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FERNANDA CUSTÓDIO DE MORAES
“QUANTIFICAÇÃO DE DAPACONAZOL EM PLASMA HUMANO
UTILIZANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM:
APLICAÇÃO A UM ESTUDO FASE I”
CAMPINAS
2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FERNANDA CUSTÓDIO DE MORAES
“QUANTIFICAÇÃO DE DAPACONAZOL EM PLASMA HUMANO
UTILIZANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM:
APLICAÇÃO A UM ESTUDO FASE I”
Orientador: Prof. Dr. GILBERTO DE NUCCI
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas para
obtenção de título de Mestra em Farmacologia.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA FERNANDA
CUSTÓDIO DE MORAES E ORIENTADA PELO PROF. DR.
GILBERTO DE NUCCI.
Assinatura do Orientador --------------------------------------------
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho com todo amor e carinho:
“A Deus e aos meus pais, Rosana e Cláudio, pelo incentivo, compreensão
e apoio que me dão todos os dias”.
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AGRADECIMENTOS
Ao professor Dr. Gilberto De Nucci, pela oportunidade de aprimorar minha
formação profissional e ensinamentos ao longo do mestrado.
Aos meus familiares por todo apoio, incentivo e conselhos durante todos os
momentos em que precisei.
Ao meu namorado, William Pye, pelo incentivo durante o mestrado e compreensão
durante os momentos de distância e ausência.
Aos amigos de laboratório, Lu Chen, Mauro Sucupira, André Arruda, Samara
Bittencourt, Caroline Honaiser, Hugo do Valle, Antônio Sérgio, Adriano, Tainah
Babadópulos, André Borges, Danielle dos Santos, Marly e Milton. Também aos amigos
Thiago Gagliano, Marinalva Sampaio e Gustavo Mendes. Agradeço a todos pelo
conhecimento e por todo companheirismo compartilhados no dia-a-dia de trabalho.
Aos Professores e aos funcionários do Departamento de Farmacologia pela atenção
dispensada durante a inserção no programa e durante o cumprimento dos créditos e pelo
trabalho excelente e dedicado que realizam.
Aos amigos do departamento da farmacologia, especialmente Julio Rojas, Renata
Lopes e Tuany Candido, pelos momentos de descontração e amizade no decorrer de minha
estada em Campinas.
A CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.
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EPÍGRAFE
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.”
Albert Einstein
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RESUMO
Um método simples, seletivo e sensível de cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada à espectrometria de massa em tandem (CLAE-EM/EM) foi desenvolvido para a
determinação de dapaconazol (BL-125) em plasma humano usando tioconazol como padrão
interno. As drogas foram extraídas a partir do plasma por uma extração líquido-líquido com
éter/hexano (80/20, v/v). A cromatografia foi realizada em uma coluna analítica Genesis
C18 partícula 4 μm (100x2.1mm i.d) com uma fase móvel de metanol/acetonitrila/água
(80/10/10,v/v/v) e acetato de amônia (0.5 mM). O dapaconazol foi quantificado usando um
espectrômetro de massa com uma fonte de electrospray no modo positivo (ES+)
configurado para o modo de monitoramento de múltiplas reações (MRM) para monitorar as
transições 415.1 > 159.2 e 387.0 > 131.0 para o dapaconazol e tioconazol, respectivamente.
O método teve tempo total de corrida de 3.8 min e uma curva de calibração linear no
intervalo de 0.2-100 ng/mL (r = 0.9998). O limite inferior de quantificação (LIQ) foi de 0.2
ng/mL. Os valores de precisão e exatidão do ensaio estavam dentro de ± 10%. Os testes de
estabilidade não indicaram nenhuma degradação significativa em condições do
experimento. Este método foi usado posteriormente para um estudo de fase I de
administração tópica de tosilato de dapaconazol em voluntários humanos saudáveis do sexo
masculino.
Palavras chave: antifúngicos, voluntários saudáveis, espectrometria de massas, sangue
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ABSTRACT
A simple, selective and sensitive method based on high-performance liquid
chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) has been
developed for the determination of dapaconazole (BL-125) in human plasma using
tioconazole as internal standard. The drugs were extracted from plasma by liquid-liquid
extraction with ether/hexane (80/20, v/v). The chromatography separation was performed
on a Genesis C18 analytical column 4 μm (100 x 2.1 mm i.d.) with a mobile phase of
methanol/acetonitrile/water (80/10/10, v/v/v) and ammonium acetate (0.5 mM).
Dapaconazole was quantified using a mass spectrometer with an electrospray source in the
ESI positive mode (ES+) configured for multiple reaction monitoring (MRM) to monitor
the transitions 415.1 > 159.2 and 387.0 > 131.0 for dapaconazole and tioconazole,
respectively. The method had a chromatography run time of 3.8 min and a linear calibration
curve over the range 0.2 – 100 ng/mL (r = 0.9998). The lower limit of quantification
(LLOQ) was 0.2 ng/mL. The precision and accuracy values of the assay were within ±10%.
The stability tests indicate no significant degradation under conditions of experiment. This
method was used for a phase I study of topical administration of dapaconazole tosylate in
healthy human male volunteers.
Key words: antifungals, healthy volunteers, mass spectrometry, blood
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Suscetibilidade de fungos dermatófitos frente ao dapaconazol com base nas
CIMs (µg/mL) (concentração inibitória mínima) ................................................................. 33
Tabela 2: Espécies dominantes de dermatófitos de acordo com a localização clínica ........ 44
Tabela 3: Instrumentos ....................................................................................................... 64
Tabela 4: Equipamentos ..................................................................................................... 64
Tabela 5: Padrões analíticos ............................................................................................... 65
Tabela 6: Reagentes ............................................................................................................ 65
Tabela 7: Amostras biológicas (plasma) utilizadas para testar a seletividade do
método.................................................................................................................................. 65
Tabela 8: Preparo da curva de calibração ............................................................................ 76
Tabela 9: Preparo dos controles de qualidade e LIQ ........................................................... 77
Tabela 10: Condições cromatográficas ............................................................................... 78
Tabela 11: Condições de ionização ..................................................................................... 79
Tabela 12: Lista de validação .............................................................................................. 81
Tabela 13: Testes de estabilidade ....................................................................................... 87
Tabela 14: Precisão e exatidão intra e inter corrida para as amostras controle de qualidade
e para o limite inferior de quantificação............................................................................. .. 95
Tabela 15: Efeito matriz no método de CLAE-EM/EM para a quantificação de
dapaconazol em plasma humano. ........................................................................................ 95
Tabela 16: Testes de estabilidade para o dapaconazol. ...................................................... 96
Tabela 17: Formulação antifúngica na forma de Creme ................................................... 137
Tabela 18: Concentração plasmática individual e parâmetros farmacocinéticos .............. 139
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Evolução dos antifúngicos .................................................................................. 31
Figura 2: Estruturas moleculares do miconazol (I) e dapaconazol (II) .............................. 32
Figura 3: Mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos ................................................... 46
Figura 4: Componentes de um cromatógrafo líquido ......................................................... 48
Figura 5: Representação esquemática de um espectrômetro de massa .............................. 50
Figura 6: Dois mecanismos propostos para a formação de íons gasosos no processo de
ionização por electrospray. (CRM = charge residual model; IEM = ion evaporation
model). ................................................................................................................................. 53
Figura 7: Esquema da espectrometria de massa em tandem ............................................... 57
Figura 8: Representação esquemática do aparato do teste de supressão iônica .................. 80
Figura 9: Espectro de massa para o dapaconazol (A) e o tioconazol (B) utilizando o modo
de ionização positivo. As linhas pontilhadas indicam o ponto de fragmentação.................. 90
Figura 10: Via de fragmentação proposta para o dapaconazol (A) e tioconazol (B) .......... 91
Figura 11: Experimento de supressão iônica mostrando a linha de base após a injeção de
um plasma branco extraído. As setas indicam os tempos de retenção esperados para o
analito (A) e o padrão interno (B). As drogas foram infundidas a uma taxa de 50µL/min na
concentração de 10ng/mL ..................................................................................................... 92
Figura 12: Cromatogramas de plasma branco e amostras processadas LIQ ...................... 93
Figura 13: Gráfico representativo da curva de calibração para o dapaconazol ................... 94
Figura 14: Gráfico da concentração vs. tempo do dapaconazol ......................................... 97
Figura 15: Estrutura química do tosilato de dapaconazol ................................................ 137
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BL 123 Tosilato de dapaconazol
BPC Boas práticas clínicas
CE Energia de colisão
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CI Chemical ionization
CID Collision induced dissociation
CIM Concentração inibitória mínima
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
C max Concentração plasmática máxima
CNS Conselho Nacional de Saúde
C último Última concentração quantificável
CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
CQ Controle de qualidade
CQA Controle de qualidade de alta concentração
CQB Controle de qualidade de baixa concentração
CQD Controle de qualidade diluído
CQM Controle de qualidade de média concentração
CRM Charge residual model
CV Coeficiente de variação
CXP Potencial de saída da célula
Da Dalton
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DP Desvio padrão
DP Potencial de declustering
DPR Desvio padrão relativo
EPR Erro padrão relativo
eV Elétron volts
E Setor eletrostático
ECG Eletrocardiograma
EI Electron ionization
EM Espectrometria de massa
ES Electrospray
ESI Electrospray ionization
EUA Estados Unidos da América
FDA Food and drug administration
FDC Federal food, drug and cosmetic act
FMN Fator de matriz normalizado
FT Fourier transform
GEPEC Gerência de Medicamentos Novos, Pesquisa e Ensaios Clínicos
HIV Human immunodeficiency virus
HPLC High performance liquid chromatography
ICR Ion cyclotron resonance
ICH International Conference on Harmonization
ID Internal diameter
IND Investigational new drug
IMC Índice de massa corpórea
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IEM Ion evaporation model
LIQ Limite inferior de quantificação
LSQ Limite superior de quantificação
M Setor magnético
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
mg Miligrama
min Minuto
mL Mililitro
mm Milímetro
MRM Monitoramento de reações múltiplas
MS Mass spectrometry
MS/MS Tandem mass spectrometry
m/z Relação massa/carga
ng/mL Nanograma por mililitro
˚ C Grau centígrado
P&D Pesquisa e desenvolvimento
PI Padrão interno
Q Quadrupolo
R Coeficiente de correlação linear
RDC Resolução da diretoria colegiada
RF Radiofrequência
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TCO Teste de carry-over
TCT Teste de cross-talk
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Tmax Tempo no qual ocorreu o Tmax
TOF Time of flight
TSS Test suitability system
T último Tempo no qual ocorreu o C último
UFC Unidades formadoras de colônia
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
USP United States Pharmacopeia
V Volts
v/v Volume por volume
Vs Versus
µg/mL Micrograma por mililitro
µl Microlitro
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SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................. xii
ABSTRACT ........................................................................................................................ xv
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... xvii
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...................................................................... xxi
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 29
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 35
2.1 Indústria farmacêutica e P&D ..................................................................................... 36
2.2 Regulamentação dos estudos clínicos no Brasil ......................................................... 40
2.3 Dermatomicoses .......................................................................................................... 42
2.4 Antifúngicos azólicos .................................................................................................. 45
2.5 Cromatografia líquida de alta eficiência ..................................................................... 47
2.6 Espectrometria de massa ............................................................................................. 49
2.6.1 Descrição básica do sistema ................................................................................. 51
2.6.1.1 Fontes de ionização ........................................................................................ 51
2.6.1.2 Analisadores de massa ................................................................................... 54
2.6.1.3 Espectrometria de massa em tandem (EM/EM)............................................. 56
2.6.1.4 Detectores ....................................................................................................... 58
3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 59
3.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 61
3.2 Objetivos específicos .................................................................................................. 61
4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 63
4.1 Materiais ..................................................................................................................... 64
4.1.1 Etapa clínica ......................................................................................................... 64
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4.1.2 Etapa analítica ...................................................................................................... 64
4.2 Métodos ....................................................................................................................... 66
4.2.1 Etapa clínica ......................................................................................................... 66
4.2.1.1 Recrutamento dos sujeitos de pesquisa .......................................................... 66
4.2.1.2 Critérios de inclusão dos sujeitos de pesquisa ............................................... 67
4.2.1.3 Critérios de exclusão dos sujeitos de pesquisa ............................................... 67
4.2.1.4 Descrição do estudo ....................................................................................... 69
4.2.1.5 Condução do estudo ....................................................................................... 70
4.2.1.6 Pós-estudo ...................................................................................................... 72
4.2.1.7 Processamento e armazenamento das amostras ............................................. 73
4.2.1.8 Procedimento durante o estudo ...................................................................... 73
4.2.1.9 Procedimento pós-estudo ............................................................................... 73
4.2.2 Etapa analítica ........................................................................................................ 74
4.2.2.1 Desenvolvimento do método analítico ........................................................... 74
4.2.2.2 Preparo de soluções ........................................................................................ 74
4.2.2.3 Soluções padrões de estoque .......................................................................... 74
4.2.2.4 Soluções de trabalho ...................................................................................... 75
4.2.2.5 Fase móvel: MeOH/ACN/H2O (80/10/10; v/v/v) e acetato de amônio (0.5
mM) ............................................................................................................................... 75
4.2.2.6 Solução de ressuspensão: Acetonitrila/Água (50/50; v/v) ............................ 75
4.2.2.7 Preparo da curva de calibração ...................................................................... 75
4.2.2.8 Preparo dos controles de qualidade ................................................................ 76
4.2.2.9 Preparo da corrida analítica ............................................................................ 77
4.2.2.9.1 Procedimento de extração ........................................................................ 77
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4.2.2.9.2 Condições cromatográficas ........................................................................... 78
4.2.2.9.3 Condições de ionização ............................................................................. 79
4.2.2.9.4 Supressão iônica ........................................................................................ 79
4.2.2.10 Validação da metodologia analítica ............................................................. 80
4.2.2.10.1 Teste de carry-over ................................................................................. 82
4.2.2.10.2 Teste de cross-talk .................................................................................. 82
4.2.2.10.3 Seletividade ............................................................................................ 82
4.2.2.10.4 Linearidade ............................................................................................. 83
4.2.2.10.5 Precisão e exatidão ................................................................................. 84
4.2.2.10.6 Recuperação ............................................................................................ 85
4.2.2.10.7 Efeito matriz ............................................................................................ 86
4.2.2.10.8 Testes de estabilidade .............................................................................. 86
5. RESULTADOS ............................................................................................................... 89
5.1 Análise por CLAE-EM/EM ........................................................................................ 90
5.2 Rota de fragmentação ................................................................................................. 91
5.3 Supressão iônica .......................................................................................................... 92
5.4 Validação da metodologia analítica ............................................................................ 92
5.4.1 Teste de carry-over .............................................................................................. 92
5.4.2 Teste de cross-talk ............................................................................................... 92
5.4.3 Seletividade .......................................................................................................... 93
5.4.4 Linearidade ........................................................................................................... 94
5.4.5 Precisão e exatidão ............................................................................................... 94
5.4.6 Recuperação e efeito matriz ................................................................................. 95
5.4.7 Testes de estabilidade ........................................................................................... 96
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5.5 Determinação de dapaconazol nas amostras dos voluntários ..................................... 96
5.6 Dados farmacocinéticos .............................................................................................. 97
6. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 99
7. CONCLUSÃO ............................................................................................................... 107
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 111
9. ANEXOS ....................................................................................................................... 119
Anexo I ........................................................................................................................... 120
Anexo II .......................................................................................................................... 126
Anexo III ......................................................................................................................... 137
Anexo IV ......................................................................................................................... 138
Anexo V ......................................................................................................................... 139
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1. INTRODUÇÃO
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Os antifúngicos azólicos são os medicamentos mais utilizados na prática clínica
para o tratamento tópico das dermatofitoses, infecções superficiais causadas por fungos. As
micoses superficiais são a mais frequente forma de infecção humana afetando de 20-25%
da população mundial e sua incidência está constantemente aumentando (Havlickova et al.,
2008).
Embora o primeiro agente antifúngico, a griseofulvina, tenha sido isolada em 1939,
os primeiros antifúngicos azólicos e polienos são datados de 1944 e 1949, respectivamente.
Apenas em 1958 uma formulação oral de griseofulvina se tornou disponível para uso
clínico. Anos mais tarde, em 1960, foi lançada a anfotericina B, considerada um padrão
ouro para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas severas. Em 1969, dois azólicos de
uso tópico, miconazol e clotrimazol, foram introduzidos no mercado. Isto foi seguido da
introdução em 1974 do antifúngico tópico econazol e em 1979 de uma formulação
parenteral de miconazol. Atualmente, estes três agentes azólicos - miconazol, clotrimazol e
econazol - ainda permanecem como os principais antifúngicos de uso tópico para o
tratamento de dermatofitoses (figura 1) (Seehan, 1999).
Os azólicos de uso tópico são úteis para o tratamento de dermatofitoses como tinea
do corpo, tinea do pé e tinea inguinal. O clotrimazol e o miconazol com frequência também
são utilizados para o tratamento de candidíase vulvovaginal. A absorção destes agentes é
insignificante e os efeitos adversos associados a eles são raros (Katzung,2010).
30
31
Figura 1: Evolução dos antifúngicos (Seehan, 1999).
Até o ano 1990, a resistência aos antifúngicos azólicos era incomum. Entretanto, por
serem os agentes antifúngicos mais utilizados na prática clínica, a resistência a estes
agentes vem aumentando e tem se tornado um problema no tratamento de infecções
fúngicas, tanto as invasivas quanto as superficiais (Maertens, 2004; White et al., 1998).
Este aumento na resistência leva a uma necessidade de se investir na pesquisa e
desenvolvimento de novos agentes. Entretanto, o progesso nessa área ainda é lento se
comparado aos antimicrobianos e esse problema é ilustrado pela escassez de novas classes
32
de compostos ao longo dos últimos 20 anos. O agente antifúngico ideal do futuro deve ter
um largo espectro de atividade anifúngica e uma baixa toxicidade. Pesquisas por um alvo
que seja essencial para a célula antifúngica, mas não para as células humanas são
necessárias a fim de evitar problemas de toxicidade (Carrilo-muñoz, 2006).
O composto dapaconazol, nome químico 1-(2-2,4-diclorofenil)-2-(4-(trifluorometil)
benzoxietil)-1H-imidazol, é um novo derivado imidazólico com potencial terapêutico para
o tratamento de infecções fúngicas. Ele apresenta importante semelhança estrutural com o
miconazol, correspondendo a uma inovação semi-radical, ou seja, a criação de um
composto a partir de moléculas já existentes.
Figura 2: Estruturas moleculares do miconazol (I) e dapaconazol (II).
Comparando-se as estruturas químicas do miconazol (I) e dapaconazol (II) na figura
2, observa-se a presença de dois anéis benzênicos e um anel imidazólico, além da função
éter. O anel imidazólico 3 presente nas duas estruturas químicas comparadas não possui
substituintes e os anéis benzênicos 1 e 2 possuem substituições: um dos anéis possui duas
substituições com cloro, nas posições 2 e 4 (comum nas duas estruturas químicas
33
comparadas) enquanto que o outro anel benzênico possui substituições diferentes em cada
estrutura comparada. No dapaconazol, o anel benzênico 1 possui apenas uma substituição
(com o grupo CF3). Já no miconazol, o anel benzênico 1 possui duas substituições com
cloro, nas posições 2 e 4 (igual ao outro anel benzênico presente na estrutura).
A atividade antifúngica da invenção foi mensurada por meio da análise in vitro da
concentração inibitória mínima (CIM) do dapaconazol em diversas cepas de fungos
filamentosos provenientes de isolados clínicos e laboratoriais. No presente experimento a
concentração inibitória mínima foi considerada como sendo a menor concentração do
agente capaz de inibir pelo menos 80% do crescimento das unidades formadoras de
colônias (UFCs).
Tabela 1: Suscetibilidade de fungos dermatófitos frente ao dapaconazol com base nas CIMs
(µg/mL) (concentração inibitória mínima).
Espécies fúngicas Miconazol Dapaconazol
Trichophyton rubrum 0.06 0.06
Trichophyton mentagrophyttes 0.125 0.25
Trichophyton tonsurans 0.5 0.5
Microsporum gypseum 0.25 0.25
Epidermophyton floccosum 0.06 0.06
O efeito inibitório do dapaconazol foi confirmado com base nos resultados obtidos
nos experimentos demostrando que o dapaconazol possui interessante atividade antifúngica
em Trichophyton, Microsporum gypseum e Epidermophyton podendo ser útil ao tratamento
de dermatomicoses.
34
O composto dapaconazol passou por estudo fase I de pesquisa clínica em indivíduos
saudáveis do sexo masculino para avaliação de segurança e tolerabilidade do uso tópico de
doses crescentes do produto, além da avaliação farmacocinética. Atualmente o composto
se encontra em fase II de pesquisa clínica, e será testado em pacientes de ambos os sexos,
na formulação comercial proposta de 2% por um período de 2 semanas para avaliação da
não inferioridade do tratamento quando comparados a outros imidazólicos de estruturas
similares.
35
2. REVISÃO BLIBIOGRÁFICA
36
2.1 Indústria farmacêutica e P&D
Desde a antiguidade a procura por tratamentos que aliviem ou curem doenças que
acometem a população tem sido uma grande preocupação para diversas civilizações. No
começo do século XIX, a maioria dos remédios utilizados era de origem natural com
estrutura química e natureza desconhecida, e os tratamentos eram baseados apenas no
conhecimento empírico (Laporte et al., 1989).
A pesquisa e o desenvolvimento (P&D) de medicamentos são essenciais para o
tratamento e cura de doenças que acometem a população. Esse setor tem uma grande
importância dentro das indústrias farmacêuticas nos dias atuais e teve um grande impulso
por volta dos anos 1940 durante a Segunda Guerra Mundial, especialmente no período pós-
guerra, diante das crescentes demandas do mercado que surgiram, havendo um aumento na
pesquisa e desenvolvimento de substâncias potentes (Paulo & Amaral, 2006).
Dentre a descoberta de alguns medicamentos que marcaram a história da
humanidade podemos citar a descoberta da sulfanilamida, sintetizada pela primeira vez em
1908 por Paul Gelmo, e mais tarde, em 1928, a descoberta da penicilina por Alexander
Fleming. Com as conquistas tecnológicas e econômicas, a produção em larga escala da
penicilina pela Pfizer foi uma das maiores contribuições da indústria farmacêutica durante a
Segunda Guerra Mundial e evitou a morte de milhares de pessoas (Calixto & Siqueira
Júnior, 2008).
O período compreendido entre 1950 e 1960 ficou conhecido como “explosão
farmacológica” devido aos avanços na área das ciências biológicas possibilitando um
melhor conhecimento sobre os mecanismos que levam às doenças e a produção de novas
terapias farmacológicas com a introdução de medicamentos revolucionários que
37
possibilitaram à população o tratamento de doenças que antes não tinham cura, sobretudo
no que diz respeito às doenças infecciosas (Laporte et al., 1989).
Entretanto, alguns incidentes desastrosos marcaram tristemente a história do
desenvolvimento de fármacos e acabaram desacelerando o lançamento de novos
medicamentos. Nos Estados Unidos, um acidente envolvendo o xarope de sulfanilamida
resultou na morte por envenenamento de 107 pessoas em decorrência de insuficiência renal
devido ao excipiente nefrotóxico dietilenoglicol. A partir do ocorrido, verificou-se a
importância da necessidade da utilização de voluntários para a realização de estudos
clínicos. Em 1938, o congresso americano aprovou o Federal Food, Drug and Cosmetic
(FDC) Act que declarava que todo fabricante deveria provar ao FDA, agência responsável
pela vigilância sanitária do país, a segurança de um medicamento antes de sua aprovação
para a comercialização (Paulo & Amaral, 2006; Calixto & Siqueira Júnior, 2008).
Anos mais tarde, ocorreu em vários países o trágico episódio envolvendo a
talidomida que foi associada a um aumento no número de fetos com más formações
(focomegalia). Este ocorrido levou o FDA a estabelecer em 1962, que os fabricantes
deveriam provar não apenas a eficácia de um medicamento, mas especialmente a sua
segurança antes de seu uso clínico. Vários outros países, além dos Estados Unidos foram
sensibilizados com o ocorrido e, a partir de então, o controle sobre os medicamentos antes
de sua aprovação e mesmo após o uso clínico passou a ser mais rigoroso, estabelecendo que
os novos produtos só devam ser aprovados após a realização de estudos randomizados de
qualidade e com poder estatístico adequado (Paulo & Amaral, 2006; Calixto & Siqueira
Júnior, 2008).
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Atualmente, o processo de P&D inclui diversos ensaios controlados que tem por
finalidade avaliar a segurança e eficácia de um novo fármaco antes de ser aprovada a sua
comercialização. Segundo TAVARES (1991:42) o desenvolvimento de novos produtos se
inicia normalmente pela síntese química de uma nova substância ou pela extração de
princípios ativos de fontes naturais. Uma vez descoberto um novo princípio ativo, este
deverá ser avaliado quanto a sua ação terapêutica para o tratamento de doenças e suas
características farmacológicas. Em uma primeira etapa, devem ser realizados os testes pré-
clínicos que incluem os testes in vitro e in vivo em animais de estudo para avaliação das
propriedades biológicas das moléculas, propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas.
Após estes testes iniciais, pode-se dar início aos estudos clínicos em voluntários humanos
(Lombardino & Lowe, 2004).
Normalmente, o FDA exige antes de iniciar os estudos clínicos um pedido de
investigação da nova droga, em inglês, investigational new drug (IND). Ele inclui
informações sobre o desenho do estudo clínico proposto, os dados obtidos dos testes em
animais, e as qualificações do investigador principal. A menos que haja proibição, os
estudos clínicos podem ser iniciados (Thau, 2012).
Os estudos clínicos em humanos são divididos tradicionalmente em quatro fases
sucessivas que visam determinar a segurança e efetividade da droga antes de sua
comercialização. Na fase I, o medicamento é testado em humanos pela primeira vez em um
pequeno número de voluntários sadios (cerca de 20 a 100 indivíduos). O principal objetivo
dos estudos fase I é testar se a droga é segura em humanos e estabelecer sua dosagem.
Também são observadas as características farmacocinéticas da droga tais como absorção,
distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade do composto (DiMasi et al., 2003).
39
Na fase II, são recrutados cerca de 100 a 300 indivíduos que têm a doença ou
condição para a qual o composto está sendo estudado e tem por finalidade obter mais dados
de segurança e dados preliminares acerca da eficácia (DiMasi et al., 2003). Um importante
objetivo desta fase é a determinação das doses e do regime terapêutico que serão estudados
posteriormente na fase III (ICH, 1997).
Os testes fase III constituem estudos multicêntricos, que envolvem entre 5 e 10 mil
pacientes, com a finalidade de gerar dados estatísticos com poder significante sobre
segurança, eficácia, relação risco-benefício e interação de drogas. Também são durante os
testes fase III que se obtêm informações necessárias para a elaboração do rótulo e da bula
do medicamento (DiMasi et al., 2003).
Por fim, os estudos fase IV, também denominados farmacovigilância ou vigilância
pós-comercialização, correspondem aos estudos que proporcionam a avaliação do uso de
um medicamento em grandes populações sem o controle experimental dos ensaios clínicos,
correspondendo a um feedback do uso em grande escala do fármaco (Sevalho, 2001). Estes
estudos começam após a aprovação do registro do medicamento e visam obter informações
adicionais sobre interação medicamentosa, dose-resposta e segurança. Também incluem
estudos para comprovar a indicação aprovada como, por exemplo, os estudos de
morbidade/mortalidade e estudos epidemiológicos (ICH, 1997).
A introdução de novos fármacos é um processo longo e complicado que envolve
gastos vultosos na área de P&D. É um processo que leva em média de 10 a 15 anos e o
gasto estimado com a pesquisa e o desenvolvimento de cada droga que tem sucesso e
consegue seu registro para ser comercializada no mercado é em torno de 800 milhões a um
40
bilhão de dólares. De cada 30.000 moléculas sintetizadas, 20.000 (66.7%) entram na fase de
estudos pré-clínicos, 200 (0.67%) entram na fase I de estudos clínicos, 40 (0.13%) passam
para a fase II, 12 (0.04%) entram na fase III e somente 9 (0.027%) são aprovados pelos
órgãos regulatórios. Vale ressaltar ainda que dos medicamentos que recebem aprovação
apenas 1 medicamento (0.003%) satisfaz o mercado, e em função disso, traz retorno para a
indústria que o desenvolveu (Calixto & Siqueira Júnior, 2008; FDA, 2002).
As etapas de síntese química, testes pré-clínicos e as fases iniciais da pesquisa
clínica (fase I e fase II) geralmente são realizadas em países desenvolvidos que se localizam
em grande parte em centros do eixo EUA, Japão e países da Europa enquanto as fases
tardias (fase III) são realizadas em países com menor capacidade tecnológica e poucos
investimentos em pesquisa. Sendo assim, observa-se que o desenvolvimento de estudos
clínicos está diretamente relacionado à capacidade de um país de produzir e desenvolver
novos medicamentos, e é um bom indicador do grau de seu desenvolvimento (Dias et al,
2013; Paulo & Amaral, 2006).
No Brasil, segundo dados da ANVISA, cerca de 60% das atividades de pesquisa
clínica estão concentradas na fase III e 80% dos estudos para desenvolvimento de novos
medicamentos são conduzidos por empresas multinacionais. Destes, apenas um total de 4%
é dedicado a pesquisas clínicas fase I, aquela em que um novo medicamento é testado pela
primeira vez em humanos (ANVISA, 2011).
2.2 Regulamentação dos estudos clínicos no Brasil
A regulamentação dos estudos clínicos e o registro de novos medicamentos variam
de acordo com o país onde a pesquisa está sendo conduzida. No Brasil, a pesquisa clínica
41
foi regulamentada a partir de 1996, por meio da resolução n˚196 do Conselho Nacional de
Saúde (CNS) e é embasada em três instâncias: os Comitês de Ética em Pesquisa (CEP), a
Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) e a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) (Dias et al., 2013).
A realização de ensaios clínicos com medicamentos no Brasil requer aprovação
prévia pelos Comitês de Ética em Pesquisa (CEPs) e, em certos casos, pela Comissão
Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), além da aprovação pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), através de sua Gerência de Medicamentos Novos, Pesquisa
e Ensaios Clínicos (GEPEC) necessários para ensaios clínicos com medicamentos e
produtos para a saúde (correlatos) que são fabricados em outros países e, portanto,
necessitam autorização para serem importados (Nishioka & Sá, 2006).
As legislações que tratam da proteção e direitos do sujeito de pesquisa são:
Documento das Américas de Boas Práticas Clínicas, Resolução 196/1996 do Conselho
Nacional de Saúde e Resolução RDC 39/2008 da ANVISA. Os estudos envolvendo seres
humanos no Brasil devem seguir essas legislações e assegurar o cumprimento das Boas
Práticas Clínicas (ANVISA, 2014).
Quanto ao registro de novos medicamentos no país a principal regulamentação é a
RDC 136/ 2003 que se aplica a todos os medicamentos novos ou inovadores. Uma vez
registrado, o medicamento pode ser comercializado por cinco anos, após o qual o registro
do medicamento deve ser revalidado por períodos iguais e sucessivos mediante uma
solicitação do detentor do registro e aprovação por parte da ANVISA (Brasil, 2003).
42
2.3 Dermatomicoses
O uso terapêutico de agentes antifúngicos, por muitos anos não recebeu a mesma
atenção despendida aos fármacos antimicrobianos devido à baixa incidência e morbi-
mortalidade relacionada a esse tipo de infecções. Entretanto, nas últimas décadas, a taxa de
incidência e a gravidade de diferentes tipos de micoses têm aumentado de forma
surpreendente e se tornou um problema de saúde pública importante, especialmente em
pacientes portadores de HIV, doenças hematológicas, pacientes transplantados e outros
indivíduos imunocomprometidos (Carrilo-Muñoz, 2006; Klepser & Lewis, 2002).
As micoses superficiais que incluem as infecções fúngicas superficiais de pele,
cabelo e unha são as infecções mais comuns e vem aumentado no mundo inteiro e estima-
se que cerca de 40 milhões de pessoas já sofreu de infecções fúngicas tanto em países em
desenvolvimento como em países desenvolvidos (Ameen, 2010).
Dentre as infecções fúngicas superficiais mais difundidas entre os seres humanos
estão as dermatomicoses que representam uma causa importante de morbidade, tendo
distribuição universal com maior afinidade para nações tropicais e subtropicais. As
dermatomicoses de ocorrência mais comum são as dermatofitoses ou tinea, resultantes do
acometimento de fungos aos tecidos queratinizados da epiderme, pelos e unhas (Gupta et
al., 1998).
Existem aproximadamente 40 espécies diferentes de dermatófitos, caracterizados
em sua capacidade de digerir a queratina e eles são divididos em três gêneros:
Trichophyton, com 22 espécies; Microsporum, com 16 espécies; e Epidermopyton, com 2
espécies. A maioria das infecções superficiais de pele, são causadas por 5 ou 6 espécies de
43
dermatófitos, das quais Trichophyton rubrum é a mais comum (Gupta et al., 1998; Aly,
1994). Menos frequentemente, as infecções de pele podem ser causadas por fungos não
dermatófitos (exemplo: Malassezia furfur em pitiriasis vesicolor e espécies de Candida)
(Hainer, 2003).
As espécies predominantes de dermatófitos bem como as manifestações clínicas
variam de acordo com a localização anatômica, e apesar de raramente apresentarem algum
risco para a vida dos pacientes, elas podem acarretar efeitos debilitantes que comprometem
sua qualidade de vida. A conduta terapêutica a seguir é frequentemente um problema aos
dermatologistas e testes de suscetibilidade antifúngica in vitro são agora padronizados
internacionalmente e tem se tornados essenciais no manejo de pacientes e no controle da
resistência. A identidade do fungo em questão pode fornecer orientações sobre a adequação
de um determinado antifúngico (Cuenca-Estrella et al.,2010; Gupta et al., 1998; Pfaller et
al., 2010).
Os sintomas das infecções fúngicas superficiais variam de leve a grave e incluem
comumente eritema, descamação e prurido. Nos casos mais graves, maceração, vesículas e
rachaduras podem estar presentes, acompanhados por invasão bacteriana secundária. A
denominação clínica das dermatofitoses consiste em utilizar o termo tinea seguida do sítio
anatômico envolvido (tabela 2) (Gupta et al., 1998; Rotta et al., 2012).
O diagnóstico das dermatomicoses é uma combinação de dados clínicos e
laboratoriais e pode ser feito com base no histórico epidemiológico, exame físico,
microscopia de hidróxido de potássio (KOH) e cultura de células. A maioria das infecções é
efetivamente tratada com as formulações tópicas de antifúngicos, sendo necessário o uso da
44
terapia oral apenas em casos mais complicados ou casos de tinea captis, tinea barbae e
onicomicoses nas quais o tratamento de primeira linha consiste no uso de antifúngico oral
(Hainer, 2003). Os tratamentos tópicos têm vantagens sobre os tratamentos sistêmicos uma
vez que possuem menos efeitos adversos, melhora a adesão do paciente e o menor custo
global do tratamento (Millikan, 2010).
Tabela 2: Espécies dominantes de dermatófitos de acordo com a localização clínica. Adaptado de
Havlickova et al., 2008.
Condição Espécie dominante
Tinea captis
(cabelo)
Trichophyton violaceum
T. tonsurans
T. soudanense
Microsporum canis
M. audouinii
Tinea pedis
(pé)
T. rubrum
T. mentagrophytes(var. interdigitale)
Epidermophyton floccosum
Tinea cruri (virilha)
T. rubrum
T. mentagrophytes(var. interdigitale)
Tinea corporis
(pernas, braços e tronco)
T. rubrum
M. canis
Tinea unguium
(unhas)
T. rubrum
T. mentagrophytes(var. interdigitale)
45
Existem poucos novos medicamentos diponíveis para o tratamento das
dermatofitoses. As duas principais categorias de fármacos com um amplo espectro de ação
para o tratamento das micoses superficiais são os azólicos e as alilaminas/benzilaminas, que
foram testados e aprovados ao longo de mais de duas décadas de uso e exibem um bom
perfil de segurança. A maioria dos agentes pertence à família dos antifúngicos azólicos
(clotrimazol, miconazol, econazol, oxiconazol, tioconazol). A terbinafina e naftifina são
dois representantes do grupo das alilaminas (Gupta & Cooper, 2008; Millikan, 2010).
Resultados de estudos de dermatofitoses em modelos animais e ensaios clínicos
mostraram uma eficácia superior das alilaminas/benzilaminas quando comparados aos azóis
para o tratamento das infecções fúngicas. As drogas alilaminas/benzilaminas possuem
evidências anteriores de eficácia, altas taxas de cura com curtos períodos de tratamento e
baixas taxas de recaídas quando comparadas aos azólicos em estudos de comparação direta
(Brennan & Leyden, 1997).
Entretanto, apesar da introdução nos anos 1990 de novos agentes como a alilamina e
terbinafina, para o tratamento de dermatomicoses, os azólicos, com 15 diferentes drogas
comercializadas no mundo, são a classe de antifúngicos mais amplamente utilizada e
estudada (Fromtling, 1988).
2.4 Antifúngicos azólicos
Os derivados azólicos utilizados na clínica possuem em sua estrutura molecular, um
anel pentagonal e são classificados de acordo com o número de átomos de nitrogênio em:
imidazólicos que possuem dois átomos de nitrogênio (cetoconazol, miconazol e
clotrimazol) e triazólicos, os quais contêm três nitrogênios (itraconazol e fluconazol). Com
46
exceção do cetoconazol, o uso dos imidazólicos é limitado ao tratamento de micoses
superficiais. Já os triazólicos, tem um amplo espectro de aplicação no tratamento tanto de
infecções fúngicas superficiais quanto sistêmicas (Seehan et al., 1999).
Estes agentes atuam sobre enzimas do citocromo P450 dos fungos, bloqueando a
enzima lanosterol desmetilase e consequentemente, a síntese de ergosterol, o que altera a
permeabilidade da membrana e a viabilidade fúngica. Também agem modificando a síntese
de lipídeos e inativando enzimas do processo oxidativo dos fungos. Os azólicos,
principalmente os imidazólicos, exercem ação apenas fungistática. Alterações na enzima
lanosterol desmetilase e aumento do efluxo das drogas são causas de resistência aos
azólicos, a qual foi constatada particularmente em Candida não albicans (Tavares,
2001)
Figura 3: Mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos. Adaptado de Catálan & Montejo, 2006.
De um modo geral, todos os antifúngicos azólicos possuem uma meia-vida sérica
longa o suficiente para possibilitar a terapia com uma ou duas doses diárias. Os principais
47
efeitos adversos dessa classe incluem intolerância gastrointestinal, hepatotoxicicidade e
hipersensibilidade. Estes compostos não devem ser utilizados durante a gravidez em função
do seu potencial teratogênico. Em se tratando dos agentes de uso tópico a absorção é
insignificante e os efeitos adversos são raros (Martinez, 2006; Tavares, 2001).
Devido ao seu mecanismo de ação em nível de citocromo P450, várias drogas
interagem com os azólicos seja reduzindo o nível sérico dos antifúngicos (rifampicina,
isoniazida, fenitoína, fenobarbital, carbamazepina), seja elevando os níveis de outros
fármacos (ciclosporina, digoxina, varfarina, benzodiazepínicos, inibidores da protease do
HIV) (Martinez, 2006; Tavares, 2001).
Os azólicos de uso tópico estão disponíveis em formulações de 1 ou 2%. A
aplicação de 1 ou 2 vezes/dia, na região afetada geralmente irá resultar no desaparecimento
das infecções superficiais por dermatófitos em 2 a 3 semanas, embora seja recomendado
que a medicação deve ser continuada até a erradicação do organismo ser confirmada
(Katzung, 2010).
2.5 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A cromatografia é um método físico-químico de separação que está fundamentada
na migração diferencial dos componentes de uma mistura que ocorre devido a diferentes
interações entre duas fases imísciveis: a fase móvel e a fase estacionária. O que torna a
técnica extremamente versátil e com uma grande aplicação são as diferentes combinações
possíveis entre fase móveis e estacionárias (Cass et al., 1998; Maldaner & Jardim, 2009).
A cromatografia líquida de alta eficiência é um tipo de cromatografia líquida que
emprega como fase estacionária pequenas colunas recheadas de materias especialmente
48
preparados, e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões. Nos últimos 40 anos, a
cromatografia líquida de alta eficiência tem sido a técnica analítica mais desenvolvida,
difundida e empregada em diversos campos da ciência, incluindo laboratórios de análises
de indústrias químicas e farmacêuticas (Maldaner & Jardim, 2009).
Na CLAE, a amostra é injetada por meio de um sistema de injeção e a fase móvel é
bombeada sobre alta pressão através da coluna onde a separação ocorre. O sistema
cromatográfico é constituído por: reservatório de fase móvel; bomba de alta pressão;
válvula de injeção; coluna; detector; registrador (figura 4) (Cass et al., 1998).
Figura 4: Componentes de um cromatógrafo líquido: a) reservatório de fase móvel; b) bomba de
alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector; f) registrador (Cass et al., 1998).
A fase móvel da CLAE deve respeitar algumas características impostas pelo método
tais como possuir um alto grau de pureza e ser compatível com o detector empregado, além
de possuir uma polaridade adequada para permitir a separação conveniente dos
componentes da amostra. Embora existam diversos tipos de solventes utilizados, os mais
comuns são: metanol, acetonitrila e água (Peres, 2002).
49
A coluna cromatográfica é o coração do sistema CLAE e as separações podem ser
dar pelo processo de partição, adsorção ou ambos, sendo o suporte mais comumente
utilizado a sílica. As fases podem atuar no modo normal, reverso ou ambos. Na
cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel, e em
fase reversa, a fase móvel é a mais polar. No caso das separações analíticas, são
frequentemente utilizadas colunas de fase reversa, na qual a fase C18 (octadecilsilica) é a
mais empregada (Cass et al., 1998).
Quanto aos detectores utilizados, não existe um detector universal, mas existem
diversos tipos que podem ser empregados: detectores baseados na absorbância UV, detector
de fluorescência, detectores por índice de refração, espectrômetro de massa, dentre outros
(Cass et al., 1998; Maldaner & Jardim, 2009)
2.6 Espectrometria de massa (EM)
A espectrometria de massa (EM) é uma poderosa técnica quantitativa e qualitativa
que está presente em diversos laboratórios clínicos e de pesquisa. Em virtude da sua
sensibilidade e velocidade, a espectrometria de massa tem desempenhado um papel
fundamental em muitas fases de descoberta de drogas (Glish & Vaschet, 2003).
Dentre algumas das aplicações na descoberta de drogas podemos citar a
identificação de alvos proteicos, monitorização e otimização de reações e análise estrutural.
A utilidade da EM no processo de descoberta de medicamentos pode, no entanto, se
estender a outros domínios. Em combinação com técnicas de separação, EM pode
desempenhar um papel importante na identificação e monitorização de biomarcadores em
fluidos fisiológicos, o que é útil na avaliação das questões de eficácia e segurança da droga.
50
Além disso, EM pode ser alguma promessa como um ensaio para a pesquisa rápida de
ligação-alvo da droga, incluindo tanto a força como sítios de interação (Glish & Vaschet,
2003).
Existem diversos tipos de espectrômetros de massa cada um com suas vantagens e
limitações. Todos são compostos por três componentes principais: fonte de ionização, o
analisador de massa e o detector. O princípio básico da técnica consiste na geração de íons
de compostos inorgânicos ou orgânicos através de uma fonte de ionização apropriada,
separá-los por sua relação massa/carga (m/z) em um analisador de massa e detectá-los
qualitativamente e quantitativamente por suas respectivas relações m/z e suas abundâncias.
A magnitude do sinal gerado no detector é convertida por um processador de dados, o qual
gera o espectro de massa correspondente. Um espectro de massa é uma função da
abundância do íon versus a relação m/z e apresentado em termos de Dalton (Da) por
unidade de carga. A sofisticação da EM surge nos métodos que são utilizados para a
geração destes íons e no modo de analisá-los (Glish & Vaschet, 2003; Gross, 2004).
Figura 5: Representação esquemática de um espectrômetro de massa (Applied Biosystems, 2005).
51
Para uma análise por EM, as amostras podem ser inseridas diretamente no
espectrômetro de massa, ou então, o equipamento pode ser acoplado a uma técnica de
separação como, por exemplo, cromatografia líquida ou cromatografia gasosa. Para a
análise de fármacos em matrizes biológicas, a técnica mais utilizada é a cromatografia
líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa em tandem (Gross, 2004;
Pereira et al., 2005).
2.6.1 Descrição básica do sistema
2.6.1.1 Fontes de ionização
Em EM medimos a relação m/z dos íons em fase gasosa. Sendo assim, a análise de
uma amostra por EM, deve ser primeiramente ionizada e depois vaporizada. Até o início
dos anos 1980, as biomoléculas eram geralmente ionizadas por métodos como o impacto de
elétron (EI) ou ionização química (CI). Entretanto, uma exigência para estes dois métodos
de ionização é que a amostra seja vaporizada. Isso não é de grande preocupação na análise
das pequenas moléculas orgânicas ou aquelas passíveis de uma análise por cromatografia
gasosa. No entanto, a maioria das amostras biológicas possuem um alto peso molecular e
uma alta polaridade que limitam sua volatilidade, não podendo ser analisadas por EI-ou CI-
EM sem uma prévia etapa de derivatização (Griffiths et al., 2001).
Diante deste quadro, ao longo dos últimos 30 anos, o desenvolvimento de novos
métodos de ionização, juntamente com melhorias nos analisadores de massa tem sido a
principal força motriz por trás do notável e dramático crescimento de espectrometria de
massa na área biológica (Laiko et al., 2000).
52
O desenvolvimento das técnicas de ionização mais brandas nos anos 1980
revolucionou a extensão de aplicação da EM uma vez que permitiu a ionização e
vaporização de biomoléculas grandes, polares e termo lábeis, sem a necessidade de prévias
derivatizações. Embora várias novas técnicas de ionização tenham sido desenvolvidas nos
últimos anos, duas merecem destaque por serem as mais utilizadas: ionização por
electrospray (ESI) e ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI). Ambas as
técnicas de ionização são capazes de produzir íons intactos de alto peso molecular através
de uma fase condensada (sólida para o MALDI e líquida para o ESI) (Griffiths et al., 2001;
Laiko et al., 2000).
Enquanto o ESI envolve a ionização a pressão atmosférica seguida da transferência
dos íons para o sistema de vácuo, no MALDI a fonte de íons opera em condições de vácuo.
Consequentemente, diferentes tipos de espectrômetros de massa são comumente equipados
para análises por ESI-EM e MALDI-EM (Laiko et al., 2000).
A ionização por electrospray é o melhor método de ionização/vaporização para uma
ampla de gama de compostos polares e o único requisito para esta técnica é que o analito
seja solúvel em algum solvente. Inicialmente, a amostra de interesse é dissolvida num
solvente, onde, em certa extensão, ela irá existir em uma forma ionizada como, por
exemplo, [M - H]+ ou [M - H]
-. Em electrospray convencionais a solução é então
bombeada através de um fino capilar (diâmetro interno de aproximadamente 0.1 mm), e
direcionada a um potencial mais alto (4 kV). Pequenas gotículas carregadas são
pulverizadas a partir do capilar ES em um banho de gás a pressão atmosférica e viajam até
um orifício no sistema de alto vácuo do espectrômetro de massa (Griffiths et al., 2001).
53
À medida que as gotículas atravessam esse caminho, elas se tornam dessolvatadas e
reduzem seu tamanho de tal forma que as forças de superfície repulsivas de Coulomb
superam as forças de tensão superficial e as gotículas se quebram em gotas menores. Este
processo continua até que é alcançado o ponto em que os íons dessorvidos de uma gota ou
solvente são completamente removidos. O mecanismo exato da formação do íon seja por
remoção do solvente completo - CRM ou modelo de carga residual- ou evaporação íon -
IEM ou modelo de evaporação do íon- está em debate e diferentes mecanismos se aplicam
em diferentes situações. Qualquer que seja o mecanismo, o resultado é a transferência do
feixe de íons gerados da zona de alta pressão para a zona de alto vácuo do analisador de
massa (Griffiths et al., 2001).
Figura 6: Dois mecanismos propostos para a formação de íons gasosos no processo de ionização
por electrospray. (CRM = charge residual model; IEM = ion evaporation model). Disponível em
http: // www.espectrometriademassa.com.br. Acesso em 18/03/2014.
O ESI é considerado, sob condições normais, uma fonte de ionização branda, o que
significa que relativamente pouca energia é transferida para o analito e, portanto pouca
54
fragmentação ocorre. É possível aumentar a fragmentação na fonte aumentando-se a
voltagem, o que aumenta as colisões com as moléculas de nitrogênio. Embora útil para
alguns analitos, à fragmentação na fonte é limitada para outros, e mais consistente com
métodos de fragmentação, tais como dissociação induzida por colisão, requeridos para
induzir a fragmentação extensiva em estudos estruturais e espectrometria de massa em
tandem (Pitt, 2009).
As pequenas moléculas (≈ <500 Da), com um único grupo funcional capaz de
transportar carga elétrica formam predominantemente íons isoladamente carregados. Isto
pode ser devido à adição de um próton ao analito [M+H]+ quando a fonte de íons é operada
em modo positivo, ou a perda de um próton [M-H]-, quando a fonte opera em modo
negativo. Adutos de cátions (M+Na+, M+K+) ou ânions (M+acetato) podem se formar se
sais estiverem presentes (Pitt, 2009).
2.6.1.2 Analisadores de massa
Após os íons serem gerados na fonte de ionização, eles são transferidos para a
região do espectrômetro conhecida como analisador de massas, onde diversos tipos de
analisadores medirão de maneiras diferentes suas relações m/z. Atualmente existem cinco
principais tipos de analisadores de massa utilizados: tempo de vôo (TOF – Time of Flight),
setor eletrostático (E) e setor magnético (B), aprisionamento de íons (ion trap), quadrupolo
(Q) e ressonância ciclotrônica de íons (ICR – Ion Cyclotron Resonance) (Glish & Vaschet,
2003).
Conceitualmente, o analisador de massa mais simples é provavelmente o tempo de
voo (TOF). O princípio deste acelerador consiste na aceleração de íons através de uma alta
55
voltagem. A velocidade dos íons, e, por conseguinte, o tempo levado para viajar através de
um tubo de voo para atingir o detector, depende de seus valores m/z. Se a tensão de
aceleração inicial é pulsada, a saída do detector como uma função do tempo, pode ser
convertida em um espectro de massa. O analisador TOF pode adquirir espectros de forma
extremamente rápida e com elevada sensibilidade. Também possui alta precisão de massa,
o que permite a determinação de fórmulas moleculares para pequenas moléculas (Bristow,
2006; Williamson & Barlett, 2007).
O analisador de setor utiliza-se de um campo elétrico estático (E) ou magnético (B)
com a finalidade de alterar a trajetória e a velocidade dos íons até o detector. Os íons
acelerados a partir da fonte de ionização são curvados por ação do campo sendo submetidos
a uma trajetória circular. Os íons que possuem maiores valores m/z percorrem uma
trajetória maior, enquanto que os íons de menor valor de m/z percorrem uma trajetória
menor, sendo assim separados (Hoffman, 2007).
O analisador ion trap é composto por três eletrodos hiperbólicos que aprisionam os
íons em um espaço tridimensional utilizando voltagens de rádio frequência (RF) que os
mantém em uma órbita estável (Payne & Glish, 2005). Em seguida, quando um potencial
RF é aplicado, os íons são desestabilizados e ejetados da armadilha com base em seus
valores m/z para criar o espectro de massa. Alternativamente, um íon específico pode ser
isolado na armadilha através da aplicação de uma tensão excitante enquanto os outros íons
são ejetados. Um gás inerte pode também ser introduzido na armadilha para induzir a
fragmentação. Uma característica interessante desses analisadores é a capacidade de
fragmentar e isolar os íons várias vezes seguidas antes do espectro de massa final ser obtido
(Tozuka et al., 2003).
56
O quadrupolo consiste em um dispositivo formado por quatro barras metálicas
(eletrodos) dispostas paralelamente que utilizam a estabilidade das trajetórias de campos
elétricos oscilantes para separar os íons durante a sua passagem. Uma combinação de
tensões de radiofrequência permite a transmissão de uma estreita banda de valores m/z ao
longo do eixo das barras. Variando as tensões com o tempo, é possível fazer a varredura
através de uma gama de relações m/z, resultando num espectro de massa (Pitt, 2009).
Por fim, o analisador de ressonância ciclotrônica assim como um analisador de setor
utiliza campos magnéticos e elétricos estáticos para determinar a relação m/z de um íon. A
principal diferença na operação de uma FT- ICR contra um setor magnético é a energia
cinética dos íons. Neste último caso, os íons têm energias cinéticas tipicamente na faixa de
keV, enquanto que em um FT-ICR, os íons têm energias cinéticas, no máximo, de algumas
dezenas de elétrons-volt (eV). Em baixas energias cinéticas, os íons não passam através do
campo, sendo, na verdade aprisionados dentro dos campos. Estes íons aprisionados são
excitados por pulsos de RF, descrevendo órbitas coerentes e, através dos detectores, os
sinais elétricos dos íons são medidos e convertidos em sua relação m/z (Glish & Vaschet,
2003; Marshall, 1998; Hoffman, 2007).
2.6.1.3 Espectrometria de massa em tandem (EM/EM)
Apesar das técnicas de ionização e os analisadores de massa ter sido desenvolvido
por volta de 1980, foi crucial para a aplicação da EM o desenvolvimento da espectrometria
de massa em tandem (EM/EM). O triplo quadrupolo é um exemplo de espectrometria de
massa em tandem (EM/EM) no qual dois ou mais estágios de análise de massa são
57
independentemente aplicados aumentando a especificidade da análise (Glish & Vaschet,
2003; Pitt, 2009).
As etapas da espectrometria de massa sequencial podem ser resumidas da seguinte
maneira: no primeiro quadrupolo, íons com a relação m/z desejada são isolados do restante
dos íons provenientes da fonte de ionização. Estes íons isolados, denominados íons
precursores, são fragmentados no segundo quadrupolo ou câmara de colisão em reações
que tipicamente envolvem o aumento da energia interna dos íons, levando a sua
dissociação. Os íons resultantes, conhecidos como íons produtos, são analisados no terceiro
quadrupolo (figura 7) (Glish & Vaschet, 2003).
Figura 7: Esquema da espectrometria de massa em tandem (Pereira et al., 2005).
O primeiro e terceiro quadrupolos podem simultaneamente varrer diferentes valores
de m/z, e diferentes painéis de pares de íons precursor/produto podem ser criados para
detectar especificamente um grande número de analitos alvo. Este processo, chamado de
monitoramento de múltiplas reações (MRM), é comumente usado em ensaios LC-MS para
58
o monitoramento de compostos de identidade conhecida devido à alta seletividade (Glish &
Vaschet, 2003; Pitt, 2009).
2.6.1.4 Detectores
Após passarem pela região do analisador de massa, os íons são direcionados ao
detector. A função do detector é captar e amplificar o sinal da corrente de íons que vem do
analisador de massa e transferi-lo para o sistema de processamento de dados (Hoffman,
2007).
59
3. OBJETIVOS
60
61
Objetivo Geral:
Este trabalho teve como objetivo geral desenvolver um método de CLAE-EM/EM
para a quantificação de dapaconazol em amostras provenientes de um estudo fase I.
Objetivos Específicos:
Desenvolver um método de CLAE- EM/EM para a quantificação de
dapaconazol em plasma humano
Validar a metodologia bioanalítica desenvolvida
Avaliar o perfil farmacocinético (velocidade e extensão da absorção)
após a aplicação tópica de tosilato de dapaconazol.
62
63
4.MATERIAIS E MÉTODOS
64
4.1 Materiais
4.1.1 Etapa Clínica
Os produtos que foram aplicados aos voluntários sadios durante a realização da
etapa clínica são listados a seguir:
Produto teste: Tosilato de dapaconazol (BL 123) (ver anexo III) – creme para
aplicação tópica nas concentrações de 0.01% a 5.0% da Biolab Sanus Farmacêutica Ltda.
Produto controle: Base do creme utilizado na formulação do produto teste, sem
princípio ativo fornecido pela Biolab Sanus Farmacêutica Ltda.
4.1.2 Etapa Analítica
Nas tabelas apresentadas a seguir, encontram-se os materiais utilizados para
condução da fase analítica de quantificação do composto teste.
Tabela 3: Instrumentos
Instrumentos
Pipetas automáticas ajustáveis (P200,P1000 e P10000)
Ponteiras plásticas descartáveis- Laptip amarela (escala 5-200 uL) e Labtip
azul (escala 200-1000 uL)
Tubos de teste de vidro descartáveis 120x12 mm e 75x12mm
Eppendorf –pipetas de repetição
Tubos Falcon de 50 e 15 mL de capacidade
Placa de PCR
Misturador Vortex
Balança analítica
Tabela 4: Equipamentos
Componente Fabricante, País Modelo
Cromatografia líquida Agilent, Alemanha G1312A/US72101050
Degasser Agilent, Japão G1379A/JP40718000
Forno de Coluna Agilent, Japão G1316A/US72102831
Auto injetor CTC Analytics, Suíça HTS PAL (N° serial:/
112508)
Espectrômetro de massa Sciex/ Applied/
Biosystems, Canada
API4000/J3540205
Fonte Sciex/ Applied/
Biosystems, Canada
1544040810
Sistema de dados Sciex/ Applied/
Biosystems, Canada
Analyst v 1.4.1
65
Tabela 5: Padrões analíticos
Padrão Finalidade Fabricante Lote Validade CAS
BL 123 Analito Biolab MIC123-
T104
Lote
corrente
1394826-04-0
Tioconazol Padrão
interno
USP H Lote
corrente
65899-73-2
Tabela 6: Reagentes
Reagente Descrição Origem
Acetonitrila Grau HPLC J.T Baker, USA
Metanol Grau HPLC J.T Baker, USA
Água Milli-Q Grau análise Millipore system
Acetato de Amônio Grau análise J.T Baker, Mexico
Éter etílico Grau análise Mallinckrodt, USA
Hexano Grau análise J.T Baker, Mexico
Tabela 7: Amostras biológicas (plasma) utilizadas para testar a seletividade do método.
Descrição Origem Lote
Plasma humano normal Galeno Unidade analítica, Brasil Pool Galeno 01513
Pool Galeno 01613
Pool Galeno 01713
Pool Galeno 01813
Plasma humano lipêmico Galeno Unidade analítica, Brasil Pool Galeno LP 00112
Pool Galeno LP 00212
Plasma humano hemolisado Galeno Unidade analítica, Brasil Pool Galeno HM 00211
Pool Galeno HM 00112
66
4.2 Métodos
4.2.1 Etapa Clínica
Este estudo foi conduzido de acordo com as Boas Práticas Clínicas (BPC) e demais
recomendações estabelecidas pela ICH, bem como de conformidade com as Resoluções
196/96, 251/97 e complementares do Conselho Nacional de Saúde (CNS) - Ministério da
Saúde e Resolução RDC 39/08 da ANVISA.
4.2.1.1 Recrutamento dos sujeitos de pesquisa
Para a condução da etapa clínica, foram selecionados, de acordo com os critérios de
inclusão/exclusão, trinta e seis voluntários sadios do sexo masculino com idade superior a
18 anos e índice de massa corpórea entre 19 e 30. Foram recrutados preferencialmente
voluntários de pele clara, tendo em vista a maior facilidade para monitorar possíveis
reações adversas (exemplo: eritema) quando da aplicação da formulação teste na pele.
Após um esclarecimento inicial sobre as condições nas quais são desenvolvidas as
pesquisas clínicas, os voluntários participaram de um processo de recrutamento, situação
em que assinaram o Termo de Recrutamento. É nesta fase, que os voluntários passaram por
uma avaliação clínica onde foram coletadas informações sobre seu histórico social, dados
antropométricos e sinais vitais, realizado o registro de ECG e efetuada uma consulta médica
para obtenção da história clínica e realização de exame físico. Os voluntários que não
apresentaram nenhuma violação dos critérios de inclusão e exclusão foram encaminhados
para realização de exames laboratoriais. Após o laudo dos exames, aqueles voluntários que
se enquadraram nos critérios de inclusão/exclusão específicos do estudo em questão foram
informados sobre esta pesquisa e suas características e convidados a participar. Depois de
67
esclarecidas todas as dúvidas, caso concordassem com as condições da pesquisa, os sujeitos
assinariam o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (anexo II).
4.2.1.2 Critérios de inclusão dos sujeitos de pesquisa
1. Sujeitos de pesquisa do sexo masculino com idade igual ou superior a 18 anos;
2. Voluntário tem seu índice de massa corpórea ≥ 19 e ≤ 30 Kg/m2;
3. Boas condições de saúde ou sem doenças significativas, a juízo médico, de acordo com
as regras do protocolo, e avaliações a que foi submetido: história clínica, medidas de
pressão e pulso, exame físico e psicológico, ECG, e exames laboratoriais complementares;
4. Capaz de compreender a natureza e objetivo do estudo, inclusive os riscos e efeitos
adversos e com intenção de cooperar com o pesquisador e agir de acordo com os
requerimentos de todo o ensaio, o que vem a ser confirmado mediante a assinatura do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo II).
4.2.1.3 Critérios de exclusão dos sujeitos de pesquisa
Problemas relacionados ao fármaco:
1. O sujeito de pesquisa tem sabidamente hipersensibilidade (reações alérgicas) ao tosilato
de dapaconazol, derivados imidazólicos ou a compostos quimicamente relacionados;
história de reações adversas sérias ou hipersensibilidade a qualquer fármaco;
2. O sujeito de pesquisa apresentou reação característica de hipersensibilidade quando da
aplicação da base do creme (formulação controle, sem princípio ativo), realizada durante os
procedimentos de recrutamento e seleção;
68
3. Uso de terapia de manutenção com qualquer medicação
Doenças ou problemas de saúde
4. Tem história de doença hepática, renal, pulmonar, gastrintestinal, epiléptica,
hematológica ou psiquiátrica; ou hipo ou hipertensão ou qualquer outra comorbidade que
requeira tratamento imediato prioritário ou que, a juízo do pesquisador principal, possa
interferir na participação do estudo e/ou exponha o sujeito de pesquisa a risco adicional do
que normalmente previsto;
5. Tem história ou teve infarto do miocárdio, angina e/ou insuficiência cardíaca e/ou
achados eletrocardiográficos não recomendados a critério do pesquisador para participação
no estudo;
6. Os resultados dos exames laboratoriais de triagem apresentam desvios considerados
clinicamente relevantes que em função de possíveis riscos impedem a participação no
estudo, a juízo do pesquisador.
Hábitos e Dependências
7. O voluntário é fumante;
8. Tem história de abuso de álcool ou drogas, ou consumo expressivo de álcool (> 5 g/dia);
Condições encontradas nos dias/meses que antecedem o estudo
9. Fez uso de medicação regular dentro das 2 semanas que antecederam o início do
tratamento que, com base na classe terapêutica, na meia-vida do fármaco e/ou metabólitos
ativos, possa ser assumida interferência com o estudo;
69
10. Tratamento dentro dos 3 meses prévios ao estudo com qualquer fármaco conhecido de
ter um potencial tóxico bem definido nos grandes órgãos;
11. O sujeito de pesquisa participou de qualquer estudo experimental ou ingeriu qualquer
fármaco experimental dentro dos seis meses que antecedem o início deste estudo;
12. O sujeito de pesquisa doou ou perdeu 450 mL ou mais de sangue durante os três meses
que antecederam ao estudo ou efetuou 4 doações dentro dos 12 meses que precederam o
estudo;
Outras condições
13. O sujeito de pesquisa tem qualquer condição que o impede de participar do estudo,
segundo julgamento do investigador.
4.2.1.4 Descrição do Estudo
Estudo aberto, de tratamento único com 3 períodos, nos quais os voluntários
receberam o produto teste em doses sucessivamente crescentes. A administração das
formulações foi por via tópica em dose única em cada um dos períodos, os quais são
separados entre si por um intervalo de 7 dias (washout). Os sujeitos de pesquisa foram
aleatoriamente designados a um dos tratamentos.
Um total de 5g do produto teste foi aplicado em uma das concentrações previamente
estabelecidas de acordo com o nº de participação do voluntário no estudo e respectivo
período de participação em um lado das costas dos voluntários em uma área de
aproximadamente 8 x 8 cm (anexo IV). No outro lado das costas do voluntário foi aplicada
70
em uma área de mesma dimensão a formulação controle (base do creme), com a finalidade
de discriminar eventuais eventos adversos que não estejam relacionados ao princípio ativo.
4.2.1.5 Condução do Estudo
Tendo em vista o delineamento (aplicação de doses crescentes do produto sob
investigação) e o objetivo do estudo de avaliar a segurança e a tolerabilidade do produto em
teste, uma dose de concentração maior só foi aplicada após a avaliação relacionada à
aplicação da concentração imediatamente mais baixa. Dessa forma, o estudo foi dividido
em 12 “fases” correspondentes aos 12 níveis de concentrações crescentes aplicados.
A primeira fase do estudo teve início com somente os 3 primeiros voluntários, que
receberam a menor concentração proposta (0.01%). Estes 3 primeiros voluntários
participaram da fase seguinte (correspondente ao 2º período de suas participações), após
uma semana da fase anterior (neste caso, 1ª fase), somente se o pesquisador responsável
concluísse que havia condições para prosseguir para o próximo nível de concentração (2ª
fase), conforme a avaliação de segurança e tolerabilidade. Nesta ocasião (2ª fase) foram
incluídos mais 3 voluntários que iniciaram a participação (1º período de participação destes
3 voluntários) já no 2º nível de concentração. Da mesma maneira, a progressão para a 3ª
fase só ocorreu após a avaliação do pesquisador responsável, ocasião em que foram
incluídos mais 3 voluntários e assim sucessivamente até a ocorrência da 12ª fase do estudo.
Cada voluntário participou somente de 3 fases – correspondente aos seus 3 períodos
de participação no estudo. Consequentemente, na 4ª fase os 3 primeiros voluntários já não
mais participaram. Para o 2º grupo de 3 voluntários (vols. 4, 5 e 6), a 4ª fase foi o 3º
período de participação, após o que foram dispensados. Este raciocínio se aplicou
71
sucessivamente aos demais grupos de 3 voluntários, que assim participaram de 3 períodos
consecutivos.
Na 10ª fase foram incluídos 9 voluntários (3 grupos e 3), completando-se os 36
voluntários previstos, para que todos participassem de 3 períodos do estudo. Excetuando-se
a 1ª e 2ª fases, todas as demais contaram com um número planejado de pelo menos 9
voluntários.
Em cada período foram observadas as instruções que se seguem e efetuados os
seguintes procedimentos:
O voluntário deveria se apresentar à unidade ambulatorial aproximadamente
às 8 horas da manhã no dia do tratamento, após ter tomado o café da manhã
em sua própria residência;
Foi efetuada punção venosa em um dos membros superiores para coletas de
amostras de sangue para a avaliação farmacocinética (somente no 1º
período foram coletados 40 mL de sangue para controle do método
analítico);
Após aplicação do produto teste e controle nos voluntários, os mesmos
deveriam permanecer sem camisa pelo período mínimo de 2 horas;
Foi efetuada a documentação da aplicação em foto e vídeo desde antes da
aplicação do produto até 6 horas após sua aplicação, acompanhada da
respectiva avaliação dermatológica;
72
Foram coletadas 4 amostras de 7mL de sangue (cada), uma antes da
aplicação do creme e às 2, 4 e 6 horas após a aplicação;
Foram servidos 2 horas após a administração um lanche padronizado;
O voluntário seria dispensado da unidade ambulatorial após a coleta da
amostra de 6 horas;
O voluntário deveria comparecer ao laboratório entre 24 e 48 horas após o
1º e 2º períodos, para realização dos exames de segurança. Após o 3º
período os exames foram realizados conforme definido para o pós-estudo.
4.2.1.6 Pós-estudo
Depois de decorrido pelo menos 7 dias do último dia de tratamento, foram
realizados os exames laboratoriais pós-estudo em horário previamente combinado.
Após o laudo destes resultados, os voluntários foram convocados para comparecer à
unidade ambulatorial para o exame clínico de alta, incluindo avaliação dermatológica,
ocasião em que foram, em princípio, dispensados, até a data de realização dos exames de
segurança tardios.
Ainda como parte do pós-estudo, cerca de 90 dias após o término do tratamento, os
exames laboratoriais foram repetidos e foi efetuada uma entrevista médica para fins de
avaliação de segurança.
73
4.2.1.7 Processamento e armazenamento das amostras
As amostras de sangue retiradas dos voluntários foram centrifugadas em torno de
2000g por 10 minutos a baixa temperatura (4 °C). Após a centrifugação, o plasma retirado
foi armazenado em frasco adequado, devidamente identificado, à temperatura de -20 °C em
freezer específico.
4.2.1.8 Procedimento durante o estudo
Em cada período do tratamento, nos dias de aplicação da medicação, os voluntários
deveriam permanecer na unidade clínica durante as horas subsequentes à aplicação dos
medicamentos e foram observados pelos profissionais de saúde durante todo o estudo,
visando à detecção de eventos adversos (incluindo sinais de toxicidade).
Os sujeitos de pesquisa foram questionados pelo menos aproximadamente aos 30
minutos, 2h, 4h e 6h após a administração das formulações. Além disto, foi realizada a
observação direta (avaliação dermatológica) da área de aplicação da medicação.
Entre 24 e 72 h após o término do primeiro e segundo períodos, o voluntário
deveria comparecer ao laboratório para coleta de sangue para fins de avaliação de
segurança – análise hematológica e bioquímica.
4.2.1.9 Procedimento pós-estudo
Todos os sujeitos de pesquisa foram reavaliados clinicamente (incluindo sinais
vitais, exame físico e ECG) e por exames laboratoriais subsidiários iguais aos realizados na
fase pré-estudo. Esta reavaliação deveria ocorrer após a última coleta de sangue, depois que
os resultados do ECG e exames laboratoriais estariam disponíveis. Além disto, cerca de 90
74
dias após o término da terapia foram repetidos os exames laboratoriais e efetuada entrevista
médica para fins de avaliação de segurança.
4.2.2 Etapa Analítica
4.2.2.1 Desenvolvimento do método analítico
4.2.2.2 Preparo de soluções
Todas as soluções foram preparadas em balões volumétricos (10 mL) corretamente
identificadas e armazenadas a 4 °C na geladeira. A exatidão para pesar os padrões é de ±
0.1 mg e as pesagens devem ser devidamente documentadas.
4.2.2.3 Soluções padrões de estoque
Foram pesadas separadamente quantidades apropriadas de BL 123 e tioconazol, em
balões volumétricos (10 mL), e diluídas em 10 mL de acetonitrila/água (50/50, v/v). São
realizadas no mínimo quatro pesagens do analito, das quais três pesagens são utilizadas
para o preparo de três curvas de calibração distintas e uma pesagem para o preparo das
amostras controle de qualidade. Já para o padrão interno é realizada apenas uma única
pesagem.
Todas as soluções preparadas devem ser bem homogeneizadas para assegurar a
concentração final das soluções. Estas soluções permanecem armazenadas até os testes
finais de estabilidade.
75
4.2.2.4 Soluções de trabalho
As soluções de trabalho são obtidas por diluição das soluções padrões
correspondentes previamente preparadas para a construção dos pontos da curva de
calibração.
4.2.2.5 Fase móvel: MeOH/ACN/H2O (80/10/10, v/v/v) e Acetato de Amônio (0.5 mM)
Para o preparo da fase móvel, deve-se medir com o auxílio de uma proveta 800 mL
de metanol, 100 mL de acetonitrila e 100 mL de água Milli-Q e transferi-los para um frasco
de armazenamento Schott de 1000 mL. Posteriormente, adiciona-se 500 uL de uma solução
de Acetato de Amônio 1M. O frasco deve ser agitado até total homogeneização da solução
e levado ao desgaseificador por um tempo aproximado de 10 minutos.
4.2.2.6 Solução de ressuspensão: Acetonitrila/Água (50/50, v/v)
Para o preparo da solução de ressuspensão, deve-se medir 500 mL de acetonitrila e
500 mL de água Milli-Q e transferi-los para o frasco de armazenamento Schott de 1000
mL. O frasco deve ser agitado até total homogeneização e levado ao desgaseificador por no
mínimo 10 minutos.
4.2.2.7 Preparo da curva de calibração
A concentração dos pontos da curva de calibração, assim como a concentração das
amostras controle de qualidade, foi definida em função da faixa de concentrações prevista,
sendo relacionada com o regime de dose para o qual o método foi desenvolvido.
As curvas de calibração foram preparadas em plasma humano e consistem em duas
amostras brancas (amostra de matriz processadas sem padrão interno), duas amostra zero
76
(amostra de matriz processada com padrão interno) e amostras padrão de plasma (non-
zero), em duplicata, cobrindo a faixa prevista das concentrações a serem quantificadas.
A curva de calibração foi preparada contaminando-se plasma humano controle com
a solução de trabalho preparada para a curva de calibração contendo o analito a ser
quantificado.
Tabela 8: Preparo da curva de calibração
Analito Conc. Plasma
(ng/mL)
Solução de trabalho Volume de
plasma
adicionado
(mL)
Volume
total
(mL)
Fator de
diluição Volume
adicionado
(mL)
Concentração
(ng/mL)
BL 123 100 0.05 1000 0.45 0.5 10.0
BL 123 75 0.05 750 0.45 0.5 10.0
BL 123 50 0.05 500 0.45 0.5 10.0
BL 123 20 0.05 200 0.45 0.5 10.0
BL 123 2 0.05 20 0.45 0.5 10.0
BL 123 1 0.05 10 0.45 0.5 10.0
BL 123 0.5 0.05 5 0.45 0.5 10.0
BL 123 0.2 0.05 2 0.45 0.5 10.0
4.2.2.8 Preparo dos controles de qualidade
As amostras de controle de qualidade e limite inferior de quantificação foram
preparadas com plasma humano e solução de trabalho previamente preparada contendo o
analito a ser quantificado.
Os controles de qualidade são preparados diariamente nas quantidades
requeridas para o ensaio.
77
Tabela 9: Preparo dos controles de qualidade e LIQ
Analito Conc. Plasma
(ng/mL)
Solução de trabalho Volume de
plasma
adicionado
(mL)
Volume
total
(mL)
Fator de
diluição Volume
adicionado
(mL)
Concentração
(ng/mL)
BL 123 160 0.10 1600 0.90 1 10.0
BL 123 80 0.10 800 0.90 1 10.0
BL 123 40 0.10 400 0.90 1 10.0
BL 123 0.6 0.10 6 0.90 1 10.0
BL 123 0.2 0.10 2 0.90 1 10.0
4.2.2.9 Preparo da corrida analítica
4.2.2.9.1 Procedimento de extração
A extração das amostras foi feita conforme descrito abaixo:
1) Colocar um número apropriado de tubos teste de vidro descartáveis de 12 x 120
milímetros em uma grade e numerá-los.
2) Adicionar (200 μL) de plasma humano em cada tubo;
3) Em cada um dos tubos adicionar, utilizando pipeta automática calibrada, 50 μL de
padrão interno (solução de Tioconazol 300 ng/mL);
4) Homogeneizar (vortex) por 5 segundos;
5) Adiconar 300 μL de água Milli-Q;
6) Homogeneizar (vortex) por 5 segundos;
7) Adicionar 4 mL de solução de extração (Éter/Hexano 80/20; v/v );
78
8) Homogenizar (vortex) por 50 segundos;
9) Congelar as amostras à -80ºC;
10) Transferir a fase orgânica superior para um outro jogo de tubos de vidro limpos e
evaporar sob fluxo de N2 a 45 ºC;
11) Dissolver os resíduos secos com 200 μL de Acetonitrila/ Água (50/50; v/v);
12) Homogeneizar (vortex) por 10 segundos;
13) Transferir as soluções para placa de PCR utilizando pipetas automáticas com ponteiras
de plástico descartáveis;
14) Tampar as placas e colocá-las nos racks do auto-injetor.
4.2.2.9.2 Condições cromatográficas
Tabela 10: Condições cromatográficas
Parâmetros Descrição
Fase móvel MeOH/ACN/H20 (80/10/10; v/v/v) + Acetato de Amônio (0.5 mM)
Coluna cromatográfica Genesis lightn C18 4um 100 mm ID 2.1mm
Pré-coluna Phenomenex, SecurityGuard Cartidges C18, 4x3 mm
Temperatura do auto-injetor 8 °C
Fluxo 260 μL/min
Pressão 50 bar
Temperatura da coluna 40 °C
Volume de injeção 10 μL
Split 1:2
79
4.2.2.9.3 Condições de ionização
O espectrômetro de massas utilizado foi o API 4000 (Sciex/Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA), equipado com uma fonte de ionização electrospray em modo
positivo. O equipamento foi programado para operar no modo de monitoramento de
múltiplas reações (modo MRM). Os parâmetros otimizados para potencial de declustering,
energia de colisão e potencial de saída da célula de colisão do método desenvolvido são
descritos na tabela abaixo. A aquisição dos dados e a análise foram feitas utilizando-se o
software Analyst (1.4.1, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Tabela 11: Condições de ionização
Composto
Transição
Potencial de
Declustering
(V)
Energia de Colisão
(eV)
Potencial de saída da
célula de colisão
(V)
Dapaconazol
415.1 > 159.2
86
41
24
Tioconazol
387.0 > 131.1
91
37
10
4.2.2.9.4 Supressão iônica
O teste de supressão iônica é realizado para verificar o efeito da supressão iônica no
sinal EM/EM do analito e do padrão interno. O aparato do teste consiste em uma bomba de
infusão conectada ao sistema por um “zero volume tee” antes do split e o sistema de CLAE
bombeando a fase móvel. A bomba de infusão foi configurada para transferir 50 µL/min de
uma mistura de analito e padrão interno (ambos na concentração de 10 ng/mL). Uma
80
amostra de plasma branco humano é submetida ao procedimento de extração proposto e o
reconstituído é injetado dentro do sistema de CLAE enquanto o mix de analito e padrão
interno são infundidos (figura 8) (Cassiano, N.M et al 2009).
Figura 8: Representação esquemática do aparato do teste de supressão iônica (Cassiano, N.M et al
2009).
4.2.2.10 Validação da metodologia bioanalítica
O método foi validado em conformidade com as orientações do FDA e ANVISA
para validação de métodos analíticos. A validação deve contemplar parâmetros como
seletividade/especificidade, linearidade, precisão, exatidão, recuperação e efeito matriz e
estabilidade dos compostos que estão sendo estudados. Também faz parte do processo de
81
validação os testes de carry- over e cross-talk que tem por finalidade validar a lavagem e o
sistema de detecção do método, respectivamente.
Cada lista de validação (lote) consiste em:
Tabela 12: Lista de validação
Amostra Descrição
TSS (5X) Analito + PI em solvente
Plasma branco extraído (2X) Plasma branco extraído
Plasma branco extraído + PI (2X) Plasma branco extraído + PI
Pontos da curva de calibração em duplicata Pontos da curva em plasma extraído (analito + PI)
LIQ (7X) Analito + PI em plasma extraído
CQB (7X) Analito + PI em plasma extraído
CQM (7X) Analito + PI em plasma extraído
CQA (7X) Analito + PI em plasma extraído
CQD (7X) Analito + PI em plasma extraído
TSS (5X) Analito + PI em solvente
Para monitorar a adequação do sistema, todas as corridas são precedidas pelos
controles da fase móvel (5 replicatas) - TSS (System Suitability Test) - que são reinjetados
no fim de cada corrida. O TSS é preparado utilizando-se uma solução de analito na
concentração baixa e PI na concentração utilizada no estudo.
82
4.2.2.10.1 Teste de carry-over (TCO)
O sistema cromatográfico deve ser testado quanto ao seu sistema de lavagem e para
tal finalidade deve-se realizar o teste de carry-over (TCO). Este teste deve ser executado
injetando-se:
01 amostra de plasma branco extraído;
01 amostra de plasma extraído em concentração do LIQ de analito e PI;
01 amostra de plasma extraído em alta concentração (LSQ) de analito e PI;
02 amostras de plasma branco extraído;
4.2.2.10.2 Teste de cross-talk (TCT)
A interferência do canal de detecção do analito no padrão interno e vice-versa deve ser
testada quanto a um possível cross-talk do sistema. O teste é realizado injetando-se:
Injeção das amostras do analito (analito na concentração de 100 ng/mL sem
PI) e monitoramento das transições do analito e PI;
Injeção das amostras de PI (PI na concentração de 300 ng/mL sem analito)
e monitoramento das transições do analito e padrão interno;
4.2.2.10.3 Seletividade
a) Conceito/Teste
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em
presença de outros componentes da matriz, descartando qualquer possível interferência.
83
Para testar a seletividade do método proposto, oito diferentes lotes de plasma branco
(4 plasma normais, 2 plasmas hemolisados e 2 plasmas lipêmicos) foram extraídos
conforme o procedimento de extração anteriormente descrito e seus cromatogramas foram
comparados.
b) Critério de aceitação
A resposta de picos interferentes próximo ao tempo de retenção do analito devem
ser inferiores a 20% da resposta do analito nas amostras do LIQ enquanto as respostas
interferentes no tempo de retenção do PI devem ser inferiores a 5% da resposta do PI.
4.2.2.10.4 Linearidade
a) Conceito/Teste
A linearidade corresponde à capacidade do método de fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração do analito em função da curva de calibração
utilizada. Para avaliação da linearidade do método, foram preparadas curvas de calibração
em plasma em oito níveis de concentrações de dapaconazol (0.2-100 ng/mL). A equação de
regressão que descreve a curva de calibração é y= a+bx (1/X ponderado).
b) Critério de aceitação
Desvio ≤ 20% em relação à concentração nominal para o LIQ;
Desvio ≤15% em relação à concentração nominal para as outras
concentrações da curva de calibração;
84
No mínimo 75% dos pontos da curva de calibração devem cumprir com os
critérios anteriores, incluindo pelo menos uma das réplicas do LIQ e da
maior concentração da curva de calibração;
Coeficiente de correlação linear deve ser igual ou superior a 0.98;
4.2.2.10.5 Precisão e exatidão
a) Conceito/Teste
A precisão pode ser descrita como o grau de concordância entre os resultados de
análises individuais, quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma
amostra homogênea, nas mesmas condições de ensaio. É expresso como desvio padrão
relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula:
Já a exatidão, representa o grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados e um valor aceito como referência. É expresso como erro padrão relativo
(EPR), segundo a fórmula:
Para avaliar a precisão e a exatidão do método analítico desenvolvido foram
utilizadas três concentrações distintas de CQs (CQB, CQM, CQA), onde se avaliou o uso
de sete determinações para cada concentração. Foram avaliadas a precisão e a exatidão com
85
base numa mesma corrida (intra-corrida) e com base em corridas realizadas em dias
diferentes (intercorrida).
b) Critério de aceitação
Precisão: para cada nível de concentração o CV não deve exceder 15%,
com tolerância de 20% para o LIQ.
Exatidão: valores médios de cada uma das concentrações devem estar entre
85-115% do valor nominal, com tolerância de 80-120% para o LIQ.
4.2.2.10.6 Recuperação
a) Conceito/Teste
A recuperação mede a eficiência do procedimento de extração proposto para o
analito e padrão interno e deve ser realizada comparando-se os resultados analíticos de
amostras extraídas a partir de três concentrações (CQB, CQM, CQA), contemplando a faixa
de linearidade do método, com os resultados obtidos com soluções padrão não extraídos
que correspondem a 100% de recuperação. O cálculo é feito em função da relação da área
do padrão extraído e não extraído, tanto para o analito quanto para o padrão interno
separadamente.
86
b) Critério de aceitação
Níveis de porcentagens de recuperação do analito e do padrão interno próximo a
100% são desejáveis, porém admitem-se valores menores desde que a recuperação seja
precisa e exata para todos os níveis de concentração.
4.2.2.10.7 Efeito matriz
a) Conceito/Teste
O teste de efeito matriz é realizado em dois níveis de concentração (CQB e CQA)
comparando-se a razão entre soluções de fase móvel com dapaconazol e amostras não
extraídas, com dapaconazol adicionado aos resíduos de plasma. Para cada amostra deve ser
obtido o fator de matriz normalizado (FMN) por PI, conforme a fórmula abaixo:
b) Critério de aceitação
O coeficiente de variação dos FMNs relativos a todas as amostras deve ser inferior a
15%.
4.2.2.10.8 Testes de estabilidade
A estabilidade do fármaco em líquidos biológicos depende de suas propriedades
químicas, da matriz biológica e do material de acondicionamento utilizado, sendo que a
estabilidade determinada para um tipo de matriz e de material de acondicionamento
específico não pode ser extrapolada para outros.
87
Para medir a estabilidade do fármaco uma série de amostras foi preparada das
soluções de trabalho utilizadas para as amostras controle de qualidade. Três alíquotas de
cada concentração foram processadas a fresco e imediatamente quantificadas a fim de
fornecer os valores de referência (fresco) e os plasmas restantes da mesma preparação
foram armazenados em diferentes conjuntos e processados posteriormente para os seguintes
testes (ciclos de descongelamento e congelamento e curta duração).
Os ensaios de estabilidade devem reproduzir as reais condições de manuseio e
análise das amostras, devendo ser avaliada a estabilidade do analito durante a coleta e
manuseio da amostra, após armazenagem de longa duração (congelamento) e curta duração
(à temperatura ambiente), após ciclos de congelamento e descongelamento e nas condições
de análise. Também se deve incluir a avaliação da estabilidade do analito nas soluções
padrão. As determinações de estabilidade devem utilizar um conjunto de amostras,
preparadas a partir de uma solução estoque recente do fármaco em análise, adicionado à
matriz biológica isenta de interferência. A seguir segue um resumo dos testes de
estabilidade realizados:
Tabela 13: Testes de estabilidade
Teste de Estabilidade Tempo Temperatura
Auto injetor 45 horas e 55 minutos 8 °C
Congelamento e descongelamento 3 ciclos -20°C
Curta duração 7 horas e 30 minutos T°C ambiente
Longa duração 174 dias -20°C
Solução padrão de dapaconazol 7 dias 4°C
Solução de trabalho de dapaconazol 7 dias 4°C
88
89
5.RESULTADOS
90
5.1 Análise por CLAE-EM/EM
O espectro de massa obtido utilizando-se o API 4000 (Sciex/Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA), equipado com uma fonte de ionização electrospray em modo
positivo e programado para operar no modo de monitoramento de múltiplas reações
(MRM) para o dapaconazol (A) e o tioconazol (B) é mostrado na figura abaixo, com os
respectivos pontos de fragmentação das moléculas.
Figura 9: Espectro de massa para o dapaconazol (A) e o tioconazol (B) utilizando o modo de
ionização positivo. As linhas pontilhadas indicam o ponto de fragmentação.
91
5.2 Rota de fragmentação
A rota de fragmentação proposta para o dapaconazol e o tioconazol é ilustrada na
figura abaixo. Quando um grupo metileno (-CH2) está ligado a um anel aromático (seja
benzênico ou heterocíclico, como no caso do tioconazol), e há um grupo ionizável nele (no
caso, o átomo de oxigênio), ocorre uma quebra heterolítica que o deixa carregado
positivamente e o anel se expande.
No caso de ser um benzeno (um tolueno, metilbenzeno), o grupo carregado se torna
um íon tropílio, um cátion anular de sete membros muito estável que, portanto, é o íon
característico, mesmo com a presença do grupo CF3 que é muito desativante de anel. O
mesmo ocorre para o tioconazol, que no caso desta proposta, o anel sofre uma expansão de
cinco para seis membros.
Figura 10: Via de fragmentação proposta para a dissociação do dapaconazol (A) e tioconazol (B).
Peso molecular: 415.1
Peso molecular: 159.2
Peso molecular: 387.0
Peso molecular: 131.0
92
5.3 Supressão iônica
Figura 11: Experimento de supressão iônica mostrando a linha de base após a injeção de um
plasma branco extraído. As setas indicam os tempos de retenção esperados para o analito (A) e o
padrão interno (B). As drogas foram infundidas a uma taxa de 50µL/min na concentração de
10ng/mL.
5.4 Validação da metodologia analítica
5.4.1 Teste de carry-over (TCO)
Comparando-se os cromatogramas obtidos pelo teste de carry-over foi aprovado o
sistema de lavagem do método pela ausência de picos interferentes nos cromatogramas
analisados.
5.4.2 Teste de cross-talk (TCT)
O teste de cross-talk (TCT) que tem por finalidade validar o sistema de detecção do
método foi aprovado pela ausência de picos interferentes nas transições monitoradas nos
cromatogramas correspondentes ao analito e ao PI.
93
5.4.3 Seletividade
A seletividade foi aprovada pela injeção do pool de plasma humano branco nos
diferentes tipos (normal, hemolisado e lipêmico). O tempo de retenção para o dapaconazol
e tioconazol foram 2.07 ± 0.3 min e 2.23 ± 0.3 min, respectivamente. Nenhuma
interferência foi observada nos cromatogramas na região do tempo de retenção do analito e
do padrão interno (figura 12).
Figura 12: Cromatogramas de plasma branco e amostras processadas LIQ.
94
5.4.4 Linearidade
A equação de regressão que descreve a curva de calibração para o dapaconazol é y=
a+bx (1/X ponderado). Três curvas de calibração preparadas independentemente de
diferentes soluções padrão foram avaliadas durante a validação. As curvas se mostraram
linear para concentrações de 0.2-100 ng/mL.
Figura 13: Gráfico representativo da curva de calibração para o dapaconazol.
5.4.5 Precisão e Exatidão
O LIQ do método desenvolvido foi 0.2 ng/mL e os valores de precisão e exatidão
encontrados estão de acordo com as normas da ANVISA e FDA (precisão menor que 20%
e exatidão entre 80-120%).
95
Os CQs nas concentrações baixa, média e alta também se encontram validados, pois
estão de acordo com os parâmetros do FDA e ANVISA (precisão menor que 15% e
exatidão entre 85-115%).
Tabela 14: Precisão e exatidão intra e inter corrida para as amostras controle de qualidade e para o
limite inferior de quantificação.
Parâmetro Concentração nominal de dapaconazol (ng/mL)
0.2 (LIQ) 0.6 (CQB) 40 (CQM) 80 (CQA)
Média (n = 7)
(ng/mL)
0.2 0.6 43.2 85.7
Precisão (%) 6.0 3.1 2.1 0.9
Exatidão (%)
113.9 107.4 108.1 107.1
Média(n = 7) (ng/mL)
0.2 0.6 40.4 81.6
Precisão (%) 10.6 6.1 5.3 4.0
Exatidão (%) 108.8 102.0 101.2 102.0
5.4.6 Recuperação e efeito matriz
A taxa de recuperação para o dapaconazol em plasma humano foi 81.5 ± 3.9%, 85.6
± 3.3% e 90.8 ± 0.7% (n=5 para cada concentração) nas concentrações de 0.6, 40 and 80
ng/mL, respectivamente. Já para o padrão interno, tioconazol, na concentração de 300
ng/mL a recuperação foi 88.2 ± 3.2%. Nenhum efeito matriz significante foi observado
(tabela 15).
Tabela 15: Efeito matriz no método de CLAE-EM/EM para a quantificação de dapaconazol em
plasma humano.
Concentração
(ng/mL)
FMN CV (%)
0.6 0.98 5.20
80 0.99 5.30
Intra-
corrida
Inter-
corrida
96
5.4.7 Testes de estabilidade
Os testes de estabilidade mostram que o analito é estável diante das condições
testadas na validação e não apresenta degradação significativa nas temperaturas e períodos
especificados na metodologia (tabela 16).
Tabela 16: Testes de estabilidade para o dapaconazol.
5.5 Determinação de dapaconazol nas amostras dos voluntários
A avaliação farmacocinética das amostras de plasma provenientes de um estudo fase
I mostrou uma baixa absorção de dapaconazol quando aplicado topicamente na pele
saudável. Três voluntários foram dropout e não participaram dos cálculos, sem haver
comprometimento do tratamento estatístico. O método descrito detectou o dapaconazol em
Estabilidade Amostra CQ
(ng/mL)
Concentração nominal de dapaconazol (ng/mL)
Média Precisão (%) Exatidão (%)
Curta duração
(7.5h) 0.6 0.58 6.2 96
80 83.7 3.2 104.63
Pós-preparo (46h) 0.6 0.61 7.9 100.83
80 87 5 108.75
Congelamento-
descongelamento
(3 ciclos)
0.6 0.55 4.2 91.17
Longa duração
(174 dias)
0.6 0.67 6.2 112.2
80 87.8 0.8 109.8
97
apenas 8% (33/412) das amostras recolhidas, com níveis de concentrações plasmáticas que
variaram de 0.24-8.0 ng/mL.
As amostras dos voluntários que receberam doses até 10 mg não teve níveis
detectáveis. Nas amostras dos voluntários que receberam 25 e 50 mg de dapaconazol
apenas 13.6% (8/59) das amostras apresentaram níveis detectáveis variando de 0.5-6.6
ng/mL. Nas amostras provenientes das doses de 100, 150 e 250 mg, apenas 14.2% (23/161)
tiveram níveis detectáveis entre 0.42 e 8.0 ng / mL.
5.6 Dados farmacocinéticos
A figura 14 representa a curva aritmética média das concentrações plasmáticas de
dapaconazol versus tempo após administração de cada uma das doses propostas.
Figura 14: Concentração plasmática de dapaconazol em função do tempo (n=33).
98
99
6. DISCUSSÃO
100
Os antifúngicos azólicos são os mais utilizados na prática clínica para o tratamento
das dermatofitoses e o aumento da resistência a estes agentes juntamente com o aumento no
número de pacientes propensos a adquirir infecções se tornaram um problema comum no
manejo deste tipo de infecção (Havlickova et al., 2008; White et al., 1998). Diante deste
quadro torna-se necessário a pesquisa e o desenvolvimento de novos agentes que sejam
eficazes no tratamento tópico das infecções fúngicas. Um agente antifúngico que apresente
um bom perfil de segurança e eficácia e uma menor chance de desenvolvimento de
resistência é sempre bem vindo ao mercado.
O presente trabalho apresenta um novo antifúngico imidazólico com potencial
terapêutico para o tratamento de dermatofitoses desenvolvido pela Biolab, que ainda está
em fase de desenvolvimento clínico: o dapaconazol. O composto passou por fase I de
pesquisa clínica, onde se avaliou a segurança e tolerabilidade da aplicação tópica de tosilato
de dapaconazol em voluntários sadios, além da análise farmacocinética do composto
(velocidade e extensão da absorção).
Existem diversos métodos analíticos para a quantificação de antifúngicos azólicos
descritos na literatura baseados em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massa em tandem (CLAE-EM/EM) (Speed et al., 1995), cromatografia
líquida de alta eficiência com detecção de luz ultravioleta (CLAE-UV) (Speed et al., 1995),
e cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada à espectrometria de massa em tandem
(CLUE-EM/EM) (Decosterd, 2010).
Neste trabalho, foi desenvolvido e validado um método de CLAE-EM/EM para a
quantificação de dapaconazol em plasma humano em amostras provenientes de um estudo
101
fase I. O tioconazol foi selecionado como padrão interno para o dapaconazol devido à
semelhança estrutural entre estes compostos.
O desenvolvimento de um método de CLAE-EM/EM é influenciado por diversos
parâmetros que estão diretamente relacionados ao resultado final. Experimentos de infusão
do analito e do padrão interno, ambos na concentração de 1µg/mL, foram realizados para
definir o modo de ionização e otimizar as condições do espectrômetro de massa para
fornecer a seletividade necessária ao estudo.
A fonte de ionização utilizada foi electrospray, que corresponde a uma fonte de
ionização branda para análise de biomoléculas de média a alta polaridade compatível com a
maioria dos solventes utilizados em CLAE (Griffiths et al., 2001). Foram testados os
modos positivo e negativo de ionização por electrospray, sendo a melhor resposta
observada no modo positivo devido às características básicas da molécula do analito e do
padrão interno que possuem uma maior tendência a protonar.
Os parâmetros potencial de declustering, energia de colisão e potencial de saída da
célula de colisão foram otimizados para operação do espectrômetro de massa no modo de
monitoramento de reações múltiplas (MRM). O potencial de declustering como o próprio
nome indica é um potencial aplicado ainda na fonte de ionização para desfazer possíveis
interações entre o analito e moléculas da fase móvel. Já a energia de colisão está
relacionada com a fragmentação dos íons na câmara de colisão. Por fim, o potencial de
saída da célula é um parâmetro que direciona os fragmentos provenientes da câmara de
colisão até o detector.
102
Os parâmetros cromatográficos devem ser definidos após a definição dos
parâmetros EM/EM e envolve: a) escolha de uma coluna cromatográfica apropriada, b)
seleção dos solventes e aditivos da fase móvel, os quais podem afetar tanto a cromatografia
quanto o processo de ionização, c) determinação do fluxo, d) determinação da temperatura
da coluna que tem efeito na separação cromatográfica e, e) escolha dos parâmetros típicos
de processamento dos cromatogramas. Nosso método cromatográfico proporcionou picos
com uma boa resolução tanto para o analito como para o padrão interno, com um tempo
total de corrida curto (3.8 min) requerido para a análise de centenas de amostras por dia
sem um processo extensivo de preparo.
Uma vez desenvolvido o método bioanalítico, é extremamente importante que ele
seja validado para garantir que gere resultados confiáveis e interpretáveis. Segundo a
ANVISA: “A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados”
(ANVISA, 2003). Um método ideal deve apresentar sensibilidade, ser seletivo para cada
analito, ter precisão e exatidão aceitáveis e ser reprodutível.
A determinação da seletividade é o passo primordial no desenvolvimento e
validação de um método bioanalítico e deve ser avaliada continuamente durante a validação
e subsequente uso do método (Grangeiro Júnior et al., 2004). Este parâmetro deve ser
avaliado através da observação da ausência de picos nos tempos de retenção do analito e do
padrão interno. Através da análise visual dos cromatogramas constatamos que o método
desenvolvido foi seletivo para o dapaconazol.
103
Ainda como partes integrantes do desenvolvimento do método foram realizados
inicialmente os testes carry over e cross talk que visam avaliar, respectivamente, o sistema
de lavagem e o sistema de detecção. O TCO foi aprovado pela ausência de picos
interferentes nos cromatogramas analisados enquanto o TCT foi aprovado pela ausência de
picos interferentes nas transições monitoradas nos cromatogramas correspondentes ao
analito e ao PI.
O método mostrou-se linear para a faixa de concentração testada de 0.2 ng/mL- 100
ng/mL com um coeficiente de correlação r ˃ 0.99 nas três listas de validação. A variação
nos valores de concentração do LIQ em relação ao seu valor nominal estava dentro do
limite de ±20% estabelecido pela ANVISA e o das amostras controle de qualidade dentro
de ± 15%, sendo que 75% dos pontos devem satisfazer estas condições.
A precisão e exatidão do método foram avaliadas dentro de uma mesma corrida
analítica (intra-lote) e em corridas analíticas de dias diferentes (inter-lote) para o limite
inferior de quantificação e as amostras controles de qualidade. O método mostrou ter uma
precisão e exatidão aceitáveis dentro de ±10%.
Outro parâmetro importante durante a quantificação de fármacos em matrizes
biológica complexas é a investigação do efeito matriz que deve ser avaliado durante o
desenvolvimento e validação de um método bioanalítico. O efeito matriz se dá quando
substâncias não monitoradas coeluem da matriz podendo afetar a detecção dos analitos e a
eficiência do processo de ionização, existindo duas maneiras de avaliá-lo: teste de
supressão iônica e fator de matriz normalizado (Cassiano, N.M et al., 2009). Nossos
resultados mostraram que nenhum efeito matriz significante foi observado.
104
Os testes de estabilidade indicaram que o analito se manteve estável durante as
condições de manuseio das amostras. Os resultados mostraram que ele foi estável por um
período de 7:30 h de bancada, até 46 h no autosampler, a 3 ciclos de congelamento e
descongelamento e 174 dias estocados em refrigerador.
O LIQ do nosso método, ou seja, a menor quantidade de dapaconazol que pôde ser
quantificada com precisão e exatidão aceitáveis foi de 0.2 ng/mL e foi adequado ao
objetivo do nosso estudo. Em estudos internos realizados em nosso laboratório com outros
imidazólicos de estruturas similares os LIQs obtidos foram 0.1 ng/mL e 0.5 ng/mL para o
fenticonazol e miconazol, respectivamente (dados internos não publicados). Em um estudo
fase I de segurança e tolerabilidade de uma solução 10% de luliconazol (imidazólico) o LIQ
obtido foi 0.05 ng/mL (Jones & Tavakkol, 2013).
A metodologia validada foi aplicada para a quantificação de dapaconazol em
amostras provenientes de um estudo fase I, mostrando uma baixa absorção sistêmica de
dapaconazol após a aplicação tópica, com apenas cerca de 20% das amostras apresentando
mais do que o LIQ e o mais elevado nível de plasma detectado de 8.04 ng/mL em apenas
uma amostra. Esses níveis de plasma são semelhantes aos níveis gerados por outros azóis
de aplicação tópica.
Em um estudo para avaliação de tolerabilidade tópica e geral, potencial de
sensibilização e disponibilidade sistêmica de eberconazol 2%, um novo antifúngico tópico
imidazólico, todas as concentrações plasmáticas de eberconazol ficaram abaixo do limite de
quantificação de 5 ng/mL do método desenvolvido (Barbanoj et al., 2005). Outro estudo
com nitrato de miconazol 2% creme em crianças com dermatite de fralda, 80% das
105
amostras tiveram níveis detectáveis que variaram de 5.2-7.4 ng/mL (Eichenfield & Bogen,
2007). Estes dados sugerem que a aplicação tópica do tosilato de dapaconazol, na
formulação avaliada, tem um perfil de permeabilidade cutânea comparável a outros
antifúngicos imidazólicos de estruturas similares e sugerem que a absorção sistêmica de
dapaconazol após aplicação tópica é clinicamente insignificante.
106
107
7.CONCLUSÃO
108
109
Foi desenvolvido e validado um método de cromatografia líquida da alta eficiência
acoplada à espectrometria de massa em tandem para a quantificação de dapaconazol em
plasma humano para fins analíticos. Este método teve seletividade satisfatória com um
limite de quantificação de 0.2 ng/mL e um tempo de corrida curto. A quantificação do
dapaconazol em plasmas humanos provenientes de um estudo de fase I mostrou que a
absorção sistêmica do dapaconazol após aplicação tópica é clinicamente negligenciável.
110
111
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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119
.
9. ANEXOS
120
Anexo I- Artigo publicado em revista científica
121
122
123
124
125
126
ANEXO II- Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Estudo Clínico Fase 1 do Composto BL123 com doses crescentes
em voluntários sadios do sexo masculino.
Protocolo número 023/12
Você está sendo convidado a participar de um estudo clínico com o objetivo de verificar a
segurança da administração em seres humanos de um novo medicamento, o BL123. O
responsável deste estudo é o Prof. Dr. Gilberto De Nucci e está sendo patrocinado pela
Biolab Sanus Farmacêutica Ltda. Sua participação é importante, porém, você não deve
participar contra a sua vontade. Leia atentamente as informações abaixo e faça qualquer
pergunta que desejar, para que todos os procedimentos desta pesquisa sejam esclarecidos.
NATUREZA E PROPÓSITO DO ESTUDO
O objetivo deste estudo clínico é verificar a segurança da administração em seres humanos
de um novo medicamento, conhecido por BL123. Além disto, pretende-se verificar os
níveis que esse medicamento atinge no sangue após a aplicação na pele em diferentes
concentrações.
Você receberá o mesmo composto BL123 em 3 concentrações diferentes, cada uma em
uma ocasião diferente em ordem crescente de concentração.
PROCEDIMENTOS A SEREM REALIZADOS E RESPONSABILIDADES
Antes de sua participação neste estudo clínico você será convidado a ir até a nossa unidade
clínica para avaliar a sua condição de saúde. Você será examinado por um médico que lhe
fará um exame completo, medindo o seu pulso, sua temperatura e sua pressão arterial.
Também será feito um exame do coração (eletrocardiograma). O médico lhe perguntará se
você teve ou tem alguma doença e se você faz uso de algum medicamento. Após a consulta
127
médica você será orientado a comparecer a um posto do laboratório de análises clínicas
conveniado para a coleta de exames laboratoriais. Os exames laboratoriais incluem:
(Análise hematológica) Hemoglobina, hematócrito, contagem total e diferencial de
leucócitos, contagem de glóbulos vermelhos, contagem e plaquetas; (Análise bioquímica)
Uréia, creatinina, bilirrubina total, proteínas totais, albumina, glicose em jejum, fosfatase
alcalina, SGOT (transaminase glutâmico oxalacética), SGTP (transaminase glutâmico
pirúvica), colesterol total, triglicérides, ácido úrico e GT (gamaglutamiltransferase);
(Urina) urina I; (Sorologia) Análise Sorológica para hepatite B, hepatite C e HIV(1+2)
(análise sorológica para Síndrome de Imunodeficiência Adquirida).
Após a aprovação dos exames de laboratório será feito um teste para verificar se o creme
utilizado como base para aplicação do medicamento, sem conter a substância em estudo
(BL123) provoca alguma reação em você. Para tanto, você comparecerá à clínica onde será
aplicado em suas costas um creme sem conter qualquer medicamento, para verificar se só o
creme em si lhe provoca alguma reação. Será necessário aguardar por cerca de 30 minutos
para se verificar se ocorre algo, sendo que a área de aplicação (sem que apareça seu rosto)
será fotografada e/ou filmada para fins de documentação do estudo. Se ocorrer alguma
reação de hipersensibilidade, tal como vermelhidão, coceira,
entre outros, você não poderá participar deste estudo, o que não lhe impede de participar de
qualquer outro estudo que esteja sendo conduzido na clínica.
Você será informado se foi aprovado em todas as avaliações realizadas e, neste caso, será
informado sobre as datas que você deverá comparecer à Clínica para a realização dos
procedimentos do estudo.
128
Durante o estudo, você deverá comparecer à Clínica 3 vezes, onde você ficará por
aproximadamente 8 horas. Estes 3 comparecimentos ocorrerão com um intervalo de 7 dias
entre eles. Em cada ocasião serão realizados os seguintes procedimentos:
a) será pega uma veia em algum local de seus braços para coleta de sangue necessária
durante o estudo;
b) será aplicado na pele em um dos lados de suas costas 5 gramas do creme contendo o
produto que está sendo testado (BL123) e, no outro lado, 5 gramas da base do creme (creme
sem a medicação) para fins de controle de alguma reação;
c) serão coletadas 4 amostras de sangue de 7 mL cada e mais uma amostra de 40mL antes
da administração da medicação (somente na primeira internação) para o controle do
método. As coletas serão realizadas através de agulha introduzida em veia superficial para a
dosagem do medicamento;
d) serão batidas fotos ou feito uma filmagem da área das costas em que o creme foi
aplicado (sem deixar que seu rosto apareça) para documentação do estudo;
e) em intervalos regulares, será verificada sua pressão, pulso e temperatura;
f) serão, também, servidas refeições padronizadas (lanche da manhã, almoço e lanche da
tarde) ou bebidas em horários preestabelecidos. Após a coleta de 6 horas da medicação,
você receberá alta da Clínica.
No intervalo entre os comparecimentos e após o último (3º) comparecimento (dias em que
você comparece à clínica para aplicação do creme e coleta de amostras), você deverá ir ao
laboratório conveniado (data a ser informada pela equipe) para a coleta de exames
laboratoriais que incluem: (Análise hematológica) Hemoglobina, hematócrito, contagem
total e diferencial de leucócitos, contagem de glóbulos vermelhos, contagem de plaquetas;
(Análise bioquímica) uréia, creatinina, bilirrubina total, proteínas totais, albumina, glicose
129
em jejum, fosfatase alcalina, SGOT (transaminase glutâmico oxalacética), SGTP
(transaminase glutâmico pirúvica), colesterol total, triglicérides, ácido úrico e _GT
(gamaglutamiltransferase); (Urina) urina I. Em cada uma destas
ocasiões serão coletados cerca de 7 mL de sangue.
Após a realização de todos os exames laboratoriais do último comparecimento você deverá
retornar à Clínica para a consulta de alta, em data a ser agendada pela equipe, e
recebimento do ressarcimento.
Cerca de 90 dias após (data a ser informada pela equipe), você deverá novamente retornar
ao laboratório de análises clínicas, ocasião em que serão coletados mais 7 mL de sangue
para a repetição dos mesmos exames citados acima.
Por fim, após a realização destes exames laboratoriais você deverá comparecer à Clínica
para consulta médica (chamada de “avaliação de segurança tardia”), em data a ser agendada
pela equipe, ocorrendo então a alta do estudo, a não ser que você apresente algum problema
que, segundo o médico, seja necessário lhe acompanhar por mais tempo.
Durante todo o estudo será colhido um total de aproximadamente 163 mL de sangue.
A duração total de sua participação na pesquisa está estimada em 135 dias, a contar do
primeiro dia de medicação, após o processo de seleção.
RESPONSABILIDADES
É condição indispensável, para participação no ensaio clínico, que você esteja em boa
saúde e, portanto, não esteja no momento sob tratamento médico ou fazendo uso de
quaisquer medicações (a não ser que liberadas pelo pesquisador) e que tampouco tenha
participado de outro estudo clínico com medicamentos nos últimos 12 meses.
Algumas regras deverão ser seguidas para sua participação no estudo:
130
a) não pode ser dependente de drogas ou álcool e caso o pesquisador tenha alguma suspeita,
poderá solicitar exame de urina para detecção do uso de drogas;
b) não pode ter doado (ou retirado/perdido por qualquer motivo) sangue ou plasma dentro
dos três meses que antecedem o estudo ou ter efetuado 4 doações no período de um ano
antes do estudo.
É ainda de sua responsabilidade, em relação a sua participação no estudo clínico:
a) comparecer à Clínica nas datas e horários informados;
b) seguir as orientações de restrição de alimentos nos dias de permanência na clínica;
c) responder aos questionamentos sobre qualquer efeito indesejável da medicação;
d) Ingerir a alimentação e líquidos que tenham sido previstos;
e) retornar nas datas, horários e locais combinados para realização de exames laboratoriais
e consultas de alta. Por ser importante para usa própria segurança, esses exames devem ser
realizados independentemente de haver sido interrompida sua participação no estudo ou de
sua desistência.
POSSÍVEIS RISCOS E DESCONFORTOS
A administração do produto sob investigação (BL123) pode causar várias reações, tais
como: reações locais passageiras no local da aplicação, como palidez, eritema
(vermelhidão) e edema. Além dos efeitos citados, a administração de qualquer
medicamento pode causar reações imprevisíveis.
A retirada de sangue é um procedimento seguro e pode causar um leve desconforto, além
de uma mancha roxa no local da picada que frequentemente desaparece sem maiores
problemas.
BENEFÍCIOS OU COMPENSAÇÕES
131
A participação neste estudo não tem o objetivo de submetê-lo a um tratamento médico.
Consequentemente, não se espera que a sua participação no estudo traga qualquer benefício
em função do tratamento. Entre os benefícios esperados estaria o desenvolvimento de um
novo para o tratamento de micoses.
EFEITOS INDESEJÁVEIS
Se você sofrer algum efeito desagradável em decorrência direta de sua participação no
estudo, você receberá tratamento neste centro de pesquisa, sem qualquer custo. Se por
qualquer motivo você não puder ser atendido na clínica do centro de pesquisa (situação de
emergência, por exemplo), você poderá também se dirigir ao ICC – Hospital e Pronto
Socorro do Coração Ltda., localizado na Av. Andrade Neves Nº 655, Campinas,
informando que é “voluntário da Galeno”. Não haverá, no entanto, qualquer compensação
de ordem financeira em função do ocorrido, a não ser que a condição faça jus de
indenização por danos, com previsto na Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.
Ao assinar este termo você não está renunciando a qualquer direito legal que você possui.
Este centro de pesquisa, com a finalidade de subsidiar a responsabilidade do Patrocinador
em relação ao pagamento de possíveis ressarcimento por danos, contratou pelo período de
180 dias, a partir da data da assinatura deste termo e efetivação da participação no estudo
(primeiro dia de aplicação da medicação), um seguro de vida em grupo.
RESSARCIMENTO
Se você participar de todas as etapas deste estudo você será ressarcido das despesas com o
transporte, alimentação e o tempo despendido na realização do estudo clínico (R$ 810,00 -
oitocentos e dez reais). Esse ressarcimento ocorrerá na primeira consulta médica após o
término dos dias de aplicação do creme. Caso você falte a alguma atividade do estudo,
receberá um valor de ressarcimento proporcional às atividades que você participou. Cerca
132
de 90 dias após, ao realizar os exames de laboratório e comparecer na última consulta do
estudo (a consulta que denominamos “avaliação de segurança tardia”) você receberá um
adicional de R$ 50,00 (cinquenta reais) como ressarcimento das despesas de alimentação e
transporte e tempo despendido no estudo. Fica também esclarecido que a desistência ou
dispensa antes do comparecimento para o primeiro dia de aplicação da medicação (creme)
não dá direito a ressarcimento. Caso você tenha sido convocado para o estudo na condição
de "voluntário reserva" e seja dispensado da participação em função do comparecimento de
número suficiente do conjunto de voluntários normalmente convocados, caberá a você o
ressarcimento de R$ 30,00 (trinta reais) por conta deste comparecimento, a ser quitado no
encerramento do estudo.
Estima-se que, durante o período de participação no estudo, você terá como despesa apenas
os gastos de deslocamento de sua residência ou trabalho até a clínica ou laboratório para a
realização de exames, consultas, ou participação também na clínica dos dias de aplicação
do medicamento e coleta de amostras. Ainda devem ser previstas eventuais visitas
posteriores para acompanhamento de eventos adversos (efeitos indesejáveis). O
ressarcimento destas despesas já está incluído no valor estabelecido no item acima.
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA
Sua participação é voluntária e você tem a liberdade de desistir ou interromper a
participação neste estudo no momento que desejar. Neste caso, você deve informar
imediatamente sua decisão ao pesquisador ou a um membro de sua equipe, sem necessidade
de qualquer explicação e sem que isto venha interferir no seu atendimento neste centro de
pesquisa.
Todas as informações e esclarecimentos necessários para poder decidir conscientemente
sobre a sua participação no referido ensaio clínico estão sendo informadas através deste
133
processo de obtenção do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Sinta-se livre para
fazer qualquer pergunta e, se desejar, consulte outras pessoas antes de decidir em participar
ou não deste estudo clínico.
Independente de seu desejo e consentimento, sua participação neste estudo clínico poderá
ser interrompida, em função a) da ocorrência de eventos adversos; b) da ocorrência de
qualquer doença que, a critério médico, prejudique a continuação de sua participação no
estudo; c) do não cumprimento das normas estabelecidas; d) de qualquer outro motivo que,
a critério médico, seja do interesse de seu próprio bem estar ou dos demais participantes; e)
da suspensão do estudo como um todo, situação que só ocorrerá após aprovação do Sistema
CEP/CONEP que aprovou a realização deste estudo. Nos outros casos, o Sistema
CEP/CONEP será imediatamente comunicado sobre o motivo da suspensão do estudo.
Você será informado sempre que houver alguma informação adicional que possa
influenciar seu desejo de continuar participando no estudo e prestará qualquer tipo de
esclarecimento em relação ao progresso da pesquisa, conforme sua solicitação. A
interrupção não causará prejuízo ao seu atendimento, cuidado e tratamento pela equipe do
centro de pesquisa.
DIVULGAÇÃO DE INFORMAÇÕES QUANTO A PARTICIPAÇÃO NO
ESTUDO
Os responsáveis pela condução deste estudo garantem a você sigilo e confidencialidade no
tratamento de seus dados. Os registros que possam identificar sua identidade serão
mantidos em sigilo, a não ser que haja obrigação legal de divulgação. Dados que permitam
sua identificação não serão revelados por ocasião da publicação dos resultados obtidos.
Todos os envolvidos na análise de seus dados estão obrigados e garantem a manutenção do
sigilo e confidencialidade acima expressos. Ao assinar este
134
Termo de consentimento livre e esclarecido você está também autorizando tal acesso aos
dados anteriormente coletados mesmo se você se retirar do estudo.
CONTATOS E PERGUNTAS
Você poderá contatar o Dr. Gilberto De Nucci, a farmacêutica Marinalva Sampaio, ou o
médico atendente para receber informações adicionais relacionadas à pesquisa ou quanto
aos seus direitos como voluntário. Os telefones para contato com o Dr. GILBERTO DE
NUCCI são: Residência: (19) 3251-6928; Clínica: (19) 3243-2767 e Celular: (19) 9178-
8879 / 8139-7522 (nas 24 horas do dia). A farmacêutica Marinalva Sampaio ou o médico
atendente podem ser encontrados na unidade clínica do centro de pesquisa, localizada na
Av. João Erbolato, 266 – Jardim Chapadão, no horário comercial, ou pelos telefones 3243-
2767 .
Caso surja alguma intercorrência, você deverá procurar a clínica do centro, localizada na
Av. João Erbolato, 266, que funciona das 8:00 às 17:00 horas, ou entrar em contato pelo
Fone 3243-2767 e solicitar que a mesma contate os médicos responsáveis pelo ensaio
clínico, ou então, entrar em contato diretamente com os mesmos nos telefones indicados
acima e no final deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Qualquer dúvida sobre os aspectos éticos deste estudo clínico ou sobre os seus direitos
como sujeito de pesquisa poderá ser respondida pelo Comitê de Ética em Pesquisa com
Seres Humanos da Universidade Estadual de Campinas, localizada na Rua Tessália Vieira
de Camargo, 126, Cidade Universitária da Unicamp, distrito de Barão Geraldo, ou pelo
telefone (19) 3521-8936, no horário das 08:30 às 11:30 horas ou das 13:00 às 17:00 horas.
O Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Estadual de
Campinas aprovou a realização deste estudo e é responsável pelo seu acompanhamento.
Se você concorda com o exposto acima leia e assine este documento.
135
Eu, ________________________________________________, com ______anos, RG nº
________________ declaro que é de livre e espontânea vontade que aceito participar como
sujeito de pesquisa voluntário no estudo clínico supracitado, de responsabilidade do Prof.
Dr. Gilberto De Nucci (Galeno Desenvolvimento de Pesquisas Ltda) e patrocinado pela
Biolab Sanus Farmacêutica Ltda.
Eu declaro que li cuidadosamente todo este documento denominado Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido e que tive a oportunidade de fazer perguntas sobre o
conteúdo do mesmo, tendo sido esclarecido sobre todos os aspectos deste estudo. As
explicações que recebi responderam por completo minhas dúvidas e afirmo estar livre e
espontaneamente decidindo participar do estudo.
Ao assinar este Termo de consentimento livre e esclarecido, eu também estou certificando
que toda a informação que eu prestei, incluindo minha história médica, é verdadeira e
correta até onde é de meu conhecimento, e declaro estar recebendo uma cópia deste
documento com todas suas páginas rubricadas e a página final assinada por mim e pelo
Pesquisador Responsável.
Ao assinar este Termo de consentimento livre e esclarecido estou autorizando o acesso às
minhas informações, conforme explicitado anteriormente.
Ao assinar este Termo de consentimento livre e esclarecido eu não renuncio qualquer
direito legal que eu venha a ter ao participar deste estudo.
Campinas, ____/____/______
_________________________________________________________
Assinatura do sujeito de pesquisa
_________________________________________________________
Assinatura da Testemunha (caso o sujeito de pesquisa não saiba ler)
136
Nome e RG:
_________________________________________________________
Assinatura do pesquisador responsável ou membro credenciado de sua equipe
Dr. GILBERTO DE NUCCI
137
Anexo III- Estrutura química do BL 123 e formulação antifúngica de
tosilato de dapaconazol (BL 123) na forma de creme.
Tabela 17: Formulação antifúngica na forma de Creme
Figura 15: Estrutura química do tosilato de dapaconazol (BL 123)
138
Anexo IV - Esquema de tratamento e definição das concentrações a serem
aplicadas em cada voluntário.
139
Anexo V- Concentração plasmática individual e parâmetros
farmacocinéticos (tabela 18)
140
141
142
143
144
Unidade de Concentração: ng/mL
N/A = amostra não disponível
NSA = Não se aplica a amostra de 24h