Aula de Bioquímica I

Tema:

Função de Proteínas:

Mioglobina e Hemoglobina

Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM

Instituto de Química de São Carlos – IQSC

Universidade de São Paulo – USP

E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br

Proteínas

Funções

Transporte e Estoque;

Catálise enzimática;

Movimento;

Suporte mecânico;

Proteção imune;

Sinalização intra e extracelular;

etc.

Variedade Funcional ���� Diferentes Estruturas Tridimensionais

Estrutura 3D ���� Estrutura Estável em função do tempo

Estabilidade versus flexibilidade

Função versus Conformação.

Como as Proteínas Funcionam

Grande maioria → interação com outras moléculas

Interações reversíveis → ligante (qualquer tipo de molécula, inclusive proteína);***Natureza transitória das interações proteína-ligante***

↓VIDA

↓RESPOSTA RÁPIDA E REVERSÍVEL A MUDANÇAS AMBIENTAIS E CONDIÇÕES

METABÓLICAS

SÍTIO DE LIGAÇÃO

→ Interação específica

→ Acoplada a uma mudança conformacional → ENCAIXE INDUZIDO

*ENZIMAS: Substratos; Sítio catalítico ou Sítio ativo.

Introdução���� Organismos aeróbicos ���� Necessitam de suprimento de O2 constante

�Organismos multicelulares vertebrados

- Desenvolvimento de sistema circulatório

- Desenvolveram proteínas de transporte de O2

1 – Mioglobina ���� músculo

- mantém suprimento local de O2

2 – Hemoglobina ���� sangue ���� hemácias

- Transporta O2 dos pulmões para os tecidos

- Transporta CO2 e H3O+ dos tecidos para os pulmões

Mioglobina versus Hemoglobina

- São similares na Estrutura Primária, Secundária e Terciária

- Ligam O2 de maneira muito similar

- Em condições similares aos tecidos, a Hemoglobina está 7% saturada com O2 enquanto que a Mioglobina apenas 90% saturada

- Hemoglobina liga O2 de maneira cooperativa e é uma proteína alostérica

- Ambas são importantes proteínas-modelo de estudo Bioquímico

Grupo Prostético = HemeA ligação O2 pelas globinas depende do grupo Heme

���� Grupo Heme ���� Protoporfirina + Fe2+ = ���� responsável pela cor vermelha do sangue

- Protoporfirina ���� 4 anéis pirrólicos (anel tetrapirrólico)

- 8 Cadeias Laterais = 4 metilas, 2 vinilas e 2 Ácidos Caboxílicos

- Ferro é coordenado no centro pelos átomos de Nitrogênio dos 4 grupos Pirróis.

Porfirina Heme Fe2+

Coordenação Hexagonal

HolomioglobinaGrupo heme está ligado à apoproteína:

1) pelo ocupação do Quinto ponto de coordenação do Fe2+ pela His proximal

2) Interações Hidrofóbicas do anel tetrapirrólico

- Sexto ponto de coordenação do Fe2+ é ocupado pelo O2

- Na forma deoxi, a His Proximal retira o Fe2+ do plano central da porfirina

HolomioglobinaGrupo heme permite monitoramento:

Holomioglobina���� 1º Proteína a ter a sua estrutura 3D resolvida

- Estrutura em Hélices Alfa - Possui 153 resíduos de AA

- Total de 8 hélices anfipáticas – nomeadas de A a H

���� Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F

- Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8)

- Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7)

Holomioglobina���� Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F

- Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8)

- Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7)

���� A ligação O2–Fe2+ gera a transferência parcial de 1 elétron do Fe2+ para o O2���� forma o íon superóxido

O2-

���� A His E7 estabiliza o O2ligado ao Fe2+ por uma

ligação de H;

���� Evita a formação do íon superóxido;

- O componente protéico estabiliza a reatividade do

O2

Interação Proteína-Ligante

pode ser quantificada

Proteínas são capazes de interagir especificamente com ligantes

A interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica

Questões apresentadas

1) Qual é o máximo número de moles de ligante por proteína?

2) Qual é a constante de equilíbrio deste ligante por cada um dos sítios de ligação?

3) A constante de equilíbrio do L por cada um dos sítios é independente da ocupação dos demais?

4) A constante de equilíbrio do L é modificada pela presença de um segundo ligante?

P + L PLk1

k2

Interação Proteína-Ligante

pode ser quantificadaA interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica

k1 e k2 são as constantes de velocidade de associação e dissociação

KA e KD são as constantes de equilíbrio no sentido de associação e dissociação

KA é dado em (mol/L)-1 (M-1)���� Quanto maior o valor de KA maior a afinidade da interação PL

KD é dado em mol/L (M)���� Quanto menor o valor de KD maior a afinidade da interação PL

� Quando a [L] é >>> [P] podemos considerar que a formação do PL não altera a [L]

� A fração de Sítios de ligação na P frente ao L pode ser descrita pela seguinte equação

P + L PLk1

k2 ADAeq K

KLP

PL

k

kKK

1

]][[

][

2

1 =∴===

][][

][

sDisponívei Sítios de Total

Ocupados Sítios

PPL

PL

+==θ

Interação Proteína-Ligante

pode ser quantificadaΘ pode ser monitorado e seu valor em função da [L] resulta numa hiperbólica retangular

][][

][

PPL

PL

+=θ

]][[][]][[

][LPKPL

LP

PLK AA =∴=

D

A

A

A

A

A

KL

L

KL

L

LK

LK

PLPK

LPK

+=

+=

+=

+=

][][

1][

][1][

][][]][[

]][[θ

Dividindo ambos os

por [P]

Dividindo ambos por

KA

DA

KK

=1

Quando [L] = KD ���� [L]onde metade dos sítios

de ligação estão ocupados pelo Ligante

���� Para 90% de saturação [L] = 9 x KD

Substituindo [PL]

Interação Mioglobina-O2

A interação entre a mioglobina e O2 segue as leis da termodinâmica mesmo considerando o Oxigênio como gás

- Adequação experimental e matemática é necessária

DKOO

θ+

=][

][

2

2

Se P50 = [O2] na qual metade dos sítios estão ocupados

Quando pO2 for equivalente à metade do sinal máximo temos KD e assim podemos

definir P50

DKpOpO

θ+

=2

2

O2 liga fortemente à mioglobina com um P50 de

0,26 kPa - Condição na qual metade dos sítios estão ocupados

A [O2] em solução depende diretamente da pressão de O2 na

atmosfera que pode ser controlada.

502

2

PpOpO

θ+

=

DKP =50

Estrutura da Hemoglobina���� A Hemoglobina é um heterotetrâmero

- Duas cadeias Alfa (141 resíduos) e duas cadeias Beta (146 resíduos)

- Possui estrutura em hélice alfa

���� Hemoglobina A (HbA) = par de dímeros α1β1 e α2β2

- A interface α1β1 e α2β2 apresenta ~30 contatos

- A interface α1β2 e α2β1 apresenta ~19 contatos

���� Maioria hidrofóbicos e alguns hidrofílicos ���� Importantes para regulação

- Grupos Heme estão bem separados (24-40 Å)

Estrutura da Hemoglobina� Cadeia Alfa e Beta da HbA apresentam ~25% de identidade com a Mioglobina

���� Alta identidade estrutural

- Apesar da baixa identidade sequencial

- Identidade estrutural é mais conservada

���� Mesma forma de ligar grupo Heme

-Possui His Proximal e Distal

Estrutura da Hemoglobina���� A HbA liga O2 de maneira cooperativa – curva Sigmoidal

���� A ligação de O2 em uma cadeia da HbA aumenta a ligação de O2 nas demais cadeias

���� A dissociação de O2 em uma cadeia da HbA facilita a dissociação de O2 nas demais cadeias

Estrutura da Hemoglobina���� A ligação de O2 com HbA é >10 x mais fraca do que com a Mioglobina

���� A baixa afinidade da HbA por O2 está relacionada com a função desta proteína

- Captar O2 nos pulmões (“alta” pO2) e liberar nos tecidos (“baixa” pO2)

���� A alta afinidade da Mioglobina por O2 está relacionada com a função: Armazenar O2

Cooperatividade� A Alosteria – “outra forma” – está envolvida na cooperatividade

Sistema de variação de afinidade/atividade frente à modulação.

���� Envolve a participação de um Modulador

- Modulador ���� Ativador ou inibidor

- Modulação homotrópica: Ligante e modulador iguais

- Modulação heterotrópica: Ligante e modulador diferentes

���� Uma curva de ligação sigmoidal é um sinal de ligação cooperativa.

Cooperatividade� A ligação cooperativa de O2 na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910)

P + nL PLn

k1

k2

nn

Aeq LPPL

kk

KK]][[][

2

1 ===

D

n

KL

θnθ ][=− DKnLn

θnθ

log]log[log −=

−�Equação de Hill

1][][+

=n

An

nAn

LK

LKnθ

1) Reorganizando2) Dividindo ambos por KA

3) Substituindo por KD

� Curva de Hill ���� log [θ/(1-θ)] versus log[L] onde a inclinação = n = nH

Aplicando Log

Cooperatividade� A ligação cooperativa de O2 na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910)

( ) ( )502 log0loglog Pnpnθn

θ −=

−

�nH não representa o número de sítios de ligação, mas o grau de interação

entre eles: o grau de cooperatividade

� nH representa a cooperatividadeentre os sítios de ligação

� nH < n

Ligação de O2 na Hemoglobina� Em exercício, o sangue arterial, após uma passagem pelo pulmão, apresenta ~98% de

saturação da HbA com O2

���� Após passar pelos tecidos, o sangue venoso apresenta ~32% de saturação de O2

- Portanto, ~66% dos pontos de ligação contribuíram para o transporte de O2

� A ação cooperativa da HbA favorece a DESCARGA adequada de O2

- Nestas condições, a Mioglobina permaneceria com 91% de saturação ���� 7% de transporte

���� A HbA transporta ~10 x mais O2 do que a Mioglobina

O2

A cooperatividade da HbA� A ligação de O2 na HbA resulta em mudanças conformacionais na tetrâmero de HbA-O2

- Um dímero Alfa-Beta sofre rotação de 15º em relação ao outro

���� A HbA existe em duas conformações principais:

1) T (Tenso) ���� Estado deoxigenado

2) R (Relaxado) ���� Estado Oxigenado

- O Estado R apresenta maior afinidade por O2 do que o estado T

- Na presença de O2, o estado R é mais estável

A cooperatividade da HbA� Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α1β2 e α2β1

���� A ligação de O2 altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos

- Mudanças no ambiente do grupo

Heme são transmitidas para as outras cadeias

do oligômero

A cooperatividade da HbA� Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α1β2 e α2β1

���� A ligação de O2 altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos

A cooperatividade da HbA� A HbA pura no estado T é muito instável

- Liga avidamente O2 em baixas [O2] e libera apenas 8% de O2 em condições fisiológicas

���� A transição T ���� R adequada depende de um ligante – o 2,3-Bisfosfoglierato – 2,3-BPG

���� A [2,3-BPG] nas hemácias é aumentada na altitude.

- Adaptação em ~ 24 horas

- Permite menor afinidade entre HbA-O2

- A HbA liga menos O2,

MAS descarga de O2 nos tecidos é MAIOR apesar da

menor pO2 atmosférica

A cooperatividade da HbA� Efeito do 2,3-Bisfosfoglierato – 2,3-BPG na p50

A cooperatividade da HbA

O 2,3-BPG:

1) Liga-se no centro do Tetrâmero da HbA;

2) É liberado após transição T ���� R;

3) Age mantendo HbA no Estado T;

4) É um Efetor Alostérico.

A cooperatividade da HbA

A transição T ���� R expulsa o BPG do sítio de ligação

Estado REstado T

A Hemoglobina Fetal- A Hb fetal contem duas cadeia Alfa e duas cadeias Gama

���� A cadeia Gama é 72% idêntica à cadeia Beta na seqüência de aminoácidos

- A modificação Beta-His143 �������� Gama-Ser143

- Modifica o sítio de interação do 2,3-BPG com a Hb

Consequências:

- Redução da afinidade da Hb Fetal por 2,3-BGP

- Aumento da afinidade da Hb Fetal por O2

���� Permite que a Hb Fetal receba eficientemente o O2 transportado pela HbA

maternal

- O feto não “experimenta” pO2 atmosférica

Outros genes

���� Existem outras 3 cadeias de hemoglobina expressas em diferentes estágios do

desenvolvimento

�Existem ainda: Neuroglobina e citoglobina

(+ similares à mioglobina)

Integração das trocas gasosas� O CO2 é transportado como HCO3

- (maior parte)

� A Hidratação do CO2 gera H+

A HbA transporta H+ e CO2

dos tecidos para o pulmão� A HbA é sensível aos níveis de H+ e CO2 nos tecidos

- H+ e CO2 são efetores alostéricos da HbA ���� aumentam a liberação de O2 para os tecidos

� O estado T é estabilizado pela redução do pH

- Resultado: descarga de O2 nos tecidos

���� É chamado de Efeito Bohr (Christian Bohr, pai de Niels Bohr)

� O CO2 é hidratado pela enzima Anidrase Carbônica nas hemácias

���� A afinidade da HbA por O2diminui com a redução do pH

A HbA liga H+ e CO2

���� A HbA transporta H+ dos tecidos para o pulmão

No capilar sanguíneo (tecidos)

���� A Hidratação do CO2 é

catalisada pela Anidrasecarbônica

�O próton liberado pela hidratação do CO2 liga-se à cadeia alfa e beta da HbA estabilizando uma ponte salina

���� estabilização do estado T

� Permite o transporte de próton para os pulmões

- 80% do transporte

Ponte salina na interface α2β1

A HbA liga H+ e CO2

���� A HbA transporta CO2 dos tecidos para o pulmão

���� O CO2 liga-se à aminas terminais

- ~15-20% do transporte ligado à HbA

- Restante é transportado na forma de HCO3- solúvel

� Forma grupos carbamato ���� carga negativa

���� Estabiliza estado T por favorecer interações eletrostáticas na interface cadeia Alfa-Beta da HbA

Descarga de O2 pela HbA66%77%88%

Fatores influentes na HbA

Efeitos na curva de saturação

Mutações na HbA� Os genes da Hb sofrem mutações que alteram a cadeia protéica

- Podem prejudicar a afinidade da Hb pelo O2

- Originam as Hemoglobinopatias – são as anemias hereditárias

- ~ 500 tipos de mutações identificadas na população humana

- Muitas mutações são inócuas

- O Surgimento da anemia depende se o indivíduo é heterozigoto ou homozigoto

���� Anemia falciforme

- devido à mutação D6V na cadeia Beta

- Forma a Hemoglobina S

- Forma um contato hidrofóbico com a F85 e V88 entre as cadeias beta

inter-tetrâmeros

Mutações na HbA� As pontes hidrofóbicas inter-cadeias propicia a fibrilação

Mutações na HbA� As pontes hidrofóbicas inter-cadeias precipitam a HbS ���� não liga O2

Mutações na HbA�A HbS forma fibras que deformam a estrutura das hemácias

� HbS aumenta resistência à malária ���� parasita vive dentro das hemácias

-possível fator seletivo positivo da HbS ���� por isto foi “selecionada” e persiste presente