Extração e Caracterização Espetroscópica da Mioglobina da CarneBioquímica Experimental II

Faculdade de CiênciasLicenciatura em Bioquímica

PL23 | Grupo 1

2013/2014

Alexandra Lança 43230

Olena Mukan 44359

Patrícia Antunes 43149

Patrícia Sequeira 43242

Docente: Maria Luísa Serralheiro

Mioglobina

Objetivos Gerais

• Extração e identificação das formas reduzida e oxidada da Mioglobina através das

duas propriedades espetrais.

• Estudo das reações redox de interconversão das espécies.

2

Mioglobina

• Proteína monomérica

• Massa molecular: 16,949Da

• Armazenamento e transporte de oxigénio

• Possui um grupo heme

• Músculos cardíaco e esquelético

Figura 1 – Diversas representações daestrutura da Mioglobina.

3

Figura 2 – Representação da estrutura da Mioglobina.

4

Transporte de Oxigénio

Oxigénio pouco solúvel em soluções

aquosas

Difusão do oxigénio pelos tecidos é

ineficiente

Nenhuma das cadeias laterais das proteínas é

adequada para a ligação reversível do

oxigénio.

Metal de Transição

FerroCobre

Têm de possuir elevada tendência para ligação

ao oxigénio

5

Ferro nas proteínas

Ferro Livre Espécies altamente reativas de oxigénio

Danos no DNAe noutras moléculas

Ligação a estruturas que sequestram e/ou o tornam menos reativo.

Grupo Heme Composto associado de modopermanente a uma proteína eque contribui para a funçãodessa proteína.

6

Grupo Heme

Complexa estrutura orgânica em anel: porfirina IX À qual está ligada um único átomo de Fe no estado ferroso.

Carácter doador deeletrões pelo que ajudama impedir a conversão doferro do heme (estadoferroso) para férrico.

Estado ferroso: liga o oxigénio de forma reversível.Estado férrico: não liga o oxigénio.

Figura 3 –Grupo Heme.7

Met-Mb e Oxy-Mb

Figura 4 – Representação dasduas ligações de coordenaçãodo Fe²⁺ perpendiculares aoplano do sistema do anel daporfirina.

8

Met-Mb e Oxy-Mb

Met-Mb Oxy-Mboxidação

redução

[FeIII-H2O-Mb][FeII-O2-Mb]

Figura 5 – Representação da forma Met-Mb. Figura 6 – Representação da forma Oxy-Mb.9

Procedimento

Esquema 1– Procedimento do trabalho realizado.10

Met-Mb e Oxy-Mb

Solução A

A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,0549g de ferricianeto de potássio,

conduzindo à produção de Met-Mb:

Fe2+-O2-Mb + K6[FeCN6] Fe3+-H2O-Mb (Equação 1)

Solução B

A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,1135 g de ditionito de sódio,

conduzindo à produção de Oxy-Mb:

Fe3+-H2O-Mb + Na2S2O4 Fe2+-O2-Mb (Equação 2)

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Análise dos Espetros

• Sobrenadante• Solução A• Solução B

Análise dos Espetros

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Espetros de Absorção no UV-Visível

Amostra Região Visível Região de Soret

Met-Mb 635nm 504nm 409nm

Oxy-Mb 580nm 542nm 417nm 348nm

Quadro 1 – Picos de absorção das formas da mioglobina na região do visível e na região de Soret.

𝜀409𝑛𝑚𝑀𝑒𝑡−𝑀𝑏 = 179 𝑚𝑀−1. 𝑐𝑚−1

𝜀417𝑛𝑚𝑂𝑥𝑦−𝑀𝑏

= 128 𝑚𝑀−1. 𝑐𝑚−1

13

Espetros de Absorção no UV-Visível - Sobrenadante

Figura 7 – Espectro de Absorção (UV-Vis) obtido para oSobrenadante. Foram lidas as absorvências noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.

Figura 8 – Espectro de Absorção (UV-Vis) do Sobrenadante. Fonte:Artigo “Microburger Biochemistry: Extraction and SpectralCharacterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas andLaura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, KansasState University, Manhattan, KS 66506”.

14

Espetros de Absorção no UV-Visível – Solução A

Figura 9 – Espectro de Absorção (UV-Vis) obtido para asolução A (Met-Mb). Foram lidas absorvências noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.

Figura 10 – Espectro de Absorção (UV-Vis) da Solução A (Met-Mb). Fonte: Artigo “Microburger Biochemistry: Extraction and SpectralCharacterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas andLaura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, KansasState University, Manhattan, KS 66506”.

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Figura 11 – Espectro de Absorção (UV-Vis) obtido para asolução B (Oxy-Mb). Foram lidas absorvências noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.

Figura 12 – Espectro de Absorção (UV-Vis) da Solução B (Oxy-Mb). Fonte: Artigo “Microburger Biochemistry: Extraction and SpectralCharacterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas andLaura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, KansasState University, Manhattan, KS 66506”.

Espetros de Absorção no UV-Visível – Solução B

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Registo das Absorvências

Amostra C.d.O.

(nm)

Abs

Sobrenadante

1/3

635 0,172

542 0,523

505 0,395

580 0,488

409 3,152

417 3,222

Amostra C.d.O.

(nm)

Abs

Solução A

1/5

635 -0,005

542 0,009

505 0,028

580 -0,002

409 0,801

417 0,533

Amostra C.d.O.

(nm)

Abs

Solução B

1/5

635 -0,003

542 0,05

505 0,022

580 0,049

409 0,415

417 0,499

Quadro 2 – Registo das absorvênciasmedidas para o sobrenadante nosrespetivos comprimentos de onda apósleitura dos espetros.

Quadro 3 – Registo das absorvênciasmedidas para a solução A nos respetivoscomprimentos de onda após leitura dosespetros.

Quadro 4 – Registo das absorvênciasmedidas para a solução B nos respetivoscomprimentos de onda após leitura dosespetros.

17

Determinação da massa de proteína nas soluções A e B: Lei de Lambert-Beer

Lei de Lambert-Beer: Abs=εlc

Solução A

Abs –Absorvência (a 409nm registou-se 0,801) - Coeficiente de absorção molar (=179mM-1.cm-1)c –Concentração de Met-Mbl – percurso ótico (l=1 cm)

𝐴𝑏𝑠 = 𝜀𝑙 𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 ↔

𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 =𝐴𝑏𝑠

𝜀𝑙↔

𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 =0,801

179 × 1↔

𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 = 4,47 × 10−3𝑚𝑀

𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 × 5 ↔

𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 4,47 × 10−3 × 5 ↔

𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 2,235 × 10−2𝑚𝑀 = 2,235 × 10−5𝑀

Como a solução A sofreu uma diluição de 1:5 tem-se que a concentração de Met-Mb é:

18

Determinação da massa de proteína nas soluções A e B: Lei de Lambert-Beer

A massa molecular da mioglobina é 16949 g/mol, como a Met-Mb possui na

sua constituição água tem-se que a massa molar da Met-Mb corresponde a

16949+2x1+15,999=16966,99gmol-1:

𝑚 = 𝑀 × 𝑛 ↔

𝑚 = 16966,99𝑔/𝑚𝑜𝑙 × 2,235 × 10−5𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿 ↔ 𝑚 = 0,3792 𝑔𝐿−1

𝑚 = 0,3792 𝑚𝑔/𝑚𝐿

Como o volume de amostra recolhido na SEC foi de 1,2mL obtém-se a massa de Met-Mb:

𝑚 = 0,3792𝑚𝑔

𝑚𝐿× 1,2𝑚𝐿 = 0,4550𝑚𝑔

19

Determinação da massa de proteína nas soluções A e B: Lei de Lambert-Beer

Para a solução B, correspondente à Oxy-Mb foram aplicados os mesmocálculos.

Solução A (Met-Mb) Solução B (Oxy-Mb)

Comprimento de onda utilizado (nm) 409 417

Absorvência 0,801 0,499

(mM-1.cm-1) 179 128

[proteína] M 2,235 × 10−5 1,949 × 10−5

Massa molar (g/mol) 16966,99 16964,99

Volume recolhido (mL) 1,2 2,8

Massa (mg) 0,4550 0,9257

Quadro 5 –Comparação de diversos parâmetros para determinação da massa de proteína entre as soluções A e B.

20

Doseamento proteico

• Método de Lowry

• Método do Biureto

• Método de Bradford

• Sobrenadante

• Solução A

• Solução B

21

Método de Lowry

• Técnica com o objetivo de determinar a concentração proteica numa determinada

solução recorrendo ao reagente Folin Ciocalteau.

Solução proteica Reagente de FolinCiocalteau

Complexo de cor Azul

Condições alcalinas

22

Método do Biureto

Amostra de proteína contendo duas ou mais

ligações peptídicas.

Reagente de Biureto(Sulfato de Cobre Alcalino)

Complexo púrpura

• Leitura das Absorvências a 280nm.• Construção de uma reta de calibração.

Os extratos celulares contém muitos outros compostos que absorvem a 280nm.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑚𝑔.𝑚𝐿−1 = 1.55𝐴280𝑛𝑚 − 0.76𝐴260𝑛𝑚 23

Método de Bradford

Resíduos de aminoácidos com cadeias laterais básicas/aromáticas

Corante Coomassie BlueG-250

Coloração Azul

24

Método Biureto Lowry Bradford

Exactidão Alta Média Mais alta que Lowry

Especificidade

Para compostos com

2 ou mais ligações

peptídicas

Reage com resíduos de

tirosina e triptofano.

Suscetível a agentes

interferentes

Reage com resíduos de

aminoácidos com

cadeias laterias

básicas/aromáticas

Rapidez da Execução Lenta Média Rápido

Precisão Preciso Preciso Preciso

Quadro Resumo dos Métodos

Quadro 6 –Comparação dos três métodos de doseamento proteico.

25

Preparação da Curva de Calibração

Solução (mL)

Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11BSA(0,35

mg/mL)

0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0 0 0

Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0,10 0,20 0,30 0,40

Água 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,40 0,30 0,20 0,10

Reagente C 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

MISTRURAR TODOS OS TUBOS E AGUARDAR 10 MINUTOS.

Reagente D 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

DEIXAR REPOUSAR À TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 30 MINUTOS.

Volume final 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25

Quadro 7 –Composição dostubos utilizadospara o métodode Lowry.. 26

Preparação da Curva de Calibração

Tubos Absorvência

Registada

1 0,000

2 0,093

3 0,182

4 0,278

5 0,324

6 0,400

7 0,520

Determinação da concentração de

proteína padrão em cada tubo:

[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 2=[𝐵𝑆𝐴] × 𝑉(𝐵𝑆𝐴)𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜

𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑛𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜↔

[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 2=0,35 × 0,05

3,25= 0,0054 𝑚𝑔/𝑚𝐿

Quadro 8 – Registo das absorvências relativasaos tubos para construção da reta de calibração.

27

Curva de Calibração

Tubos Absorvência [proteína]

(mg/mL)

1 0,000 0,0000

2 0,093 0,0054

3 0,182 0,0108

4 0,278 0,0162

5 0,324 0,0215

6 0,400 0,0269

7 0,520 0,03230

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300 0,0350A

bs

(75

0n

m)

[proteína]/tubo (mg/mL)

Curva de Calibração - Método de Lowry

y = 15,361x + 0,0086

R² = 0,992

Quadro 9 – Registo das absorvências econcentrações proteicas determinadas relativasaos tubos para construção da reta de calibração.

Gráfico 1 – Reta de Calibração para o método deLowry.

28

Determinação da concentração proteica

SobrenadanteTubos Absorvência

8 0,480

9 0,789

10 1,025

11 1,231

y=mx+b y=Abs e x=[proteína]

Abs=m[proteína]+b

Com m=15,361 e b=0,0086

Exemplo Tubo 8:

𝐴𝑏𝑠𝑡𝑢𝑏𝑜 8 = 𝑚[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8+𝑏 ↔ [𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8=𝐴𝑏𝑠𝑡𝑢𝑏𝑜 8−𝑏

𝑚↔

[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8=0,480−0,0086

15,361↔ [𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8=0,031 mg/mL

Quadro 10 – Registo das absorvênciasdos tubos com as amostras relativas aosobrenadante.

29

Determinação da concentração proteica – Fatores de Diluição

Inicialmente realizou-se uma diluição de 1:20 para análise

espetrofotométrica e para o doseamento proteico, então à concentração

determinada pelo método de Lowry multiplica-se o fator de diluição que tem o valor

20:

𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 8(1) = 𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 × [𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] 𝑡𝑢𝑏𝑜 8↔

[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] 𝑡𝑢𝑏𝑜 8= (1) 20× 0,031 ↔ 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 8(1) = 0,6138 mg/mL

30

Determinação da concentração proteica – Fatores de Diluição

Quando adicionada a amostra aos tubos de ensaio a analisar, deu-se uma

nova diluição devido à presença do reagente C, do reagente D e da água. Assim é

necessário determinar o fator de diluição:

𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 =𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑎 𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜

𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜=0,1

3,25= 0,030769

𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 8(2) = 0,6138 ×1

0,030769= 19,95 𝑚𝑔/𝑚𝐿

Volume de amostra = 0,1 mLVolume total do tubo = 3,25 mL

31

Registo das concentrações proteicas - Sobrenadante

O mesmo procedimento foi aplicado a todos os restantes tubos do

sobrenadante, da solução A e da Solução B.

Tubos Absorvência 1º Fator diluição 2º Fator diluição [proteína] final (mg/mL)

8 0,480 1/20 0,0308 19,95

9 0,789 1/20 0,0615 16,51

10 1,025 1/20 0,0923 14,34

11 1,231 1/20 0,1231 12,93

Quadro 11 – Registo das absorvências, diluições e concentração proteica final relativasao sobrenadante.

32

Registo das concentrações proteicas – Solução A

Tubos Absorvência 1º Fator de Diluição 2º Fator de Diluição [proteína] final

8 0,566 1:5 0,0308 5,897

9 0,940 1:5 0,0615 4,926

10 0,186 1:5 0,0923 0,625

11 1,425 1:5 0,1231 3,746

Quadro 12 – Registo das absorvências, diluições e concentração proteica final relativas à solução A.

33

Tubos Absorvência 1º Fator de Diluição 2º Fator de Diluição [proteína] final

8 0,439 1:5 0,0308 4,553

9 0,657 1:5 0,0615 3,430

10 0,882 1:5 0,0923 3,080

11 1,075 1:5 0,1231 2,820

Registo das concentrações proteicas – Solução B

Quadro 13 – Registo das absorvências, diluições e concentração proteica final relativas à solução B.

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[Proteína]

mg mL-1

[Met-Mb]

mg mL-1

[Oxi-Mb]

mg mL-1

Mproteína

(mg)

η (%) Grau de

Purificação

Sobrenadante 19,95 - - 19,95 100 1

Solução A 5,897 0,3792 - 7,0764 35,47 0,023

Solução B 4,552 - 0,3306 12,7456 63,88 0,0464

Quadro de purificação

𝜂 =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑑𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 𝐴

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒× 100

𝐺𝑟𝑎𝑢 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎ção =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑛𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 𝐴

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒

Quadro 14 –Quadro de purificação.

35

• http://www.uniprot.org/uniprot/P02192 consultado a 21/03/2014 14h19• http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1 consultado a 21/03/2014 14h34• http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html consultado a 22/03/2014

15h20

Bibliografia

36