extração e caracterização espetroscópica da mioglobina da carne

7/22/2019 Extrao e Caracterizao Espetroscpica Da Mioglobina Da Carne

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Extrao e CaracterizaoEspetroscpica da

Mioglobina da CarneBioqumica Experimental II

FacL

Alexa

OlenaPatrcPatrc

Doc


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Mioglobina

Objetivos Gerais

Extrao e identificao das formas reduzida e oxidada da Mioglobinaduas propriedades espetrais.

Estudo das reaes redox de interconverso das espcies.


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Mioglobina

Protena monomrica Massa molecular: 16,949Da

Armazenamento e transporte de oxignio

Possui um grupo heme

Msculos cardaco e esqueltico

Figura 1 Diversas representaes

estrutura da Mioglobina.


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Figura 2 RMioglobina.


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Transporte de Oxignio

Oxignio poucosolvel em soluesaquosas

Difuso do oxigniopelos tecidos ineficiente

Nenhuma das calaterais das prote

adequada paraligao reversve

oxignio.

Metal deTransio

FerroCobre

Tm de possuir elevadatendncia para ligaoao oxignio


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Ferro nas protenas

Ferro Livre Espcies altamentereativas de oxignio

Danos no DNAe noutras molculas

Ligao a estruturasque sequestram e/ou otornam menos reativo.

Grupo Heme Composto associado de modopermanente a uma protena e

que contribui para a funodessa protena.


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Grupo Heme

Complexa estrutura orgnica em anel: porfirina IX qual estnico tomestado ferr

Carctereletres pe

a impedir aferro do hferroso) pa

Estado ferroso: liga forma reversvel.

Estado frrico: no Figura 3 Grupo Heme.


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Met-Mb e Oxy-Mb

Met-Mb Oxy-Mboxidao

reduo

[FeIII-H2O-Mb][F

Figura 5 Representao da forma Met-Mb. Figura 6 Represe


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Procedimento

Esquema 1 Procedi


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Met-Mb e Oxy-Mb

Soluo AA 5mL do sobrenadante juntou-se 0,0549g de ferricianeto de p

conduzindo produo de Met-Mb:

Fe2+-O2-Mb + K6[FeCN6] Fe3+-H2O-Mb (Equa

Soluo BA 5mL do sobrenadante juntou-se 0,1135 g de ditionito d

conduzindo produo de Oxy-Mb:

Fe3+-H2O-Mb + Na2S2O4 Fe2+-O2-Mb (Equa


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Anlise dos Espetros

Sobrenadante Soluo A Soluo B

Anlise dos Espetros


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Espetros de Absoro no UV-Visvel

Amostra Regio Visvel Regio de

Met-Mb 635nm 504nm 409nm

Oxy-Mb 580nm 542nm 417nm

348nm

Quadro 1 Picos de absoro das formas da mioglobina na regio do visvel e na regio de Soret.

= 179 .

= 128 .


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Espetros de Absoro no UV-Visvel - Sobrenadante

Figura 7 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para oSobrenadante. Foram lidas as absorvncias noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.

Figura 8 Espectro de Absoro (UV-Vis) dArtigo Microburger Biochemistry: ExtCharacterization of Myoglobin from HamburgLaura A. Andersson*Department of Biochemistr

State University, Manhattan, KS 66506

.


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Espetros de Absoro no UV-Visvel Soluo A

Figura 9 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para asoluo A (Met-Mb). Foram lidas absorvncias noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.

Figura 10 Espectro de Absoro (UV-Vis)Mb). Fonte: Artigo Microburger Biochemistry: ECharacterization of Myoglobin from HamburgeLaura A. Andersson*Department of Biochemistry,

State University, Manhattan, KS 66506.


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Figura 11 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para asoluo B (Oxy-Mb). Foram lidas absorvncias noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.

Figura 12 Espectro de Absoro (UV-Vis)Mb). Fonte: Artigo Microburger Biochemistry: ECharacterization of Myoglobin from HamburgeLaura A. Andersson*Department of Biochemistry,

State University, Manhattan, KS 66506.

Espetros de Absoro no UV-Visvel Soluo B


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Registo das Absorvncias

Amostra C.d.O.(nm)

Abs

Sobrenadante

1/3

635 0,172

542 0,523

505 0,395

580 0,488

409 3,152

417 3,222

Amostra C.d.O.

(nm)

Abs

Soluo A

1/5

635 -0,005

542 0,009

505 0,028

580 -0,002

409 0,801

417 0,533

Amostra C.d.O

(nm

Soluo B

1/5

635

542

505

580

409

417

Quadro 2 Registo das absorvnciasmedidas para o sobrenadante nosrespetivos comprimentos de onda aps

leitura dos espetros.

Quadro 3 Registo das absorvnciasmedidas para a soluo A nos respetivoscomprimentos de onda aps leitura dos

espetros.

Quadro 4 Registo dmedidas para a soluocomprimentos de onda

espetros.


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Determinao da massa de protena nas solues A e BLei de Lambert-Beer

Lei de Lambert-Beer: Abs=lc

Soluo A

Abs

Absorvncia (a 409nm registou - Coeficiente de absoro molar (=c Concentrao de Met-Mbl percurso tico (l=1 cm)

=

=

=0,801

179 1

= 4,47 10

= 5

= 4,47 10 5

= 2,235 10 = 2,235

Como a soluo A sofreu uma diluio de 1que a concentrao de Met-Mb :


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A massa molecular da mioglobina 16949 g/mol, como a Met-Msua constituio gua tem-se que a massa molar da Met-Mb co

16949+2x1+15,999=16966,99gmol -1:

=

= 16966,99/ 2,235 10/ = 0,3792

= 0,3792 /

Como o volume de amostra recolhido na SEC foi de 1,2mL obtm-se a mMb:

= 0,3792

1,2 = 0,4550


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Para a soluo B, correspondente Oxy-Mb foram aplicadoclculos.

Soluo A Met-Mb) Soluo B OComprimento de onda utilizado (nm) 409 417

Absorvncia 0,801 0,49

(mM-1.cm-1) 179 128

[protena] M 2,235 10 1,949

Massa molar (g/mol) 16966,99 16964

Volume recolhido (mL) 1,2 2,8

Massa (mg) 0,4550 0,925

Quadro 5 Comparao de diversos parmetros para determinao da massa de protena entre as solu


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Doseamento proteico

Mtodo de Lowry

Mtodo do Biureto

Mtodo de Bradford

Sobrenadante

Soluo A

Soluo B


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Mtodo de Lowry

Tcnica com o objetivo de determinar a concentrao proteica numa d

soluo recorrendo ao reagente Folin Ciocalteau.

Soluo proteica Reagente de FolinCiocalteau

Complexo de cor Azul

Condies alcalinas


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Mtodo do Biureto

Amostra de protenacontendo duas ou mais

ligaes peptdicas.

Reagente de Biureto(Sulfato de Cobre Alcalino)

Complexo prpura

Leitura das Absorvncias a 280nm. Construo de uma reta de calibrao.

Os extratos celulares cmuitos outros composque absorvem a 280nm

.

= 1.55


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Mtodo de Bradford

Resduos de aminocidoscom cadeias lateraisbsicas/aromticas

Corante Coomassie BlueG-250

Colorao Azul


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Mtodo Biureto Lowry B

Exactido Alta Mdia Mais a

Especificidade

Para compostos com

2 ou mais ligaes

peptdicas

Reage com resduos de

tirosina e triptofano.

Suscetvel a agentes

interferentes

Reage c

amin

cade

bsica

Rapidez da Execuo Lenta Mdia

Preciso Preciso Preciso

Quadro Resumo dos Mtodos

Quadro 6 Comparao dos trs mtodos de doseamento proteico.


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Preparao da Curva de Calibrao

Soluo(mL)

Tubos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10BSA(0,35

mg/mL)

0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0 0

Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0,10 0,20 0,30

gua 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,40 0,30 0,20

Reagente C 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

MISTRURAR TODOS OS TUBOS E AGUARDAR 10 MINUTOS.

Reagente D 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

DEIXAR REPOUSAR TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 30 MINU

Volume final 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25


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Preparao da Curva de Calibrao

Tubos AbsorvnciaRegistada

1 0,000

2 0,093

3 0,182

4 0,278

5 0,324

6 0,400

7 0,520

Determinao da concentrao dprotena padro em cada tubo:

[] =[] ()

[] =0,35 0,05

3,25 = 0,0054

Quadro 8 Registo das absorvncias relativasaos tubos para construo da reta de calibrao.


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Curva de Calibrao

Tubos Absorvncia [protena]

(mg/mL)

1 0,000 0,0000

2 0,093 0,0054

3 0,182 0,0108

4 0,278 0,0162

5 0,324 0,0215

6 0,400 0,0269

7 0,520 0,03230

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,

A

bs(750nm)

[protena]/tubo (mg/m

Curva de Calibrao - Mtodo

Quadro 9 Registo das absorvncias econcentraes proteicas determinadas relativasaos tubos para construo da reta de calibrao.

Grfico 1 Reta de Calibrao para o mtodo deLowry.


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Determinao da concentrao proteica

Sobrenadante

Tubos 8

9

10

11

y=mx+b y=Abs e x=[protena]

Abs=m[protena]+b

Com m=15,361 e b=0,0086

Exemplo Tubo 8:

= [] + [] =

[] =,,

, [] =0,031 m

Quadro 10

Rdos tubos com asobrenadante.


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Determinao da concentrao proteica Fatores de D

Inicialmente realizou-se uma diluio de 1:20 pa

espetrofotomtrica e para o doseamento proteico, ento c

determinada pelo mtodo de Lowry multiplica-se o fator de diluio qu

20:

(1) = []

[] = (1) 20 0,031 (1) = 0,6


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Determinao da concentrao proteica Fatores de D

Quando adicionada a amostra aos tubos de ensaio a analisar,

nova diluio devido presena do reagente C, do reagente D e da

necessrio determinar o fator de diluio:

=

=,

,= 0,030769

(2) = 0,6138

,= 19,95 /

Volume de amostra =Volume total do tubo


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Registo das concentraes proteicas - Sobrenadante

O mesmo procedimento foi aplicado a todos os restante

sobrenadante, da soluo A e da Soluo B.

Tubos Absorvncia 1 Fator diluio 2 Fator diluio [pr

8 0,480 1/20 0,0308

9 0,789 1/20 0,0615

10 1,025 1/20 0,0923

11 1,231 1/20 0,1231

Quadro 11 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativasao sobrenadante.


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Registo das concentraes proteicas Soluo A

Tubos Absorvncia 1 Fator de Diluio 2 Fator de Diluio [prote

8 0,566 1:5 0,0308 5,

9 0,940 1:5 0,0615 4,

10 0,186 1:5 0,0923 0,

11 1,425 1:5 0,1231 3,

Quadro 12 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativas soluo A.


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Tubos Absorvncia 1 Fator de Diluio 2 Fator de Diluio [prote

8 0,439 1:5 0,0308 4

9 0,657 1:5 0,0615 3

10 0,882 1:5 0,0923 3

11 1,075 1:5 0,1231 2

Registo das concentraes proteicas Soluo B

Quadro 13 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativas soluo B.


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[Protena]

mg mL-1

[Met-Mb]

mg mL-1

[Oxi-Mb]

mg mL-1

Mprotena

(mg)

(%) Gra

Purif

Sobrenadante 19,95 - - 19,95 100

Soluo A 5,897 0,3792 - 7,0764 35,47 0,

Soluo B 4,552 - 0,3306 12,7456 63,88 0,0

Quadro de purificao

=

100

o =

Quadro 14

Quadro de pu


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http://www.uniprot.org/uniprot/P02192 consultado a 21/03/2014 14h19 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1 consultado a 21/03/2014 14h34 http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html consultad

15h20

Bibliografia
http://www.uniprot.org/uniprot/P02192http://www.uniprot.org/uniprot/P02192http://www.uniprot.org/uniprot/P02192http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html%20consultado%20a%2022/03/2014http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1http://www.uniprot.org/uniprot/P02192

extração e caracterização espetroscópica da mioglobina da carne

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