torr (760 torr=1atm)" no intervalo fisiológico da pO2 no sangue, a Mb está

quase totalmente saturada com O2.

YO2=0,97 a pO2=100 torr e 0,91 a pO2=30 torr

A Mb é um modelo útil para o estudo de outrasproteínas de ligação.


Hemoglobina

! Tem função fisiologicamente específica – o transporte de O2.

! Constitui um sistema sofisticado de transporteque fornece a quantidade adequada de O2 aostecidos.


Estrutura da hemoglobina

! É uma proteína tetramérica, com a estruturaquaternária α2β2 (um dímero αβ).

! As subunidades α e β são relacionadasestrutural e evolutivamente entre si e com a mioglobina.

! Sua estrutura foi elucidada por Max Perutz em1968, o pai da cristalografia de proteínas pordifração de raios X.



Cada monômero da estrutura tetramérica dahemoglobina possui um grupo heme

Apenas cerca de 18% dos resíduos de aminoácidos são identicos na mioglobina e nas subunidades da hemoglobina, mas os

três polipeptídeos possuem estruturasterciárias similares.

Estrutura da hemoglobina


! A ligação do O2 altera toda a estrutura do tetrâmero, de forma que a estrutura da desoxiemoglobina e a daoxiemoglobina são perceptivelmente diferentes.

! Em ambas as formas, as subunidades α e β fazemcontato extenso: os contatos na interface α1-β1 e seuequivalente, envolvem 35 resíduos, e os da interface α1-β2 envolvem 19 resíduos.

! Essas associações são predominantementehidrofóbicas, embora envolvam ligações de H e pares iônicos.

A estrutura da hemoglobina


Oxihemoglobina e desoxihemoglobina


A estrutura da hemoglobina

! Os pares das subunidades α1−α2 e β1−β2 estãoseparados por um canal de ~20Å de diâmetropreenchido com solvente.

! Quando o O2 se liga, os contatos α1−β2 e α2−β1sofrem um deslocamento, produzindo umaalteração na estrutura quaternária.

! Esse rearranjo estrutural é um elemento crucial no comportamento da ligação do O2 à hemoglobina.


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Ligação do O2 à hemoglobina

! A hemoglobina tem uma p50 total de 26 torr(em uma pressão de O2 de 26 torr, metadeda hemoglobina está saturada com O2)

! Valor cerca de 10x maior do que a p50 damioglobina (2,8 torr)

! A hemoglobina não apresenta uma curvahiperbólica de ligação ao O2, como namioglobina.


A ligação de O2 à hemoglobina segue o traçado de uma curva sigmóide



! A hemoglobina pode transferir mais O2 paraos tecidos do que transferiria se apresentasse uma curva hiperbólica com a mesma p50

! Nas pressões arteriais de O2, está quasetotalmente saturada com O2, mas naspressões venosas de O2 está somentemetade saturada.


! Em qualquer sistema de ligação, uma curvasigmóide é característica de uma interaçãocooperativa entre os sítios:

A ocupação de um sítio pelo ligante afeta a ocupação dos demais sítios por ligantesadicionais



Equação de Hill

! Tentativa inicial de analisar a curva sigmóidede dissociação do O2 da hemoglobina foirealizada por Archibald Hill (1910)

! Hill presumiu que a hemoglobina (Hb) liga nmoléculas de O2 em uma única etapa

Hb + n O2 " Hb(O2)n

ou seja, com cooperatividade infinita.


Equação de Hill

Em analogia a equação

YO2 = pO2/K + pO2 para a Mb,

YO2 = (pO2)n / (p50)n + (pO2)n

é conhecida como equação de Hill.

Ela descreve o grau de saturação dahemoglobina como uma função da pO2.


"""" A cooperatividade infinita da ligação de O2 comodescrita por Hill é uma impossibilidade física

! A quantidade n, a constante de Hill, aumenta com o grau de cooperatividade de uma reação, proporcionando uma caracterização conveniente de uma reação de ligação de ligante

n=1, a equação descreve uma hipérbole (reação nãocooperativa)

n>1, a equação descre uma sigmóide (reaçãopositivamente cooperativa)

n<1, reação negativamente cooperativa


A constante de Hill, n, e o valor de p50 que melhordescrevem uma curva de saturação da Hb podemser determinados graficamente pela equação

YO2 / 1 - YO2 = (pO2)n / (p50)n

Tomando o log em ambos os lados, tem-se uma equação linear

log (YO2 / 1 - YO2) = n log pO2 – n log p50



A curva linear do log (YO2 / [1 - YO2]) pelolog de pO2, chamada curva de Hill, tem uma inclinação de n e um intercepto de log p50 no eixo do log pO2.

Gráfico de Hill

Modelos mais realistas para analisar a ligaçãocooperativa do O2 à Hb foram desenvolvidos

Proteínas alostéricas

A cooperatividade da ligação do O2 à Hb é um modeloclássico

A ligação de um ligante pode aumentar ou diminuir a afinidade de ligação de ligantes a outros sítios daproteína – são interações alostéricas


Existem dois modelos propostos paraexplicar a ligação cooperativa do ligante

1. Modelo de simetria do alosterismo (propostopor Monod, Wyman e Changeux em 1965):

a. Uma proteína alostérica é um oligômero de subunidades simetricamente relacionadas;

b. Cada subunidade existe em dois estadosconformacionais em equilíbrio;

c. O ligante pode ligar-se à subunidade em ambas as conformações. Somente a mudança conformacional altera a afinidade pelo ligante;

d. As subunidades devem alterar a conformação de modo combinado.

Modelo de simetria de MWC

! A principal objeção ao modelo de simetria consistena dificuldade de acreditar que a simetriaoligomérica seja perfeitamente conservada emtodas as proteínas

! E, embora algumas proteínas exibamcooperatividade negativa, o modelo explicasomente a cooperatividade positiva.


2. Modelo sequencial - proposto por Daniel Koshland

! É uma alternativa ao modelo de simetria.! A ligação do ligante induz uma alteração

conformacional na subunidade à qual se liga e, pelainfluência dessa sobre as subunidades vizinhas, surgem interações cooperativas

! As mudanças conformacionais ocorremsequencialmente à medida que mais sítios de ligaçãoestão sendo ocupados

! A afinidade varia com a conformação.


As proteínas que seguem o modelo sequencialdo alosterismo podem apresentarcooperatividade positiva ou negativa

! Se o acoplamento mecânico entre as subunidades for particularmente forte, as mudanças conformacionais ocorrerão simultaneamente, mantendo sua simetria

! Neste caso, o modelo de simetria pode ser consideradoum caso extremo do modelo sequencial

! A ligação do O2 à Hb exibe características de ambos osmodelos – é combinada e causa mudanças estruturais pequenas


Como a ligação de um O2 num grupo heme afeta a afinidade de ligação de outro grupo heme?

A informação é transmitida de modo mecânico para os demais grupos heme por movimentos da proteína. Esses movimentos são responsáveis pelas diferentes estruturas quaternárias da oxi- e desoxi-Hb.


Mecanismo de cooperatividade da ligação de O2

A hemoglobina possui dois estados conformacionais

! Baseadas nas estruturas cristalográficas das formas oxi e desoxi, Perutz formulou um mecanismo para a oxigenação da Hb:

Há dois estados conformacionais estáveis: o estado R, oxigenado, e o estado T, desoxigenado.

As conformações das 4 subunidades diferem do estado T para o R.

A ligação do O2 inicia uma série de movimentos coordenados.


Formas R e T

! A característica da transição T " R da Hb é que suas subunidades estão tão firmemente acopladas que não podem acontecer grandes mudanças estruturais terciárias dentro de uma subunidade, sem que ocorram mudanças estruturais quaternárias em toda a proteína – só há duas formas R e T.

! Nenhuma subunidade ou dímero muda sua conformação de modo independente.


Formas R e T

! O estado T tem baixa afinidade pelo O2, devido ao comprimento da ligação Fe-O2 (0,1 Å maior).

! Quando 1 O2 liga-se a um dímero, a tensão gerada no estado T é suficiente para levar a proteína ao estado R

! Então todas as subunidades são convertidas simultaneamente ao estado R, tenham ou não O2ligado.

! Nesta conformação, as subunidades não-ocupadas apresentam maior afinidade pelo O2.


O efeito Bohr

! As mudanças conformacionais que ocorrem na Hb pela ligação do O2 reduzem os pKs de vários grupos (N-terminal das α e C-terminal das β).

! No estado T esses grupos ácidos com carga positiva participam de ligações iônicas o que eleva seus pKs, ao passo que no estado R tais interações não existem.

! O aumento do pH (remoção de prótons), estimula a hemoglobina a ligar mais O2 em pressões de O2 mais baixas – é o efeito Bohr – Christian Bohr (1904)


O efeito Bohr


O efeito Bohr desempenha funções importantes

O2 " pulmões para os tecidosCO2 " difunde-se dos tecidos para os capilares e

pulmõesO CO2 dissolvido transforma-se lentamente em bicarbonato (HCO3

-)

CO2 + H2O " H+ + CO3-

No eritrócito, a enzima anidrase carbônica acelera essa reação. Então, a maior parte do CO2 é transportado no

sangue na forma de bicarbonato.


Nos pulmões, onde a pressão de O2 é alta, a ligação do O2 à Hb rompe as ligações iônicas do estado T e forma o estado R, liberando assim, os prótons de Bohr, que se recombinam com o bicarbonato para eliminar o CO2.


“A hemoglobina altamente purificada (Stripped Hb) tem uma afinidade muito maior pelo oxigênio do que a hemoglobina no sangue total.”

Porque?

Joseph Barcroft (1921) especulou que o sangue conteria, além do CO2, alguma outra substância, afetando a ligação do O2 à Hb.


D-2,3-bisfosfoglicerato – o BPG


D-2,3-bisfosfoglicerato – o BPG

Liga-se fortemente a desoxi-Hb e fracamente a oxi-Hb.

Assim, a presença do BPG nos eritrócitos reduz a afinidade da Hb pelo O2 por mantê-la na sua forma desoxi

Onde se liga na molécula da Hb?


O BPG liga-se à concavidade central

! Na transição T " R, as duas subunidades βse aproximam,estreitando a concavidade central, e expulsando o BPG

! Portanto, estabiliza a conformação T da Hb pela ligação cruzada de suas subunidades β

! Desloca o equilíbrio R " T, reduzindo a afinidade da Hb pelo O2.


BPG – função fisiológica indispensável

! No sangue arterial (pO2 = 100 torr) a Hb está 95% saturada com O2

! No sangue venoso (pO2 = 30 torr) a Hb está 55% saturada

Então, ao passar pelos capilares, a Hb descarrega cerca de 40% de O2

Na ausência de BPG, somente pequena parte do O2 seria liberado, devido ao aumento da afinidade.

O BPG exerce um papel importante na adaptação às grandes altitudes


A Hb fetal (αααα2222γγγγ2222) tem baixa afinidade pelo BPG


Hemoglobinas anormais

O estudo de indivíduos com deficiências fisiológicas levou a descoberta de aproximadamente 500 hemoglobinas variantesCerca de 95% delas são resultado de substituições de um único aminoácido na cadeia polipeptídica da globina.


! As mutações que desestabilizam as estruturas terciárias e quaternárias alteram a afinidade da Hb pelo O2 e reduzem a sua cooperatividade.

! As Hbs instáveis são degradadas pelos eritrócitos e seus produtos de degradação causam lise celular – é a anemia hemolítica



! Outras mutações favorecem a oxidação do Fe(II) para Fe(III) – cianose

São indivíduos portadores de metahemoglobinaEssa Hb apresentam cooperatividade reduzida

! Há também mutações que aumentam a afinidade da Hb pelo O2, levando ao aumento do número de eritrócitos para compensar a quantidade reduzida de O2 que chega aos tecidos - policitemia



A anemia falciforme

! Os indivíduos que apresentam os dois alelos (homozigotos) do gene da hemoglobina S sofrem de anemia falciforme, na qual a desoxi-Hb S forma filamentos insolúveis que deformam os eritrócitos


Micrografia eletrônica de eritrócitos humanos


! As células rígidas e em forma de foice não conseguem passar com facilidade pelos capilares.

! Em 1956, V. Ingram mostrou que a Hb S continha uma Val na posição 6 das cadeias β, ao invés de Glu.

Doença congênita originada pela troca de um aminoácido específico de uma proteína


A anemia falciforme

Hemoglobina S

! A estrutura cristalográfica da desoxi-Hb S mostrou que a cadeia lateral da Val de cada molécula mutante encaixa-se em uma concavidade hidrofóbica na superfície da subunidade β de outra molécula de hemoglobina

! Esse contato intermolecular permite a formação de polímeros lineares entre as moléculas da Hb S – formam agregados de 14 cadeias que enrolam-se e formam fibras de cerca de 220Å de diâmetro


Anemia falciforme

Nem a Hb normal, e nem a oxi-Hb S podem polimerizar

A concavidade hidrofóbica não acomoda a cadeia lateral do Glu de uma cadeia normal, e essa concavidade não

existe na oxi-Hb

Muitos homozigotos para Hb S apresentam somente uma forma leve de anemia falciforme, pois apresentam níveis relativamente altos de Hb fetal (α2γ2)


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