extração pitanga

5/25/2018 Extrao Pitanga

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DBORA NASCIMENTO E SANTOS

Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio

dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia unifloraL.)

Pirassununga

2012


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DBORA NASCIMENTO E SANTOS

Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio

dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia unifloraL.)

Verso Corrigida

Dissertao apresentada Faculdade deZootecnia e Engenharia de Alimentos daUniversidade de So Paulo, como parte dosrequisitos para a obteno do Ttulo deMestre em Cincias.

rea de Concentrao: Cincias daEngenharia de Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Lopes deOliveira.

Pirassununga

2012


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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao

Servio de Biblioteca e Informao da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos daUniversidade de So Paulo

Santos, Dbora Nascimento eS237e Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo

da composio dos extratos de sementes de pitanga(Eugenia uniflora L.) / Dbora Nascimento e Santos. -Pirassununga, 2012.

99 f.Dissertao (Mestrado) -- Faculdade de Zootecnia e

Engenharia de Alimentos Universidade de So Paulo.Departamento de Engenharia de Alimentos.rea de Concentrao: Cincias da Engenharia de

Alimentos.Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Lopes de

Oliveira.

1. Extrao supercrtica 2. Eugenia uniflora L.3. GC/MS 4. Atividade antioxidante 5. Leishmaniose.I. Ttulo.


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AGRADECIMENTOS

Acho maravilhoso olhar pra trs nesses dois anos e pensar que, se pudesse voltar no tempo

e ter a chance de mudar como tudo aconteceu, s tiraria a dor que causei pela ausncia (e

claro, anteciparia todas as bolsas de estudos de todos os meus amigos e a minha!!), apenas

isso. Foram momentos de alegria, pesar, inquietao, e sobretudo MUITO aprendizado, em

todos os sentidos.

Agradeo a Deus por nunca soltar a minha mo e s colocar pessoas maravilhosas na

minha vida, comeando pela minha querida orientadora Prof Dr. Alessandra Lopes de

Oliveira, qual faltam palavras para agradecer tamanho carinho, orientao, confiana e

ateno dispensadas. Foi uma honra ser a sua primeira orientanda de Ps-Graduao,

espero ter correspondido s suas expectativas e tomara que no futuro eu possa repetir com

muitos tudo o que aprendi com voc.

minha famlia, namorido e amigos (Amanda, Csar Henrique, Davison, Frankeline,

Janana, Lucas, Mariana de Morais, Mariana Sfora, Marina, Robson e tantos outros

queridos) da minha amada terra, que durante esse tempo me encheram de coragem e

persistncia.

todos os professores do Departamento de Engenharia de Alimentos da FZEA, obrigada

pelos ensinamentos e orientaes. Um agradecimento especial a Prof. Dr.Eliana Setsuko,

que na ausncia da minha orientadora, me ajudou bastante no incio desta caminhada. Aos

professores Dr. Carlos Augusto Fernandes de Oliveira e Dr. Edson Roberto da Silva, pelo

uso dos seus laboratrios nas anlises de perfil antimicrobiano e inibio da enzima

arginase, respectivamente.

Aos meus queridos amigos e colegas: Adja, Camila, Diane, Eliane, Graziella, Gisele e

Fausto, Josianne, Jlio, Keliani, Maira, Mariana C. e K., Mirelle, Mirian, Naira, Natali, Noemi,

Paola, Paula, Samira, Sarah, Thaise, e Volnei; obrigada pelos momentos de alegria,

descontrao, apoio e torcida. Sei que tudo foi de corao. Essas palavras so tambm

para a maravilhosa equipe do LTAPPN (minha segunda casa), Nilsone estagirios.

Aos queridos tcnicos Guilherme, Keila, Marcelo, Mrcio e Roice, obrigada pelo apoio

tcnico prestado e palavras de amizade.

querida graduanda Larissa Lima de Sousa, por me acompanhar em todo o projeto e pelas

horas de descontrao que tornaram o trabalho menos cansativo. Sua seriedade no trabalho

te levar para longe, assim espero.

CAPES pela concesso da bolsa de estudos e FAPESP pelo financiamento do projeto.


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RESUMO

Santos, D. N. Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio

dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia uniflora L.). 2012. 99 f. Dissertao

(Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So

Paulo, Pirassununga, 2012.

A semente de Pitanga resduo do processamento da polpa e suco da fruta e os poucos

trabalhos existentes sobre sua composio denotam grande valor nutricional. A extrao

com fluido supercrtico, pelos benefcios que apresenta, constitui uma excelente ferramenta

para a obteno e estudo de extratos. Assim, os objetivos deste trabalho foram obter

extratos de sementes de Pitanga utilizando CO2 supercrtico (SC-CO2), caracteriz-los e

avaliar possveis atividades biolgicas in vitro. As sementes lavadas, secas e trituradasforam caracterizadas e apresentaram umidade de 12,73%, granulometria de 0,48mm e

extrato etreo de 0,52%. As sementes foram colocadas em contato com o SC-CO2 em

diferentes condies de presso (P) e temperatura (T), conforme um Delineamento

Composto Central Rotacional com P e T como variveis independentes. A condio

operacional de rendimento mais elevado foi repetida com etanol como co-solvente (SC-

EtOH). Para todos os extratos determinou-se o perfil de volteis por cromatografia gasosa

com espectrmetro de massas (CG/EM), a concentrao de compostos fenlicos totais

(CFT), a atividade antioxidante pela inativao dos radicais DPPH e ABTS, e a presena de

terpenos por cromatografia em camada delgada (CCD). Nos extratos, obtidos via SC-CO2,

Soxhlet e SC-EtOH, alm de sua frao purificada, foram determinadas a concentrao

inibitria mnima (CIM) com S. aureus, E. coli, B. subtilise P. aeruginosa, e a inibio da

enzima arginase de Leishmania e de rato. O rendimento dos extratos variou de 0,16 a

0,48%, sendo P a nica varivel que influenciou no processo (p


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enzima arginase foi baixa para o extrato supercrtico, Soxhlet e a frao purificada, porm o

extrato SC-EtOH inibiu em at 48% o que indica forte ao contra o desenvolvimento da

Leishmania. Ainda, a inibio da arginase em mamferos tem funo vasodilatadora. O

extrato SC-EtOH possui compostos diferentes dos demais devido modificao da

polaridade pelo co-solvente (EtOH). Esta hiptese tambm constatada pela atividade

antioxidante, que foi menor para os extratos supercrticos que para aqueles obtidos com SC-

EtOH que apresentou maior concentrao em equivalente de Trolox e inibio do radical

DPPH de 94%. Os resultados mostram extratos de semente de Pitanga altamente

promissores para aplicaes contra enfermidades devido ao antimicrobiana e inibitria

da arginase.

Palavras-chave: extrao supercrtica; Eugenia unifloraL.; GC/MS; atividade antioxidante;

leishmaniose.


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ABSTRACT

Santos, D. N. Supercritical extraction with carbon dioxide and study of Pitanga seeds

(Eugenia unifloraL.) extracts composition. 2012. 99 f. M.Sc. Dissertation Faculdade de

Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So Paulo, Pirassununga, 2012.

The Pitanga seed is a waste of the fruit pulp and juice processing, and the few existing

studies on its composition denote a high nutritional value. Due to its benefits, the supercritical

fluid extraction is an excellent tool to obtain and study extracts. Therefore, the objectives of

this study were to obtain extracts of Pitanga seeds using supercritical CO2 (SC-CO2),

characterize them and evaluate potential biological activities in vitro. The washed, dried and

crushed seeds were characterized and presented 12.73% moisture, particle size of 0.48 mm

and 0.52% ether extract. The seeds were placed in contact with the SC-CO2 under differentconditions of pressure (P) and temperature (T), according to a Central Composite Design

with P and T as independent variables. The operational condition of higher yield was

repeated with ethanol as co-solvent (SC-EtOH). For all extracts were determined: the profile

of volatiles by gas chromatography with mass spectrometer (CG/ EM), the concentration of

total phenolics compound (CFT), the inactivation of antioxidant activity by DPPH and ABTS

radicals and the presence of terpenes by layer chromatography (CCD). In the extracts

obtained by SC-CO2, Soxhlet and SC-EtOH and its purified fraction, the minimum inhibitory

concentration (CIM) with S. aureus, E. coli, B. subtilisand P. aeruginosawere determined,

as well as the inhibition of the enzyme arginase of Leishmaniaand rat. The yield of extracts

ranged from 0.16 to 0.48%, being P the only variable that influenced the process (p


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due to the modification of their polarity with the co-solvent (EtOH). This hypothesis is also

confirmed by the antioxidant activity, which was lower for the supercritical extracts compared

with the extracts obtained with SC-EtOH, with the highest equivalent concentration of Trolox

and DPPH radical inhibition of 94%. The results show that extracts of Pitanga seeds are

highly promising for applications against diseases, due to antimicrobial activity and inhibition

of arginase.

Keywords: Supercritical extraction; Eugenia uniflora L.; GC/ MS; antioxidant activity;

leishmaniasis.


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LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 -Pitangueira. ......................................................................................................... 27

Figura 2 -Biossntese de compostos terpnicos a partir de isopentil difosfato em tecidos

vegetais. ............................................................................................................................ 31

Figura 3 -Semente de Pitanga seca inteira (A) e triturada (B). ............................................ 41

Figura 4 -Extrao da semente de Pitanga utilizando Soxhlet (A). Detalhe do arraste de

lipdios pelo solvente lquido (B). ........................................................................................ 42

Figura 5 -Sistema de extrao com CO2supercrtico do LTAPPN, FZEA/USP (A). Extrato

supercrtico de semente de Pitanga (B). ............................................................................ 44

Figura 6 Curva padro de Limoneno para o clculo da concentrao de sesquiterpenos

expresso em Equivalente de Limoneno (EqLim) dos extratos de semente de Pitanga. ...... 49Figura 7 -Curva padro de cido glico para determinao quantitativa de compostos

fenlicos totais. .................................................................................................................. 50

Figura 8 -Curva padro que relaciona a concentrao de Trolox com a resposta da inibio

do ABTS+ com leitura feita a 734 nm. .............................................................................. 51

Figura 9 Rendimento das extraes de semente de Pitanga em funo da densidade do

CO2 supercrtico. ................................................................................................................ 58

Figura 10 -Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas no rendimento de extratos

supercrticos de semente de Pitanga. ................................................................................ 59

Figura 11 -Superfcie de resposta gerada pelo modelo de segunda ordem que mostra os

efeitos das variveis independentes no rendimento da extrao. ................. ..................... 61

Figura 12 Massa acumulada de extrao em funo do tempo de extrao. .............. ..... 62

Figura 13 Massa acumulada de extrao em funo do volume acumulado de CO2. ....... 63

Figura 14 ndice de refrao dos extratos SFE de sementes de Pitanga a 20 e 40C. ..... 64

Figura 15 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel

60 F254 com fase mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo para

a deteco de terpenos. .................................................................................................... 65

Figura 16 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga em Cromatografia de

Camada Delgada, em placa de Slica Gel 60 F254com fase mvel tolueno e acetato de etila

(93:7 v:v) e revelador uma soluo 0,05% do radical DPPH. .......... ............ ....................... 67

Figura 17 -Cromatograma de ons total (total ion chromatography, TIC) dos extratos de

semente de Pitanga (ensaio 1 ao 8, de baixo pra cima), coluna capilar Rtx-5MS; fase

mvel metanol. Detalhe na seo ampliada, em que so evidenciados os principais picos.

.......................................................................................................................................... 69


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Figura 18 -Cromatograma de ons total (total ion chromatography, TIC) da frao Soxhlet e

dos extratos supercrticos (ensaios 9, 10 e 11 de baixo para cima) de semente de Pitanga;

coluna capilar Rtx-5MS; fase mvel metanol. Os picos em destaques esto igualmente

mostrados na Figura 17. .................................................................................................... 70

Figura 19 Espectros de massa (EM) dos compostos majoritrios dos extratos de semente

de Pitanga. A: EM do gama-elemeno dos extratos. B: EM do gama-elemeno da biblioteca

NIST. C: EM do furanodieno dos extratos. D: EM do curzereno da biblioteca NIST. E: EM

do germacrone dos extratos. F: EM do germacrone da biblioteca NIST............................. 72

Figura 20 -Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na obteno de

germacrone (A) e -elemeno (B) nos extratos supercrticos de semente de Pitanga. ......... 74

Figura 21 -Superfcie de resposta gerada pelo modelo de segunda ordem que mostra os

efeitos das variveis independentes na concentrao de germacrone (21.A) e -elemeno

(21.B) nos extratos............................................................................................................. 76Figura 22 -Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na quantidade de

compostos fenlicos dos extratos de semente de Pitanga. ................................................ 77

Figura 23 -Diluio seriada do extrato supercrtico de semente de Pitanga para

determinao da concentrao inibitria mnima. .............................................................. 82


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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 -Comparao de algumas propriedades fsicas do gs, lquido e fluido

supercrtico. ....................................................................................................................... 19

Tabela 2-Propriedades crticas de solventes que podem ser usados na extrao

supercrtica. ....................................................................................................................... 20

Tabela 3-Nveis dos dois fatores, presso e temperatura, no DCCR. ................................. 44

Tabela 4 -Matriz do DCCR de dois fatores incluindo trs pontos centrais para o estudo do

efeito da presso e temperatura nos extratos da semente de Pitanga. .............................. 45

Tabela 5 Diluio e contedo dos tubos de ensaio para determinao da Concentrao

Inibitria Mnima. ............................................................................................................... 53

Tabela 6 -Umidade e extrato etreo da semente de Pitanga seca e triturada. .................... 55Tabela 7 -Densidade aparente da amostra de semente de Pitanga seca e triturada. .... ..... 55

Tabela 8 Massa de sementes de Pitanga secas e trituradas retidas nas peneiras usadas

na determinao do dimetro mdio das partculas. ................... ....................................... 56

Tabela 9 -Matriz do Delineamento Composto Central Rotacional de dois fatores (P e T) com

trs pontos centrais para o estudo do efeito da presso e temperatura no rendimento (R),

concentraes de compostos fenlicos totais (CFT) e volteis dos extratos de semente de

Pitanga. ............................................................................................................................. 57

Tabela 10 -Coeficientes de regresso significativos para modelos linear e quadrtico que

simulam o rendimento dos extratos de semente de Pitanga obtidos com CO2supercrtico.

.......................................................................................................................................... 60

Tabela 11 -ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR para o

rendimento (%) dos extratos. ............................................................................................. 60

Tabela 12 ndice de reteno dos compostos revelados pela Cromatografia em Camada

Delgada dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel 60 F254com fase

mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo. .................................. 66

Tabela 13 -Composio da frao voltil dos extratos supercrticos da semente de Pitanga

(Eugenia uniflora) obtidos por anlise em GC/MS em coluna Rtx-5MS. .......................... 70

Tabela 14 -Coeficientes de regresso para modelos linear e quadrtico que simulam a

concentrao dos sesquiterpenos (Germacrone e -elemeno) nos extratos de semente de

Pitanga obtidos com CO2supercrtico. ........................................ ....................................... 74

Tabela 15 -ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR com dois

fatores para a concentrao de germacrone (ppm EqLim) dos extratos. ........................... 75

Tabela 16 -ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR com dois

fatores para a concentrao de -elemeno (ppm EqLim) dos extratos. .................... .......... 75


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Tabela 17 Atividade antioxidante dos extratos de semente de Pitanga pelo percentual de

inibio do radical DPPH em trs concentraes e pelo mtodo de varredura do radical

ABTS. ................................................................................................................................ 79

Tabela 18 -Concentrao inibitria mnima (ppm) dos diferentes extratos de semente de

Pitanga. ............................................................................................................................. 83

Tabela 19 -Porcentagem (%) da atividade de inibio da arginase isolada de fgado de rato

e da Leishmania ................................................................................................................ 84


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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ABTS

Acetil-CoA

AI

ASR

CCD

CFT

CG/ EM

CIM

CLAE

CO2DCCR

DPPH

EFS

EM

EqLim

ER

ESA

EtOH

FRAP

GAE

GRAS

HMG-CoA

IPP

KI

MeOH

ORAC

P

SC-CO2

SC-EtOH

SLCC

T

TIC

UFC

Radical 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)

acetil-co-enzima-A

ndice de Van der Dool e Kratz

Anlise de superfcie de resposta

Cromatografia em camada delgada

Compostos fenlicos totais

Cromatografia gasosa com espectrmetro de massas acoplado

Concentrao inibitria mnima

Cromatografia lquida de alta eficincia

Dixido de carbonoDelineamento Composto Central Rotacional

Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

Extrao com fluido supercrtico

Espectro de massa

Equivamente de Limoneno

Equivalente de retinol

Extrao por solvente avanado

Etanol

Capacidade de reduo de ons ferro em plasma

Equivalente de cido glico

Geralmente Reconhecidos como Seguros

3-hidroxi-3-metilglutaril-Co-A

Isopentenil difosfato

ndice de Kovatz

Metanol

Capacidade de absoro de radicais de oxignio

Presso

Dixido de carbono supercrtico

Extrao supercrtica com etanol como co-solvente

Sucos de Laranja Concentrado e Congelado

Temperatura

Total ion chromatography

Unidade formadora de colnias


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SUMRIO

1 INTRODUO .................................................................................................................. 16

2 REVISO DA LITERATURA ............................................................................................. 18

2.1EXTRAO COM FLUIDOS SUPERCRTICOS...................................................................................... 18

2.1.1 O uso de co-solvente ............................................................................................................ 222.1.2 O estudo da cintica de extrao ......................................................................................... 24

2.2PITANGA (EUGENIA UNIFLORAL.) .................................................................................................... 26

2.3COMPOSTOS TERPNICOS.............................................................................................................. 29

2.4ENSAIOS PARA DETECO DE BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE MATRIZES VEGETAIS......................... 33

2.4.1 Atividade antioxidante........................................................................................................... 332.4.2 Atividade antimicrobiana ....................................................................................................... 352.4.3 Inibio da enzima arginase ................................................................................................. 38

3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 40

4 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................ 41

4.1OBTENO E PREPARAO DA SEMENTE DE PITANGA..................................................................... 41

4.2CARACTERIZAO DA AMOSTRA..................................................................................................... 41

4.2.1 Umidade................................................................................................................................ 414.2.2 Extrato etreo ....................................................................................................................... 424.2.3 Granulometria ....................................................................................................................... 424.2.4 Densidade aparente ............................................................................................................. 43

4.3OBTENO DOS EXTRATOS COM CO2SUPERCRTICO...................................................................... 434.3.1 Processo de extrao ........................................................................................................... 434.3.2 Delineamento Composto Central Rotacional ....................................................................... 444.3.3 Extrao supercrtica com co-solvente (SC-EtOH) .............................................................. 454.3.4 Purificao do extrato supercrtico obtido com co-solvente ................................................. 454.4.5 Cintica de extrao ............................................................................................................. 46

4.4CARACTERIZAO DOS EXTRATOS.................................................................................................. 46

4.4.1 ndice de refrao ................................................................................................................. 464.4.2 Caracterizao dos extratos em cromatografia em camada delgada (CCD) ....................... 464.4.3 Anlise do perfil de volteis por cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro de

massas (CG/EM) ........................................................................................................................... 474.4.4 Anlise de compostos fenlicos totais (CFT) ....................................................................... 494.4.5 Atividade antioxidante pelo mtodo DPPH........................................................................... 504.4.6 Atividade antioxidante pelo mtodo ABTS ........................................................................... 514.4.7 Determinao da atividade antimicrobiana - concentrao inibitria mnima ...................... 524.4.9 Inibio da enzima arginase ................................................................................................. 53

4.5ANLISE ESTATSTICA..................................................................................................................... 54

5 RESULTADOS E DISCUSSES ...................................................................................... 55


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5.1CARACTERIZAO DA SEMENTE DE PITANGA................................................................................... 55

5.2DETERMINAO DE RENDIMENTO GLOBAL....................................................................................... 56

5.3DETERMINAO DE CINTICA DE EXTRAO.................................................................................... 61

5.4CARACTERIZAO DOS EXTRATOS.................................................................................................. 63

5.4.1 ndice de refrao e cromatografia em camada delgada ..................................................... 645.4.2 Composio voltil dos extratos ........................................................................................... 67

5.5ANLISE DA BIOATIVIDADE DO EXTRATO SUPERCRTICO DE SEMENTE DE PITANGA............................ 77

5.5.1 Quantificao dos compostos fenlicos totais...................................................................... 775.5.2 Quantificao da atividade antioxidante ............................................................................... 785.5.3 Determinao da atividade antimicrobiana .......................................................................... 815.5.4 Determinao da inibio da enzima arginase .................................................................... 83

6 CONCLUSES ................................................................................................................. 85

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................. 86


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SANTOS, D. N. Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio dos extratos de sementes de Pitanga ( Eugenia unifloraL.)

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1 INTRODUO

A Pitanga, uma fruta de crescente importncia no cenrio brasileiro, composta depolpa e semente, a qual responsvel por 31% do peso total da fruta. A fruta e a polpa so

detentoras de substncias com inmeras propriedades funcionais, visto a sua elevada

concentrao em carotenides. Sendo resduo do processamento da polpa em suco ou

polpa congelada, as sementes atualmente no apresentam nenhuma aplicao industrial. O

estudo da composio dos extratos das sementes e suas atividades biolgicas vo de

encontro s perspectivas da indstria de alimentos, que prezam pelo total aproveitamento

das matrias-primas (SANTOS et al., 2011).

O Brasil tem lugar de destaque na produo de leos essenciais, ao lado da ndia,

China e Indonsia, que so considerados os quatro grandes produtores mundiais. A posio

do Brasil deve-se aos leos essenciais de ctricos, que so subprodutos da indstria de suco

de laranja concentrado e congelado (SLCC). No passado, o pas teve destaque como

exportador de leo essencial de pau-rosa, sassafrs e menta. Nos dois ltimos casos,

passou condio de importador (BIZZO; HOVELL; REZENDE, 2009).

Na obteno de leos essenciais, alm do enfoque dado s matrizes vegetais, como a

semente de Pitanga, por exemplo, a escolha do mtodo de extrao fundamental para a

preservao das suas caractersticas. Dentre os novos mtodos de extrao existentes, o

que utiliza fluido supercrtico tm se tornado foco de estudos, j que este possui vrias

vantagens em relao aos demais mtodos, pelas condies brandas de operao,

ausncia de resduos aps a extrao, dentre outras (SANTOS et al., 2011). Inmeros

trabalhos mostram que a qualidade dos extratos obtidos pela extrao supercrtica so

superiores aos obtidos pelos mtodos convencionais. Porm, quando se remete a

tecnologia supercrtica, sabe-se que o investimento inicial de uma planta industrial possui

custo mais elevado tendo em vista as particularidades de um sistema que opera a alta

presso. Para se chegar a condies otimizadas de operao e baratear o produto final,

crucial o estudo das variveis que interferem no processo, para que se possam obter os

rendimentos mximos, o que se consegue atravs de um planejamento experimental eanlise de superfcie de resposta das variveis estudadas na operao.

A busca por produtos naturais com propriedades biolgicas e que no ofeream riscos

aos consumidores crescente e tem sido tema de trabalhos de inmeros grupos de

pesquisa. As diversas metodologias existentes para a avaliao e comprovao de

atividades bioativas (antimicrobiano, antioxidante, antineoplsica, antimutagnica, dentre

outras) auxiliam na pesquisa de aplicaes de tais produtos e justificam etapas posteriores,


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quando necessrias, como a purificao destes produtos naturais ou mesmo a aplicao em

testes in vivo, os quais so bem mais complexos.

Neste trabalho foram obtidos extratos supercrticos de semente de Pitanga, sob

condies pr-estabelecidas de presso e temperatura. Foi realizado o estudo destes

extratos avaliando sua composio voltil, quantidade de compostos fenlicos totais, alm

de ensaios de bioatividade, tais como a antimicrobiana, antioxidante e de inibio da enzima

arginase.


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2 REVISO DA LITERATURA

2.1 Extrao com Fluidos Supercrticos

Desde os primrdios histricos praticou-se a extrao de substncias a partir de

matrizes vegetais, com fins alimentcios, aromticos e medicamentosos. A finalidade sempre

foi obter um produto mais especfico, puro e padronizado (MAUL; WASICKY; BACCHI,

1986). O fracionamento de misturas naturais complexas para a obteno de compostos

puros ou concentrados de interesse tem sido objeto de pesquisas. Os mtodos tradicionais

de obteno de extratos so destilao a vapor (com ou sem vcuo), extrao por solvente

lquido, cromatografia preparativa, adsoro e processos seletivos por membranas. O uso

da extrao com fluido supercrtico e, em particular com o dixido de carbono supercrtico,

uma alternativa interessante devido s vrias vantagens que apresenta (GAN;

BRIGNOLE, 2011).

Nos ltimos anos, tem havido um interesse crescente na recuperao de compostos

bioativos de fontes naturais para o desenvolvimento de alimentos funcionais. A extrao

com fluido supercrtico (EFS) tem sido reconhecida como um procedimento promissor para

aplicaes em alimentos, na rea farmacutica e cosmtica, pois proporciona maior

seletividade, menores tempos de extrao e no utiliza solventes orgnicos txicos (SERRA

et al., 2010).O potencial do fluido supercrtico como solvente foi inicialmente estudado na dcada

de 60, por uma equipe de pesquisadores russos em Kniipp, e nos Estados Unidos pelo

Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, na Califrnia. Os equipamentos em

pequena e grande escala surgiram no mercado na dcada de 70 e as primeiras plantas em

escala industrial surgiram na dcada de 80 na Alemanha, para a descafeinao de caf e

para a extrao de lpulo. Esta operao, embora ainda no tenha uma aplicao industrial

mundialmente disseminada, tem despertado grande interesse de pesquisas devido s suas

vantagens que refletem na qualidade dos produtos extrados quando comparados com

aqueles extrados por tcnicas convencionais (PENEDO, 2007).

A tecnologia com fluidos supercrticos tem se desenvolvido consideravelmente em um

grande nmero de setores industriais. Fluidos supercrticos so empregados para extrao

de vrias substncias tais como a cafena do caf, nicotina do tabaco, leos de alimentos,

em corantes de tecidos fabris ou como fase mvel em cromatografia de fluidos supercrticos

(MARSAL et al., 2000).


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O fluido quando submetido presso e temperatura acima de seu ponto crtico torna-

se supercrtico. Vrias propriedades dos fluidos so alteradas sob essas condies,

tornando-se parecidas com as de alguns gases e lquidos. A densidade do fluido supercrtico

similar dos lquidos, sua viscosidade assemelha-se dos gases e sua capacidade de

difuso intermediria entre os dois estados. Portanto, o estado supercrtico de fluidos pode

ser definido como o estado no qual lquido e gs so indistinguveis entre si. Devido sua

baixa viscosidade e alta capacidade de difuso (Tabela 1), os fluidos supercrticos

apresentam propriedades de transporte melhores que os lquidos, permitindo que as taxas

de extrao aumentem. Podem se difundir facilmente atravs de materiais slidos,

resultando em melhores rendimentos nas extraes (ANDREO; JORGE, 2006; BERNA et al.

2000).

Tabela 1 - Comparao de algumas propriedades fsicas do gs, lquido e fluidosupercrtico.

Propriedades fsicasGs

(1atm, 15 30C)

Fluido supercrtico Lquido

15 30CTC, PC TC, 4PC

Coeficiente de difuso (cm.s-1) 0,1-0,4 0,7 x 10-3 0,2 x 10-3 (0,2-2) x 10-5

Viscosidade (g.cm-1.s-1) (1-3) x 10-4 (1-3) x 10-4 (3-9) x 10-4 (0,2-3) x 10-2

Densidade (g.L-1) (0,6-2) x 10-3 0,2-0,5 0,4-0,9 0,6-1,6

autodifuso para gs e gs denso; mistura binria para lquido.FONTE: TZIA; LIADAKIS, 2003.

Alguns fluidos tm sido examinados como solventes em estado supercrtico. Por

exemplo, hidrocarbonetos como hexano, pentano e butano, xido nitroso, hexafluoreto de

enxofre e hidrocarbonetos fluorados. Entre estes, o dixido de carbono (CO2) o mais

popular solvente supercrtico porque ele seguro, facilmente disponvel e tem um baixo

custo (REVERCHON; DE MARCO, 2006). Na anlise dos valores de presso e temperatura

crtica de diferentes solventes (Tabela 2) nota-se que existem substncias que possuem

condies muito brandas de operao, como o etano, etileno e clorotrifluormetano. Porm,

desvantagens como ser reativo, caro, pouco disponvel e deixar resduos aps o processo,

fizeram do dixido de carbono a opo melhor empregvel.O uso da extrao com dixido de carbono supercrtico (SC-CO2) como solvente tem

um interesse crescente para a recuperao de compostos benficos sade, sendo por

isso, adequado para aplicao nas indstrias alimentcia e farmacutica. Dixido de carbono

um solvente ideal para a extrao de produtos naturais, porque de baixa toxicidade, no

explosivo, prontamente disponvel e fcil de remover a partir de produtos extrados. Por

fazer parte de um mtodo de extrao livre de solventes orgnicos, o uso do CO 2


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favorvel ao meio ambiente e, alm disso, por possuir uma temperatura crtica de 31C

oferece a possibilidade de recuperar com o mnimo de danos possveis os compostos

naturais termossensveis, preservando suas propriedades bioativas. A desvantagem do

dixido de carbono supercrtico que os compostos polares muitas vezes so difceis de

extrair. Essa dificuldade pode ser facilmente resolvida usando pequenas quantidades de

modificadores orgnicos ou co-solventes (DANH et al., 2009; LAROZE et al., 2010; SALGIN,

2007).

Tabela 2 - Propriedades crticas de solventes que podem ser usados na extraosupercrtica.Solvente Temperatura Crtica (C) Presso Crtica (bar)

Dixido de carbono 31,10 73,76

Etano 32,30 48,84

Etanol 240,75 61,40Etileno 9,30 50,36

Propano 96,70 42,45

Propileno 91,90 46,20

Ciclohexano 280,30 40,73

Benzeno 289,00 48,94

Tolueno 318,60 41,14

Clorotrifluormetano 28,90 39,21

Triclorofluormetano 198,10 44,70

Amnia 132,50 112,77

gua 374,20 220,48

FONTE: DIEHL, 2008.

Um empecilho propagao industrial desta tecnologia reporta-se ao custo inicial de

montagem da planta de operao. O equipamento que opera alta presso mais caro que

aqueles dos processos de separao convencionais, contudo, conforme Goodarznia e

Eikani (1998), o custo de funcionamento geralmente inferior, e isto faz com que o custo

total sejam comparveis quando o processo for conduzido em condies otimizadas e comvolume de extrao adequado.

Para possveis aplicaes industriais, a otimizao e avaliao do processo de

extrao com modelagem matemtica so fundamentais. Em mtodos clssicos, os

parmetros de processo so otimizados atravs da realizao de experimentos

concentrando-se em um fator de cada vez, o que mais trabalhoso e demorado, e tambm

ignora o efeito da interao entre os parmetros do processo. Comparado aos mtodos


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clssicos, a metodologia de superfcie de resposta (ASR) mais eficiente pois, requer

menos dados e fornece os efeitos da interao entre as variveis na resposta. Por isso, tem

sido amplamente aplicada para aperfeioar os parmetros de processamento na produo

de alimentos e medicamentos, por exemplo (XIA et al., 2011).

Sobrepujando a dificuldade de custos e operando em condies de altos rendimentos,

o produto extrado atravs desta tecnologia de boa qualidade e pouco necessita de

operaes de refino posteriores. Portanto, os extratos obtidos via extrao com CO 2

supercrtico so geralmente reconhecidos como seguro (Generally Recognised as Safe -

GRAS) para ser usado na produo de alimentos. A tecnologia de extrao com SC-CO 2

tem sido aplicada na extrao de leos a partir de um grande nmero de materiais e seus

extratos tm demonstrado um alto potencial para futuras aplicaes em frmacos e

alimentos (ZHANG et al., 2010).

No processo de extrao, vrios fatores interferem no rendimento final, como o tipo dematriz envolvida, por exemplo. Estudos comparativos de diferentes procedimentos de

secagem das matrizes vegetais mostraram que o melhor rendimento do soluto em estudo

obtido a partir da biomassa seca naturalmente (exposio ao ar), enquanto que o material

seco em estufa fornece menor rendimento. Anlises de microscopia eletrnica de varredura

mostraram que a amostra seca em estufa tem uma pelcula superficial slida que contrasta

com a superfcie porosa das matrizes secas ao ar (MOLYNEUX; COLEGATE, 2008).

Outro fator que influencia no rendimento da extrao o tamanho das partculas da

matriz vegetal. Como uma tendncia geral, a diminuio do tamanho das partculas gera um

aumento do rendimento de extrao. O menor tamanho de partcula facilita o acesso do

solvente de extrao at o soluto, reduzindo as limitaes de transferncia de massa. A

reduo das partculas , provavelmente, associada a uma quebra mais intensa da parede

celular e o rompimento da parede celular facilita a difuso do soluto (LAROZE et al., 2010).

Por exemplo, os leos so armazenados dentro de vesculas celulares. Aps a moagem,

estas vesculas podem ser danificadas levando a uma liberao mais rpida dos leos.

Assim, quanto mais as vesculas so danificadas, mais acessvel o soluto fica para o dixido

de carbono supercrtico, levando a um maior rendimento de extrao (MHEMDI et al., 2001).

A quantidade de gua disponvel presente no substrato tambm pode condicionar o

rendimento final do processo de extrao. Sahena et al. (2009) reportam que o alto teor de

umidade reduz o contato da matriz com o SC-CO2, devido consistncia pastosa que a

amostra apresenta, e nesses casos a umidade atua como uma barreira para a difuso da

SC-CO2na amostra, assim como para a difuso de lpidos para fora desta. O aumento da

recuperao lipdica com a diminuio do contedo de umidade tem sido demonstrada em

amostras midas tais como a carne e de peixe, embora a umidade no afeta a


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extratabilidade destes a nveis baixos. Assim, amostras com alto teor de umidade so

geralmente liofilizadas antes da extrao com SC-CO2para melhorar a sua eficincia.

Ainda na reduo de partculas, a utilizao do CO2como agente de extruso pode

anteceder a prpria operao de extrao. Alguns autores propuseram um pr-tratamento

original para a extrao do leo de sementes que consistiu de uma rpida despressurizao

do sistema contendo a matriz vegetal e o CO2pressurizado no sentido de quebrar as clulas

das sementes. Foi mostrado que a despressurizao em poucos segundos a partir de

20MPa e 35C em condies atmosfricas aumentou a quantidade de leo recuperado na

extrao (BOUTIN; BADENS, 2009).

Outra aplicao que vem ganhando espao o processo de tingimento com CO2

supercrtico. Esta tecnologia limpa se tornou uma alternativa vivel para o tingimento

convencional de tecidos, o qual utiliza quantidades excessivas de gua. As vantagens do

CO2 supercrtico neste processo referem-se ao fato de poder ser reciclado, ser barato,essencialmente no-txico, no inflamvel e ter fcil acesso s condies crticas. Alm

destas vantagens comuns a todas as suas aplicaes neste processo, os restos de corante

dissolvido no fluido supercrtico podem ser recuperados quando o fluido expandido.

Estudos mostram o sucesso desta tcnica no tingimento de polmeros (poli tereftalato de

etileno e polipropileno) e fibras naturais (algodo e l). Neste sentido, pesquisas seguem

estudando as condies operacionais que favorecem uma melhor solubilidade dos corantes

no fluido supercrtico, aperfeioando o processo (CABRAL et al., 2007).

Demonstrando algumas das aplicaes essenciais do CO2supercrtico em diferentes e

relevantes processos, vale revisar quelas que correlacionam o emprego de co-solventes ou

modificadores nos processos de extrao, mesmo porque tambm enfoque deste trabalho.

2.1.1 O uso de co-solvente

O uso de co-solventes em extrao com fluido supercrtico (pequenas quantidades de

solventes orgnicos combinados com CO2supercrtico) tem sido empregado para melhorar

a eficincia da extrao, aumentando a produtividade e modificando a seletividade do

processo. O co-solvente pode alterar algumas caractersticas da mistura de solventes (CO 2e co-solvente), tais como polaridade e interaes especficas com o soluto, formando pontes

de hidrognio ou interagindo com stios ativos da matriz slida (DALMOLIN et al., 2010).

Propano/butano, metanol, etanol e outras substncias podem ser usadas como co-

solventes (POKORNY; YANISHLIEVA; GORDON, 2001). Alguns autores estudaram o uso

de etanol (EtOH) como co-solvente para obter extratos supercrticos e observaram que a

solubilidade do extrato aumentou com o aumento da concentrao deste co-solvente


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(DALMOLIN et al., 2010). A presena de etanol afeta positivamente a extrao de polifenis.

Este fato est relacionado com as interaes covalentes (ligaes de hidrognio) e dipolo-

dipolo que aumentam a solubilidade de compostos fenlicos. Outros autores j mostraram

que a solubilidade de polifenis em (SC-CO2 + etanol) depende da polaridade final adquirida

pelo sistema de extrao (SERRA et al., 2010).

Os resultados do rendimento de extratos constituintes de compostos fenlicos na

extrao com fluido supercrtico aumentam diretamente com a polaridade do solvente. O

uso de etanol como co-solvente demonstrou-se particularmente vivel para melhorar o

rendimento desta frao fenlica. A uma temperatura constante, o aumento da presso

aumentou o rendimento devido ao aumento da densidade, j para uma presso constante, o

rendimento total e da frao fenlica decresceu quando a temperatura aumentou devido

reduo da densidade do solvente (GARCIA-SALAS et al., 2010).

Trabalhos de pesquisa que indicam a influncia de etanol como co-solventereceberam especial ateno j que estes resultados serviram como parmetros indicativos

de procedimentos adaptados neste trabalho. Somado a isso, o EtOH foi escolhido como co-

solvente tambm por ser GRAS e por ser o Brasil um dos maiores produtores. Fatores como

este tambm devem ser considerados no estudo de processo.

Em estudo proposto por Sun e Temelli (2006) para a extrao de carotenides, foi

utilizado leo de canola como co-solvente, por possuir alta solubilidade em SC-CO2 se

comparada ao -caroteno. Alm disso, leos vegetais constituem bons solventes para

carotenos. Nesta pesquisa, o rendimento de e -caroteno aumentou em duas vezes e o de

lutena aumentou cerca de quatro vezes com a incorporao de leo de canola como co-

solvente no processo de extrao.

Na pesquisa realizada por Vasapollo et al.(2004), foi utilizado leo de avel como co-

solvente da extrao de licopeno de tomates. As justificativas para a escolha do leo foram

baixo custo e sua baixa acidez que evita degradao do carotenide durante a extrao,

alm de reproduzir os mais altos rendimentos dentre os demais testados (amendoim,

amndoa e girassol). Os ndices de extrao de licopeno em condies otimizadas e na

presena de co-solvente chegaram a 60% sob a frao total extravel. Em outro trabalho

semelhante, foi verificado que a presena de leos vegetais como co-solvente aumentaram

o rendimento de extrao e contribuiram para a estabilidade do licopeno (YI et al., 2010).

O uso de co-solventes em condies especiais tambm tem sido proposto para

melhorar a solubilidade de diferentes solutos e/ou para aumentar a seletividade de extrao.

Um exemplo a aplicao de extrao por solvente avanado (ESA). Esta tcnica envolve o

uso de CO2, gua e/ ou solventes orgnicos a temperaturas e presses elevadas, de 40 a

200C, e de 3,3 a 20,3 MPa. Esta tcnica tem sido aplicada com sucesso na extrao de

solutos polares, incluindo as antocianinas do bagao de sabugueiro (SERRA et al., 2010).


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Assim como o emprego de co-solvente na modificao da polaridade do CO2

supercrtico e consequente modificao da solubilidade e seletividade do soluto, no h

como desenvolver estudos de extrao sem acompanhar o comportamento da cintica de

extraes. A cintica aponta a influncia do equipamento e condies operacionais na

extrao e caracteriza o processo especificamente para a matriz vegetal em estudo.

2.1.2 O estudo da cintica de extrao

O estudo das curvas de extrao supercrtica e o conhecimento dos efeitos das

variveis operacionais permitem a definio do volume do extrator e vazo de solvente.

Segundo a literatura, as curvas de extrao so claramente divididas em trs perodos,

controlados por diferentes mecanismos de transferncia de massa (MEZZOMO; MARTNEZ;

FERREIRA, 2009; PIANTINO et al., 2008):

(a) A curva inicia-se com o perodo de taxa de extrao constante: nesta fase a

superfcie externa das partculas coberta com soluto (de fcil acesso) e a

conveco o mecanismo de transferncia de massa dominante;

(b) No segundo perodo ocorre a taxa de extrao Falling, nesta etapa as falhas

do soluto na camada externa da superfcie da matriz aparecem e ento

inicia-se o mecanismo de difuso, fenmeno que atua combinado com a

conveco;(c) Finalmente, ocorre o perodo de difuso controlada, onde a camada de

soluto na superfcie externa praticamente desapareceu e a transferncia de

massa ocorre principalmente por difuso do interior das partculas da matriz

slida.

O objetivo principal da modelagem das curvas de cinticas de extrao com fluido

supercrtico definir parmetros para desenho de processos, como as dimenses do

equipamento a ser projetado, fluxo do solvente e tamanho de partcula da matriz. Esses

parmetros so usados para predizer a curva total de extrao e dessa forma estimar a

viabilidade de processo em escala industrial. Vrios modelos matemticos so apresentados

na literatura para descrever a extrao com fluido supercrtico. Um modelo deve ser um

instrumento matemtico que reflete o comportamento fsico da estrutura slida e as

observaes experimentais. Desta forma, poder ser usado como uma ferramenta de

simulao para as curvas de cintica de EFS e depois, para aplicaes industriais desta

tecnologia (MEZZOMO; MARTNEZ; FERREIRA, 2009).


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Os principais parmetros da EFS so a vazo do solvente, o tamanho da partcula do

slido e a durao do processo de extrao. Outros fatores determinantes do processo so

o poder de solubilizao e a seletividade do solvente com relao aos componentes de

interesse e a capacidade de difuso destes no fludo (BRUM, 2010).

Zizovic et al.(2007) discutem em sua reviso bibliogrfica que o modelo matemtico

amplamente utilizado no estudo de processo foi introduzido por Sovov. O pressuposto

bsico deste modelo que parte das clulas, unidades contendo hipoteticamente o soluto

so abertas pela moagem. O soluto facilmente acessvel a partir destas clulas trituradas

extrado primeiro, e a frao mais protegida pelas paredes celulares segue sendo extrada

mais lentamente. As vantagens deste modelo que ele pode ser aplicado em qualquer tipo

de matriz vegetal contendo diferentes tipos de solutos, lipdios ou leos essenciais, por

exemplo. A contribuio significativa para a modelagem da extrao supercrtica de leo

essencial foi dada por Reverchon, Donsi e Sesti (1993), que introduziram modelos baseadosno balano de massa diferencial no vaso extrator, fazendo analogia transferncia de calor.

Operaes de extrao supercrtica de leos essenciais foram modeladas e preditas em

macro-escala por muitos autores, e os resultados experimentais foram ajustados e descritos

em modelos posteriormente propostos. Mais recentemente, Sovov (2005) introduziu um

novo modelo para a extrao supercrtica de produtos naturais, o qual tambm se baseia no

conceito de clulas intactas e trituradas e com dois perodos de extrao, o primeiro regido

pelo equilbrio de fases e o segundo governado por difuso interna nas partculas.

Na extrao de leo de sementes peletizadas ou esmagadas, diz-se que a cintica de

extrao dividida em duas principais etapas. O leo livre extrado inicialmente a partir da

superfcie das partculas de semente a uma taxa constante que parcialmente determinada

por mecanismos de transferncia externa de massa. Na segunda etapa, quando o leo livre

na superfcie da partcula se esgota, a taxa de extrao determinada por mecanismos de

transferncia de massa interna do leo aprisionado nas clulas (del VALLE et al., 2004).

A modelagem matemtica da extrao com fluido supercrtico de solutos com alto

valor agregado a partir de matrizes vegetais, tais como ervas, sementes, folhas ou casca

dificultada pela existncia de estruturas diferenciadas para cada material. Antes da extrao,

o material geralmente modo para aumentar a superfcie em contato com o solvente SC-

CO2e tambm aumentar a acessibilidade do soluto aprisionado nas estruturas celulares e

com isso fornecer a cintica de transferncia de massa que tambm influenciada pela

forma das partculas. Na modelagem, normalmente empregam-se formas geomtricas

bsicas (cilindro, placa ou esfera). Para reduzir a complexidade do modelo, tambm

necessrio fazer suposies simplificadas sobre como o soluto distribudo dentro da matriz

slida que pode estar adsorvido na rede de poros, aprisionado dentro de estruturas

celulares ou distribudo de forma homognea dentro das partculas. As resistncias


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envolvidas nos mecanismos de transferncia de massa tambm devem ser consideradas

como a resistncia de transferncia interna de massa, resistncia de transferncia externa

de massa ou uma combinao de vrias resistncias (OLIVEIRA; SILVESTRE; SILVA,

2011).

2.2 Pitanga (Eugenia unifloraL.)

A Pitanga, fruto da pitangueira (Eugenia unifloraL.) pertence famlia botnica das

Myrtaceae. uma planta frutfera nativa do Brasil, mas encontrada tambm no Norte da

Argentina e Uruguai. Apesar de constituir um cultivo tradicional das regies Sul e Sudeste

do Brasil, nos ltimos anos a regio Nordeste iniciou um cultivo mais tecnificado para

explorao comercial desta fruta de alto potencial econmico. A pitangueira (Figura 1)

frutifica de outubro a janeiro, sendo que a principal forma de comercializao a polpa

congelada (EMBRAPA, 2006). No que concerne produo e comercializao da fruta, no

se dispe de dados oficiais, tanto no Brasil quanto no mundo, no entanto estima-se que o

Brasil seja o maior produtor mundial. Os maiores plantios esto localizados no Estado de

Pernambuco, onde a regio possui cerca de 300 ha cultivados (BEZERRA et al., 2004;

SANTOS et al., 2002).

O fruto uma baga globosa, com sete a dez sulcos longitudinais de 1,5 a 5,0 cm de

dimetro e coroado com spalas persistentes, possuindo um aroma caracterstico intenso esabor doce e cido. No processo de maturao, o epicarpo passa de verde para amarelo,

alaranjado, vermelho, vermelho-escuro, podendo chegar at quase negro. No Brasil no se

conhecem variedades perfeitamente definidas de pitangueiras e em Pernambuco, comum

encontrar pitanga de colorao variando de alaranjada a avermelhada (LIMA; MLO; LIMA,

2002).

O valor nutricional da Pitanga relevante, j que ela apresenta elevado teor em

carotenides (225,9 mg.g-1) com valor de pr-vitamina A de 991 ER.100 g-1 e teor de

vitamina C de 29,4 mg.100mg-1, podendo contribuir para o requerimento dirio destas

vitaminas na alimentao (MLO; LIMA; NASCIMENTO, 1999). Alm disso, a Pitanga

contm grandes quantidades de clcio, fsforo e antocianinas (SILVA, 2006). Devido ao seu

sabor altamente particular e seu contedo de carotenides, o cultivo da cereja brasileira,

como tambm chamada, tem-se demonstrado promissor aos programas de explorao

sustentvel na Mata Atlntica brasileira, um dos pontos de Conservao Internacional da

Biodiversidade do Cerrado. Esta ateno dada Pitanga nestes programas de explorao

sustentvel se deve ao fato da Mata Atlntica ser uma rea caracterizada pela baixa


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SANTOS, D. N. Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia unifloraL.)

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atividade econmica e pela Pitanga ser cultivada, em sua grande maioria, em pomares

domsticos ou como atividade agrcola de pequena escala, ou ainda colhidas selvagemente

(CELLI; PEREIRA-NETTO; BETA, 2011).

Figura 1 -Pitangueira.

A polpa congelada da Pitanga tem elevado contedo de compostos fenlicos, os quais

so conhecidos pela sua atividade antioxidante. Dentro do grupo dos carotenides, no

estudo realizado por Filho et al.(2008), foram encontrados no extrato supercrtico da polpa

de Pitanga os seguintes compostos: All-trans-lutena, All-trans-zeaxantina, All-trans-rubixantina, cis-rubixantina I, cis-rubixantina II, All-trans--criptoxantina, All-trans-licopeno,

13-cis-licopeno,All-trans--caroteno, All-trans--caroteno, (all-trans+9-cis)--caroteno e (13-

cis+15-cis)--caroteno. A respeito dos compostos fenlicos, a frao aquosa de frutos de

Pitanga contm antocianinas antioxidantes (BAGETTI et al., 2009).

O emprego das folhas de Eugenia uniflora L., cuja infuso tem sido utilizada na

medicina popular como anti-hipertensiva e antireumtica, bem conhecido no Brasil. As

folhas e frutos so empregados na medicina popular em vrias regies do pas, por serem

considerados excitantes, febrfugos, aromticos e antidisentricos. O extrato alcolico

utilizado em bronquites, tosses, febres, ansiedade e verminoses (AURICCHIO et al., 2007).

O extrato hidroalcolico das folhas diminuiu os nveis da enzima xantina oxidase,

supostamente envolvida no desencadeamento da gota, alm de ter apresentado

caractersticas de vaso-relaxante, antioxidante, antidiarrico, hipotrigliceridmico,

hipoglicmicos e propriedade bactericida, este ltimo tambm observado no leo essencial

(AMORIM et al., 2009). Ogunwande et al. (2005) demonstram efeitos como abaixamento


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dos nveis de glicose sangunea e, diurtico, antifebril, anti-inflamatrio e contra doenas

estomacais.

H uma gama de fitoqumicos j identificados nas folhas da Pitanga, so eles os

compostos fenlicos da famlia dos flavonides como o miricitrina, quercetina e seus

derivados como a quercitrina 3-l-ramnosdeos, terpenides como monoterpenos, triterpenos,

sesquiterpenos, taninos hidrolisados como o eugeniflorina D1 e o eugeniflorina D2

(EMBRAPA, 2006). Em estudo com as cascas da rvore da Pitanga, realizado por Brandelli

et al. (2009), observou-se que essa tem a capacidade de inativar trofozotos de Giardia

lamblia(um dos mais comuns parasitas intestinais), com uma concentrao mnima inibitria

de 0,313 mg.mL-1 de extratos. Alguns taninos hidrolisados presentes no extrato da folha

inibem o vrus Epstein-Barr, conhecido por estar intimamente associado ao carcinoma naso-

farngeo (LEE et al., 2000).

Um trabalho pioneiro realizado por Oliveira et al. (2006) mostra que o fruto dapitangueira possui monoterpenos como componentes volteis majoritrios, sendo trans--

ocimeno, cis-ocimeno, -ocimeno e -pineno em sua composio e o fato do suco da

Pitanga ser usado na medicina popular brasileira contra diarreia, reumatismo, febre e

diabetes, pode estar relacionado ao fato do fruto possuir compostos volteis semelhantes

queles presentes nas folhas, cuja bioatividade tem sido comprovada cientificamente.

Considerando esta particularidade do fruto, o mesmo grupo de pesquisa estudou a

otimizao do processo de obteno de extratos de pitanga pelo emprego de CO2

supercrtico (MALAMAN et al.,2011). Anlises sensoriais revelaram que os extratos ricos

em compostos volteis, principalmente os -damascenone, 5,6,7,7a-tetraidro-4-4-7a-trimetil-

2(4H)-benzofuranone, germacrene B, espatulenol, selina-1,3,7(11)-trien-8-one, 10-(1-

metiletenil)-(E, E)-3,7-ciclodecadien-1-one, farnesil acetone e 2-etil-2-metil-tridecanol

contriburam para a percepo da maior intensidade do aroma caracterstico da fruta, os

quais tambm esto presentes nas folhas como revelado pela literatura (PINO et al., 2003).

Neste estudo, a otimizao do processo revelou que as melhores condies de extrao

supercrtica foram aquelas que empregavam 200 bar e 50C.

Segundo Ogunwande et al. (2005) e Costa et al. (2009) o leo essencial da folha e do

fruto de Pitanga contm sesquiterpenos oxigenados dentre estes os principais so

isofurano-germacreno, germacreno B e germacrone. Componentes do leo essencial de

folhas de Pitanga foram identificados por CG/EM, o seu aroma foi classificado como

semelhante a "cogumelo", "madeira" e "especiarias", devido presena de furanodieno e

notas de "ervas daninhas" e "pepino", devido a presena de selinatrienone (selina-1, 3,7

(11)- trien-8-one), o componente em maior concentrao, recentemente sintetizado. Muitos

compostos volteis das folhas de Pitanga tambm so evidenciados no fruto, incluindo

selina-1, 3 , 7 (11)- trien-8-one. (OLIVEIRA; KAMIMURA; RABI, 2009).


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Com relao a sua semente, existem poucos trabalhos que relatam a sua composio.

Bagetti e colaboradores (2009) avaliaram a composio nutricional e a atividade

antioxidante destas sementes e os resultados revelaram os carboidratos como a classe mais

abundante, compostos principalmente de fibras insolveis. A frao protica muito

reduzida e dentre os cidos graxos presentes, 45 a 47% destes so polinsaturados,

desejveis dieta humana por exercer efeito sobre a reduo da incidncia de doenas

cardiovasculares. Em outro estudo com semente de Pitanga realizado por Luzia, Bertanha e

Jorge (2010), foi obtido extrato etanlico das sementes para investigar seu potencial

antioxidante. A concentrao do extrato que alcanou uma atividade antioxidante de 50% foi

de 30,72 ppm. A concentrao de compostos fenlicos presentes nos extratos etanlicos de

semente de Pitanga tambm elevada, de 75,64mg.g-1extrato.

Segundo Andrade et al.(2009), a semente de Pitanga ainda possui uma protena, a

lectina, que exibe uma notvel atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa eKlebsiellasp. com uma concentrao inibitria mnima de 1,5

g.mL-1, e moderadamente inibe o crescimento de Bacillus subtilis, Streptococcus sp. e

Escherichia colicom uma concentrao mnima inibitria de 16,5 g.mL-1.

Considerando a informao escassa da composio das sementes de Pitanga, a sua

possvel aplicao industrial, visto ao fato de ser resduo do processamento do fruto, o

histrico deste grupo de pesquisa na investigao da composio dos extratos supercrticos

das folhas e do fruto da Pitangueira e as informaes bibliogrficas que revelam sua alta

atividade antioxidante e antimicrobiana geraram o estmulo para o desenvolvimento deste

trabalho.

2.3 Compostos Terpnicos

Os leos volteis de plantas so conhecidos e utilizados desde a antiguidade por suas

propriedades biolgicas, especialmente antibacteriana, antifngica e antioxidante (SOUZA et

al., 2007). leos essenciais, tambm denominados leos volteis, geralmente extrados por

destilao das plantas, so lquidos hidrofbicos contendo compostos aromticos volteis.

Os leos essenciais so amplamente utilizados em perfumes, cosmticos, bem como em

alimentos e bebidas como aditivos de flavor. Alguns leos essenciais mostram vrias

atividades farmacolgicas e so considerados as fraes ativas mais importantes de

medicamentos fitoterpicos (DANG et al., 2010).

leos essenciais, com ou sem resinas e gomas so encontrados em estruturas

secretoras especializadas situadas dentro dos tecidos vegetais ou na superfcie da planta

(tricomas). O tipo de estrutura secretora especfico para a famlia ou espcie vegetal. O


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processo de isolamento do leo essencial quer por extrao ou destilao, deve ser

dependente da forma como o leo est armazenado na estrutura vegetal e do tipo de

estrutura secretora. Estruturas secretoras no tecido da planta podem ser clulas secretoras,

cavidades secretoras ou canais secretores. Uma cavidade secretora normal em vegetais

so os dutos, os quais se alongam na forma de uma rede se estendendo desde as razes

atravs do caule at as folhas, flores e frutos (ZIZOVIC et al., 2007).

De acordo com a sua disposio na matriz vegetal, os leos essenciais so

classificados como leos superficiais ou subcutneos. O primeiro secretado pelas

glndulas superficiais, e o subcutneo secretado bem abaixo da superfcie externa do

material vegetal, como pela casca de rvores, entre as fissuras da madeira, nas flores secas

e brotos, nas sementes, razes e frutos (ARAUS; URIQUE; del VALLE, 2009). Os leos

essenciais tm uma composio complexa, contendo de algumas dezenas a centenas de

constituintes, especialmente hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos) e compostosoxigenados (lcoois, aldedos, cetonas, cidos, fenis, xidos, lactonas, teres e steres).

Ambos os hidrocarbonetos e compostos oxigenados so responsveis pelos odores e

sabores caractersticos. O aroma de um leo o resultado da combinao dos aromas de

todos os seus componentes (POURMORTAZAVI; HAJIMIRSADEGHI, 2007).

Terpenos podem ser originados tanto do metabolismo de carboidratos quanto de

lipdios e so classificados pelo nmero de unidades de isopreno que contm.

Monoterpenos contm duas unidades de isopreno (10 carbonos), sesquiterpenos contm

trs unidades de isopreno (15 carbonos) e diterpenos contm quatro unidades de isopreno

(20 carbonos). Desses grupos, os monoterpenos, e mais especificamente, os monoterpenos

oxigenados, so considerados os mais importantes na constituio do aroma de certas

frutas, como por exemplo, as ctricas. Limoneno, um hidrocarboneto monoterpnico que

possui um odor suave, o principal terpeno na maioria dos leos ctricos representando at

95%. Os terpenos oxigenados, muitas vezes, compreendendo menos de 5% do leo,

geralmente fornecem o sabor caracterstico de espcies ctricas diferentes. Por exemplo,

citral considerado o componente de impacto no sabor que caracteriza o leo de limo,

mas raro encontrar mais de 2% de citral neste leo essencial (REINECCIUS, 2006).

A via biossinttica proposta para a sntese de isopentenil difosfato (IPP) combina trs

molculas de acetil-co-enzima-A (acetil-CoA) para formar molculas de 3-hidroxi-3-

metilglutaril-Co-A (HMG-CoA) que por sua vez, so reduzidos a cido mevalnico e depois

fosforilados e descarboxilados para formar o IPP, o elemento chave na sntese natural dos

terpenos. Sabe-se que o IPP tambm pode ser formado atravs de uma via que no inclui o

cido mevalnico, mas ainda faltam evidncias para amparar a existncia desta alternativa.

A prxima etapa desta sntese envolve a combinao de unidades de IPP para formar

geranil difosfato, farnesil difosfato e geranil-geranil difosfato, que servem como precursores


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das famlias mono-, sesqui- e diterpenos, respectivamente (Figura 2). Os demais membros

dessas famlias surgem a partir da ciclizao secundria ou modificao destes trs

precursores (REINECCIUS, 2006).

Figura 2 -Biossntese de compostos terpnicos a partir de isopentil difosfato em tecidosvegetais.Adaptado de REINECCIUS, 2006.

Sesquiterpenos so uma das classes estruturalmente mais diversificadas de produtos

naturais isolados de plantas, fungos, bactrias e invertebrados marinhos. Nas plantas eles

podem atuar contra parasitas, como predadores, ou para atrair polinizadores. Todas as

dezenas de milhares de sesquiterpenos conhecidos presentemente so derivados a partir

2x

1x

OPP

TetraterpenosFitoeno

Dipertenos

Geranilgeranildifosfato

Poliprenis

Politerpenos

2x

CH2OPP

Isopentenildifosfato

CH2OPP

Dimetilalildifosfato

Hemiterpenos

3x

Sesquiterpenos

Esqualeno Triterpenos2xOPP

Farnesil difosfato

OPP

Geranil difosfato

Monoterpenos


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de trezentas estruturas de hidrocarbonetos bsicos gerados por sesquiterpenos adenilato

sintases usando farnesil difosfato como substrato (GARMS; KLLNER; BOLAND, 2010).

Dentre os mtodos de obteno de leos essenciais a partir de fontes vegetais, a

destilao a vapor tem sido a mais tradicionalmente aplicada. Uma das desvantagens dos

mtodos de arraste a vapor ou hidrodestilao que os leos essenciais sofrem alterao

qumica j que os compostos sensveis ao calor podem ser facilmente destrudos. Portanto,

a qualidade do leo essencial extremamente prejudicada. Nesse nterim, os mesmos

autores relatam que a extrao dos componentes de leos essenciais com a utilizao de

solventes a alta presso, ou fluidos supercrticos, tem recebido muita ateno nos ltimos

anos, especialmente na indstria de alimentos, farmacutica e cosmtica, porque apresenta

uma alternativa aos processos convencionais, que normalmente empregam alta temperatura

(BOCEVSKA; SOVOV, 2007; POURMORTAZAVI; HAJIMIRSADEGHI, 2007).

Alm da degradao trmica, a hidrodestilao de compostos volteis torna-seineficiente tambm por alguns desses componentes se dissolverem parcialmente na gua e

sua distribuio entre as fases leo essencial e gua no separador do aparelho de

destilao ficar desfavorecida. Assim, a extrao com SC-CO2mostra-se ser a tcnica de

escolha para o isolamento de steres monoterpnicos, alguns de seus lcoois, e

sesquiterpenos de plantas (BOCEVSKA; SOVOV, 2007).

A extrao com CO2supercrtico tambm uma ferramenta poderosa na pesquisa de

fragrncias e de leos essenciais, especialmente porque o isolamento de componentes

volteis usando mtodos tradicionais, como a destilao a vapor ou de amostragem de

headspacedinmico produz extratos com fragrncia que podem no refletir as propriedades

de aroma do material natural. Com as condies de extrao que empregam temperaturas

brandas, a extrao com fluido supercrtico a mais adequada para isolar leos essenciais

de especiarias, flores, ervas, folhas, sementes e razes. Os extratos obtidos so geralmente

considerados como sensorialmente superiores aos concentrados produzidos pelas tcnicas

tradicionais. Uma desvantagem da extrao com CO2supercrtico, no entanto, a presena

de outros compostos no extrato que no contribuem para a impresso de fragrncia, tais

como hidrocarbonetos de cadeia longa ou lcoois parafnicos (MARSILI, 2002).

A co-extrao de substncias de baixa volatilidade como ceras cuticulares juntamente

com o leo essencial voltil tpico para extrao com SC-CO2de leos essenciais a partir

de material herbceo. Uma possibilidade de obter um leo essencial relativamente puro a

utilizao de separao em dois estgios. No primeiro estgio as substncias de baixa

volatividade e indesejadas so precipitadas e separadas do CO2 supercrtico baixa

temperatura e o leo essencial, sendo mais solvel ao solvente, se separa deste aps uma

alterao na presso e temperatura no segundo separador (BOCEVSKA; SOVOV, 2007).


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A extrao com fluido supercrtico do leo essencial melhora a qualidade do leo

evitando o estresse trmico dos componentes terpnicos. No entanto, as condies de

extrao, principalmente presso e temperatura, responsveis pelo poder de solvente do

fluido supercrtico devem ser otimizadas, uma vez que estas variveis so diretamente

responsveis pela composio do extrato e, portanto, por suas propriedades funcionais. No

entanto, outros fatores como a geometria do leito fixo, o nmero de estgios de extrao e

separao, e o fluxo de solvente podem influenciar no desempenho do processo (LANGA et

al., 2009). Goodarznia e Eikani (1998) afirmam que a presso e a temperatura tima de

extrao para a obteno de alto rendimento de leos essenciais, resultando em

solubilidade insignificante dos outros componentes esto nas faixas de 80 a 100 bar e de 40

a 50 C.

Esta faixa de presso e temperatura foi estudada neste trabalho. Assim como o estudo

da extrao supercrtica, o estudo da aplicao dos extratos complementa os resultados deforma a justificar a viabilidade da tecnologia empregada. Deste modo, anlises da

bioatividade dos extratos supercrticos das sementes de Pitanga foram contempladas neste

trabalho.

2.4 Ensaios para Deteco de Bioatividade de Extratos de Matrizes Vegetais

2.4.1 Atividade antioxidante

Em humanos, o desequilbrio entre espcies oxidantes e antioxidantes pode provocar

uma srie de desordens celulares, tais como peroxidao lipdica, danos protico-

enzimticos e inclusive, alteraes no DNA, as quais podem estar associadas a inmeros

processos deletrios, como o cncer, aterosclerose, diabetes mellitus, artrite reumatide,

distrofia muscular, catarata, desordens neurolgicas e do trato respiratrio alm de

envelhecimento precoce (BIANCO; SANTOS, 2010).

Recentemente, tem havido um interesse crescente em espcies reativas de oxignio

em sistemas biolgicos e seus papis como agentes causais implcitos na etiologia de uma

variedade de doenas crnicas. Assim, a ateno est sendo focada nas funes

bioqumicas de proteo dos antioxidantes naturais nas clulas dos organismos que os

contenham (MENSOR et al., 2001).

Para medir a capacidade antioxidante de alimentos e amostras biolgicas, diferentes

ensaios foram introduzidos. O conceito de capacidade antioxidante foi primeiro originado

para a qumica e mais tarde adaptado para a biologia, medicina, epidemiologia e nutrio.


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Ele descreve basicamente a habilidade de molculas eletronicamente instveis em

neutralizar os radicais livres de sistemas biolgicos atravs de reaes de oxido-reduo

(redox). Este conceito fornece um quadro mais amplo dos antioxidantes presentes em uma

amostra biolgica, uma vez que considera os efeitos aditivo e sinrgico de todos os

antioxidantes e no somente o efeito de um dos compostos isolados, e podem, portanto,

causar benefcios sade como antioxidantes potenciais contra doenas mediadas pelo

estresse oxidativo (FLOEGEL et al., 2011).

Nos ltimos anos, vrios ensaios espectrofotomtricos foram adotados para medir a

capacidade antioxidante de alimentos, sendo os mais populares os ensaios que utilizam os

radicais 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) e o 2,2-difenil-1-picrilhidrazila

(DPPH). Alm daquele que mede a capacidade de absoro de radicais de oxignio (ORAC)

e a capacidade de reduo de ons ferro em plasma (FRAP). A maioria destes ensaios

emprega o mesmo princpio, um composto radicalar sinttico de cor ou oxi-redutor geradoe a capacidade de uma amostra biolgica para eliminar os radicais ou para reduzir o

composto redox-ativo monitorado por espectrofotmetro, juntamente com a aplicao de

um padro adequado para quantificar esta capacidade antioxidante, por exemplo, por

equivalente de Trolox (TEAC) ou equivalente de vitamina C (VCEAC). Alm disso, existem

dois tipos bsicos de mecanismos. Um deles baseia-se na transferncia de eltrons e

envolve a reduo de um oxidante de cor, como o ABTS, DPPH e ensaio FRAP. O outro

aborda uma transferncia de tomo de hidrognio, como no teste ORAC, em que os

antioxidantes e o substrato competem termicamente pelos radicais peroxila gerados

(FLOEGEL et al., 2011).

Em se tratando do estudo de extratos vegetais, os quais so compostos por uma

infinidade de substncias, alm de conhecer a capacidade antioxidante total, mais

recentemente tem-se agregado outras metodologias com o intuito de identificar os

compostos que mais contribuem para tal efeito. A cromatografia em camada delgada (CCD)

combinada com ensaio de inibio do radical DPPH um mtodo que tem a capacidade de

garantir a reao de oxi-reduo suficiente a partir do isolamento de grupos de

componentes com atividade antioxidante em uma mistura. Os compostos ativos, separados

em bandas, so vistos como manchas claras contra um fundo roxo na cromatoplaca. Testes

preliminares usando CCD possibilitam direcionar a separao de compostos antioxidantes

em cromatografia de alta resoluo como a anlise por cromatografia lquida de alta

eficincia (CLAE) (ZHAO, J. et al., 2010).

O radical DPPH (DPPH) tambm tem sido utilizado em CLAE com a finalidade de

indicar a atividade antioxidante de cada componente, a qual medida pela inibio destes

radicais livres. Embora a combinao da CLAE com as reaes de oxi-reduo usando

DPPH seja eficiente, o sistema on-line pode apresentar uma cintica de reao lenta que


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permite uma caracterizao imprecisa da atividade antioxidante destes compostos. Alm

disso, esta tcnica desconsidera o efeito sinrgico que uma substncia pode exercer sob a

outra e assim, um composto que na prtica teria uma alta atividade antioxidante, por esta

tcnica (CLAE + DPPH) visualizado um baixo efeito, pois este composto analisado

individualmente (ZHAO, J. et al., 2010).

A interao de um potencial antioxidante com DPPH depende de sua conformao

estrutural. O nmero de molculas de DPPH que so reduzidas parece estar

correlacionado com o nmero de grupos hidroxila disponvel. sugerido que o DPPH livre

abstrai o hidrognio de molculas de compostos fenlicos que so doadores de eltrons.

Este poderia ser o mecanismo geral das reaes com flavonis antiperoxidativos, por

exemplo. Com base no mecanismo de reduo da molcula de DPPH extensivamente

descritos na literatura, que est correlacionada com a presena de grupos hidroxila na

molcula antioxidante, pode-se inferir que a grande atividade de extratos polares ,provavelmente, devido presena de substncias com um grupo hidroxila disponvel,

fenlico ou no. Esta exigncia estrutural poderia estar ligada presena de flavonides ou

taninos condensados, por exemplo (MENSOR et al., 2001).

O radical 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) um conhecido

composto utilizado para a anlise colorimtrica de oxidantes qumicos diversos. A molcula

de ABTS incolor convertida para a cor azul-esverdeada na sua forma radicalar, pela

oxidao de um eltron. O ABTS+mostra fortes bandas de absoro de UV-vis em 415,

648, 728 e 812 nm, e conhecido por ser uma espcie radicalar mais duradoura, pois

diferente do radical DPPH que, quando formado s pode ser usado para anlises no mesmo

dia, o radical ABTS quando em soluo pode ser estocado por at um ms sob refrigerao.

Tem sido relatado que ABTS pode ser rapidamente formado por reaes com vrios radicais

inorgnicos, como OH, Br2-e RS, e diversos radicais orgnicos, tais como radicais alcoxil

ou alcoxilperoxil. Alm disso, oxidantes no radicalares, como o cido percarboxlico,

ferrato, espcies de bromo e cloro, so conhecidos por reagir com ABTS para produzir

estequiometricamente ABTS+. Portanto, ABTS+tem sido utilizado como uma sonda cintica

para o estudo de reaes de neutralizao de radicais livres, bem como um reagente para a

anlise quantitativa de oxidantes qumicos (LEE; YOON, 2008). Este mtodo tem sido

aplicado para o estudo de fraes antioxidantes solveis em gua e antioxidantes

lipossolveis, compostos puros e extratos (RE et al., 1999).

2.4.2 Atividade antimicrobiana


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A sobrevivncia e proliferao dos micro-organismos nos alimentos um problema

importante, que pode levar deteriorao e assim prejudicar a qualidade de produtos

alimentcios ou causar infeco e doena. Estima-se que as doenas diarricas de origem

alimentar j causam cerca de 4 a 6 milhes de mortes por ano, sendo crianas a maioria.

Apesar dos conservantes qumicos serem utilizados h anos, existem controvrsias j que

alguns podem causar problemas de sade respiratria, por exemplo. Portanto, necessrio

encontrar uma nova maneira de reduzir ou eliminar micro-organismos nos alimentos e

prolongar a vida de prateleira. Somado a isto, a crescente demanda dos consumidores por

produtos naturais tem levado investigao de novos agentes antimicrobianos a partir de

matrizes vegetais (LV et al., 2011).

O estudo para a descoberta de novas substncias com capacidade antimicrobiana tem

sido estimulado pela demanda dos consumidores que relacionam extratos obtidos de fontes

vegetais com sade e alimentos mais saudveis. Produtos naturais tm sido uma fonteparticularmente rica de agentes anti-infecciosos, produzindo, por exemplo, a penicilina, em

1940, as tetraciclinas em 1948 e os glicopeptdeos em 1955 (CUSHNIE; LAMB, 2005).

Dentre os extratos de matrizes vegetais j reconhecidamente antimicrobianos, destaca-se

os leos essenciais de cravo, organo, alecrim, tomilho, slvia e vanilina. Eles tm

geralmente ao inibitria mais expressiva contra bactrias Gram-positivas do que contra

bactrias Gram-negativas (HOLLEY; PATEL, 2005).

Vrios fatores relacionados aos prprios micro-organismos condicionam a resistncia

aos agente antimicrobianos, como a complexidade da parede celular. De acordo com Lv et

al. (2011), geralmente reconhecido que as clulas da fase logartmica do crescimento

microbiano so mais sensveis aos fatores de estresse externos, enquanto as clulas da

fase estacionria so mais resistentes. Este fenmeno pode ser explicado pelas mudanas

estruturais ou conformacionais na parede celular dos micro-organismos por ser uma

estrutura dinmica que pode se adaptar a mudanas fisiolgicas. Por exemplo, tem sido

demonstrado que no peptidoglicano de clulas de Escherichia coli ocorrem alteraes

evidentes durante a transio da fase logartmica (inicio do ciclo microbiano de grande

multiplicao dos micro-organismos) para fase estacionria (final do ciclo microbiano, no

qual o nmero de bactrias originadas praticamente igual ao nmero de bactrias que

morrem), incluindo o espessamento da camada de peptidoglicano e o aumento da grau de

ligaes cruzadas deste glico-polissacardeo. Isso mostra que o aumento das ligaes

qumicas no peptidoglicano tornam as clulas cultivadas h mais tempo mais difceis de

serem danificadas.

A Organizao Mundial de Sade no tem medido esforos para padronizar os testes

de susceptibilidade antimicrobiana a nvel internacional. Estudos colaborativos publicados

na dcada de 70 tiveram o objetivo de padronizar a diluio em caldos e testes de


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susceptibilidade antimicrobiana em meios de cultura com diluio em gar. Depois, testes

de difuso em disco foram cuidadosamente padronizados para uso nos pases

escandinavos e nos Estados Unidos. Com a divulgao destes dois procedimentos, muitos

detalhes processuais passaram a ser cuidadosamente controlados e bem definidos. Uma

variedade de outros mtodos foram criados, mas houve pouco esforo para o controle de

variveis importantes, como a densidade de inculo, gar, condies de incubao, dentre

outros. Os testes padronizados de disco envolvem medir o dimetro de cada zona de

inibio e comparar com a concentrao inibitria mnima (CIM) obtida por testes de

suscetibilidade de diluio em gar ou caldo (SCHWALBE; STEELE-MOORE; GOODWIN,

2007).

Basicamente, maior poder antimicrobiano ter a substncia que conseguir um grande

halo de inibio (distncia sem crescimento microbiano) com uma baixa concentrao, o

que significa que esta substncia a uma concentrao baixa consegue reproduzir umaresposta inibitria eficiente. Em teste de inibio de micro-organismos atravs da medio

do halo de inibio, existe uma classificao com trs nveis que leva em conta a distncia

entre a substncia teste presente no disco de papel e a cultura bacteriana, sendo ela: baixa

atividade (zona de inibio 12mm), atividade moderada (12mm < zona de inibio


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antimicrobiana de um leo essencial particular, o conhecimento da composio qumica

fundamental (RATTANACHAIKUNSOPON; PHUMKHACHORN, 2010).

Na reviso publicada por Cushnie e Lamb (2005), foi abordado o mecanismo de ao

de flavonides que podem compreender trs vias principais de inativao dos micro-

organismos: uma das vias a inibio da sntese de cidos nuclicos, atravs de ligao de

hidrognio formadas entre o flavonide com a cadeia de DNA ou intercalao dos anis do

flavonide com as bases dos cidos nuclicos e essa rota leva a inibio da sntese de DNA

e RNA. Outro mecanismo a inibio do funcionamento da membrana citoplasmtica por

meio da modificao das regies hidroflicas e hidrofbicas da membrana. Algumas

catequinas interagem com a bicamada lipdica pela penet

extração pitanga

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