alteraciones del aparato de golgi y del trÁfico de
TRANSCRIPT
Wilson Orlando Rendoacuten Rodriacuteguez Beneficiario COLFUTURO 2008
UNIVERSIDAD DE MURCIA
FACULTAD DE MEDICINA
ALTERACIONES DEL APARATO DE GOLGI Y DEL TRAacuteFICO DE MEMBRANAS EN UN MODELO
CELULAR DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON
Wilson Orlando Rendoacuten Rodriacuteguez
2011
Agradecimientos
La fe es el don maacutes grande que puede recibir el ser humano y justamente yo me siento un privilegiado por ese regalo de Dios Por tanto mi agradecimiento inicial y el maacutes enorme es para Dios en quien confiacuteo porque los planes que tiene preparados para miacute son mejores que los que yo mismo puedo elegir Yo solo quiero poder alcanzar la capacidad de seguir enteramente sus pasos porque su guiacutea proteccioacuten y cuidados son verdaderos soacutelo Dios puede revelar el camino Recuerdo que cuando era un nintildeo mi madre siempre rellenaba la primera paacutegina en mis cuadernos de escuela y en uno de los guiones por debajo de mi nombre expresaba una frase de peticioacuten de alabanza y de amor a Dios palabras que sin lugar a dudas llegaron a oiacutedos de Dios SU respuesta siempre me acompantildea a pesar de mi condicioacuten tan mundana Te doy gracias Dios miacuteo por mantenerme siempre en tus brazos por darme un corazoacuten feliz por brindarme lo que es mejor para mi por mi familia y por todo lo que has creado
Quiero agradecer a mi familia en especial a mis padres que dariacutean su vida sin dudas por la felicidad de sus hijos Por la entrega de mi madre su entereza grandeza voluntad de acero energiacutea nobleza bondad humildad amor y por su estrategia para criar a sus hijos jejeje aunque le haya resultado un hijo un poco relajado A mi padre por soportar las adversidades del pasado pero sobre todo por tener las agallas de perseverar por su familia Agradezco a mis hermanos y hermanitas que me quieren incondicionalmente los amo con todo mi corazoacuten a Jhon ldquotacajhonrdquo a Luchito mijo a las ldquobarbasrdquo Giovi y Yeimi A toda mi familia mi abuela
mis tiacuteas tiacuteos primos y primas quienes siempre me recuerdan y me tienen en sus pensamientos y oraciones Tambieacuten agradezco a Lilia mi suegra una mujer que me quiere maacutes que a su hija a Mauro y a toda su familia que en todo momento estaacuten pendientes de nuestro bienestar A mi esposa que tomoacute la difiacutecil decisioacuten de acompantildearme en el camino de la vida aunque no lo tuviese faacutecil Lily muchas gracias por tu apoyo y amor Agradezco a mi gran amigo Victor simplemente por ser un verdadero amigo Ademaacutes quiero dar las gracias a Angelita por hacer de su casa un segundo hogar para miacute por su amor y por sus oraciones a mi nombre
Agradezco al doctor Gustavo Del Valle quien confioacute en mi impulsaacutendome y daacutendome la oportunidad de lanzarme al mundo de la transferencia del conocimiento
Agradezco al Dr Joseacute Aacutengel Martiacutenez por darme la oportunidad de pertenecer a tan excelente grupo de investigacioacuten por confiar en mi por escuchar mis humildes opiniones cientiacuteficas y por su ayuda profesional Quiero agradecer a la Dra Moacutenica Tomaacutes y a la Dra Emma Martiacutenez por su gran apoyo pero en especial por abrirme las puertas de la formacioacuten doctoral Nunca olvidareacute la oportunidad que me han dado mis tutores para hacer posible tan magniacutefica meta
Doy gracias por su compantildeiacutea y apoyo a todas las personas que componen el Departamento de Biologiacutea Celular e Histologiacutea a Teresa Zomentildeo Luis Miguel Irene Stenson Vicente Carlita Salvador mi compantildeerita Narci Mariacutea del Carmen Blanca y Esther tambieacuten a los Drs Manuel Avileacutes Juan Francisco Madrid Francisco Hernandez
Joseacute Ballesta Luis Miguel Pastor y a las Dras Mariacutea Joseacute Mariacutea Jimeacutenez Concepcioacuten y Adelina
Mis sinceros agradecimientos para el Servicio de Apoyo a la Investigacioacuten de la Universidad de Murcia en especial a Fara Antonio Teresa Maruja Manuela y Francisco Tambieacuten a la gente del Departamento de Bioquiacutemica por su ayuda teacutecnica
Jesuacutes le dijo Yo Soy el Camino la Verdad y la Vida
San Juan 146
ABREVIATURAS
6-OHDA 6-hidroxidopamina
AG Aparato de Golgi
ARN Aacutecido ribonucleico
ATP Adenosiacuten trifosfato
ATV Aacuterea tegmental ventral del cerebro
BFA Brefeldina A
BH Barrera hematoencefaacutelica
BSA Albuacutemina seacuterica bovina
CG Complejo de Golgi
CGN Red del cis-Golgi
COMT Catecol-O-metiltransferasa
DA Dopamina
EP Enfermedad de Parkinson
ERGIC Compartimento intermedio entre el retiacuteculo endoplaacutesmico y el aparato de Golgi
FBS Suero bovino fetal
GAP Proteiacutena activadora de las GTPasas
GDF Factor de disociacioacuten del GDI
GDI Factor inhibidor de la disociacioacuten del GDP ligado a Rab
GEF Factor de intercambio de nucleoacutetidos de guanina
GFP Proteiacutena verde fluorescente
GSH Glutatioacuten
IT Intermediario de transporte
KDEL r Receptor de la secuencia KDEL (lys-asp-glu-leu)
MAO Monoamino oxidasa
MAO-B Monoamino oxidasa tipo B
MET Metanfetamina
ABREVIATURAS
MPDP 1-metil-4-fenil 23 dihidropiridiacutenico
MPP+ 1-metil-4-fenilpiridinio (producto de la oxidacioacuten del 1-metil-4-fenil-23 dihidropiridiacutenico (MPDP)
MPTP 1-metil-4-fenil-1236-tetrahidropiridina
MTs Microtuacutebulos
NDMA Metilenedioximetanfetamina o ldquoEcstasyrdquo
NEM N-etilmaleimida
NGF Factor de crecimiento nervioso
NMDA Receptor ionotroacutepico de glutamato que responde al agonista N-metil D-aspartato
NOS Oxido niacutetrico sintasa
NSF Factor sensible a NEM
PFA Paraformaldehiacutedo
RE Retiacuteculo endoplaacutesmico
REt Retiacuteculo endoplaacutesmico transicional
ROS Especies reactivas de oxigeno
siRNA Aacutecido ribonucleico de interferencia
SNAP Proteiacutena soluble de unioacuten a NSF
SNARE Receptor de las proteiacutenas SNAP
SNC Sistema nervioso central
SNc Sustancia negra pars compacta
SNr Sustancia negra pars reticularis
SOD Superoacutexido dismutasa
SUP Sistema ubiquitina-proteasoma
TBS-T Tampoacuten salino tris con tweenreg 20
TGN Red del trans-Golgi
TH Tirosina hidroxilasa
t-SNARE SNARE ligada a la membrana diana
VND Vesiacuteculas de nuacutecleo denso
ABREVIATURAS
v-SNARE SNARE ligada a la membrana vesicular
VSVg Proteiacutena G del virus de la estomatitis vesicular
IacuteNDICE
I RESUMEN --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3
II INTRODUCCIOacuteN ----------------------------------------------------------------------------------------------- 7
III OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 13
IV REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA---------------------------------------------------------------------19
1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA ------------------------------------------ 19
11 Sintomatologiacutea de la enfermedad de Parkinson ----------------------------------------- 19
12 Aspectos generales sobre la dopamina ---------------------------------------------------- 20
13 Etiologiacutea de la enfermedad de Parkinson -------------------------------------------------- 22
14 Fisiopatologiacutea de la enfermedad de Parkinson ------------------------------------------ 25
15 Citopatologiacutea de la enfermedad de Parkinson ------------------------------------------- 27
16 Terapeacuteutica para la enfermedad de Parkinson ------------------------------------------ 29
161 Tratamiento convencional con faacutermacos antiparkinsonianos ---------------- 29
162 Cirugiacutea versus tratamiento farmacoloacutegico ------------------------------------------- 32
1621 Cirugiacutea de estimulacioacuten subtalaacutemica bilateral (STN-DBS) -------------- 32
1622 Palidotomiacutea y Talamotomiacutea -------------------------------------------------------- 32
163 Futuras dianas terapeacuteuticas en la enfermedad de Parkinson ---------------- 33
1631 Sobre mecanismos especiacuteficos del traacutefico intracelular ------------------- 33
1632 Incremento de sentildeales sobre receptores cannabinoides --------------- 33
1633 Vacuna para modificar el sistema inmunitario ------------------------------- 34
1634 Faacutermacos para contrarrestar la citotoxicidad de α-sinucleiacutena --------- 34
1635 Vacuna que contiene α-sinucleiacutena ----------------------------------------------- 34
1636 Medicina regenerativa ---------------------------------------------------------------- 35
1637 Terapia geacutenica -------------------------------------------------------------------------- 35
164 Terapias alternativas para la enfermedad de Parkinson ----------------------- 36
1641 Relacionadas a los aspectos nutricionales ---------------------------------- 36
1642 Biomarcadores en la enfermedad de Parkinson ---------------------------- 36
1643 Fisioterapia ------------------------------------------------------------------------------- 37
1644 Terapia ocupacional ------------------------------------------------------------------- 37
1645 Estimulacioacuten eleacutectrica transcraneal --------------------------------------------- 37
1646 Estiacutemulo sensorial repetitivo ------------------------------------------------------- 37
1647 Calidad de vida y eficacia ----------------------------------------------------------- 38
2 α-SINUCLEIacuteNA Y PARKINSON ------------------------------------------------------------------------ 39
21 Localizacioacuten de la proteiacutena α-sinucleiacutena --------------------------------------------------- 43
22 Papel fisioloacutegico de la proteiacutena α-sinucleiacutena ---------------------------------------------- 43
IacuteNDICE
23 Bioquiacutemica de la proteiacutena α-sinucleiacutena ----------------------------------------------------- 45
24 Posibles alteraciones que dan lugar a la agregacioacuten de α-sinucleiacutena ----------- 46
25 Papel citopatoloacutegico de la agregacioacuten de α-sinucleiacutena ------------------------------- 48
3 MODELOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS PARA ENFERMEDAD DE PARKINSON --------------------------------------------------------------------------------------------------- 50
31 Modelos animales ----------------------------------------------------------------------------------- 50
311 Parkinsonismo inducido por neurotoxinas ------------------------------------------- 50
3111 6-hidroxidopamina --------------------------------------------------------------------- 51
3112 1-metil-4-fenil-1236 tetrahidropiridina ---------------------------------------- 54
3113 Rotenona moneb y paraquat ----------------------------------------------------- 58
312 Otros modelos experimentales ---------------------------------------------------------- 59
3121 Animales deficientes en un gen especiacutefico o transgeacutenico -------------- 59
3122 Neuroinflamacioacuten en modelos de enfermedad de Parkinson ---------- 60
32 Modelos Celulares ---------------------------------------------------------------------------------- 61
321 Modelo con ceacutelulas PC12 ----------------------------------------------------------------- 61
3211 Tratamiento con 6-hidroxidopamina en ceacutelulas PC12 -------------------- 63
3212 Tratamiento con metanfetamina en ceacutelulas PC12 ------------------------- 64
3213 Tratamiento con MPTP en ceacutelulas PC12 -------------------------------------- 65
322 Otros modelos celulares utilizados para enfermedad de Parkinson ------- 66
4 TRAacuteFICO FUNCIONAL EN NEURONAS ---------------------------------------------------------- 67
41 Transporte intracelular ---------------------------------------------------------------------------- 67
42 Organizacioacuten estructural y transporte de la viacutea secretora ---------------------------- 68
421 Retiacuteculo Endoplaacutesmico --------------------------------------------------------------------- 69
422 Compartimento intermedio o ERGIC -------------------------------------------------- 70
423 Complejo de Golgi ---------------------------------------------------------------------------- 72
424 Red del trans-Golgi -------------------------------------------------------------------------- 73
425 Neuroexocitosis ------------------------------------------------------------------------------- 74
43 Proteiacutenas reguladoras del transporte -------------------------------------------------------- 76
431 Proteiacutenas Rab GTPasas ------------------------------------------------------------------- 76
44 Proteiacutenas de anclaje y fusioacuten ------------------------------------------------------------------- 78
441 Proteiacutenas SNARE ---------------------------------------------------------------------------- 79
442 Proteiacutenas de aproximacioacuten ---------------------------------------------------------------- 81
45 Citoesqueleto ----------------------------------------------------------------------------------------- 81
451 Microtuacutebulos ------------------------------------------------------------------------------------ 82
IacuteNDICE
452 Actina --------------------------------------------------------------------------------------------- 83
5 TRAFICO ALTERADO EN MODELOS DE ENFERMEDAD DE PARKINSON ------- 84
V MATERIALES Y MEacuteTODOS ---------------------------------------------------------------------------- 91
1 REACTIVOS UTILIZADOS -------------------------------------------------------------------------------- 91
2 CULTIVO CELULARES ------------------------------------------------------------------------------------- 98
3 TRATAMIENTOS --------------------------------------------------------------------------------------------- 99
4 ENSAYOS DEL TRANSPORTE ---------------------------------------------------------------------- 100
41 Anaacutelisis del transporte retrogrado y anteroacutegrado mediante el uso de BFA ------ 100
42 Ensayos del transporte utilizando la proteiacutena G del VSV (VSVg-GFP) ----------- 101
5 INMUNOFLUORESCENCIA -------------------------------------------------------------------------- 101
6 ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR ----------------------------------------------------------- 103
7 INMUNODETECCIOacuteN DE PROTEIacuteNAS POR WESTERN BLOTTING --------------- 103
71 Extraccioacuten de proteiacutenas ---------------------------------------------------------------------------- 103
72 Electroforesis ------------------------------------------------------------------------------------------- 104
73 Western Blot -------------------------------------------------------------------------------------------- 105
74 Inmunodeteccioacuten -------------------------------------------------------------------------------------- 105
8 AMPLIFICACIOacuteN PURIFICACIOacuteN Y TRANSFECCIOacuteN DE PLAacuteSMIDOS ---------- 106
82 Transformacioacuten de bacterias competentes y cultivo en placas ---------------------- 107
83 Multiplicacioacuten de bacterias ------------------------------------------------------------------------ 107
84 Purificacioacuten del ADN plasmiacutedico ---------------------------------------------------------------- 108
85 Transfeccioacuten transitoria ----------------------------------------------------------------------------- 109
9 ARNs DE INTERFERENCIA (siRNA) -------------------------------------------------------------- 111
10 MICROSCOPIacuteA ELECTROacuteNICA DE TRANSMISIOacuteN --------------------------------------- 111
101 Microscopiacutea convencional ----------------------------------------------------------------------- 111
102 Crioultramicroscopiacutea ------------------------------------------------------------------------------- 112
103 Crioinmunocitoquiacutemica --------------------------------------------------------------------------- 113
11 ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO ------------------------------------------------------------------------------ 114
VI RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------------------- 117
1 MECANISMOS DE NEUROTOXICIDAD ---------------------------------------------------------- 118
2 CAMBIOS EN LA DISTRIBUCIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA α-SINUCLEIacuteNA ---------------- 118
3 ESTUDIO DE VIABILIDAD CELULAR -------------------------------------------------------------- 126
4 FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI --------------------------------------------- 126
5 RELACIOacuteN ENTRE LA FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI Y FORMACIOacuteN DE AGREGADOS --------------------------------------------------------------------- 137
IacuteNDICE
6 MECANISMOS DE FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI --------------- 141
7 ESTUDIO DE LA ALTERACIOacuteN DEL TRANSPORTE INTRACELULAR ------------ 150
8 BUacuteSQUEDA DE PROTEIacuteNAS IMPLICADAS EN LA FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI --------------------------------------------------------------------------------- 168
9 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIOacuteN O DEPLECIOacuteN DE PROTEIacuteNAS RAB GTPasas ESPECIacuteFICAS Y LA SNARE SINTAXINA-5 SOBRE LA MORFOLOGIacuteA DEL COMPLEJO DE GOLGI -------------------------------------------------------------------------- 173
10 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIOacuteN DE RAB GTPasas SOBRE LA FORMACIOacuteN DE INCLUSIONES INTRACELULARES ------------------------------------- 180
VII DISCUSIOacuteN ------------------------------------------------------------------------------------------------ 185
1 Liacutenea celular PC12 como modelo neuronal de enfermedad de Parkinson ----------- 185
2 Mecanismo citopaacutetico de la proteiacutena α-sinucleiacutena --------------------------------------------- 186
3 Fragmentacioacuten del complejo de Golgi iquestconsecuencia de apoptosis ---------------- 188
4 La fragmentacioacuten del complejo de Golgi precede a los dantildeos en el citoesqueleto 189
5 Alteraciones del traacutefico intracelular ----------------------------------------------------------------- 191
6 Fragmentacioacuten del complejo de Golgi y niveles de expresioacuten de proteiacutenas --------- 194
7 Relacioacuten entre la fragmentacioacuten del complejo de Golgi inclusiones intracitoplasmaacuteticas y alteracioacuten del traacutefico celular -------------------------------------------- 198
8 Consideraciones finales --------------------------------------------------------------------------------- 202
XIII CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------- 205
IX ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------------------------------- 209
X BIBLIOGRAFIacuteA --------------------------------------------------------------------------------------------- 213
RESUMEN
3
I RESUMEN
El sello citopatoloacutegico de la enfermedad de Parkinson (EP) es la
formacioacuten de inclusiones intracelulares conocidas como cuerpos de Lewy de
los cuales la proteiacutena α -sinucleiacutena (αs) es el principal componente En los
uacuteltimos antildeos ha quedado claro que el principal efecto de la sobreexpresioacuten de
αs yo su agregacioacuten es la alteracioacuten de los primeros estadiacuteos de la viacutea
secretora Los agregados de la proteiacutena αs puede n inhibir el transporte entre
el retiacuteculo endoplaacutesmico y el aparato de Golgi (AG) lo cual se refleja en una
reduccioacuten de los niveles del transportador de monoamina vesicular a la
sinapsis Esto se traduce en la acumulacioacuten toacutexica de dopamina libre en el
citosol provocando estreacutes oxidativo y finalmente la muerte celular En
levadura la sobreexpresioacuten de proteiacutenas Rab especiacuteficas proteiacutenas SNARE y
otras relacionadas con la cubierta de vesiacuteculas tipo COPII protegen contra el
dantildeo inducido por αs Por lo tanto las proteiacutenas que median la unioacuten
especiacutefica entre los intermediarios del transporte y las membranas de destino
en la viacutea secretora temprana son la clave para entender los mecanismos
moleculares que desencadenan neurodegeneracioacuten en la EP Una de las
consecuencias de las alteraciones del transporte entre el retiacuteculo
endoplaacutesmico y AG inducido por la sobreexpresioacuten yo agregacioacuten de la
proteiacutena αs puede ser la fragmentacioacuten del AG La fragmentacioacuten de este
orgaacutenulo se ha descrito en muchas enfermedades neurodegenerativas Se ha
postulado que el desequilibrio entre el transporte anteroacutegrado y retroacutegrado
podriacutea conducir a la fragmentacioacuten del AG en las neuronas dopamineacutergicas
En el presente estudio se analizan los mecanismos implicados en la
fragmentacioacuten del AG en ceacutelulas neuronales PC12 tratadas con las
neurotoxinas 6-hidroxidopamina o metanfetamina como modelos celulares de
enfermedad de la EP Nuestros datos demuestran que la fragmentacioacuten del
AG precede y podriacutean dar lugar a la agregacioacuten de la proteiacutena αs con la
subsecuente formacioacuten de inclusiones conduciendo a alteraciones en el
transporte anteroacutegrado y retroacutegrado entre el retiacuteculo endoplaacutesmico y el AG y
dantildeo en el citoesqueleto Por el contrario la fragmentacioacuten del AG estaacute
RESUMEN
4
directamente relacionada con alteraciones en los niveles de expresioacuten de las
GTPasas Rab1 2 y 8 y la proteiacutena SNARE sintaxina 5 Asiacute la sobreexpresioacuten
de las proteiacutenas Rab1 y 8 y la deplecioacuten de Rab 2 y sintaxina 5 restauran la
morfologiacutea del AG En conclusioacuten la homeostasis de un nuacutemero limitado de
proteiacutenas Rab y SNARE es importante para la comprensioacuten de la
citopatologiacutea de la EP La fragmentacioacuten del AG puede ser una especie de
sentildeal indicativa de que algo en la ceacutelula estaacute mal y que el mecanismo de
defensa celular se debe iniciar lo que podriacutea inducir la formacioacuten de cuerpos
de inclusioacuten del tipo agresomas que funcionariacutean como un sistema de
adaptacioacuten y ldquosupervivenciardquo celular
INTRODUCCIOacuteN
7
II INTRODUCCIOacuteN
Entre los trastornos neurodegenerativos en humanos la enfermedad de
Parkinson es la segunda en presentacioacuten patologiacutea que afecta variadas
conductas del individuo en las que se ven involucrados primariamente diversos
programas motores aunque tiene la capacidad de provocar demencia en fases
tardiacuteas de la entidad Es auacuten maacutes preocupante en teacuterminos de salud puacuteblica
que el parkinsonismo se incremente en la poblacioacuten maacutes joven como efecto de
factores psicosociales asociados al abuso y dependencia de drogas
El estudio sobre la enfermedad de Parkinson se desarrolla desde varios
frentes como son la identificacioacuten de genes implicados y su comportamiento el
estudio de patrones sintomaacuteticos ensayos farmacoloacutegicos anaacutelisis de los
cambios en el ADN mitocondrial estudios anatomopatoloacutegicos estudio con
biomarcadores que revelan el desarrollo de la enfermedad y estudios sobre
factores neurotroacuteficos Asimismo entre estas liacuteneas de investigacioacuten tambieacuten
se encuentra el estudio del traacutefico intracelular el cual tiene un papel relevante
en los uacuteltimos antildeos gracias al avance del conocimiento de los mecanismos
citotoacutexicos que se presentan en la enfermedad Estos hallazgos apuntan a que
las alteraciones producidas en el transporte son clave en el proceso citopaacutetico
y la subsecuente muerte celular En la enfermedad de Parkinson se producen
dantildeos en algunos de los pasos de la viacutea secretora aunque no se conocen con
detalle los fenoacutemenos subyacentes y el mecanismo molecular de este proceso
El uso de nuevas herramientas y modelos de investigacioacuten ha proporcionado
importantes pistas sobre los mecanismos de neurodegeneracioacuten
desencadenados por la alteracioacuten en el traacutefico
El sello citopatoloacutegico de la enfermedad de Parkinson es la formacioacuten de
agregados proteicos intracelulares conocidos como cuerpos de Lewy cuyo
componente principal es la proteiacutena α-sinucleiacutena En los uacuteltimos antildeos se ha
puesto de manifiesto que el efecto principal de la sobreexpresioacuten de α-
INTRODUCCIOacuteN
8
sinucleiacutena yo su agregacioacuten es la alteracioacuten en los pasos iniciales de la viacutea
secretora Se ha postulado que los agregados de α-sinucleiacutena pueden inhibir el
transporte entre el retiacuteculo endoplaacutesmico (RE) y el aparato de Golgi (AG)
reduciendo los niveles del transporte vesicular de monoaminas a las sinapsis
dando como resultado la acumulacioacuten toacutexica de dopamina libre en el citosol
que induce la formacioacuten de ROS causando estreacutes oxidativo y finalmente la
muerte de la ceacutelula (Lashuel y Hirling 2006)
En levaduras la sobreexpresioacuten de especiacuteficas proteiacutenas Rab SNARE y
proteiacutenas de cubierta tipo COPII protegen contra los dantildeos inducidos por α-
sinucleiacutena (Cooper et al 2006) La GTPasa REGolgi Ypt1pRab1 parece tener
un papel clave en este proceso Estudios posteriores apoyan que Rab3A y
Rab8A implicados en pasos tardiacuteos de la viacutea secretora participan tambieacuten en
la neurodegeneracioacuten inducida por α-sinucleiacutena (Gitler et al 2008) En ceacutelulas
de mamiacutefero la sobreexpresioacuten de α-sinucleiacutena sus formas aberrantes o
mutadas asociados a los casos familiares de enfermedad de Parkinson
retrasan el transporte entre el RE y el AG conforme con los resultados
obtenidos en levadura (Thayanidhi et al 2010) Esta alteracioacuten puede
invertirse al sobreexpresar proteiacutenas SNARE implicadas en el transporte entre
RE-Golgi demostrando que el efecto toacutexico de α-sinucleiacutena puede ser
antagonizado por estas proteiacutenas reguladoras Tambieacuten se sabe que α-
sinucleiacutena proteiacutena de modulacioacuten sinaacuteptica secuestra aacutecido araquidoacutenico lo
cual se traduce en el bloqueo de la activacioacuten de proteiacutenas SNARE (Darios et
al 2010) Asiacute las proteiacutenas que median la unioacuten especiacutefica entre los
intermediarios de transporte y las membranas de destino en la viacutea secretora
temprana son claves para comprender los mecanismos moleculares que
desencadenan neurodegeneracioacuten en la enfermedad de Parkinson
Una de las consecuencias de las alteraciones del traacutefico entre el RE y el
AG inducida por la sobreexpresioacuten yo agregacioacuten de α-sinucleiacutena puede ser la
fragmentacioacuten del AG El desequilibrio entre el transporte anteroacutegrado y
retroacutegrado podriacutea conducir a la fragmentacioacuten del AG en neuronas
dopamineacutergicas (Lashuel y Hirling 2006) De hecho se trata de un mecanismo
comuacuten de fragmentacioacuten del AG (Mironov y Beznoussenko 2011) La
INTRODUCCIOacuteN
9
fragmentacioacuten de este orgaacutenulo se ha descrito en muchos trastornos
neurodegenerativos (Gonatas et al 2006 Fan et al 2008) incluyendo la
enfermedad de Parkinson (Fujita et al 2006) Es un evento temprano en el
proceso de neurodegeneracioacuten no asociado con muerte apoptoacutetica (Gonatas et
al 2006) Ademaacutes la fragmentacioacuten del AG puede estar relacionada con la
formacioacuten de agregados prefibrilares de α-sinucleiacutena pero es independiente de
inclusiones (Gosavi et al 2002)
En el presente estudio analizamos en un modelo neuronal de
enfermedad de Parkinson los mecanismos moleculares involucrados en la
fragmentacioacuten del AG y su relacioacuten con la formacioacuten de inclusiones reactivas
para la proteiacutena α-sinucleiacutena Nuestros resultados demuestran que la
fragmentacioacuten del AG no es provocado por el desequilibrio en el transporte o
alteraciones del citoesqueleto sino que maacutes bien se trata de una
consecuencia debida a las alteraciones en la homeostasis de proteiacutenas Rab y
SNARE especificas La sobreexpresioacuten o deplecioacuten de estas proteiacutenas
implicadas en el traacutefico intracelular pueden prevenir la fragmentacioacuten del AG
lo cual es muy uacutetil para que la ceacutelula recobre su capacidad de supervivencia y
funcioacuten El AG es considerado la estacioacuten central de la viacutea secretora donde
llegan las proteiacutenas recieacuten sintetizadas desde el RE y son clasificadas para ser
transportadas hacia su destino final (Farquhar y Palade 1981 Farquhar y
Hauri 1997) Nuestros resultados sugieren que en neuronas es necesario
que este orgaacutenulo mantenga sus caracteriacutesticas morfoloacutegicas y funcionales
para frenar la aparicioacuten de inclusiones intracelulares
OBJETIVOS
13
III OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar en un modelo celular para la enfermedad de Parkinson la
arquitectura del aparato de Golgi y su relacioacuten con las alteraciones del traacutefico
intracelular y citoesqueleto con la agregacioacuten de la proteiacutena α-sinucleiacutena
Puesto que el estudio del comportamiento de fragmentacioacuten del complejo
de Golgi y del traacutefico intracelular alterado puede ser crucial para entender el
mecanismo de defensa de las neuronas ante el estreacutes oxidativo (patroacuten
comuacuten para todos los factores causales de la enfermedad de Parkinson)
postulamos que la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y
funcionales del aparato de Golgi y del traacutefico podriacutea evitar la aparicioacuten de
inclusiones intracelulares y en general restaurar el funcionamiento celular lo
que disminuiriacutea el ciclo de ataque oxidativo y por tanto la peacuterdida de
neuronas
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Optimizar las condiciones de proliferacioacuten y diferenciacioacuten neuronal de
la liacutenea celular PC12
bull Utilizar las neurotoxinas 6-hidroxidopamina y metanfetamina para
simular las alteraciones celulares que de forma natural se producen en
la enfermedad de Parkinson
bull Inducir la aparicioacuten de inclusiones intracelulares mediante la utilizacioacuten
de las sustancias 6-hidroxidopamina y metanfetamina como agentes
neurotoacutexicos
bull Anaacutelisis de la dinaacutemica de formacioacuten de las inclusiones intracelulares
OBJETIVOS
14
bull Anaacutelisis morfoloacutegico de los componentes de la viacutea secretora e
intermediarios de transporte en ceacutelulas PC12 despueacutes de diferentes
tiempos de tratamiento
bull Comparar los cambios morfoloacutegicos que se puedan observar entre los
tratamientos con 6-OHDA 6-OHDA maacutes catalasa y metanfetamina
bull Caracterizacioacuten morfoloacutegica del complejo de Golgi en condiciones
neurotoacutexicas
bull Estudio de la cineacutetica de distribucioacuten de proteiacutenas del aparato de Golgi
en ceacutelulas neuronales PC12 bajo condiciones de tratamiento
bull Comparacioacuten de la cineacutetica de fragmentacioacuten del complejo de Golgi
entre las neurotoxinas 6-OHDA y MET
bull Realizar ensayos a corto y largo plazo que permitan relacionar la
generacioacuten de inclusiones celulares y las lesiones en la arquitectura
del aparato de Golgi y del sistema de transporte intracelular
bull Analizar el tipo de proteiacutenas del citoesqueleto que podriacutean resultar
alteradas con el tratamiento y su posible agregacioacuten
bull Realizar el anaacutelisis cineacutetico del transporte anteroacutegrado y retroacutegrado
mediante el uso de la droga brefeldina A
bull Anaacutelisis del transporte del mutante sensible a temperatura ts045 de la
proteiacutena G del virus de la estomatitis vesicular (VSVg) en ceacutelulas
neuronales PC12 para el estudio de la cineacutetica del transporte
anteroacutegrado
bull Evaluar el nivel de sobreexpresioacuten de la proteiacutena α-sinucleiacutena en ceacutelulas
neuronales PC12 despueacutes del tratamiento neurotoacutexico
bull Anaacutelisis bioquiacutemico de los niveles de expresioacuten de proteiacutenas Rab
SNARE y otras proteiacutenas relevantes implicadas en el transporte RE-
Golgi y en el mantenimiento de la organizacioacuten del aparato de Golgi
bull Utilizar teacutecnicas inmunohistoquiacutemicas crioinmunocitoquiacutemicas y de
western blotting para dilucidar el mecanismo citopaacutetico implicado en la
fragmentacioacuten del complejo de Golgi y del traacutefico intracelular
OBJETIVOS
15
bull Utilizar las teacutecnicas de sobreexpresioacuten y deplecioacuten para las posibles
proteiacutenas halladas implicadas en el desorden del traacutefico con el fin de
evaluar la capacidad de restauracioacuten del complejo de Golgi del
transporte y de la formacioacuten de inclusiones intracelulares
El propoacutesito final de esta tesis doctoral es aportar nuevos datos que
ayuden a explicar el papel del aparato de Golgi en la patogeacutenesis de la enfermedad de Parkinson
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
19
1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA
Tras el Alzheimer la enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda
entidad neurodegenerativa maacutes comuacuten en humanos patologiacutea de evolucioacuten
progresiva que causa primariamente trastornos del movimiento afectando la
postura y la locomocioacuten En fases tardiacuteas de la enfermedad puede producir
variadas alteraciones del comportamiento e incluso demencia y suele acabar
con una invalidez permanente del paciente La prevalencia de la enfermedad
es del 1 a nivel mundial y se presenta principalmente en personas mayores
de 50 antildeos (Polymeropoulos et al 1996 Lang y Lozano 1998a b Savitt et al
2008) En Espantildea afecta a dos de cada cien personas mayores de 65 antildeos y
en Europa del 06 al 36 de la poblacioacuten comprendida entre los 65 y 80 antildeos
de edad (de Lau y Breteler 2006) Aunque un 20 de los enfermos con
Parkinson estaacuten por debajo de los 50 antildeos la predominancia en adultos
joacutevenes es considerablemente menor y muy rara la aparicioacuten en nintildeos
asimismo es poco prevalente en negros y japoneses En la actualidad existe
una extensa bateriacutea terapeacuteutica paliativa para una enfermedad que auacuten no
tiene cura
11 Sintomatologiacutea de la enfermedad de Parkinson
El tratado ldquoParaacutelisis Temblorosardquo incorpora el teacutermino acuntildeado por el
meacutedico britaacutenico James Parkinson en 1817 cuando describioacute la enfermedad
Hoy en diacutea se conocen posiblemente todas las variaciones sintomatoloacutegicas y
los cambios que sufren durante la progresioacuten de las diferentes fases de la
enfermedad La sintomatologiacutea primaria comprende las diferentes formas de
disfuncioacuten motora que se producen por el descenso en los niveles de
dopamina (DA) sobre el estriado reflejaacutendose en los siguientes signos
acinesia (ausencia de movimiento) hipocinesia (disminucioacuten de la capacidad
motriz) bradicinesia (lentitud en los movimientos voluntarios) rigidez muscular
tremor sin intencioacuten (en especial de las extremidades superiores) discinesia
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
20
(alteracioacuten del movimiento) acatisia (incapacidad de mantenerse quieto) voz
monoacutetona (a menudo entrecortada) aumento en la apertura de los paacuterpados
amimia facial (peacuterdida de la capacidad gestual) y en general alteracioacuten de la
postura (Oertel y Ellgring 1995) Tambieacuten se pueden presentar otros siacutentomas
asociados como siacutendrome emeacutetico dolor testicular siacutendrome abdominal
estrentildeimiento signo de Meyerson o reflejo glabelar positivo trastornos
cognitivos e incluso demencia en fases terminales de la enfermedad (Pfeirffer
2005 NINDS 2009)
12 Aspectos generales sobre la dopamina
La DA es una amina bioacutegena cuya nomenclatura es ldquo4-(2-aminoetil)
benzeno-12 diolrdquo y al igual que las otras catecolaminas son sintetizadas a
partir del aminoaacutecido L-tirosina (Figura 1) La tirosina hidroxilasa (TH) la
primera enzima en la ruta biosinteacutetica limita la cantidad de catecolaminas
producidas a traveacutes de un mecanismo fisioloacutegico conocido como
retroalimentacioacuten negativa por concentracioacuten de sustrato La TH cataliza la
adicioacuten de un grupo hidroxilo a la tirosina formando 34-dihidroxi-L-fenilalanina
conocida como L-DOPA La siguiente reaccioacuten estaacute catalizada por la DOPA
descarboxilasa que pasa L-DOPA a dopamina (Baumlck et al 1987) Una vez se
ha sintetizado se produce el almacenamiento en el interior de vesiacuteculas
sinaacutepticas conocidas como vesiacuteculas granulares o de nuacutecleo denso La DA es
metabolizada por los sistemas enzimaacuteticos monoamino-oxidasa (MAO) y
catecol-O-metiltransferasa (COMT) siendo la enzima MAO tipo A quien
caracteriza a las neuronas dopamineacutergicas (Finberg y Youdim 1983) La
accioacuten enzimaacutetica de MAO-A sobre la DA resulta en la formacioacuten del aacutecido 34-
dihidroxifenilaceacutetico (DOPAC)
Su administracioacuten sisteacutemica mimetiza la accioacuten simpaacutetica pero como no
atraviesa la barrera hematoencefaacutelica (BH) carece de efectos centrales Un
precursor de la dopamina que atraviesa la BH es la sustancia denominada
levodopa De las catecolaminas presentes en el sistema nervioso central (SNC)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
21
la DA representa maacutes del 50 Se encuentra en mayor abundancia en la
sustancia negra del mesenceacutefalo pero tambieacuten estaacute presente a otros niveles y
especialmente en el sistema liacutembico Los tractos dopamineacutergicos en SNC son
viacutea nigroestriada (el mayor 80 de toda la DA del cerebro que se proyecta
desde la pars compacta de la sustancia negra a los nuacutecleos caudado y
putamen del estriado) viacutea mesoliacutembica viacutea mesocortical y viacutea
tuberoinfundibular La informacioacuten emitida por las sentildeales dopamineacutergicas son
traducidas en funcioacuten de las aacutereas superiores de integracioacuten neuronal Se le
relaciona con diversas funciones motoras neuroendocrinas con la expresioacuten
de estados afectivos y la capacidad de juicio En loacutebulos frontales controla el
flujo de informacioacuten proveniente de otras aacutereas del cerebro Los desordenes
asociados con este transmisor en esta regioacuten del cerebro pueden causar
alteracioacuten de funciones cognitivas como memoria atencioacuten y resolucioacuten de
problemas La DA es liberada en situaciones de agrado y placer por lo que se
argumenta que las viacuteas dopamineacutergicas estaacuten alteradas en las personas
adictas a la cocaiacutena anfetaminas y nicotina las cuales incrementan los niveles
de DA en estas aacutereas (Bahema et al 2000)
Figura 1 Ruta simplificada de la siacutentesis y metabolismo de catecolaminas (modificado de Erdelyi et al 2011)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
22
13 Etiologiacutea de la enfermedad de Parkinson
En general el deterioro del movimiento que se presenta en esta
enfermedad se produce por peacuterdida o disfuncioacuten del 60 al 80 de las
neuronas de la sustancia negra pars compacta (SNc) (Bezard et al 2010)
estructura mesencefaacutelica productora de dopamina (DA) una sustancia
fundamental en los circuitos cerebrales implicados en el control del movimiento
Los siacutentomas asociados se producen por lesiones en otros centros neurales
superiores que incluyen al locus coeruleus estructuras olfatorias anteriores
partes inferiores del tronco del enceacutefalo y dantildeo de las terminales nerviosas
productoras de noradrenalina Las posibles causas de deterioro que
predominan y precipitan selectivamente la peacuterdida neuronal en la EP seriacutean las
siguientes
bull Factores toacutexicos tasas elevadas de incorporacioacuten de aluminio o cobre
ciertos pesticidas (como los organofosforados que son los maacutes
claramente relacionados con el Parkinson) algunos herbicidas y
neurotoxinas endoacutegenas que producen disfuncioacuten mitocondrial
bull Factores nutricionales Consumo elevado de hierro con su incremento
paralelo en neuronas dopamineacutergicas (Jenner y Olanow 1996) dietas
bajas en vitamina C y antioxidantes como el selenio y la vitamina E
bull Factores geneacuteticos
Mutacioacuten de genes α-sinucleiacutena (αs) fue el primer gen descubierto
ligado a la enfermedad de Parkinson (Golbe et al 1990) del cual se
han identificado tres puntos de mutacioacuten A53T A30P y E46K
(Lashuel et al 2002) Otros genes identificados son SOD1 PARK-
9 DJ-1 oacute PARK-7 (Waragai et al 2006) PINK-1 (Marongiu et al
2009) LRRK2 oacute PARK-8 PARK-2 que es la mutacioacuten maacutes comuacuten
hallada en la enfermedad de Parkinson la cual genera un desorden
en la funcioacuten de la proteiacutena parkina (Apartado 15) e induce
parkinsonismo juvenil de caraacutecter autosoacutemico recesivo (Cookson et
al 2003 Cookson et al 2005) Otras mutaciones se han hallado
para UCH-L1 oacute PARK-5 (Hattori et al 2000 Leroy et al 1998) asiacute
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
23
como la mutacioacuten del gen para la proteiacutena DT-diaforasa (Paris et al
2009) Tambieacuten se pueden hallar mutaciones de otras proteiacutenas
como la ubiquitina C en una poblacioacuten especiacutefica de individuos con
EP
Polimorfismos gen que codifica para el receptor D2 de la dopamina
gen que codifica para la enzima DT-diaforasa (necesaria para evitar
el ataque de metabolitos neurotoacutexicos generados especiacuteficamente
por la oxidacioacuten de la dopamina) Adicionalmente se ha comprobado
que cuando la DT- diaforasa estaacute inactiva debido a un polimorfismo
o mutacioacuten geneacutetica aumenta en 38 la posibilidad de desarrollar
Parkinson (Caacuterdenas et al 2008)
Variaciones especiacuteficas del ADN mitocondrial de forma poco precisa
se han descrito variaciones especiacuteficas del ADN de las mitocondrias
las cuales podriacutean tener la capacidad potencial de modificar el riesgo
de aparicioacuten de la enfermedad (Gaweda et al 2010) Otros trabajos
no son tan consistentes pero seguacuten los indicios encontrados no
descartan la posibilidad que variantes hereditarias del ADN
mitocondrial en grupos poblacionales puedan contribuir al riesgo de
aparicioacuten del Parkinson familiar (Simon et al 2010) Se sigue
trabajando para definir coacutemo estas posibles variaciones pueden
conducir a la enfermedad de Parkinson
bull Dantildeo excitotoacutexico se debe al incremento de la actividad glutamineacutergica
ante el descenso de la dopamina provocando disfuncioacuten mitocondrial en
neuronas dopamineacutergicas (Antkiewicz 2002)
bull Estreacutes oxidativo supone el exceso de produccioacuten de radicales libres o el
fallo en su eliminacioacuten El estreacutes oxidativo es una caracteriacutestica comuacuten
en la patogeacutenesis de la lesioacuten neural en especial de las neuronas
dopamineacutergicas (Jenner y Olanow 1996) Es de gran importancia la
enzima DT-diaforasa que bajo ciertas condiciones puede verse alterada
su actividad y tal efecto se refleja en el incremento de especies
reactivas de oxigeno (ROS) en su incapacidad de antagonizar el efecto
negativo de la quinona (metabolito de la hidroacutelisis de la dopamina) y en
la formacioacuten de αs protofibrilar (Caacuterdenas et al 2008 Paris et al 2009)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
24
De la misma forma otras enzimas con accioacuten reductora y que se
encuentran mutadas en el Parkinson no tienen la capacidad de prevenir
el ataque oxidativo al que estaacuten expuestas de manera natural las
neuronas nigrales
bull Perturbacioacuten inflamatoria local la neuroinflamacioacuten puede ser inducida
por una variedad de sustancias que dantildean zonas especiacuteficas del
cerebro De hecho la acumulacioacuten de agentes pro-inflamatorios ha sido
implicada como factor de riesgo medioambiental para la EP (Liu et al
2003) Asimismo se ha demostrado que las neuronas dopamineacutergicas
en los cerebros de los pacientes con Parkinson tienen niveles maacutes altos
de una enzima inflamatoria llamada COX-2 (Minghetti 2004) Estos
hallazgos sugieren que la inflamacioacuten puede estar involucrada en la
peacuterdida de neuronas dopamineacutergicas (Cicchetti et al 2002 Hald y
Lotharius 2005 Etminan et al 2008) En un modelo murino para la EP
utilizando la neurotoxina 1-metil-4-fenil-1236-tetrahidropiridina (MPTP)
se observoacute un incremento en la activacioacuten del factor de transcripcioacuten
para COX-2 lo que aumentoacute la siacutentesis de la enzima con posterior
peacuterdida de neuronas productoras de DA Por el contrario la inactivacioacuten
del factor de transcripcioacuten para COX-2 mitigoacute la peacuterdida de neuronas
dopamineacutergicas de la sustancia negra (Wang et al 2009)
Adicionalmente otros estudios alrededor de la neuroinflamacioacuten
aseguran que los niveles cerebrales de AMP ciacuteclico juegan un papel
importante en la neuroproteccioacuten y en la respuesta neuroinflamatoria
(Lonze y Ginty 2002 Volakakis et al 2010 Morales et al 2011)
bull Traacutefico intracelular alterado nuevos hallazgos cientiacuteficos ofrecen
pruebas soacutelidas de que la enfermedad de Parkinson se origina por la
alteracioacuten en el transporte de proteiacutenas y liacutepidos dentro de la ceacutelula
(Cooper et al 2006 Lashuel y Hirling 2006 Fan et al 2008 Gitler et
al 2008) lo que se antepone a la aparicioacuten del estreacutes oxidativo o
durante su presentacioacuten fenoacutemeno que tambieacuten se relaciona con la
alteracioacuten y posterior agregacioacuten de la proteiacutena αs (Lashuel y Hirling
2006)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
25
Se piensa que las enfermedades neurodegenerativas pueden ser
generadas por mecanismos comunes y en las cuales se comparten muchos
aspectos en sus manifestaciones maacutes tardiacuteas En todas ellas se producen
depoacutesitos anormales de proteiacutenas y deacuteficit funcionales dramaacuteticos de
naturaleza progresiva debidos a la peacuterdida de neuronas y a las alteraciones
sinaacutepticas (Hardy y Gwinn-Hardy 1998) Probablemente el origen es
multifactorial y son diversos los factores intriacutensecos y extriacutensecos que se
asocian para ser posible su aparicioacuten Asimismo la aparente selectividad
neuronal podriacutea deberse a que cada enfermedad afecta en grado variable a
poblaciones distintas de neuronas a lo largo del tiempo durante el que se
desarrolla la enfermedad La plasticidad propia del sistema nervioso permitiriacutea
una cierta compensacioacuten funcional hasta que se produce una cantidad de dantildeo
tan grande que genera un fallo catastroacutefico en la poblacioacuten neuronal maacutes
susceptible o afectada Es de anotar que ciertamente la EP todaviacutea es poco
conocida a nivel cientiacutefico y resulta muy difiacutecil de prevenir no obstante los
investigadores estaacuten haciendo grandes progresos para entender y tratar la
enfermedad
14 Fisiopatologiacutea de la enfermedad de Parkinson
La lesioacuten fundamental en la EP se produce sobre la sustancia negra pars
compacta un centro de comando neural implicado en funciones motoras que
ante su deceso progresivo disminuye su influencia dopamineacutergica sobre el
sistema estriatal (estructuralmente denominado el neoestriado compuesto por
los nuacutecleos subcorticales caudado y putamen) (Figura 2A B) Esto genera una
informacioacuten erroacutenea mediada por alteracioacuten de las eferencias de este sistema
con proyeccioacuten talaacutemica lo que conlleva a una disminucioacuten de sentildeales
excitatorias desde el taacutelamo sobre la corteza motora Asimismo desde el
nuacutecleo caudado y putamen existe una viacutea inhibitoria hacia la sustancia negra
mediada por el neurotransmisor GABA (aacutecido gamma-aminobutiacuterico) esta
interaccioacuten fisioloacutegica mantiene cierto grado de inhibicioacuten de las dos aacutereas No
obstante en la EP predominan los estiacutemulos excitatorios sobre el estriado
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
26
(Figura 2A B) ya que las fibras provenientes de la corteza cerebral segregan
acetilcolina neurotransmisor excitatorio y la peacuterdida selectiva de neuronas
nigrales ocasiona una importante deficiencia del neurotransmisor dopamina
sobre el mismo sistema (Gerfen et al 1990 Harrison et al 1990) fenoacutemeno
que explica de forma general los referidos trastornos del movimiento (Lang y
Lozano 1998 Gerfen 2006)
Figura 2 Mecanismo fisiopatoloacutegico de la enfermedad de Parkinson (A) Muestra
las interconexiones fisioloacutegicas y alteradas del control motriz entre la sustancia negra
pars compacta y corteza cerebral Las flechas azules representan los estiacutemulos
excitatorios y en rojo los inhibitorios (B) Resume las viacuteas de informacioacuten motora
alteradas en la EP El signo ldquo+rdquo representa las sentildeales excitatorias y el ldquo-rdquo las
inhibitorias La liacutenea roja expresa bloqueo
A
B
A
B
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
27
Adicionalmente hallazgos recientes han puesto de manifiesto que el axoacuten
de la neurona de la sustancia negra que se proyecta hacia el estriado puede
ramificarse a lo largo de su recorrido pudiendo asiacute modular la actividad de
otros centros neurales superiores estructuras cerebrales cuya funcionalidad no
es uacutenicamente motora y que intervienen en la inteligencia del aprendizaje
memorizacioacuten y representacioacuten de movimientos asociados a las diferentes
conductas del individuo Por otra parte se ha demostrado que las neuronas de
la sustancia negra maacutes severamente afectadas en la EP tienen axones muy
ramificados (Prensa 2009)
15 Citopatologiacutea de la enfermedad de Parkinson
Los cuerpos de Lewy (CL) son la principal caracteriacutestica neuropatoloacutegica
de esta enfermedad (Forno et al 1988) Friederich Heinrich Lewy en 1912 fue
quien observoacute por primera vez estas estructuras en cerebros de pacientes con
EP (Lewy 1912) y se piensa que representan el mecanismo de adaptacioacuten y
ldquosupervivenciardquo con el cual las neuronas dopamineacutergicas de la sustancia negra
pars compacta encierran a moleacuteculas anormales que de otra manera seriacutean
perjudiciales (Harrower et al 2005 Uversky 2007 Wakabayashi et al 2007)
Sin embargo otros estudios sugieren que estas estructuras son un
subproducto de procesos degenerativos dentro de las neuronas El principal
componente de los cuerpos de Lewy es la proteiacutena αs la cual se encuentra
incrementada en la fraccioacuten insoluble de cerebros procedentes de individuos
con esta enfermedad (Spillantini et al 1997) En la actualidad no cabe duda
que esta proteiacutena estaacute iacutentimamente relacionada con el dantildeo de las neuronas
nigrales y que los mecanismos en los que puede participar en el proceso
citopatoloacutegico son muy variados Uno de estos mecanismos se describe por su
interaccioacuten con la proteiacutena parkina (Shimura et al 2001) la cual de forma
normal protege a las neuronas de una variedad de amenazas como en la
citotoxicidad de alfa-sinucleiacutena Sin embargo en la mutacioacuten del gen PARK-2
en el individuo autosoacutemico recesivo (la mutacioacuten maacutes comuacuten en pacientes
adultos joacutevenes con EP) se genera una proteiacutena con funcioacuten alterada Como
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
28
otras proteiacutenas con dominios ldquoRING-fingerrdquo la parkina funciona como una E3
ligasa (Hattori et al 2000 Shimura et al 2000 Zhang et al 2000) formando
parte de la maquinariacutea celular que liga a otras proteiacutenas con ubiquitina como la
αs y las marca para su degradacioacuten por el proteasoma (Zhang et al 2000) El
efecto final observado de su modificacioacuten es un incremento en el metabolismo
del transmisor dopamina induciendo estreacutes oxidativo (Winner 2008) muy
posiblemente por la disfuncioacuten y el acuacutemulo progresivo de αs que provoca la
retencioacuten intracitoplasmaacutetica de dopamina o su incorrecta incorporacioacuten en las
vesiacuteculas El defecto en el sistema de degradacioacuten interna de proteiacutenas genera
agregacioacuten de proteiacutenas exceso de toxinas y otras sustancias que podriacutean
acumularse hasta niveles peligrosos llevando a la muerte celular (Ciechanover
y Brundin 2003 Giasson y Lee 2003 Moore et al 2003) El sistema ubiquitina
proteasoma (SUP) requiere interacciones entre varias proteiacutenas incluidas la
parkina y UCH-L1 Por ello la alteracioacuten en la funcionalidad de este sistema
por diferentes fenoacutemenos o por mutaciones de los genes anteriormente
mencionados puede explicar parcialmente como se origina la enfermedad de
Parkinson
En el caso anteriormente descrito se produce estreacutes oxidativo seguido de
agregacioacuten de la proteiacutena αs pero se sabe que su acuacute mulo producto de la
codificacioacuten del gen mutante o sobreexpresioacuten de la misma tambieacuten produce
estreacutes oxidativo (Gao 2008) que a su vez genera una grave alteracioacuten del
sistema ubiquitina proteasoma (Chen et al 2005 Kawahara 2008) y de la
actividad mitocondrial (la disfuncioacuten mitocondrial es un participante importante
en las enfermedades neurodegenerativas) Asimismo existen actualmente
fuertes evidencias que consideran la agregacioacuten y la alteracioacuten del
metabolismo de la αs como los principales promotores de una grave disfuncioacuten
en el traacutefico intracelular el cual conduciriacutea a la degeneracioacuten y posterior
muerte neural (Lee et al 2006 Garciacutea-Reitboumlck et al 2010 Thayanidhi et al
2010) Es por esto que presentes estudios se centran en investigar las rutas
del deterioro celular asociadas con la proteiacutena αs sus funciones interacciones
con otras moleacuteculas y la secuencia de eventos nocivos desde la agregacioacuten
con el propoacutesito de intentar explicar el fenoacutemeno que subyace desde la
agresioacuten hasta la degeneracioacuten y deceso de las neuronas dopamineacutergicas Es
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
29
de resaltar que ciertos estudios han demostrado que en ratones mutantes nulos
para αs presentan resistencia total a la enfermedad donde no se presentan
signos de agregacioacuten proteica (Dauer et al 2002)
16 Terapeacuteutica para la enfermedad de Parkinson
Pese a que no existe cura para esta entidad neurodegenerativa y los
tratamientos que se encuentran disponibles se limitan a paliar los siacutentomas se
ofrecen cada diacutea meacutetodos maacutes sofisticados que intentan mejorar la calidad de
vida del enfermo Las investigaciones se suceden sin parar y en la actualidad
hay ensayos precliacutenicos con numerosos faacutermacos y diferentes teacutecnicas
terapeacuteuticas (Savitt et al 2008)
161 Tratamiento convencional con faacutermacos antiparkinsonianos
En la EP se produce una desaparicioacuten progresiva de las neuronas
nigrales generando una disminucioacuten de los estiacutemulos dopamineacutergicos sobre el
sistema estriatal lo que hace que el circuito responsable de modular el
movimiento se vuelva superactivo Por tal motivo se trata de forma loacutegica
restablecer el agonismo dopamineacutergico a traveacutes de terapia farmacoloacutegica Una
de las formas claacutesicas que se utiliza desde principios de la deacutecada de los
sesenta es la administracioacuten de levodopa (L-DOPA 34-dihidroxi-L-
fenilalanina) (Carlsson et al 1957) una sustancia que las neuronas pueden
usar para fabricar y reponer la dopamina que falta (Kitamura et al 2003) La
levodopa funciona por lo general muy bien cuando aparecen los siacutentomas y
durante un nuacutemero de antildeos que variacutea en funcioacuten del paciente pero al cabo de
un tiempo suele dejar de ser efectiva y hay que buscar terapias alternativas No
obstante algunos estudios apuntan a que medicamentos como la seleginina o
rasagilina (inhibidores de la enzima monoamino-oxidasa tipo B MAO-B ver
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
30
apartado 3211) administrados al principio de la enfermedad podriacutean retrasar
la necesidad del paciente de tratarse con levodopa (Clarke 2008)
Ademaacutes del tratamiento con levodopa se han utilizado otros
medicamentos agonistas de la dopamina que comprenden los derivados de la
ergolina (alcaloides del ergot) tal como bromocriptina (Foley et al 2004)
pergolina cabergolina y dihidroergocriptina Asiacute como los no derivados de la
ergolina entre los que se encuentran el pramipexol ropinirol y la apomorfina
(Radad et al 2005) Estos uacuteltimos desarrollados con la esperanza de ofrecer
los beneficios de las ergolinas pero sin sus efectos colaterales Es de notar
que cada faacutermaco posee efectos que estaacuten en funcioacuten de otras condiciones
presentes en cada paciente (Bonuccelli 2003) Por ejemplo se ha sugerido
que enfermos con una variante de poca actividad del gen para COMT (enzima
que metaboliza la dopamina) tienen peores resultados que otros en pruebas
cognitivas donde los medicamentos dopamineacutergicos pueden empeorar la
cognicioacuten en estas personas tal vez porque la actividad reducida de la COMT
hace que se acumule dopamina hasta niveles perjudiciales en algunas partes
del cerebro En el futuro podriacutea ser posible examinar tales diferencias
geneacuteticas individuales con el fin de mejorar el tratamiento de la enfermedad
Otros faacutermacos utilizados convencionalmente en el tratamiento del
Parkinson son los siguientes inhibidores de la COMT (entacapona y
tolcapona) amantadina (promueve la liberacioacuten de DA y funciona como
antagonista de receptores NMDA) (Sullivan y Toulouse 2011) y
anticolineacutergicos (trihexifenidil profenamina benztropina y etopropazina)
(Kitamura et al 2002)
Se encuentran en ensayos cliacutenicos una variedad de nuevos tratamientos
farmacoloacutegicos para la enfermedad de Parkinson entre ellos
bull Ganglioacutesido GM1 que aumenta los niveles de dopamina cerebral Se
estaacute estudiando si este farmaco puede reducir los siacutentomas retardar la
evolucioacuten de la enfermedad o restablecer parcialmente las ceacutelulas
cerebrales dantildeadas en el Parkinson (Schneider et al 2010)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
31
bull Istradefilina que podriacutea mejorar la funcioacuten motora en la enfermedad
(Mizuno et al 2010 Knebel et al 2011)
bull ACP-103 es un potente agonista inverso de receptores para el
neurotransmisor serotonina (5-HT2A) donde su efecto disminuiriacutea la
gravedad de los siacutentomas parkinsonianos y las complicaciones
asociadas con la administracioacuten de levodopa Este faacutermaco fue evaluado
en modelos animales para EP consiguiendo resultados prometedores al
reducir siacutentomas motrices como el tremor o las discinesias (Vanover et
al 2008)
bull Potenciales medicamentos neuroprotectores para ver si pueden retrasar
la evolucioacuten de la enfermedad como la creatina coenzima Q10 (Yang et
al 2009) minociclina y GPI-1485 (Abdel-Salam 2008) asiacute como varios
inhibidores de la MAO-B incluidos la selegilina lazabemida y rasagilina
(Kitamura et al 2002)
bull Factores neurotroacuteficos que respaldan la supervivencia crecimiento y
desarrollo de las ceacutelulas cerebrales (Korsching 1993) son otro tipo de
terapia potencial para la enfermedad de Parkinson Se ha demostrado
que un medicamento de eacutestos el factor neurotroacutefico derivado de la liacutenea
celular glial (GDNF Glial cell-derived neurotrophic factor) (Lin et al
1993) protege las neuronas productoras de dopamina y promueve su
supervivencia en modelos con MPP+ y 6-OHDA para enfermedad de
Parkinson (Hou et al 1996 Egger et al 1999 Ma et al 2000) Otros
factores neurotroacuteficos que pueden ser uacutetiles para tratar la enfermedad
comprenden la neurotrofina-4 (NT-4) el factor neurotroacutefico derivado del
cerebro (BDNF Brain-derived neurotrophic factor) y el factor de
crecimiento fibroblaacutestico 2 (FGF-2 Fibroblast growth factor) (Sullivan y
Toulouse 2011)
bull Un tratamiento que puede mejorar algunos de los siacutentomas secundarios
de la enfermedad de Parkinson como la depresioacuten y los trastornos de la
deglucioacuten es la quetiapina (Weintraub et al 2011) ademaacutes puede
reducir la psicosis o la agitacioacuten en los pacientes parkinsonianos con
demencia
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
32
bull Levetiracetam un medicamento aprobado para tratar la epilepsia podriacutea
reducir las discinesias en los pacientes con Parkinson sin interferir con
otros medicamentos para la enfermedad (Stathis et al 2011)
162 Cirugiacutea versus tratamiento farmacoloacutegico
1621 Cirugiacutea de estimulacioacuten subtalaacutemica bilateral (STN-DBS)
La estimulacioacuten profunda del cerebro es una terapia aprobada por la
Agencia del medicamento estadounidense (FDA Food and Drug
Admionistration) Consiste en implantar en el cerebro electrodos conectados a
un dispositivo eleacutectrico que puede ser programado externamente y que
funciona con bateriacuteas Los electrodos estimulan las regiones del cerebro
implicadas en el control del movimiento bloqueando las sentildeales que causan
los temblores (Esselink et al 2009) Sin embargo la teacutecnica es muy invasiva
requiere cirugiacutea intracraneal y no funciona bien en todos los casos No
obstante en un estudio dirigido por Francesc Valldeoriola del Servicio de
Neurologiacutea del Hospital Cliacutenico de Barcelona se asegura que el mejor
tratamiento para los afectados del Parkinson es la intervencioacuten quiruacutergica tanto
desde el aspecto econoacutemico como en el de calidad de vida ademaacutes de
poderse mantener en el tiempo a diferencia del tratamiento claacutesico con
levodopa (Valldeoriola et al 2007)
1622 Palidotomiacutea y Talamotomiacutea
Son meacutetodos de destruccioacuten cerebral selectiva el maacutes comuacuten de los dos
procedimientos es la palidotomiacutea en el cual se destruye el globo paacutelido La
palidotomiacutea puede mejorar los siacutentomas de temblor rigidez y bradicinesia
posiblemente al interrumpir las conexiones entre el globo paacutelido y el cuerpo
estriado o el taacutelamo Por el contrario en la talamotomiacutea se destruye
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
33
quiruacutergicamente parte del taacutelamo con el fin principal de reducir el temblor
Debido a que estos procedimientos causan la destruccioacuten permanente de tejido
cerebral han sido mayormente reemplazados por la estimulacioacuten cerebral
profunda en el tratamiento de la EP (Esselink et al 2009)
163 Futuras dianas terapeacuteuticas en la enfermedad de Parkinson
1631 Sobre mecanismos especiacuteficos del traacutefico intracelular
El descubrimiento de la alteracioacuten del traacutefico en la EP y de su relevancia
en el subsecuente deceso neural ha abierto una nueva viacutea al desarrollo de
faacutermacos contra el Parkinson Estos hallazgos proporcionan una base para
descubrir nuevas estrategias terapeacuteuticas y acelerar el descubrimiento de
tratamientos maacutes efectivos contra esta enfermedad Una de las causas que
desencadenariacutea el Parkinson podriacutea ser el fallo en el transporte de proteiacutenas
entre dos compartimentos claves de la ceacutelula el retiacuteculo endoplaacutesmico y el
aparato de Golgi Se trata de un hallazgo importante ya que hasta ahora la
causa de la enfermedad de Parkinson se desconoce y cualquier avance en
esta liacutenea es muy relevante Una o varias proteiacutenas diana que pudieran
restablecer ese traacutefico interrumpido o al menos reparar parte del problema
podriacutean ser la base para nuevos tratamientos (Cooper et al 2006)
1632 Incremento de sentildeales sobre receptores cannabinoides
Investigaciones recientes sugieren que ciertas sustancias que provocan
efectos similares a los del cannabis podriacutean servir para iniciar nuevas viacuteas de
tratamiento contra la enfermedad de Parkinson (Morgese et al 2007) El
faacutermaco experimental llamado URB597 que ralentiza la disolucioacuten de los
endocannabinoides en el cerebro conjuntamente a la terapia de agonismo
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
34
dopamineacutergico mostroacute en un modelo de ratoacuten una recuperacioacuten sorprendente
baacutesicamente de normalidad (Kreitzer y Malenka 2007 Rodriacuteguez et al 2011)
1633 Vacuna para modificar el sistema inmunitario
El objetivo de esta terapia es buscar un mecanismo que pueda proteger a
las neuronas productoras de dopamina En un modelo de ratoacuten para la
enfermedad de Parkinson se utilizoacute una vacuna conteniendo ceacutelulas
inmunitarias tratadas con una droga llamada copoliacutemero-1 la cual incrementa
el nuacutemero de ceacutelulas T inmunitarias secretoras de citocinas antiinflamatorias y
factores de crecimiento La vacuna modificoacute la conducta de las ceacutelulas gliales
en el cerebro para que sus respuestas fueran beneficiosas en lugar de
perjudiciales Se redujo la inflamacioacuten el grado de neurodegeneracioacuten y
aumentoacute la produccioacuten de factores de crecimiento nervioso (Laurie et al 2007)
1634 Faacutermacos para contrarrestar la citotoxicidad de α-sinucleiacutena
Los investigadores han empezado ya a probar compuestos que revierten
la citotoxicidad de la proteiacutena αs Se han analizado maacutes de 150000 faacutermacos
1635 Vacuna que contiene α-sinucleiacutena
La vacuna conocida como PD01 ha sido objeto de numerosos ensayos
precliacutenicos que han confirmado su principio de accioacuten Esta vacuna podriacutea
ofrecer por primera vez la oportunidad de tratar las causas de la enfermedad de
Parkinson actuando especiacuteficamente contra la proteiacutena αs humana la cual
estaacute fuertemente asociada al perfil cliacutenico de la patologiacutea Asiacute la reduccioacuten en
la concentracioacuten de αs en el cerebro se reflejariacutea en un efecto positivo sobre la
progresioacuten del Parkinson (Schneeberger et al 2010) Igualmente un ensayo
de inmunizacioacuten con αs humana realizado en un modelo de ratoacuten transgeacutenico
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
35
para EP mostroacute produccioacuten de anticuerpos con alta afinidad relativa que se
asociaron a la disminucioacuten en la agregacioacuten de αs en soma y sinapsis
neuronal Ademaacutes los niveles de neurodegeneracioacuten fueron mucho menor y
los anticuerpos producidos reconocieron la proteiacutena αs aberrante asociada a la
membrana de las neuronas promoviendo su degradacioacuten (Masliah et al 2005)
1636 Medicina regenerativa
En un plazo difiacutecil de establecer el trasplante de ceacutelulas madre
embrionarias para reemplazar las neuronas perdidas en la enfermedad podriacutean
transformarse en generadoras inagotables de dopamina En un modelo de rata
de la enfermedad se trasplantaron ceacutelulas progenitoras neurales derivadas de
ceacutelulas madre embrionarias Las ceacutelulas parecieron desencadenar una mejoriacutea
en varias pruebas de conducta aunque relativamente pocas ceacutelulas
trasplantadas se convirtieron en neuronas productoras de dopamina (Torres et
al 2007) Sin embargo se estaacuten desarrollando nuevos meacutetodos para mejorar
el nuacutemero de ceacutelulas productoras de dopamina que pueden formarse de ceacutelulas
madre embrioacutenicas en cultivo asimismo tambieacuten se estaacute explorando si las
ceacutelulas madre de cerebros de adultos pueden ser uacutetiles para tratar la
enfermedad de Parkinson (Fricker-Gates y Gates 2010) Se ha demostrado
que el cerebro de humanos adultos contiene ceacutelulas progenitoras multipotentes
que pueden multiplicarse y formar todos los tipos celulares principales del
cerebro incluso neuronas (Moe et al 2005 Siebzehnrubl et al 2011)
1637 Terapia geacutenica
Es otro enfoque para tratar la enfermedad de Parkinson En estudios de
terapia geneacutetica en modelos animales de la enfermedad se estaacuten probando
distintos genes y teacutecnicas de suministro de genes en un esfuerzo por refinar
este tipo de tratamiento (Burton et al 2003)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
36
164 Terapias alternativas para la enfermedad de Parkinson
1641 Relacionadas a los aspectos nutricionales
bull Aunque actualmente no existe evidencia de que los suplementos
dieteacuteticos pueden retrasar la enfermedad de Parkinson varios estudios
estaacuten examinando si puede ser uacutetil la complementacioacuten con vitaminas
del complejo B (Jia et al 2010)
bull Mantenimiento del balance energeacutetico ya que el desequilibrio dieteacutetico
afecta la actividad de la dopamina en el cerebro
bull Consumo adecuado de sustancias dieteacuteticas con alto poder antioxidante
en el organismo (Perumal et al 1992)
1642 Biomarcadores en la enfermedad de Parkinson
Los biomarcadores para enfermedad Parkinson poseen caracteriacutesticas
mensurables que pueden revelar si la enfermedad estaacute desarrollaacutendose o
evolucionando Tales biomarcadores pueden ayudar a los meacutedicos a detectar
la enfermedad antes de que aparezcan los siacutentomas y mejorar su diagnoacutestico
Tambieacuten mostrariacutean si los medicamentos y otros tipos de terapia tienen un
efecto positivo o negativo sobre el curso de la enfermedad
Uno de los biomarcadores maacutes promisorios para la enfermedad son las
teacutecnicas con imaacutegenes cerebrales Por ejemplo algunos investigadores estaacuten
usando la Tomografiacutea con Emisioacuten de Positrones (PET) cerebral para tratar de
identificar cambios metaboacutelicos en los cerebros de personas con Parkinson y
para determinar coacutemo estos cambios se relacionan con los siacutentomas de la
enfermedad (Savitt et al 2006) Otros biomarcadores potenciales para la
enfermedad son las alteraciones en la expresioacuten geneacutetica
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
37
1643 Fisioterapia
La rehabilitacioacuten fiacutesica es esencial para que la persona mantenga su
autonomiacutea Los ejercicios maacutes indicados son los que mejoran el equilibrio
aquellos que trabajan la coordinacioacuten de movimientos y los ejercicios
respiratorios siempre en funcioacuten de la situacioacuten particular y de modo
progresivo
1644 Terapia ocupacional
Trata de conseguir que la persona tenga la maacutexima independencia
funcional en el desarrollo de las actividades de la vida cotidiana ello permite
una mejor adaptacioacuten e integracioacuten social
1645 Estimulacioacuten eleacutectrica transcraneal
Estudios cliacutenicos estaacuten tratando de probar si la polarizacioacuten eleacutectrica
transcraneal o la estimulacioacuten magneacutetica transcraneal puede reducir los
siacutentomas de Parkinson En la polarizacioacuten eleacutectrica transcraneal se usan
electrodos colocados en el cuero cabelludo para generar una corriente eleacutectrica
que modifica las sentildeales en la corteza cerebral y en la estimulacioacuten magneacutetica
transcraneal se usa una espiral de alambre aislado en el cuero cabelludo para
generar una corriente eleacutectrica breve
1646 Estiacutemulo sensorial repetitivo
El Parkinson se caracteriza porque quienes lo padecen sufren temblores
Sin embargo cuando la medicacioacuten habitual deja de surtir efecto se produce en
ellos un fenoacutemeno casi opuesto su marcha se bloquea y quedan inmoacuteviles
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
38
fenoacutemeno conocido como crisis de bloqueo No obstante si a estos pacientes
se les marca un ritmo sensorial pueden salir de esta crisis relativamente faacutecil lo
que mejora la vida cotidiana de los enfermos
En los antildeos sesenta ya se habiacutea observado que a muchos enfermos les
ayuda a desbloquearse la simple visioacuten de una franja de rayas coloreadas
tambieacuten son satisfactorios otros estiacutemulos visuales la muacutesica y variados
estiacutemulos sonoros asiacute como sensaciones taacutectiles pero es el estiacutemulo sonoro
el que mejor funciona ayudando a salir de sus bloqueos hasta a un 80 de
pacientes En todos los casos la frecuencia de los estiacutemulos y el ritmo deben
ser ajustados para cada paciente no es curativo no suple el tratamiento
farmacoloacutegico ni evita el avance de la enfermedad solo se considera una
terapia de apoyo (del Olmo y Cudeiro 2005 Arias y Cudeiro 2008)
1647 Calidad de vida y eficacia
La valoracioacuten de la terapeacuteutica se puede contrastar mediante escalas que
valoran la actividad motora de la enfermedad o escalas de medicioacuten geneacutericas
de calidad de vida asociado a la salud en general
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
39
2 α-SINUCLEIacuteNA Y PARKINSON
La principal caracteriacutestica neuropatoloacutegica de la EP la constituyen las
inclusiones proteicas intracelulares conocidas como cuerpos de Lewy (Lewy
1912 Forno et al 1988 Savitt et al 2008 Kosaka 2010) agregados fibrilares
donde se han identificado maacutes de 70 moleacuteculas (Tabla 1) considerados
marcadores de neurodegeneracioacuten Se han descrito dos tipos
troncoencefaacutelico que es una masa eosinoacutefila simple o muacuteltiple esfeacuterica o
elongada con nuacutecleo denso y halo perifeacuterico y el cortical que tambieacuten es
eosinoacutefilo pero irregular en su forma estructura pobremente definida y a
menudo sin halo o centro denso (Wakabayashi et al 2007) (Figura 3)
Figura 3 Cuerpos de Lewy (CL) y neuritas de Lewy en pacientes con enfermedad de Parkinson (ACEF) con demencia de CL (B) y enfermedad de CL (D) (A) CL conceacutentrico en una neurona pigmentada de la SN HampE (B) CL tipo cortical en corteza temporal HampE (C) Tiacutepico CL en una neurona pigmentada de la SN inmunomarcado con anti-αs Note que el nuacutecleo central no es inmunoreactivo (D) Muacuteltiples neuritas de Lewy en el nuacutecleo vagal dorsal inmunomarcados con anti- αs (E) Cuerpo paacutelido en una neurona pigmentada de la SN HampE (F) Co-ocurrencia de un cuerpo paacutelido y dos CLs en una neurona pigmentada de la SN HampE Barra de calibrado 10 microm (Wakabayashi et al 2007)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
40
Tabla 1 Componentes moleculares de los cuerpos de Lewy (Wakabayashi et al 2007)
COMPONENTES MOLECULARES DE LOS CUERPOS DE LEWY
MOLECULA TIPO DE CUERPO DE LEWY
Troncoencefaacutelico Cortical Agrina + ND Activadores del proteasoma (PA700 PA28) + + αβ-cristalina - +- α2-macroglobulina + ND α-sinucleiacutena + + ATPasa de la subunidad 26S del proteasoma ND +- β -TrCP + + Calbindina-D + ND Ciclina β + ND Citocromo c + - Clusterinaapolipoproteina J +- + Cromogranina A + + Culina-1 + + DJ-1 +- - Dorfina + + Enzima (E1) activadora de ubiquitina + + Enzima UbcH7 (E2) de conjugacioacuten a ubiquitina + ND Factor de crecimiento de fibroblastos +- - Fosfolipasa C-δ - +- Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa +- ND Heme oxigenasa-1 + + Histona deacetilasa 4 + + Immunoglobulina (IgG) + ND I kBα + + Kinasa 2 rica en leucina + + Kinasa 5 dependiente de ciclina + + kinasas reguladas por sentildeal extracelular + - Lipidos + + NEDD8 + + Neurofilamentos + + NFk B + + NUB1 + + OmiHtrA2 + ND Pael-R + ND Parkina + +
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
41
COMPONENTES MOLECULARES DE LOS CUERPOS DE LEWY
MOLECULA TIPO DE CUERPO DE LEWY
Troncoencefaacutelico Cortical Proteiacutena 1 asociada a microtuacutebulos + - Proteiacutena 1B asociada a microtuacutebulos (MAB 5) + + Proteiacutena 2 asociada a microtuacutebulos + + Proteinasa multicataliacutetica +- + Proteiacutena MxA +- ND Protein kinasa II dependiente de calciocalmodulina + +
Proteiacutena 14-3-3 + + Proteiacutena-G acoplado al receptor de kinasa 5 + - proteiacutenas del amiloide relacionadas a la gelsolina + + Proteiacutenas de choque de calor (Hsp 27 40 60 70 90 y 110) + +
Proteiacutena de interaccioacuten al COOH-terminal de Hsp70 + ND
Proteiacutenas del complemento (C3d C4d C7 y C9) +- +- Proteiacutena del retinoblastoma + - Proteiacutena25 que promueve la polimerizacioacuten de tubulina + +
Proteiacutena precursora del amiloide + +- Proteiacutenas relacionadas al agresomacentrosoma + + Proteoglicanos del condroitiacuten sulfato + + Productos terminales de la glicacioacuten avanzada + + p35 + + p38 + ND Prolil-isomerasa Pin 1 + ND Proteasoma + + p62sequestrosoma 1 + ND PINK1 +- - ROC1 + + Sept4H5 + + SIAH-1 + ND Superoacutexido dismutasa 1 (CuZn superoxido dismutasa) + ND
Superoacutexido dismutasa 2 (Mn superoxido dismutasa) +- ND
Sinfilina-1 + + Sinaptofisina +- +- Sinaptotagmina XI + ND Tau +- +- Transglutaminasa tisular + ND Torsina-A + + Tropomiosina - +
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
42
COMPONENTES MOLECULARES DE LOS CUERPOS DE LEWY
MOLECULA TIPO DE CUERPO DE LEWY
Troncoencefaacutelico Cortical Tubulina + ND Transportador vesicular de monoaminas 2 + - Tirosina hidroxilasa + ND Ubiquitina + + Ubiquitina C-terminal hidrolasa ND + + positivo +- deacutebilmente positivo - negativo ND= no descrito
Ultraestructuralmente los cuerpo de Lewy estaacuten compuestos de
estructuras filamentosas que se asemejan a neurofilamentos pero maacutes
gruesos y sin ramificaciones ademaacutes en el tipo troncoencefaacutelico se observa en
el nuacutecleo estructuras tipo vesicular o circular (Wakabayashi et al 2007) El
principal componente de estas inclusiones es la proteiacutena αs que se acumula en
regiones corticales y subcorticales en la EP lo que la hace clave de estudio en
esta enfermedad y en las llamadas sinucleopatiacuteas Ademaacutes siempre estaacute
presente en las formas raras de presentacioacuten familiar y en los casos
esporaacutedicos de la EP (Spillantini et al 1998)
Los cuerpos paacutelidos son estructuras menos eosinoacutefilas que los cuerpos de
Lewy y coexisten frecuentemente con estos en la misma neurona siendo los
cuerpos de Lewy maacutes pequentildeos (Figura 3) Tienen aacutereas hialinas pero sin
halo ultraestructuralmente tienen material granular o vesicular esparcido junto
con filamentos Los cuerpos paacutelidos son deacutebilmente positivos a ubiquitina e
intensamente inmunoreactivos para αs En la fase temprana de la EP son maacutes
abundantes los cuerpos paacutelidos lo que se puede demostrar por la fuerte
correlacioacuten de immunoreactividad a ubiquitina entre cuerpos paacutelidos y cuerpos
de Lewy este fenoacutemeno sugiere que los cuerpos de Lewy se forman a partir de
los cuerpos paacutelidos (Olanow et al 2004 Wakabayashi et al 2007)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
43
21 Localizacioacuten de la proteiacutena α-sinucleiacutena
Estaacute ampliamente distribuida por todo el sistema nervioso pero es
especialmente toacutexica para las ceacutelulas dopamineacutergicas (Rochet et al 2004
Yasuda et al 2007) Inicialmente se identificoacute como una proteiacutena asociada a
las vesiacuteculas sinaacutepticas pero tambieacuten se localiza en el citosol y en el nuacutecleo
(Uversky 2007) Tiene la capacidad de asociarse en un 50 con fosfoliacutepidos
de membrana y el otro 50 es fundamentalmente citosoacutelico (Lotharius y
Brundin 2002)
22 Papel fisioloacutegico de la proteiacutena α-sinucleiacutena
Estudios histoquiacutemicos han demostrado que αs estaacute asociada con
vesiacuteculas presinaacutepticas lo que sugiere funcionalidad de esta proteiacutena en
aspectos relacionados con la transmisioacuten sinaacuteptica (Maroteaux et al 1988
Polymeropoulos et al 1997) asiacute como en el mantenimiento del reservorio de
vesiacuteculas sinaacutepticas (Cabin et al 2002)
Aunque se desconoce el mecanismo exacto se ha postulado que la
proteiacutena αs podriacutea cumplir un papel importante en la funcioacuten neuronal al
regular la formacioacuten de las vesiacuteculas sinaacutepticas desde endosomas tempranos a
traveacutes de interacciones con la fosfolipasa D2 (PLD2) (Cockcroft 2001)
regulacioacuten en el transporte de vesiacuteculas sinaacutepticas (Gitler et al 2008) y
modulacioacuten del reciclaje de las mismas al inhibir PLD2 (Jenco et al 1998 Ahn
et al 2002) PLD2 es la enzima que cataliza la hidroacutelisis de fosfatidilcolina
para producir aacutecido fosfatiacutedico y colina (Cockcroft 2001 Lotharius y Brundin
2002) El aacutecido fosfatiacutedico es un liacutepido crucial en los procesos de unioacuten y fusioacuten
de vesiacuteculas (Riebeling et al 2009) Asiacute estaacute implicado en reclutar moleacuteculas
adaptadoras que disparan la gemacioacuten de vesiacuteculas de la membrana donadora
y tambieacuten en reclutar proteiacutenas de fusioacuten a la membrana (Cockcroft 2001) Asiacute
el efecto de la modulacioacuten de la actividad de PLD2 por αs podriacutea ser un
mecanismo importante de regulacioacuten del ciclo de vesiacuteculas sinaacutepticas (Figura
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
44
4) A pesar de estos hallazgos en un reciente estudio donde se utilizaron
diferentes liacuteneas celulares incluyendo la liacutenea celular PC12 se demostroacute que
αs no generaba inhibicioacuten significativa de la actividad de PLD2 maacutes bien podriacutea
ser un efecto de la citotoxicidad general causada por sobreexpresioacuten o
expresioacuten de las formas anormales de αs (Rappley et al 2009)
Se sugiere que αs podriacutea servir como chaperona para el correcto
plegamiento de proteiacutenas SNARE ligadas al proceso sinaacuteptico (Chua y Tang
2006 Cooper et al 2006) Ademaacutes estudios con ratones transgeacutenicos
involucran la proteiacutena αs en el ensamblaje de complejos de proteiacutenas SNARE
las cuales son necesarias para la fusioacuten de vesiacuteculas con la membrana
plasmaacutetica (Gitler et al 2008)
Hay evidencias que prueban que esta proteiacutena estaacute implicada en la
produccioacuten almacenamiento y liberacioacuten de dopamina (Cabin et al 2002
Lotharius y Brundin 2002 Shun et al 2005 Larsen et al 2006 Larsen et al
2006) Al influenciar la actividad de la enzima tirosina hidroxilasa (TH) se
modula la produccioacuten de eacutesta catecolamina (ver apartado 3211) Como
ejemplo se ha observado que al silenciar la siacutentesis de αs se produce un
incremento de la actividad TH aumentando la produccioacuten de dopamina (Liu et
al 2008) El papel de αs seriacutea el de moleacutecula reguladora en la siacutentesis de
dopamina evitando que concentraciones elevadas de esta amina se oxide en
el citosol y provoquen estreacutes oxidativo que dariacutea lugar a muacuteltiples
consecuencias patogeacutenicas incluyendo la formacioacuten de αs protofibrilar (Volles
et al 2001)
Su funcioacuten en la plasticidad neural se ha demostrado analizando el
aprendizaje motor del trino en una especie de canario donde incrementa la
inmunoreactividad del anaacutelogo a la αs en el proceso de aprendizaje y
disminuye despueacutes de eacuteste (George y Clayton 1988)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
45
Figura 4 Papel fisioloacutegico de la proteiacutena α -sinucleiacutena Terminal presinaacuteptica de
neurona dopamineacutergica que representa la funcioacuten potencial de la proteiacutena αs en la
regulacioacuten del almacenamiento de la DA La DA se sintetiza en el citoplasma e
inmediatamente pasa a vesiacuteculas monoamineacutergicas La proteiacutena αs al unirse a
fosfoliacutepidos de membranas cambia de su estructura secundaria en espiral aleatoria a
un 83 en α-heacutelice Las mutaciones en αs podriacutean resultar en una reduccioacuten del
nuacutemero de vesiacuteculas que estaacuten disponibles para el almacenamiento de dopamina lo
que lleva a una acumulacioacuten de dopamina libre en citosol y el aumento de los niveles
de estreacutes oxidativo (Julie Lotario y Patrik Brundin 2006)
23 Bioquiacutemica de la proteiacutena α-sinucleiacutena
El gen de αs fue por primera vez identificado en la raya eleacutectrica Torpedo
californica cuyos oacuterganos eleacutectricos estaacuten inervados por grandes terminales
colineacutergicas (Maroteaux et al 1988) La substancia P un peacuteptido
neurotrasmisor y neuromodulador generado a partir del mismo precursor
preprotakinina se detectoacute tambieacuten en la raya Rajabatis (Dahlstedt 1959) De
esta sustancia igualmente deriva otro peacuteptido la substancia K y probablemente
la sinucleiacutena La familia de las sinucleiacutenas ademaacutes de αs incluye a las
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
46
proteiacutenas beta-sinucleiacutena (βs) y γ-sinucleiacutena (γs) Entre las caracteriacutesticas maacutes
notables destaca que αs y βs a diferencia de γs se localizan en las terminales
nerviosas presinaacutepticas y que βs y γs no aparecen en los cuerpos de Lewy ni
poseen propiedades agregativas in vitro Se ha demostrado que la proteiacutena βs
es capaz de inhibir la agregacioacuten (fibrilacioacuten) de αs in vitro observaacutendose un
comportamiento similar en estudios in vivo sobre cerebro de ratones Los
miembros de esta familia de sinucleiacutenas contienen entre 127 y 140
aminoaacutecidos con un 55 y 62 de homologiacutea de secuencia (Clayton y George
1998) La proteiacutena αs contiene 140 aminoaacutecidos y aparece en el material
geneacutetico del cromosoma 4q21 La βs contiene 134 aminoaacutecidos aparece en el
material geneacutetico del cromosoma 5q55 y no se conoce en la actualidad alguna
patologiacutea neurogeneacutetica asociada a ella (Spillantini et al 1998)
La conformacioacuten nativa de αs es auto -inhibitoria de su agregacioacuten
mientras que las formas mutantes de αs ligadas al inicio temprano de la EP
desestabilizan interacciones terciarias especiacuteficas que son esenciales para que
αs adopte su conformacioacuten nativa (Lotharius y Brundin 2002 Mandal et al
2006 Waxman y Giasson 2009) Se ha demostrado que se puede unir a
vesiacuteculas in vivo e in vitro a traveacutes de fosfoliacutepidos de membrana por interaccioacuten
de dos terceras partes de su dominio amino terminal Esta interaccioacuten induce
un dramaacutetico cambio de su estructura secundaria pasando de una estructura
espiral aleatoria a una en α-helix (Davidson et al 1998) en maacutes de un 80 de
su estructura En la mutacioacuten Ala30Pro de αs se altera la capacidad de
interaccionar con la membrana de las vesiacuteculas (Jensen et al 1998 Jo et al
2002) En la mutacioacuten Ala53Thr no se afecta la unioacuten a vesiacuteculas pero si a
membranas planas (Jo et al 2000)
24 Posibles alteraciones que dan lugar a la agregacioacuten de α-sinucleiacutena
Mutaciones del gen de la proteiacutena αs en A30P A53T (principal mutacioacuten)
y E46K inducen su propia agregacioacuten (forma familiar autosoacutemico dominante)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
47
Tambieacuten la duplicacioacuten y triplicacioacuten del gen provocan agregacioacuten de αs
conduciendo a la presentacioacuten de la EP (Polymeropoulos et al 1997 Kruger et
al 1998 Singleton et al 2003 Chartier-Harlin et al 2004 Ibanez et al 2004
Zarranz et al 2004)
La cineacutetica de fibrilacioacuten de αs depende de factores tales como la
temperatura pH e interaccioacuten con poliaminas e iones metaacutelicos Se ha
demostrado que una variacioacuten grave del pH y eventos de estreacutes oxidativo a
nivel celular producen cambios de la conformacioacuten de la proteiacutena αs proteiacutena
que en su forma normal nativa carece de una estructura estable La
disminucioacuten en el pH celular transforma la proteiacutena αs en un periodo corto de
tiempo a una conformacioacuten parcialmente plegada potenciando formaciones
oligomeacutericas prefibrilares que terminan en agregados fibrilares (Uversky et al
2001) Este fenoacutemeno tambieacuten ocurre cuando la proteiacutena αs es sometida a
incrementos de temperatura de forma continua La conformacioacuten parcialmente
plegada puede ser transitoria pero ante la presencia croacutenica de estos factores
(cambio de pH y ROS) se hace estable y da lugar a los pasos subsecuentes
hasta la forma fibrilar
Maacutes del 90 de la forma insoluble de αs en sinucleopatiacuteas es fosforilada
en serina 129 (Anderson et al2006) de forma normal soacutelo el 4 de Ser 129
esta fosforilada Esta fosforilacioacuten promueve la oligomerizacioacuten y agregacioacuten
fenoacutemeno demostrado in vitro con αs recombinante fosforilada en dicho
aminoaacutecido (Fujiwara et al 2002)
Existen diferentes mecanismos patogeacutenicos que guiacutean la agregacioacuten de la
αs como se ha demostrado a traveacutes del estudio de los casos familiares versus
los no familiares donde en los primeros la mutacioacuten de αs promueve su propia
agregacioacuten aunque en los no relacionados con mutaciones tambieacuten presentan
agregacioacuten (Spallantini et al 1997)
El cobre se une especiacuteficamente al extremo N-terminal de αs induciendo
su agregacioacuten bajo condiciones que podriacutean ser relevantes para la EP (Wright
et al 2009 Binolfi et al 2010) Asimismo el papel del cobre en otros
desoacuterdenes neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer sugiere
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
48
que las perturbaciones en la homeostasis de este ion metaacutelico podriacutean
constituir un elemento comuacuten en la etiologiacutea de estos desordenes
neurodegenerativos (Feaga et al 2011)
Como conclusioacuten se piensa que la agregacioacuten de proteiacutenas impide la
actividad protectora en las terminales sinaacutepticas lo que causa una lesioacuten
retroacutegrada por efecto toacutexico lo que desencadena la apoptosis o muerte celular
por necrosis
25 Papel citopatoloacutegico de la agregacioacuten de α-sinucleiacutena
Una cuestioacuten innegable para la proteiacutena αs es que sus formas alteradas
tienen un efecto devastador sobre la integridad de las neuronas nigrales
dopamineacutergicas Estas formas alteradas de αs generan dos rutas citopaacuteticas
una de ellas desencadenada por la funcioacuten anormal de la proteiacutena y la otra por
el efecto toacutexico de la forma aberrante
La modificacioacuten de αs causa defectos en el transporte de vesiacuteculas La
clave citopatoloacutegica de esta proteiacutena puede recaer sobre su efecto toacutexico en la
alteracioacuten del transporte de vesiacuteculas desde el retiacuteculo endoplaacutesmico (RE)
(Cooper et al 2006 Gitler et al 2008) Las vesiacuteculas del RE emergen pero su
acoplamiento o fusioacuten al Golgi esta inhibido La sobreexpresioacuten de la GTPasa
Rab1 (ver apartado 431 funciones de las proteiacutenas Rab GTPasas)
reconstituye este traacutefico (Cooper et al 2006) Estos hallazgos sugieren que αs
altera la maquinaria de transporte Se sabe ademaacutes que la agregacioacuten de αs
genera estreacutes del RE promoviendo la acumulacioacuten de otras proteiacutenas mal
plegadas (Gitler et al 2008) lo que exacerba el dantildeo en el transporte
Hay estudios que demuestran que la agregacioacuten de αs afecta el reciclaje de
vesiacuteculas sinaacutepticas generando una acumulacioacuten de dopamina en el
citoplasma lo que desencadena estreacutes oxidativo (Lotharius y brundin 2002)
Esta hipoacutetesis se basa en la alteracioacuten de dos funciones importantes de la
proteiacutena αs (ver apartado 22) una de ellas a traveacutes de la modulacioacuten de la
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
49
actividad de la enzima tirosina hidroxilasa (Liu et al 2008) y la otra que
presenta a αs como reguladora del ciclo de vesiacuteculas sinaacutepticas En neuronas
dopamineacutergicas las formas aberrantes sobreexpresada o mutada podriacutean
generar una reduccioacuten del nuacutemero de vesiacuteculas principalmente en la reserva
de vesiacuteculas sinaacutepticas localizadas en los botones axoacutenicos (Murphy et al
2000 Cabin et al 2002) Este fenoacutemeno provocariacutea un incremento progresivo
en los niveles de dopamina citosoacutelica especialmente si la retroalimentacioacuten
negativa de TH por αs se encuentra alterada El efecto subsecuente es un
incremento del estreacutes oxidativo dependiente de dopamina libre en citosol
(Lotharius et al 2002 Xu et al 2002 Zhou et al 2002) Asimismo la
produccioacuten de ROS a nivel intracelular induce que maacutes αs pase a la forma
protofibrilar produciendo permeabilizacioacuten de vesiacuteculas dopamineacutergicas lo que
exacerba el estreacutes oxidativo en estas neuronas
Un incremento de αs induce la acumulacioacuten de αs fibrilar de parkina y α -
tubulina afectaacutendose su solubilidad Como consecuencia decrece la
ubiquitizacioacuten de α -tubulina lo que produce la alteracioacuten del citoesqueleto
(Kawahara et al 2008) La proteiacutena parkina es la E3 ligasa para α - tubulina y
αs entre otras (Hattori et al 2000) pero αs insoluble afecta a su ligasa Se ha
demostrado que la sobreexpresioacuten de αs aumenta los niveles de parkina
encontraacutendose de forma anormalmente incrementada en la fraccioacuten insoluble
el mismo fenoacutemeno ocurre si se utiliza un inhibidor del sistema proteasoma
(Kawahara et al 2008)
α -sinucleiacutena agregada altera de forma perjudicial la expresioacuten geneacutetica lo
que puede generar dantildeos graves de las funciones internas de la ceacutelula
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
50
3 MODELOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS PARA ENFERMEDAD DE PARKINSON
El desarrollo de modelos experimentales para esta entidad
neurodegenerativa se ha encaminado en reproducir aquellas alteraciones
histoloacutegicas y neuroquiacutemicas que se producen por dantildeo y peacuterdida de neuronas
dopamineacutergicas de la sustancia negra pars compacta Aunque los modelos
animales y celulares son de gran beneficio para el entendimiento de la
patogeacutenesis solo pueden abarcan parcialmente algunos de los frentes
fisiopatoloacutegicos y citopatoloacutegicos que se desarrollan de forma natural en la EP
No obstante brindan informacioacuten valiosa de mecanismos implicados y son el
primer paso para evaluar posibles tratamientos
31 Modelos animales
Existe mucha variabilidad entre modelos pero el propoacutesito de un buen
modelo animal es lograr reproducir a traveacutes de procedimientos estandarizados
el mayor acercamiento a los eventos citopaacuteticos que ocurren de forma natural
en la EP Esto permite entenderla mejor y brinda mayor posibilidad de
asociarlos a nuevas terapias
311 Parkinsonismo inducido por neurotoxinas
Las sustancias 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y 1-metil-4-fenil-1236
tetrahidropiridina (MPTP) han sido utilizadas de forma claacutesica para reproducir
los desoacuterdenes neuroloacutegicos que se presentan en la EP (Dauer y Przedborski
2003) Ambas actuacutean de forma selectiva como agentes que perturban o
destruyen el sistema catecolamineacutergico Ademaacutes existen otras sustancias como
rotenona (Norazit et al 2010) maneb y paraquat que administradas
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
51
sisteacutemicamente pueden inducir ciertas caracteriacutesticas particulares de la EP
(Dauer y Przedborski 2003 Schober 2004 Duty y Jenner 2011)
3111 6-hidroxidopamina
6-OHDA sustancia aislada y conocida desde la deacutecada del 60
(Ungerstedt 1968) anaacutelogo hidroxilado de la dopamina natural que compite
de forma dominante por los receptores que captan catecolaminas Es
considerada la neurotoxina maacutes utilizada en el desarrollo de modelos
experimentales en roedores aunque tambieacuten resulta ser un toacutexico efectivo en
gatos y primates produciendo degeneracioacuten y muerte de la sustancia negra
(Beal 2001) No atraviesa la barrera hematoencefaacutelica por lo que carece de
accioacuten neurotoacutexica sobre el sistema nervioso central si es administrada
sisteacutemicamente no obstante puede ser inyectada a nivel intracerebral
logrando lesionar de forma selectiva todos los sistemas catecolamineacutergicos del
enceacutefalo observaacutendose cambios trascurridas 12 horas (Faull y Laverty 1969)
Este fenoacutemeno lesivo se debe a su alta afinidad por el sistema de transporte de
aminas bioacutegenas (Luthman et al 1989) lo que explica el dantildeo severo y
destructivo de esta sustancia sobre neuronas adreneacutergicas simpaacuteticas
postganglionares cuando es administrada de forma sisteacutemica
En 1968 Ungerstedt describioacute que la inyeccioacuten estereotaacutexica (teacutecnica
neuroquiruacutergica que posibilita el acceso a zonas profundas del cerebro
mediante una aguja de biopsia) de 6-OHDA en el haz nigroestriado induciacutea un
dantildeo selectivo de las neuronas productoras de dopamina de la sustancia
negra Seguidamente se demostroacute bajo la misma teacutecnica que 6-OHDA induciacutea
degeneracioacuten tanto en las neuronas de la SNc que proyectan al estriado como
las del aacuterea tegmental ventral (ATV) que forman parte del sistema
dopamineacutergico mesoliacutembico y las cuales no se afectan en los pacientes con
Parkinson Estos hallazgos indican que histopatoloacutegicamente la lesioacuten
producida por 6-OHDA a este nivel es maacutes extensa que en los pacientes con
EP de ocurrencia natural por lo cual muchos de los modelos con esta
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
52
sustancia se han limitado a inducir la lesioacuten directamente inyectando soacutelo en
zonas especiacuteficas que involucran la SN pars compacta para evitar de esta
manera la afectacioacuten de las neuronas dopamineacutergicas del aacuterea ATV Sin
embargo esta teacutecnica tiene el problema de inducir degeneracioacuten muerte
raacutepida y extensa de casi todas las neuronas productoras de DA manifestando
eventos citopatogeacutenicos que difieren sustancialmente de aquellos que ocurren
de forma lenta y progresiva en la EP Por el contrario la inyeccioacuten estriatal de
6-OHDA reproduce una degeneracioacuten lenta y progresiva de las neuronas
productoras de DA de la sustancia negra ipsilateral a la lesioacuten debido
posiblemente a la degeneracioacuten neuronal retroacutegrada secundaria a la lesioacuten de
terminales de DA estriatales las cuales presentan peacuterdida neuronal
dependiente de la dosificacioacuten administrada de la neurotoxina (Sauer y Oertel
1994 Przedborski et al 1995)
Desde el punto de vista de la sintomatologiacutea motora se sabe que al
inyectar unilateralmente 6-OHDA directamente sobre la SN se produce un
desequilibrio en los niveles de DA entre los 2 lados del enceacutefalo a nivel del
sistema estriatal Este fenoacutemeno se presenta inmediatamente despueacutes de la
cirugiacutea y el cual genera de forma espontaacutenea una conducta motriz alterada
donde el animal rota de forma ipsilateral a la lesioacuten Asimismo estos animales
con lesioacuten unilateral de la viacutea nigroestriada siguen presentando el mismo patroacuten
de rotacioacuten cuando seguidamente se les administran sustancias que estimulan
la produccioacuten y liberacioacuten de dopamina (Przedborski et al 1995) No obstante
cuando reciben estiacutemulos agonistas dopamineacutergicos muestran rotacioacuten
contralateral a la lesioacuten que se explica como consecuencia de la denervacioacuten
induciendo una regulacioacuten positiva en el nuacutemero de receptores para DA en el
estriado del mismo lado a la lesioacuten contrario a las anfetaminas que estimulan
la liberacioacuten de dopamina en las terminales presinaacutepticas aumentando la
concentracioacuten de DA uacutenicamente en el estriado contralateral a la lesioacuten lo que
produce un desequilibrio funcional a favor de eacuteste (Schober 2004)
Neuroquiacutemicamente las neuronas dopamineacutergicas auacuten funcionales tratan
de compensar el deacuteficit de dopamina inducido por la lesioacuten Asiacute cuando se
pierden maacutes del 90 de las neuronas nigrales se produce un incremento de la
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
53
actividad de la enzima tirosina hidroxilasa lo cual genera una mayor cantidad
de dopamina liberada en el estriado por las terminales dopamineacutergicas
existentes que se acompantildea de una regulacioacuten positiva de los receptores
postsinaacutepticos El incremento de receptores dopamineacutergicos estriatales D2 es
mucho maacutes elevado que para los receptores D1 el cual solo se incrementa
levemente En estos casos la frecuencia de descarga de las neuronas
dopamineacutergicas de la SNc se incrementa pero no es suficiente para
compensar el deacuteficit de DA
Se ha postulado que la muerte de las neuronas dopamineacutergicas debido al
efecto toxico de 6-OHDA se produce principalmente por un dantildeo generado en
la cadena respiratoria de la mitocondria donde se disminuye la actividad
enzimaacutetica de glutatioacuten (GSH) y superoacutexido dismutasa (SOD) (Perumal et al
1992) con posterior alteracioacuten del complejo I mitocondrial lo que bloquea la
fosforilacioacuten oxidativa y formacioacuten de ATP (Betarbet et al 2002) disparando la
cascada apoptoacutetica Aunque existen estudios que indican que 6-OHDA posee
una potente accioacuten inhibidora sobre este mecanismo mitocondrial evidencias
recientes demuestran que la inhibicioacuten del complejo I no es suficiente para
desencadenar la muerte neuronal por apoptosis (Choi et al 2011)
Tambieacuten se ha demostrado que la muerte de neuronas productoras de DA
inducida por 6-OHDA estaacute ligada fundamentalmente a la formacioacuten de
metabolitos generadores de estreacutes oxidativo como peroacutexido de hidrogeno
(H2O2) radicales libres del tipo hidroxilo (OH-) y quinonas producto de su
metabolismo (Perumal et al 1992) Asimismo la oxidacioacuten de 6-OHDA por la
monoamino-oxidasa y la auto-oxidacioacuten favorecida por la presencia de Fe++
fomentan la produccioacuten de estos radicales Por tal motivo sustancias
antioxidantes como vitamina E oacute N-acetil-cisteiacutena inhibidores de la MAO y
quelantes de hierro protegen a las neuronas dopamineacutergicas de la accioacuten
neurotoacutexica de la 6-OHDA (Cadet et al 1989 Perumal et al 1992)
Con este modelo no se producen cuerpos de inclusioacuten y su acuacutemulo
causa la muerte celular sin caracteriacutesticas de tipo apoptoacutetica (Jeon et al 1995
Woodgate et al 1999) No obstante otros autores manifiestan que 6-OHDA si
produce apoptosis (Burton et al 2003) aunque en bajo porcentaje que estaacute
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
54
mediado en parte por la activacioacuten de la cascapa 3 y la proteasa lisosomal
catepsina D
3112 1-metil-4-fenil-1236 tetrahidropiridina
La neurotoxina selectiva para estructuras dopamineacutergicas MPTP es un
anaacutelogo lipofiacutelico del narcoacutetico meperidina Descubierta accidentalmente en
1982 (Langston et al 1983) cuando adictos heroinoacutemanos que se inyectaron
heroiacutena sinteacutetica contaminada con esta sustancia desarrollaron siacutentomas
ideacutenticos a los enfermos con Parkinson que insoacutelitamente revertiacutean su
sintomatologiacutea en totalidad con tratamientos claacutesicos antiparkinsonianos como
L-dopa o agonistas dopamineacutergicos A diferencia de 6-OHDA esta neurotoxina
si puede atravesar la barrera hematoencefaacutelica como protoxina e inducir
manifestaciones de la EP de forma irreversible en ciertas especies animales
incluyendo al humano (Markey et al 1984) De hecho la utilizacioacuten de esta
sustancia de forma experimental se debe hacer con precaucioacuten ya que ingresa
a traveacutes de varias viacuteas y su exposicioacuten puede dar lugar a un siacutendrome
parkinsoniano croacutenico
Es la neurotoxina de eleccioacuten en modelos animales siendo en primates el
mejor caracterizado (Beal 2001) En estas especies se usan dosis croacutenicas
para parecerse maacutes a la EP ya que los siacutentomas parkinsonianos son
inicialmente transitorios pero se hacen permanentes con la administracioacuten
repetida de la toxina semanas y meses logrando reproducir todos los signos
clave de la enfermedad de Parkinson incluyendo la formacioacuten de agregados
intracelulares (Forno et al 1993) Tambieacuten es usada eficientemente en perros
gatos ovejas y desafortunadamente con menos eficiencia en roedores
especialmente en ratoacuten al tener menor afinidad por el transportador de DA
En general para todas estas especies se produce un siacutendrome parkinsoniano
asociado a una degeneracioacuten selectiva de las neuronas dopamineacutergicas de la
SNc (Schober 2004) No obstante a pesar de su eficiencia la administracioacuten
de MPTP entre las diferentes especies estudiadas induce respuestas con
distintas caracteriacutesticas y se ha postulado que esta variabilidad en las
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
55
respuestas puede estar relacionada con diferencias en el metabolismo de
MPTP y en la distribucioacuten y retencioacuten cerebral de su metabolito MPP+ Incluso
se ha descrito que la neurotoxicidad del MPTP es dependiente del contenido en
neuromelanina debido a la alta afinidad del MPP+ por este pigmento presente
en las neuronas productoras de DA (Herrero et al 1993) mientras que para
otros estaacute relacionada con la actividad monoamino-oxidasa tipo B a nivel de la
microvasculatura cerebral
Una vez administrada la toxina es raacutepidamente metabolizada en astrocitos
por accioacuten de la monoamino oxidasa tipo B convirtieacutendose en 1-metil-4-fenil
23 dihidropiridiacutenico (MPDP) el cual de forma espontaacutenea se oxida a MPP+
dado que las neuronas dopamineacutergicas tienen una baja actividad MAO-B se
cree que la transformacioacuten del MPTP ocurre en estas ceacutelulas gliales las cuales
son responsables de regular el ambiente bioquiacutemico que rodea a las neuronas
(Przedborski y Vila 2003) La oxidacioacuten de MPTP puede ser bloqueada cuando
se utilizan inhibidores de la MAO-B como deprenil y pargilina lo que demuestra
que son los metabolitos polares de esta sustancia los que poseen efectos
perjudiciales y no el agente lipofiacutelico MPTP como tal Posiblemente de forma
pasiva el MPP+ se transpola al liacutequido extracelular y en su forma catioacutenica
ingresa activamente al interior de la neurona dopamineacutergica al competir por el
transportador de DA Se mueve al interior de las vesiacuteculas sinaacutepticas por unioacuten
al transportador de monoaminas vesicular aunque puede ingresar a
mitocondrias o encontrarse libre en citosol de hecho es un mecanismo
protector el paso a vesiacuteculas sinaacutepticas (Klaidman et al 1993)
El efecto toacutexico de esta sustancia en neuronas dopamineacutergicas ha sido
atribuido a su capacidad de producir dantildeos a nivel mitocondrial (Nicklas et al
1985) Se ha comprobado que MPP+ es transportado activamente desde el
citoplasma al interior de la mitocondria en contra de un gradiente de
concentracioacuten Una vez en la mitocondria inhibe el complejo multienzimaacutetico I
de la cadena transportadora de electrones alterando la fosforilacioacuten oxidativa
El efecto de este fenoacutemeno se refleja en un descenso en la produccioacuten de ATP
(Fabre et al 1999) adicionalmente se genera un exceso de radicales libres
provocado por la alteracioacuten en los potenciales transmembrana y la deplecioacuten
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
56
del glutation reducido (GSH) (Hasegawa et al 1997) Los efectos de MPP+
sobre la mitocondria pueden tambieacuten estimular indirectamente la produccioacuten de
ROS al promover la fuga de DA libre al citosol desde las vesiacuteculas sinaacutepticas
debido a la incapacidad del transportador vesicular de monoaminas para
mantener el gradiente de concentracioacuten por falta de ATP (Johnson 1988)
Otros estudios sugieren que el mecanismo patogeacutenico generado por
MPP+ en el cual se perturba la funcioacuten mitocondrial se debe a cambios
bioquiacutemicos que afectan severamente las concentraciones de calcio
intracelular fenoacutemeno que precede a la degeneracioacuten y muerte celular En este
proceso lesivo inicialmente ocurre una deplecioacuten de Ca++ mitocondrial que es
seguida de un incremento de las concentraciones de Ca++ citosoacutelico el cual
ingresa desde el liacutequido extracelular por activacioacuten de canales NMDA (receptor
ionotroacutepico de glutamato que responde al agonista N-metil D-aspartato)
dependientes de ligando Este incremento de calcio activa una enzima
especiacutefica dependiente Ca++ denominada oxido niacutetrico sintasa (NOS)
produciendo oacutexido niacutetrico el cual a su vez puede inducir una inhibicioacuten directa
de la cadena respiratoria mitocondrial (Przedborski y Vila 2003) o dar lugar a la
formacioacuten de peroxinitritos que son potentes inductores de estreacutes oxidativo De
hecho se ha obtenido neuroproteccioacuten frente a MPP+ con antagonistas NMDA
lo cual se interpreta por el bloqueo en la entrada del calcio Asimismo la
mutacioacuten especiacutefica en ratones que da lugar a la carencia de expresioacuten para el
gen que codifica a NOS fueron significativamente maacutes resistentes al
tratamiento con MPTP lo que demuestra la implicacioacuten crucial de NOS en el
proceso neurotoacutexico mediado por MPTP y posiblemente en la EP (Liberatore et
al 1999)
A pesar de todas las evidencias que hacen pensar que el proceso
citopaacutetico mediado por esta neurotoxina es debido principalmente a los dantildeos
generados en la mitocondria nuevos hallazgos bastante soacutelidos han
demostrado que el dantildeo y posterior deceso de neuronas dopamineacutergicas de la
SNc no es producido por el efecto directo sobre la mitocondria si no que ocurre
por otros mecanismos no ligados a este orgaacutenulo De hecho se piensa que es
por el efecto perjudicial de la toxina sobre el citoesqueleto de la neurona lo que
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
57
afecta el transporte y liberacioacuten de DA la inhibicioacuten del complejo I mitocondrial
potenciariacutea el problema al inducir una disminucioacuten en la produccioacuten de ATP
celular que dariacutea lugar a una alteracioacuten en la organizacioacuten de los
microfilamentos (Choi et al 2011)
Se piensa que el estreacutes oxidativo inducido por MPP+ en el interior de la
neurona puede contribuir a la accioacuten toacutexica del MPTP Se sugiere entonces que
el dantildeo celular se origina por la sobreproduccioacuten intraneuronal de radicales
superoacutexido y otros radicales libres originados por la induccioacuten oxidativa del
MPP+ tambieacuten por la disminucioacuten en los niveles intracelulares de glutatioacuten y el
incremento en la auto-oxidacioacuten de la DA Asimismo se ha demostrado que el
MPP+ induce peroxidacioacuten lipiacutedica en cultivos de ceacutelulas productoras de DA
(Rojas y Rios 1993 Obata 2003) Sin embargo el dantildeo inducido por esta
neurotoxina no es antagonizado por sustancias antioxidantes como el aacutecido
ascoacuterbico oacute el tocoferol ni potentes quelantes de metales de transicioacuten pueden
proteger de su efecto dantildeino al contrario exacerban su toxicidad Estos
hallazgos justifican por que muchos estudios con MPTP no centran la muerte
de neuronas dopamineacutergicas inducida por la formacioacuten de radicales libres
Ciertas sustancias conocidas como factores troacuteficos neuronales podriacutean tener
la capacidad de frenar la degeneracioacuten de neuronas dopamineacutergicas inducida
por MPP+ como es el caso del factor neurotroacutefico derivado de las ceacutelulas
gliales (GDNF) un poderoso protector que ha sido probado con eacutexito en
modelos animales para esta neurotoxina (Gash et al 1996)
Neuroquiacutemicamente la accioacuten toacutexica del MPTP a nivel de la sinapsis
dopamineacutergica se caracteriza por una reduccioacuten de la concentracioacuten de DA y
de sus metabolitos Tambieacuten se ha demostrado que se produce alteracioacuten en la
densidad de receptores dopamineacutergicos e inhibicioacuten de las enzimas implicadas
en la siacutentesis de DA Al contrario de lo que sucede en la EP donde la deplecioacuten
de DA es maacutes intensa en el putamen que en nuacutecleo caudado los primates
expuestos de forma croacutenica a la accioacuten del MPTP muestran una disminucioacuten
homogeacutenea y no selectiva del contenido de DA en el sistema estriatal Sin
embargo los estudios realizados a bajas dosis en estas especies exhiben
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
58
degeneracioacuten preferencialmente sobre el putamen como en la EP (Moratalla
et al 1992)
Histopatoloacutegicamente los estudios realizados en primates han demostrado
que la lesioacuten inducida por MPTP afecta ademaacutes de las neuronas nigrales
otras poblaciones de neuronas dopamineacutergicas como son las neuronas del
ATV No obstante la peacuterdida neuronal es de mayor intensidad en las neuronas
productoras de DA de la SNc (Sirinathsinghji et al 1992 Varastet 1994)
3113 Rotenona moneb y paraquat
Rotenona moneb y paraquat son pesticidas orgaacutenicos de uso comuacuten
que administrados sisteacutemicamente en animales producen una sintomatologiacutea
homologa a la que presentan los pacientes con enfermedad de Parkinson en
especial rigidez bradicinesia y temblores De hecho el paraquat presenta una
estructura con similaridad a la de MPP+ y la rotenona se une a los mismos
sitios de unioacuten del MPP+ Estas caracteriacutesticas habilitan a estas sustancias
como modelos neurotoacutexicos uacutetiles para el estudio del Parkinson (Dauer y
Przedborski 2003 Nisticograve et al 2011)
En roedores se ha encontrado que la exposicioacuten a estos pesticidas
agriacutecolas puede causar cambios celulares y de conducta que imitan a aquellos
observados en la enfermedad de Parkinson Ademaacutes la exposicioacuten croacutenica de
rotenona en animales se relaciona con un dantildeo en el sistema dopamineacutergico
donde se produce degeneracioacuten progresiva de ceacutelulas nigroestriatales e
inclusiones citoplasmaacuteticas similares a los cuerpos de Lewy los cuales son
ricos en la proteiacutena αs (Betarbet et al 2000) Asimismo estudios de campo
sugieren que la exposicioacuten croacutenica ambiental a pesticidas como el paraquat
podriacutea contribuir a la aparicioacuten de esta patologiacutea en humanos (Liou et al
1997)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
59
Se piensa que el efecto toacutexico general de estas sustancias se produce
sobre la mitocondria afectando la cadena transportadora de electrones
rotenona y paraquat inhiben el complejo I y moneb el complejo III
312 Otros modelos experimentales
3121 Animales deficientes en un gen especiacutefico o transgeacutenico
Las nuevas teacutecnicas de biologiacutea molecular han permitido obtener cepas
de ratones en los que se ha eliminado la expresioacuten de determinados genes
Para el estudio de la EP se dispone en la actualidad de ratones que carecen
especiacuteficamente de un subtipo de receptor para DA lo cual ha ayudado a
conocer su verdadera funcioacuten en las respuestas motoras mediadas por este
transmisor asiacute como su posible accioacuten moduladora en el funcionamiento de los
ganglios basales Por ejemplo el anaacutelisis histoloacutegico de ratones que carecen
de receptores DA-D1 receptor maacutes abundante y ampliamente distribuido en el
estriado (Jaber et al 1995) no muestra diferencias anatoacutemicas en relacioacuten con
los animales control Sin embargo estos animales muestran de forma
espontaacutenea una marcada hiperactividad motora que no se modifica por la
accioacuten de agonistas o antagonistas D1 Estos resultados sugieren que la
expresioacuten de receptores D1 resulta criacutetica para el desarrollo de una conducta
motora normal Por el contrario ratones que no expresan receptores DA-D2
muestran una marcada rigidez hipocinesia alteraciones posturales y una
actividad motora espontaacutenea reducida que se asemeja a la sintomatologiacutea
descrita en los pacientes con EP (Baik et al 1995) En base a estos hallazgos
parece claro que la estimulacioacuten de receptores D2 es responsable de la mejoriacutea
cliacutenica de los pacientes con EP tratados con L-dopa y cuestionan la utilidad del
tratamiento con agonistas selectivos D1
En modelos de ratones transgeacutenicos para enfermedad de Parkinson se
han observado alteraciones relacionadas con el traacutefico intracelular donde la
liberacioacuten de dopamina es afectada por el efecto dantildeino de la agregacioacuten de
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
60
las formas aberrantes de αs sobre las proteiacutenas SNARE involucradas en el
proceso de la neuroexocitosis (Garcia-Reitboumlck et al 2010)
Tambieacuten se han desarrollado modelos animales con alteraciones de los
genes de parkina La forma maacutes comuacuten de parkinsonismo familiar se debe a la
mutacioacuten del gen que codifica para la parkina y este fenoacutemeno se asocia con la
agregacioacuten de esta proteiacutena y de α -sinucleiacutena (Palacino et al 2004 Lu et al
2009)
Se han creado modelos murinos basados en la sobreexpresioacuten
mutaciones especiacuteficas (responsables de los casos familiares autosoacutemicos
dominantes) o Knock outs geneacuteticos para la proteiacutena αs (Poon et al 2005
Wakamatsu et al 2008 Zhou et al 2008) En los dos primeros se reproduce
de forma inconstante la sintomatologiacutea de la EP incluyendo la formacioacuten de
inclusiones intraneuronales No se producen signos de agregacioacuten proteica
para el nulo en αs siendo lo maacutes destacado que presentan resistencia total a
la enfermedad (Dauer et al 2002)
Otros investigadores han usado la ingenieriacutea geneacutetica para desarrollar
modelos invertebrados como el de Drosophila melanogaster y Caenorhabditis
elegans donde se han realizado modificaciones para la expresioacuten de proteiacutenas
humanas asociadas con EP (Link 2001)
3122 Neuroinflamacioacuten en modelos de enfermedad de Parkinson
Nuevas investigaciones se estaacuten concentrando en coacutemo la inflamacioacuten
puede participar en la aparicioacuten del Parkinson ya que esta respuesta fisioloacutegica
es comuacuten en una variedad de enfermedades neurodegenerativas Se sabe que
las neuronas dopamineacutergicas en los cerebros de los pacientes con EP tienen
niveles maacutes altos de una enzima inflamatoria llamada COX-2 que aquellos de
personas sin la enfermedad (Minghetti 2004) Igualmente varios estudios han
mostrado que las moleacuteculas promotoras de la inflamacioacuten aumentan el nivel de
muerte celular despueacutes del tratamiento con ciertas neurotoxinas Como
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
61
ejemplo en un modelo de ratoacuten para la enfermedad de Parkinson la
disminucioacuten en los niveles de COX-2 duplicoacute el nuacutemero de neuronas que
sobrevivieron (Wang et al 2009)
32 Modelos Celulares
321 Modelo con ceacutelulas PC12
La liacutenea celular de feocromocitoma de rata PC12 deriva de tejido
canceriacutegeno de la medula adrenal (Greene y Tischler 1976) Estas ceacutelulas en
cultivo sometidas al factor de crecimiento nervioso se polarizan y desarrollan
extensiones de tipo neuriacuteticas (Greene y Tischler 1976 Greene y Rein 1977
Teng et al 1998) proceso de diferenciacioacuten que es acompantildeado de cambios
dramaacuteticos en la reorganizacioacuten de la ruta biosinteacutetica temprana los cuales son
necesarios para dar lugar al crecimiento de sus prolongaciones (Sannerud et
al 2006) En este estado de diferenciacioacuten las ceacutelulas PC12 mantienen un
fenotipo neuroendocrino productor almacenador y liberador de aminas
bioacutegenas (Malagelada y Greene 2008) con capacidad de excitabilidad
eleacutectrica en respuesta a neurotransmisores especiacuteficos (Teng et al 1998
Martin y Grishanin 2003)
Desde hace varios antildeos las ceacutelulas del pareacutenquima adrenomedular
constituyen un modelo ampliamente utilizado en estudios sobre la
neurosecrecioacuten (Tooze 1998 Chanat y Tooze 1998 Martin y Grishanin 2003)
Especiacuteficamente estas ceacutelulas cromafines comparten origen embrionario y
muacuteltiples propiedades funcionales con las neuronas autonoacutemicas simpaacuteticas
postganglionares liberadoras de catecolaminas (Green y Rein 1977 Teng et
al 1998) lo que las convierte en un modelo celular uacutetil para el estudio de la
EP Estas cualidades beneficiosas han sido ampliamente utilizadas para
probar el efecto de sustancias o condiciones ambientales y geneacuteticas que
potencialmente pueden causar EP asiacute como para el estudio de compuestos
que podriacutean ser usados en el tratamiento de ella (Gassen et al 1998 Mayo et
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
62
al 1998 Tanaka et al 2001 Nie et al 2002 Am et al 2004 Wang et al
2005 Malagelada et al 2006 Meuer et al 2006 Xu et al 2007) Las toxinas
maacutes utilizadas en el modelo celular de PC12 para EP han sido 6-OHDA y MPP+
(1-metil-4-fenilpiridina) este uacuteltimo un metabolito activo neurotoacutexico del 1-metil-
4-fenil-1236-tetrahidropiridina (MPTP) (Hartley et al 1994 Blum et al 2001)
como se ha explicado previamente Sustancias como rotenona paraquat
dieldrin dopamina L-DOPA peroacutexido de hidroacutegeno y anfetaminas han sido
otros agentes tambieacuten utilizados en esta liacutenea celular (Fleming et al 1994
Walkinshaw y Waters 1995 Drukarch et al 1996 Yang y Sun 1998 Panet et
al 200 Chen et al 2003 Hirata y Nagatsu 2005 Yoshimoto et al 2004 Gesi
et al 2006 Saito et al 2007)
En la membrana de estas ceacutelulas se expresan receptores colineacutergicos de
tipo nicotiacutenico que median la secrecioacuten de catecolaminas en respuesta a la
acetilcolina la cual en condiciones naturales es liberada por las terminaciones
nerviosas autonoacutemicas presinaacutepticas del nervio esplaacutecnico Asimismo esta
liacutenea sintetiza almacena y libera preferencialmente la catecolamina
denominada dopamina (Greene y Tischler 1976) La DA es una amina
bioacutegena que es metabolizada por los sistemas enzimaacuteticos MAO y COMT
como se describioacute en el apartado 12 De forma especial las ceacutelulas PC12
contienen la isoforma MAO tipo A la cual caracteriza tambieacuten a las neuronas
dopamineacutergicas (Finberg y Youdim 1983) lo que contrasta con la establecida
prevalencia del tipo B en las ceacutelulas cromafines de la meacutedula adrenal (Youdim
1991) Asimismo la accioacuten enzimaacutetica de MAO-A sobre la DA resulta en la
formacioacuten del aacutecido 34-dihidroxifenilaceacutetico (DOPAC) metabolito que se
encuentra en mayor concentracioacuten en ceacutelulas PC12 indiferenciadas si se
comparan con las terminales nerviosas de neuronas dopamineacutergicas que se
proyectan al neoestriado (nuacutecleos caudado y putamen) Este fenoacutemeno puede
ser debido a una menor eficiencia para almacenar DA en las ceacutelulas PC12
indiferenciadas (Fornai 2007)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
63
3211 Tratamiento con 6-hidroxidopamina en ceacutelulas PC12
Igual que en los modelos animales para enfermedad de Parkinson la 6-
OHDA es la neurotoxina maacutes comuacutenmente usada en la degeneracioacuten de
neuronas catecolamineacutergicas derivadas de liacuteneas celulares
Las neuronas dopamineacutergicas son ricas en ROS como anioacuten superoacutexido
peroacutexido de hidrogeno y radicales hidroxilo producto del metabolismo
enzimaacutetico y no enzimaacutetico de dopamina Los eventos citopaacuteticos inducidos por
6-OHDA pueden ser producidos entonces por factores mediadores de estreacutes
oxidativo que incrementan la oxidacioacuten de liacutepidos proteiacutenas y aacutecidos nucleicos
(Lotharius y Brundin 2002 Jenner 2003)
El mecanismo de ataque toacutexico de 6-OHDA comienza sobre el cultivo
celular con la produccioacuten exoacutegena de sustancias perjudiciales para la ceacutelula
debido a la auto-oxidacioacuten de la misma Esta reaccioacuten mediada por oxigeno
molecular ambiental resulta raacutepidamente en la generacioacuten de anioacuten
superoacutexido peroacutexido de hidrogeno y p-quinona (2 hidroxi-5-(2 aminoetil)-14-
benzo quinona) ROS que inician un ambiente hostil de tipo oxidativo continuo
diezmando a las ceacutelulas PC12 de sus capacidades naturales de defensa
Adicionalmente se ha descrito que p-quinona media la muerte celular inducida
por 6-OHDA (Saito et al 2007)
6-OHDA tambieacuten puede actuar como agente clastogeacutenico (sustancia que
puede producir roturas en los cromosomas dando lugar a peacuterdidas ganancia o
reordenamiento) y como mutaacutegeno (Glinka et al 1997)
Se han demostrado dos aspectos importantes relacionados al mecanismo
de accioacuten producido por 6-OHDA en las ceacutelulas PC12 Uno de ellos elimina la
posibilidad de participacioacuten del transportador de dopamina como mediador en
la incorporacioacuten de la toxina al interior de la ceacutelula (Woodgate et al 1999) y el
segundo sentildeala que la muerte inducida por esta toxina es independiente de la
actividad metaboacutelica que involucra a las mitocondrias (Wu et al 1996) En
base a estos hallazgos se sugiere que el mecanismo citopaacutetico inducido por
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
64
6-OHDA puede diferir con el que sucede en los modelos animales o que
simplemente no estaacute bien clarificado (Woodgate et al 1999)
Ciertas investigaciones revelan que 6-OHDA induce muerte celular
apoptoacutetica en ceacutelulas PC12 (Walkinshaw y Waters 1994 Ochu et al 1998
Ryu et al 2005) la cual se desencadena tras la induccioacuten de dantildeos
mitocondriales desencadenados por la toxina (inhibicioacuten del complejo I y IV
mitocondrial) (Glinka y Youdim 1995) A continuacioacuten se produce liberacioacuten de
citocromo c y en consecuencia activacioacuten de la caspasa 9 que da lugar a la
formacioacuten de apoptosomas en presencia de ATP fenoacutemeno que promueve la
activacioacuten de la caspasa 3 la aparicioacuten de caspasa 8 activada se relaciona con
sentildeales de activacioacuten extramitocondrial (Hanrott et al 2006)
Otros autores sentildealan que ademaacutes de la muerte por apoptosis las ceacutelulas
PC12 tratadas con 6-OHDA sufren hinchazoacuten celular por peacuterdida de la
homeostasis ioacutenica dantildeo de organelas y por uacuteltimo lisis ruta considerada
como muerte necroacutetica la cual supera significativamente a la muerte por
apoptosis en este modelo Estos hallazgos indican que 6-OHDA induce
primariamente necrosis en liacutenea celular PC12 (Woodgate et al 1999)
3212 Tratamiento con metanfetamina en ceacutelulas PC12
La metanfetamina (MET) es un agonista dopamineacutergico indirecto que
incrementa las concentraciones de DA al estimular su siacutentesis adicionalmente
incrementa la liberacioacuten inhibe su captacioacuten y disminuye su degradacioacuten El
incremento de las concentraciones citosoacutelicas de DA inducidas por MET en
PC12 ocasionan dantildeos metaboacutelicos de tipo oxidativo que alteran la estabilidad
de la proteiacutena parkina inactivando su funcioacuten (LaVoie et al 2005) Ademaacutes la
DA-quinona producto del metabolismo de la DA tiene la capacidad de ligar a
la proteiacutena α -sinucleiacutena en forma protofibrilar provocando su precipitacioacuten y
posterior agregacioacuten (Conway et al 2000 Conway et al 2001 Norris et al
2005)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
65
Se puede reproducir la formacioacuten de inclusiones intracelulares en ceacutelulas
PC12 tratadas con MET (Cubells et al 1994 Fornai et al 2004) Esta droga y
su derivado MDMA (metilenedioximetanfetamina) (ecstasy) son toacutexicas en las
terminales nerviosas monoamineacutergicas como resultado de la formacioacuten de
radicales libres producidos a partir del exceso de DA citosoacutelica Este fenoacutemeno
genera un incremento de ROS que perturba el ambiente redox a nivel
intracelular (Battaglia et al 2002) provocando alteracioacuten funcional del sistema
ubiquitina-proteasoma dantildeo que se piensa es fundamental en la geacutenesis de
los cuerpos de inclusioacuten en este modelo Asimismo la formacioacuten de inclusiones
puede ser prevenida si se eliminan los radicales libres si se inhibe la
produccioacuten de dopamina o si se realiza un pretratamiento con S-apomorfina
(antioxidante-agente quelante del Fe++) razoacuten por la cual se piensa que el
trastorno causado sobre el SUP es debido al desorden intracelular en el
ambiente redox (Lazzeri et al 2007) La muerte de las ceacutelulas PC12 como
efecto del tratamiento con MET se produce tanto por necrosis como por
apoptosis (Panet et al 2001 Lazzeri et al 2007)
3213 Tratamiento con MPTP en ceacutelulas PC12
El metabolito activo del MPTP MPP+ es toacutexico en cultivos de ceacutelulas
productoras de DA
Las bases moleculares de 6-OHDA son frecuentemente comparadas con
las de MPTP ya que ambas inhiben el complejo I mitocondrial y son
destructivas para neuronas dopamineacutergicas Sin embargo existen evidencias
que sugieren que los mecanismos de accioacuten por los que actuacutea la neurotoxina
MPTP difieren sustancialmente de los observados para 6-OHDA (Woodgate et
al 1999) El metabolito activo MPP+ en cultivos celulares es selectivamente
incorporado a la ceacutelula por medio del transportador de dopamina y una vez en
el interior ejerce sus efectos toacutexicos a traveacutes de la inhibicioacuten del complejo I
mitocondrial y de la inhibicioacuten de enzimas implicadas en la siacutentesis de DA A
diferencia del mecanismo de accioacuten de 6-OHDA el bloqueo del transportador
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
66
de dopamina en el modelo de MPP+ atenuacutea la toxicidad ejercida por esta
sustancia (Heikkila et al 1984 Javitch et al 1985 Mayer et al 1986 Sonsalla
et al 1987) Adicionalmente la inhibicioacuten de la glicolisis en ceacutelulas PC12
exacerba el dantildeo producido por MPP+ evidenciando que el mecanismo de
accioacuten de esta sustancia esta mediado por el metabolismo energeacutetico (Basma
et al 1992)
Asimismo se postula que la alteracioacuten del SUP en el modelo de MPTP
es producido por deplecioacuten de ATP causado por el bloqueo del complejo I
mitocondrial y en este caso contrario a lo que ocurre en el modelo con MET la
agregacioacuten de αs podriacutea ocurrir como un factor accidental debido al deterioro
del SUP
El tratamiento con MPP+ en ceacutelulas PC12 posee la capacidad de
reproducir inclusiones intracelulares las cuales son semejantes en aspecto
aparicioacuten y evolucioacuten en el tiempo si se comparan con aquellas generadas por
tratamientos con MET en esta misma liacutenea celular (Gesi et al 2006) Se ha
demostrado que los cuerpos de inclusioacuten inducidos por esta toxina son
estructuras dinaacutemicas las cuales modifican su aspecto en funcioacuten del tiempo
Pasan de una estructura limitada por membrana cuando la ceacutelula es sometida
a tratamiento por corto tiempo a una altamente condensada con un nuacutecleo
central electrodenso en tratamientos prolongados Estos hallazgos sugieren
que la formacioacuten de las inclusiones intracelulares es un proceso que involucra
muacuteltiples pasos en el cual de forma inicial diferentes mecanismos toacutexicos
convergen para desencadenar la misma respuesta bioloacutegica con un mismo
efecto final (Gesi et al 2006)
322 Otros modelos celulares utilizados para enfermedad de Parkinson
Ceacutelulas dopamineacutergicas MN9D
Ceacutelulas dopamineacutergicas MES235
Ceacutelulas dopamineacutergicas B65 de neuroblastoma
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
67
Ceacutelulas de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) usadas como modelo
para formar inclusiones (Smith et al 2005) Es una liacutenea neuronal
dopamineacutergica en la cual se ha demostrado citotoxidad inducida por 6-
OHDA
P19 son ceacutelulas de una liacutenea de carcinoma embrionario murino las
cuales se diferencian en ceacutelulas neurales bajo tratamiento con aacutecido
retinoico a diferencia de las ceacutelulas PC12 no requieren sustancias para
la adhesioacuten (Woodgate et al 1999)
Cultivo neuronal primario de ceacutelulas estriatales y del cerebro medio
Estas ceacutelulas responden al tratamiento con metanfetamina o dopamina
Tratamiento con MET (dosis de 0001-10 microM) o dosis de DA (01-1000
microM)
Neuronas granulosas cerebelares de rata (CGNs)
Ceacutelulas B103 linea neuronal derivada de neuroblastoma de rata
4 TRAFICO FUNCIONAL EN NEURONAS
41 Transporte intracelular
Las neuronas son ceacutelulas polarizadas especialidad estructural y funcional
que les permite llevar a cabo su propoacutesito intercomunicador Esta organizacioacuten
concreta del traacutefico intracelular en las neuronas les brinda la capacidad de
organizar diferentes actividades en distintas regiones celulares lo que hace
posible que un alto rango de interconexiones sinaacutepticas puedan llevar al interior
o al exterior de la ceacutelula la sentildeal o sentildeales correctas efecto que se refleja en
una correcta funcioacuten fisioloacutegica del tejido nervioso y por tanto del organismo en
general al ser el centro de control y regulacioacuten
El hecho de que estas ceacutelulas exhiban polarizacioacuten como caracteriacutestica
fenotiacutepica implica que una amplia gama de maquinaria especializada se
organice asimeacutetricamente Estas simples variaciones dan como resultado una
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
68
eficiente capacidad para la clasificacioacuten de proteiacutenas intriacutensecas cuyos coacutedigos
son reconocidos y separados por complejos adaptadores regulando el traacutefico
de proteiacutenas a dominios concretos de membrana De esta forma el andamiaje
diferencialmente asociado con la cara citosoacutelica de la membrana define y
estabiliza las caracteriacutesticas bioquiacutemicas de los dominios resultantes donde la
sentildealizacioacuten especiacutefica se traduce en una correcta orientacioacuten en el espacio
tridimensional y da lugar a respuestas funcionales
En neuronas como en el resto de ceacutelulas eucariotas existe un dinamismo
estructural donde continuos intercambios suceden entre compartimentos
intracelulares Este dinamismo impulsado por el traacutefico bidireccional entre
membranas permite conservar la identidad y estructura de cada
compartimento Para poder mantener el equilibrio homeostaacutetico intracelular las
ceacutelulas transportan proteiacutenas y liacutepidos a traveacutes de las viacuteas secretora y
endociacutetica proceso que implica la participacioacuten de una compleja maquinariacutea de
transporte donde se generan intermediarios de transporte movimiento del
cargo entre diferentes compartimentos y la fusioacuten especiacutefica de estos
transportadores con su correspondiente membrana diana
A continuacioacuten presentareacute un breve repaso de los procesos involucrados
en el transporte funcional lo que podraacute permitir un mejor entendimiento de los
hallazgos en la alteracioacuten del transporte en modelos de enfermedad de
Parkinson
42 Organizacioacuten estructural y transporte de la viacutea secretora
La ruta secretora estaacute constituida por el transporte de proteiacutenas y liacutepidos
recieacuten sintetizados en el retiacuteculo endoplaacutesmico (RE) hacia diversos destinos
como orgaacutenulos membrana plasmaacutetica o medio extracelular (Palade 1975)
Este traacutefico estaacute altamente organizado y se mueve en un patroacuten bidireccional
el transporte anteroacutegrado que va desde el origen de siacutentesis hasta su destino
final mientras que el transporte retroacutegrado que se mueve en sentido contrario
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
69
421 Retiacuteculo Endoplaacutesmico
El RE es el compartimento maacutes grande de la ceacutelula el cual estaacute
compuesto por una red membranosa de cisternas y tuacutebulos interconectados
que se distribuyen a traveacutes de todo el citoplasma Es la estructura clave del
punto de partida de la viacutea secretora donde las proteiacutenas recieacuten sintetizadas
experimentan un correcto plegamiento Adicionalmente estaacute implicado en
funciones como la N-glicosilacioacuten oligomerizacioacuten de proteiacutenas metabolismo
de liacutepidos detoxificacioacuten y mantenimiento del equilibrio de ciertos iones
Ademaacutes suceden fenoacutemenos complejos de control de calidad asiacute las proteiacutenas
mal plegadas son retenidas hasta su adecuado plegamiento o son translocadas
al citosol para su posterior degradacioacuten El RE se divide en retiacuteculo
endoplaacutesmico rugoso y en retiacuteculo endoplaacutesmico liso seguacuten tengan o no
ribosomas asociados a su cara citoplasmaacutetica
En regiones especializadas del RE denominados elementos
transicionales o RE transicional son separadas las proteiacutenas que continuacutean la
viacutea secretora de aquellas que especiacuteficamente residen en el RE (Palade
1956) Adyacente a las aacutereas de mayor concentracioacuten de elementos
transicionales se encuentra un complejo sistema tuacutebulo-vesicular llamado
compartimento intermedio VTCs (vesicular tubular clusters) o ERGIC
(ERGolgi-intermediate compartment) (Saraste y Kuismanen 1992 Bannykh
et al 1996 Hauri et al 2000 Klumperman 2000 Hauri y Schweizer 1992)
En estas estructuras especializadas del RE con aspecto evaginante se produce
el ensamblaje de las proteiacutenas de cubierta tipo COPII (Schekman y Orci 1996)
de las cuales depende la salida de la carga (Barlowe 1998) o bien mediante
la formacioacuten de estructuras tubulares que son tambieacuten dependientes de COPII
(Mironov et al 2003)
Algunas proteiacutenas son entonces concentradas selectivamente en estas
zonas de salida del RE por un proceso de reconocimiento de una secuencia
sentildeal que interacciona directamente con los componentes de COPII (Kuehn y
Schekman 1997 Klumperman 2000) mientras otras proteiacutenas lo hacen de un
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
70
modo no selectivo Se cree que una vez las vesiacuteculas COPII se han formado se
mueven hasta fusionarse para formar el ERGIC
El complejo de componentes de la cubierta tipo COPII estaacute formado por
una serie de proteiacutenas solubles que se encuentran en el citosol las cuales se
ensamblan en la membrana del RE para dar lugar a la biogeacutenesis de
intermediarios del transporte de tipo vesicular y muy probablemente tambieacuten de
tipo tubular (Kaiser y Schekman 1990 Rexach et al 1994) La formacioacuten de
estas estructuras permite la seleccioacuten y concentracioacuten de algunos tipos de
carga mediante la interaccioacuten con las secuencias sentildeal (Aridor y Balch 1996
Springer y Schekman 1998) Por otro lado permiten la deformacioacuten fiacutesica de la
membrana donadora dando lugar a la gemacioacuten de una vesiacutecula (Barlowe et
al 1994)
La cubierta COPII estaacute formada por dos heterodiacutemeros Sec23p24p y
Sec13p31p (Barlowe et al 1994) y una proteiacutena con capacidad de unir GTP
llamada Sar1p la cual es activada por Sec12p una proteiacutena integral de
membrana del RE la cual tiene funcioacuten GEF (guanine nucleotide exchange
factor cataliza el intercambio de GDP por GTP) (Barlowe y Schekman 1993)
Sar1p-GTP unido a los elementos transicionales recluta al complejo
Sec23p24p y eacuteste a su vez al Sec13p31p (Schekman y Orci 1996) Asimismo
Sec23p actuacutea como una proteiacutena GAP (ldquoGTPase-activating proteins)
induciendo la hidroacutelisis del GTP unido a Sar1p lo que desencadena la
disociacioacuten de la cubierta (Yoshihisa et al 1993)
422 Compartimento intermedio o ERGIC
El compartimento intermedio o ERGIC se identifica por la presencia del
marcador ERGIC-5358 Es una estacioacuten transitoria de clasificacioacuten entre el RE
y la cara cis del aparato de Golgi donde el movimiento de la carga se realiza
de forma bidireccional seguacuten corresponda (Hauri y Schweizer 1992)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
71
Desde esta estructura las proteiacutenas residentes del RE y aquellas mal
plegadas unidas a chaperonas pueden ser devueltas por trasporte retroacutegrado
al RE a traveacutes de vesiacuteculas revestidas tipo COP I (Tang et al 1995
Klumperman et al 1998 Martiacutenez-Menaacuterguez et al 1999) asimismo la
transferencia de la carga hacia el Golgi tambieacuten depende de este mismo
intermediario de transporte (Tang et al 1995 Scales et al 1997 Klumperman
et al 1998 Warren y Mellman 1999 Stepehens et al 2000) el cual puede
ser de naturaleza vesicular (Bannykh et al 1996 Orci et al 1991 Pagano et
al 1999) o tubular (Clermont et al 1994 Krinjnse-Locker et al 1994 Mironov
et al 2003) En todos los casos el movimiento de estas estructuras es
dependiente de microtuacutebulos (Presley et al 1997 Scales et al 1997 Ben
Tekaya et al 2005)
El complejo COP I estaacute formado por siete subunidades peptiacutedicas
(coatoacutemero) y una proteiacutena con actividad GTPasa ARF1 (ADP-ribosylation
factor 1) (Malhotra et al 1989 Waters et al 1991) Los siete polipeacuteptidos son
a szlig szlig γ d e ζ -COP los cuales se encuentran asociadas total o
parcialmente durante su permanencia en el citosol El ensamblaje del complejo
sobre la membrana donadora se inicia cuando un GEF especiacutefico activa a
ARF1 al catalizar el cambio de GDP por GTP estado en el cual la GTPasa
puede unirse a la membrana Se han descrito diferentes GEFs para ARF1 lo
que podriacutea incrementar el rango de especificidad en el transporte (Lee et al
2004) Una vez activado ARF1-GTP recluta el coatoacutemero pre-ensamblado en
el citosol lo que origina la deformacioacuten y gemacioacuten de la membrana (Orci et al
1993 Zhao et al 1997) Cuando una proteiacutena GAP especiacutefica activa la
actividad GTPasa de ARF1 (Lee et al 2004) se produce la hidroacutelisis de GTP
sentildeal que dispara la disociacioacuten de la cubierta
El complejo entre ARF1GEF y su actividad GTPasa es sensible a la
sustancia brefeldina A (BFA) BFA es un aacutecido graso derivado de hongos que
inactiva a la GTPasa y como consecuencia se produce una inhibicioacuten de la
biogeacutenesis de vesiacuteculas tipo COPI (Lee et al 2004) Asiacute el efecto del
tratamiento con BFA produce la fusioacuten de las membranas del aparato de Golgi
con el RE (Lippincott-Schwartz et al 1990 Klausner et al 1992)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
72
423 Complejo de Golgi
El aparato de Golgi (AG) es una estructura de alto dinamismo estructural
el cual estaacute organizado en forma de cisternas membranosas aplanadas que se
ordenan en apilamientos alineados donde cada uno de estos es llamado
dictiosoma Varios de estos dictiosomas en ceacutelulas de mamiacuteferos se conectan
entre siacute para formar una estructura reticular acintada que se mantiene
activamente alrededor del centrosoma en una posicioacuten perinuclear gracias a la
interaccioacuten con el sistema de microtuacutebulos (Egea et al 2006 Kepes et al
2005) El conjunto de cisternas puede dividirse en tres compartimentos
morfoloacutegica y funcionalmente diferentes la red del cis-Golgi (CGN cis-Golgi
network) la red intra Golgi o red media-Golgi y la red del trans-Golgi (TGN
trans-Golgi network) En el aacuterea que rodea el aparato de Golgi se encuentran
numerosas vesiacuteculas revestidas tipo COPI
El complejo de Golgi es la estacioacuten central y distribuidora final de la viacutea
secretora cuya organizacioacuten estructural es mantenida por una matriz proteica
componentes del citoesqueleto y la participacioacuten del fosfoliacutepidos tipo inositoles
(Zhiping et al 2008) Las macromoleacuteculas sintetizadas en RE tanto en el
rugoso como en el liso llegan a eacutel mediante transporte tuacutebulo-vesicular y son
recibidas en la cara cis del AG El AG no se limita al transporte de las
sustancias recibidas por el contrario le da la forma final a las moleacuteculas que
ingresan para su posterior clasificacioacuten y distribucioacuten proceso en el cual tienen
lugar muacuteltiples reacciones La modificacioacuten de la carga sucede mediante su
paso a traveacutes de las cisternas en las cuales se produce modificacioacuten
secuencial por eliminacioacuten y adicioacuten de monosacaacuteridos de las glicoproteiacutenas
sintetizadas en el RE rugoso adicioacuten de nuevos bloques oligosacariacutedicos
siacutentesis de heteropolisacaacuteridos que se unen a proteiacutenas especiacuteficas para
formar moleacuteculas maacutes complejas siacutentesis de glucoliacutepidos reacciones de
fosforilacioacuten sulfatacioacuten y proteoacutelisis (Farquhar y Palade 1998) Las enzimas
residentes del AG son a menudo utilizadas como marcadores de sub-
compartimentos concretos del complejo de Golgi ya que se distribuyen de
manera polarizada sobre las cisternas
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
73
El complejo COPI media tanto en el transporte intra-Golgi (anteroacutegrado y
retrogrado) como el transporte retroacutegrado desde el aparato de Golgi hacia el
RE (Storrie et al 1998 Martiacutenez-Menaacuterguez et al 2001 Lippincott-Schwartz
2001) Asimismo a partir de la red del trans Golgi brotan diferentes tipos de
vesiacuteculas que contienen los productos definitivos lugar donde son clasificados
y empaquetados para su destino final (Mellman y Simons 1992)
El transporte a traveacutes del complejo de Golgi se ha explicado a partir de
dos modelos el primero se apoya en el transporte vesicular donde las
cisternas del Golgi son estructuras individuales estaacuteticas y la carga debe ser
movida entre ellas mediante vesiacuteculas (Palade 1975 Orci et al 1996) El
segundo es el modelo de maduracioacuten de cisternas donde la carga se
transporta en cisternas con dinamismo estructural las cuales progresan en el
Golgi en direccioacuten cis-trans (Grasseacute 1957) y el reciclaje selectivo de las
proteiacutenas residentes en el Golgi y el RE se reciclan al ser concentradas en
vesiacuteculas tipo COP I (Love et al 1998 Lanoix et al 2001 Martiacutenez-
Menaacuterguez et al 2001 Mironov et al 2001) Tambieacuten se han propuesto
nuevos modelos que son una mezcla de los dos anteriores (Pelham y
Rothman 2000 Orci et al 2000) y otros donde conexiones tubulares
participan al igual que las vesiacuteculas como intermediarios del transporte
(Griffiths 2000 Mironov et al 2003 Trucco et al 2004 Martiacutenez-Alonso et al
2005 Martiacutenez-Alonso et al 2007 Vivero-Salmeroacuten et al 2008)
424 Red del trans-Golgi
La red del trans-Golgi es un compartimento tuacutebulo reticular localizado en
la cara de salida del AG estaacute formado por una gran cantidad de membranas de
tipo vesicular y tubular (Ladinsky et al 1994) Es morfoloacutegica y funcionalmente
diferente del conjunto de cisternas que forman el AG y como se mencionoacute
anteriormente a partir del cual la carga es clasificada y transportada hasta
diversos destinos de la viacutea secretora Se ha descrito que las membranas del
TGN se pueden dividir en diferentes dominios dando lugar a regiones
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
74
especializadas Sub-dominios que vendriacutean dados por la diferencia en la
localizacioacuten de proteiacutenas de cubierta y factores de aproximacioacuten residiendo en
cada uno una funcioacuten diferente en la clasificacioacuten y transporte de la carga
(Gleeson et al 2004) Adicionalmente el TGN recibe material de la viacutea
endociacutetica reciclando varias proteiacutenas endosomales y de membrana
plasmaacutetica (Farquar y Palade 1981 Simons y van Meer 1988) lo que
convierte a esta estructura en un sitio de interseccioacuten entre las viacuteas secretora y
endociacutetica
Las vesiacuteculas cubiertas de clatrina que emergen del TGN transportan la
carga hasta el sistema endosomalisosoma Otro tipo de intermediario de
transporte son los graacutenulos de secrecioacuten que son los responsables de la
secrecioacuten regulada en ceacutelulas especializadas Ademaacutes se ha demostrado que
una gran variedad de cargo es transportado hacia la membrana plasmaacutetica en
grandes estructuras tuacutebulo-vesiculares (Hirschberg et al 1998 Toomre et al
1999 Polishchuk et al 2003) Estos intermediarios del transporte se mueven a
lo largo de microtuacutebulos e interaccionan con actina durante el proceso de
formacioacuten y movimiento (Gleeson et al 2004)
425 Neuroexocitosis
La neuroexocitosis es un mecanismo fundamental para la liberacioacuten de
sustancias que modulan las respuestas de comunicacioacuten interneuronal El
proceso implica la fusioacuten de la membrana de la vesiacutecula sinaacuteptica con la
membrana plasmaacutetica lo que da lugar a la exposicioacuten del contenido de la
vesiacutecula con el liacutequido extracelular presente a nivel de la hendidura sinaacuteptica
Para llevar a cabo este cometido la neurona cuenta con una maquinaria
especializada que actuacutea con alta regulacioacuten y rapidez en respuesta a una
orden espacial y temporal El control espacial se ejerce sobre regiones con
microdominios especiacuteficos que se denominan zonas activas en el cual los
complejos SNARE (ver apartado 441) son los responsables de ejecutar la
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
75
orden al conseguir aproximar y fusionar las membranas destinadas
especiacuteficamente para tal efecto
Ocurren tres etapas secuenciales en la neuroexocitosis La primera es el
acercamiento intimo o la unioacuten de la vesiacutecula sinaacuteptica con la membrana
plasmaacutetica la segunda requiere un proceso de maduracioacuten vesicular para
poder alcanzar la competencia secretora o ldquoprimingrdquo (capacidad de ensamblaje
de los complejos SNARE) (Chen et al 2001 Sorensen 2003) y estar listas
para ser liberadas (Artalejo 2005) y por uacuteltimo el desarrollo de la fusioacuten como
tal entre membranas que se desencadena por el incremento local de la
concentracioacuten citosoacutelica de calcio en respuesta a un potencial de accioacuten
(Suumldhof 2000) En este proceso se precisan proteiacutenas de la maquinaria de
fusioacuten proteiacutenas Rab de control y regulacioacuten (ver apartado 431) ademaacutes de
proteiacutenas especiacuteficas tales como complexinas (se unen al complejo trans-
SNARE estabilizaacutendolo en la fase de ldquoprimingrdquo lo que impide la fusioacuten hasta la
llegada del potencial de accioacuten) (Reim et al 2001 Tang et al 2006)
sinaptotagminas (funcionan como sensores de la concentracioacuten de calcio libre
en el citosol disparando la fusioacuten) (Suumldhof 2002) y munc13 (implicada en la
adaptacioacuten a la frecuencia de descarga) (Ashery et al 2000 Rosenmund et al
2002 Artalejo 2005) La neuroexocitosis involucra tres proteiacutenas SNARE
especiacuteficamente neuronales sintaxina1A y SNAP-25 ligadas a la membrana
plasmaacutetica y sinaptobrevina 2 oacute VAMP 2 (ldquovesicle-associated membrane
proteinrdquo) en la membrana de la vesiacutecula sinaacuteptica (Bennet et al 1992 Trimble
et al 1998 Suumldhof 2004) Sinaptotagmina 7 actuacutea como sensor de calcio en
la exocitosis de las ceacutelulas cromafines de la medula adrenal pero no en la
neuronal donde participan las sinaptotagminas 1 2 (Schonn et al 2008) y 4
(Tsuboi 2008)
Las catecolaminas son especiacuteficamente almacenadas en el interior de
vesiacuteculas sinaacutepticas conocidas como vesiacuteculas de nuacutecleo denso (VND) En el
interior de estas vesiacuteculas se encuentran unas sustancias llamadas
cromograninas las cuales forman complejos con las catecolaminas Un
regulador criacutetico en el proceso de anclaje y unioacuten de las VND a la membrana
plasmaacutetica es la GTPasa Rab27A Se ha demostrado que la sinaptotagmina-
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
76
a tambieacuten conocida como granufilina-a y la rabfilina son proteiacutenas efectoras
de Rab27A Ambas necesarias para anclar las VND a la membrana plasmaacutetica
al interactuar con la maquinaria de fusioacuten Ademaacutes la importancia de
granufilina-a y rabfilina radica en que tambieacuten tienen la capacidad de unirse a
las GTPasas Rab8 que regula el transporte post-Golgi y Rab3 que se
encuentra involucrada junto con Rab27A en el proceso de exocitosis La
interrupcioacuten del ciclo GDPGTP debido a las formas mutadas de Rab27A inhibe
la capacidad de liberacioacuten de las vesiacuteculas de nuacutecleo denso lo que demuestra
la importancia de esta Rab GTPasa en el proceso de la neuroexocitosis
(Tsuboi 2008)
43 Proteiacutenas reguladoras del transporte
431 Proteiacutenas Rab GTPasas
Las proteiacutenas Rab son una familia de GTPasas que se encuentran
implicadas en el control y regulacioacuten del traacutefico intracelular a todos sus niveles
(Figura 5) El efecto de las Rab GTPasas se produce por activacioacuten de sus
proteiacutenas efectoras las cuales traducen la sentildeal de la proteiacutena Rab que se
refleja en la destinacioacuten correcta del cargo Las siguientes son las funciones de
regulacioacuten mediadas a traveacutes de las proteiacutenas Rab GTPasas
Reclutamiento del cargo en forma especiacutefica
Empaquetamiento selectivo del cargo
Formacioacuten de las vesiacuteculas
Gemacioacuten de las vesiacuteculas
Desensamblaje de la cubierta proteica de las vesiacuteculas
Regulacioacuten direccional del movimiento de los intermediarios de
transporte
Regulacioacuten del acercamiento de los intermediarios de transporte
Control de la unioacuten y fusioacuten del intermediario de transporte
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
77
Dentro de los efectores de las Rab GTPasas se incluyen las proteiacutenas
adaptadoras proteiacutenas de cubierta factores de acercamiento ciertas kinasas y
fosfatasas y proteiacutenas motoras El correcto mantenimiento del dinamismo en el
traacutefico se debe a la capacidad celular de mantener intercomunicadas a las
proteiacutenas Rab GTPasas funcioacuten vital que es modulada por las mismas Rabs
mediante la activacioacuten de sus proteiacutenas efectoras (Segev 2001) Esta
intercomunicacioacuten entre proteiacutenas Rab permite regular el traacutefico en el espacio y
en el tiempo
Las proteiacutenas Rab GTPasas pueden ejercer funciones de control y
regulacioacuten al ser una familia numerosa maacutes de 60 identificadas en mamiacuteferos
con diferentes localizaciones (Somsel-Rodman y Wandinger-Ness 2000)
(Figura 5) El principio regulador de las proteiacutenas Rab estriba en el continuo
intercambio entre la forma activa unida a membrana (Rab-GTP) y la forma
soluble inactiva (Rab-GDP) esta uacuteltima estabilizada por el GDI que es un factor
inhibidor de la disociacioacuten del GDP ligado a Rab Por tanto son los GEF las
moleacuteculas responsables de catalizar el intercambio de GDPGTP y las
proteiacutenas GAP las que estimulan la actividad GTPasa intriacutenseca de las Rab
Asimismo proteiacutenas GDF especiacuteficas (GDI displacement factor (GDI) Rab
GDP dissociation inhibitor) GEF y maacutes de 38 proteiacutenas GAP regulan la accioacuten
de las Rab lo que da lugar a eventos concretos en diferentes membranas con
identidad propia sobre microdominios especiacuteficos de una misma membrana o
en un paso determinado del transporte
El reclutamiento selectivo de una proteiacutena Rab sobre una determinada
membrana es dependiente del factor GDF especiacutefico para esa Rab Este
desplaza a la proteiacutena GDI y permite el anclaje de Rab a la membrana
seguidamente al unirse a su GEF especiacutefico libera el GDP y se activa al ligar
GTP (adquiere una conformacioacuten estructural definida) (Gonzaacutelez y Scheller
1999) Asiacute con esta estructura tridimensional la proteiacutena Rab-GTP puede
reclutar a sus efectores los cuales ejecutan actividades especiacuteficas del traacutefico
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
78
Figura 5 Distribucioacuten de las proteiacutenas Rab GTPasas (Stenmark 2009)
44 Proteiacutenas de anclaje y fusioacuten
Durante el proceso del traacutefico de membranas los intermediarios de transporte
deben ser direccionados acercados y unidos a la membrana receptora antes
de su fusioacuten Igualmente la ceacutelula cuenta con mecanismos que aseguran por
medio de acciones combinadas el acercamiento y la fusioacuten donde inicialmente
el transportador es conducido y mantenido proacuteximo a la membrana diana
mediante las proteiacutenas de aproximacioacuten Seguidamente entre membrana
donadora y receptora se da el acoplamiento especiacutefico de proteiacutenas SNAREs
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
79
las cuales interaccionan para anclar el transportador a la membrana diana y
promover el uacuteltimo paso del proceso el cual consiste en el acercamiento iacutentimo
entre las membranas promoviendo su fusioacuten
441 Proteiacutenas SNARE
Las SNAREs (soluble NSF attachment protein receptors) (Soumlllner et al
1993) son proteiacutenas integrales de membrana presentes tanto en las
membranas donadoras (v-SNAREs) como en las receptoras (t-SNAREs) (Block
et al 2001) Su funcioacuten es realizar el anclaje especiacutefico del transportador a la
membrana diana y facilitar el posterior proceso de fusioacuten de ambas
membranas Su nombre deriva de la interaccioacuten con dos componentes Uno de
ellos es una ATPasa sensible a la sustancia N-etilmaleimida (NEM) por lo que
fue llamada factor sensible al NEM (NSF N-ethylmaleimide-sensitive factor)
(Block et al 1988) El otro es una proteiacutena que interacciona con esta ATPasa
y se llamoacute proteiacutena de unioacuten al NSF (SNAP soluble N-ethylamleimide-
sensitive factor attachment protein) (Clary et al 1990) Por lo tanto las
SNAREs son los receptores de las proteiacutenas SNAP
Para que el proceso de anclaje y fusioacuten se realice correctamente primero
la v-SNARE es reclutada y empaquetada junto con la carga en el transportador
fenoacutemeno que es posible debido a la interaccioacuten de la v-SNARE con las
proteiacutenas de cubierta COP I y COP II (Miller et al 2003 Mossessova et al
2003 Rein et al 2002) Seguidamente el transportador es aproximado a la
membrana receptora por diferentes factores de anclaje que interaccionan
facilitando el adecuado emparejamiento de la v-SNARE con la t-SNARE
Posteriormente la interaccioacuten de ambas SNARE en membranas opuestas
lleva a la formacioacuten del complejo trans-SNARE que hace que las membranas
se situacuteen muy proacuteximas entre siacute permitiendo la fusioacuten de ambas (Fasshauer
2003) Tras la fusioacuten el complejo cis-SNARE es desensamblado gracias a la
intervencioacuten de las proteiacutenas NSF y SNAP donde la hidroacutelisis del ATP provoca
el desacoplamiento entre SNAREs (Soumlllner et al 1993) y garantiza la
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
80
generacioacuten de sus formas monomeacutericas para proacuteximas reacciones (Figura 6)
Todas estas acciones actuacutean de manera controlada en el espacio y el tiempo
haciendo que la unioacuten y la fusioacuten se realicen de forma especiacutefica
Figura 6 Formacioacuten de los complejos SNARE y su regulacioacuten (modificado de Bassham y Blatt 2008)
El complejo formado por Syntaxina5Membrina(GS27)Bet1Sec22b
parece mediar en la fusioacuten homotiacutepica de los intermediarios de transporte
derivados de COPII que dan lugar a la formacioacuten del ERGIC El complejo
formado por Syntaxina5GS28Bet1Ykt6 se ha sugerido que interviene en el
transporte tardiacuteo desde el RE hasta el aparato de Golgi y probablemente medie
en la fusioacuten del ERGIC con la cara cis del complejo de Golgi Un tercer
complejo formado por Syntaxina5GS28GS15Ykt6 seriacutea responsable del
transporte intraGolgi y mediariacutea tambieacuten en el transporte retroacutegrado desde los
endosomas hasta el aparato de Golgi (Hong 2005)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
81
442 Proteiacutenas de aproximacioacuten
Las proteiacutenas de aproximacioacuten Tethering tiacutepicamente son moleacuteculas
alargadas que interactuacutean con la membrana a traveacutes de sus colas o complejos
de muacuteltiples subunidades proteicas (Pfeffer 1999 Waters y Pfeffer 1999) Se
tratariacutea de una interaccioacuten deacutebil a larga distancia que permitiriacutea la accioacuten
posterior de las proteiacutenas SNARE El proceso de anclaje de los transportadores
es mediado por las familias de pequentildeas GTPasas Rab y Arl al regular la
actuacioacuten de los factores de aproximacioacuten los cuales se comportan como sus
efectores
Estas proteiacutenas parecen tener una localizacioacuten determinada cada una de
ellas dariacutea especificidad y selectividad a este proceso (Lupashin y Sztul 2005)
ademaacutes de tener otras funciones como son el ensamblaje del complejo trans-
SNARE la seleccioacuten de la carga e interaccioacuten con el citoesqueleto
Algunas de las proteiacutenas de aproximacioacuten maacutes conocidas son la proteiacutena
p115 en mamiacuteferos la cual interviene en el transporte RE-Golgi posiblemente
promoviendo la fusioacuten de las vesiacuteculas COPII (Allan et al 2000) p115 puede
tener actividad como modulador de la funcioacuten de las SNAREs asiacute como factor
de aproximacioacuten para el mantenimiento de la estructura y funcioacuten del complejo
de Golgi (Hong 2005) La proteiacutena Giantina y GM130 al interactuar con p115
intervienen en la aproximacioacuten de las vesiacuteculas COPI a las membranas cis del
aparato de Golgi (Linstedt et al 2000) Golgina-84 es una proteiacutena integral de
membrana involucrada en la generacioacuten y mantenimiento de la arquitectura del
complejo de Golgi (Satoh et al 2003 Diao et al 2003)
45 Citoesqueleto
Todos los elementos del citoesqueleto junto con sus proteiacutenas motoras y
no motoras tienen un papel fundamental en el posicionamiento de las
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
82
estructuras subcelulares asiacute como en la biogeacutenesis y funcioacuten de la mayoriacutea de
las organelas
451 Microtuacutebulos
Los microtuacutebulos (MTs) son estructuras ciliacutendricas que se originan en el
centrosoma Estaacuten formados por diacutemeros de α y szlig tubulina En las ceacutelulas de
mamiacuteferos los MTs intervienen en diversos procesos celulares como el
movimiento de membranas y orgaacutenulos el posicionamiento de compartimentos
y divisioacuten celular
Los MTs son elementos dinaacutemicos que crecen y decrecen mediante la
polimerizacioacuten y despolimerizacioacuten de los heterodiacutemeros de tubulina Una de
las caracteriacutesticas de los MTs es que estaacuten polarizados posen un extremo +
o de crecimiento raacutepido y un extremo - o de crecimiento lento Este uacuteltimo es
el que se encuentra unido al centrosoma En ceacutelulas de mamiacuteferos la posicioacuten
yuxtanuclear del AG estaacute correlacionada con el centrosoma Asiacute mediante la
despolimerizacioacuten de los microtuacutebulos el AG se fragmenta y se produce la
formacioacuten de los llamados mini-dictiosomas cercanos a los sitios de salida del
RE Tambieacuten se han implicado los MTs en el transporte a diferentes niveles en
la viacutea secretora Asiacute el extremo - direcciona mediante proteiacutenas motoras tipo
dineiacutenas el movimiento de las estructura pre-Golgi en su camino hasta la cara
cis del AG (Presley et al 1997) El transporte desde el TGN hasta la
membrana plasmaacutetica es dependiente de MTs (Toomre et al 1999) Y tambieacuten
se han relacionado con el transporte retroacutegrado desde el aparato de Golgi al
RE (Sciaky et al 1997)
Existe un conjunto de proteiacutenas que regulan las funciones de los MTs Las
proteiacutenas motoras que utilizan la hidroacutelisis del ATP para desplazarse a lo largo
de los MTs siendo las kinesinas las que se mueven hacia el extremo + de los
MTs mientras que las dineiacutenas lo hacen hacia el extremo - Las proteiacutenas
reguladoras no motoras denominadas MAPs (Microtubule associated
proteins) interaccionan con los MTs actuando como estabilizadoras y
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
83
moduladoras de la unioacuten de estos con otros componentes celulares
participando como ejemplo en el posicionamiento del aparato de Golgi (Rios et
al 2004)
452 Actina
La actina es una proteiacutena monomeacuterica globular (G-actina) cuya
polimerizacioacuten va a dar lugar a los microfilamentos de actina (F-actina) que
junto con lo microtuacutebulos y filamentos intermedios van a formar el citoesqueleto
celular El citoesqueleto de actina va a intervenir en procesos de
mantenimiento de la forma soporte estructural movimiento celular asiacute como en
el movimiento de orgaacutenulos y membranas Esta proteiacutena se encuentra
relacionada con el mantenimiento de la forma de cisternas aplanadas del AG
(Egea et al 2006)
Los filamentos de actina son estructuras muy dinaacutemicas y polarizadas
Poseen un extremo + por donde tiene lugar la polimerizacioacuten y un extremo -
de despolimerizacioacuten proceso que depende de la hidroacutelisis de ATP Existen un
conjunto de proteiacutenas que van a ser las encargadas de regular la
polimerizacioacuten de actina y su interaccioacuten con otros elementos de la ceacutelula Asiacute
se describen las proteiacutenas de unioacuten a actina o ABPs (actin binding proteins)
que van a regular el crecimiento neto del filamento de actina
Asociadas a los filamentos actina existen una serie de proteiacutenas motoras
que pertenecen a la familia de las miosinas Su desplazamiento a lo largo de
los filamentos depende de ATP Dentro de esta familia encontramos las
miosinas tipo I V y VI y la miosina tipo II que se ha relacionado con el traacutefico de
membranas (DePina y Langford 1999 Steimle et al 2005)
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
84
5 TRAacuteFICO ALTERADO EN MODELOS DE ENFERMEDAD DE PARKINSON
Las entidades neurodegenerativas tiacutepicamente se caracterizan por
peacuterdida neuronal progresiva que se extiende hasta hacerse patente los
siacutentomas de la enfermedad Asimismo existen evidencias que demuestran que
la fragmentacioacuten del AG (Fujita et al 2006 Gonatas et al 2006 Fan et al
2008) y la alteracioacuten del traacutefico en general contribuyen sustancialmente en la
patogeacutenesis de estas enfermedades (Zhiping et al 2008)
En neuronas el AG estaacute involucrado en el flujo axoplaacutesmico de
numerosas proteiacutenas endoacutegenas y del transporte de variadas moleacuteculas
exoacutegenas a traveacutes de rutas trans-sinaacutepticas y del transporte axoplaacutesmico
retroacutegrado (Zhiping et al 2008) Igualmente como hemos revisado en el
apartado del traacutefico funcional son muchas las funciones que se llevan a cabo
en esta organela reacciones que son vitales para mantener la funcionalidad
neuronal Por tanto es faacutecil deducir que cualquier trastorno en el
funcionamiento del complejo de Golgi puede repercutir en consecuencias
graves para la estabilidad y desempentildeo normal de la neurona como unidad y
del tejido nervioso en conjunto
Asimismo se ha evidenciado que ciertas condiciones patoloacutegicas o la
sobreexpresioacuten de proteiacutenas asociadas al AG pueden alterar su estructura
apilada Aunque la disociacioacuten de organelas es una caracteriacutestica claacutesica en
enfermedades neurodegenerativas algunos experimentos demuestran que la
fragmentacioacuten del AG es un estado precliacutenico de la neurodegeneracioacuten
(Karecla y Kreis 1992 Mourelatos et al 1996) lo que la convierte en un
indicador fiable de actividad degenerativa (Stieber et al 1996)
La fragmentacioacuten del AG en enfermedades neurodegenerativas es
probablemente causada por una gama amplia de mecanismos Dentro de estos
mecanismos pueden estar implicadas proteiacutenas que mantienen la estructura
del AG alteraciones del traacutefico entre el RE-AG desequilibrio entre la salida y
llegada de intermediarios de transporte (Lashuel y Hirling 2006 Mironov y
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
85
Beznoussenko 2011) asiacute como el acuacutemulo y formacioacuten de agregados
proteicos en el soma celular que conducen a un deficiente transporte axonal
No existe una idea clara si estas inclusiones representan una reaccioacuten
protectora por parte de la ceacutelula o si son una sentildeal de dantildeo neuronal
irreversible Se ha postulado que las inclusiones intracelulares juegan un papel
crucial en la patogeacutenesis de la fragmentacioacuten del AG (Zhiping et al 2008)
Es conocido que la integridad y principalmente la localizacioacuten del AG se
debe en parte a la interaccioacuten de esta organela con el sistema de microtuacutebulos
por tanto uno de los mecanismos que explicariacutea la fragmentacioacuten del AG y la
alteracioacuten en la capacidad de secrecioacuten celular es la perturbacioacuten del sistema
de microtuacutebulos y sus proteiacutenas asociadas La agregacioacuten de proteiacutenas afecta
el sistema de microtuacutebulos y guiacutea a la fragmentacioacuten del AG Cuando se
fragmenta el AG se hace ineficiente la capacidad de transportar moleacuteculas
desde el post-Golgi hacia las organelas ademaacutes en este estado la
maduracioacuten de la maquinaria de transporte se afecta produciendo variacioacuten en
la segregacioacuten de sustancias hacia el axoacuten o las dendritas Siacute el transporte
hacia las dendritas o el axoacuten estaacute alterado en neuronas la polaridad de la
ceacutelula pierde su estabilidad y por tanto la capacidad de comunicacioacuten
interneuronal (Zhiping et al 2008)
Como se ha mencionado en apartados anteriores la EP se caracteriza
por presentar agregados de la proteiacutena αs en neuronas de la sustancia negra
inclusiones que pueden causar dantildeo al interferir con pasos particulares del
traacutefico de membranas (Zhiping et al 2008 Lee et al 2006) Se ha observado
en desordenes neuroloacutegicos que presentan fragmentacioacuten del AG como la
proteiacutena αs afecta el sistema de microtuacute bulos y los microfilamentos de actina
aunque el transporte no dependiente de microtuacutebulos permanece sin alteracioacuten
(Lee et al 2006) Ademaacutes se ha demostrado en neuronas dopamineacutergicas que
la exposicioacuten a αs oligomeacuterica disminuye la polimerizacioacuten de tubulina
alterando la formacioacuten de microtuacutebulos (Chen et al 2007) En los uacuteltimos antildeos
se han realizado estudios en modelos animales y celulares de la EP arrojando
aportes valiosos que ayudan a clarificar el papel primario de los efectos
perjudiciales causados por la sobreexpresioacuten formas mutadas o agregacioacuten de
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
86
la proteiacutena αs Se sugiere que las formas alteradas de αs se comportan como
el efector primario de los dantildeos originados en pasos iniciales de la viacutea
secretora Se ha evidenciado que la respuesta seguida a la sobreexpresioacuten de
αs en levaduras induce un bloqueo del traacutefico vesicular entre el RE -AG lo que
causa estreacutes a nivel del RE Asimismo la toxicidad de αs puede ser bloqueada
al inducir la sobreexpresioacuten de la GTPasa Ypt1Rab1 en el modelo de levadura
(Cooper et al 2006) o en modelos animales (Chua y Tang 2006)
Bajo condiciones normales en el lumen del RE las chaperonas ayudan a
plegar correctamente las proteiacutenas recieacuten sintetizadas las cuales seraacuten
seguidamente translocadas a otros compartimentos pero en ciertas
condiciones de estreacutes celular puede haber un incremento de proteiacutenas mal
plegadas que se acumulan en el RE Este fenoacutemeno produce una activacioacuten de
la expresioacuten proteica que incrementa la carga funcional del RE y de la
maquinaria celular de degradacioacuten de proteiacutenas (Marciniak y Ron 2006) lo que
genera un equilibrio muy deacutebil que se puede romper con facilidad si continuacutea el
ataque por parte del agente agresor La respuesta al estreacutes del RE en ceacutelulas
neuronales PC12 inducido por 6-OHDA fue confirmado al observar la
activacioacuten de las kinasas PERK y IRE1α las cuales son sensores claves de
estreacutes en RE tambieacuten se incrementoacute la chaperona HSP70 que se asocia con
este tipo de estreacutes Estos mismos hallazgos fueron encontrados en ceacutelulas
PC12 y cultivos primarios de neuronas simpaacuteticas tratadas con las toxinas
MPP+ y rotenona (Ryu et al 2002) Asimismo se ha demostrado que la
sobreexpresioacuten del mutante de αs induce estreacutes del RE (Smith et al 2005) Se
puede considerar como conclusioacuten que una causa del bloqueo en el transporte
entre el RE-Golgi es el estado alterado de la funcioacuten del retiacuteculo endoplaacutesmico
En otra investigacioacuten se demuestra como la toxicidad de αs reflejada en el
bloqueo del traacutefico entre el RE y el AG puede ser suprimida al sobreexpresar
las proteiacutenas SNARE involucradas en el transporte RE-AG (Thayanidhi et al
2010) Estos hallazgos sugieren que la expresioacuten de las formas mutadas de la
proteiacutena αs antagonizan la correcta funcioacuten de las proteiacutenas SNARE al inhibir
el ensamblaje de los complejos Visto de otra forma las vesiacuteculas se producen
correctamente desde el RE pero su unioacuten o fusioacuten a las membranas
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
87
receptoras esta inhibido Igualmente se encontroacute que la sobreexpresioacuten de la
proteiacutena SNARE Ykt6 fue la maacutes eficiente en la labor de suprimir el bloqueo del
transporte entre RE-Golgi (Thayanidhi et al 2010) Curiosamente Ykt6 es la
SNARE con mayor expresioacuten en neuronas y en la liacutenea celular PC12 aunque
se desconoce la razoacuten de este fenoacutemeno (Hasegawa et al 2006)
Se sabe que el acuacutemulo de oligoacutemeros de αs en las terminales sinaacutepticas
y axoacuten juega un importante papel en el mecanismo de neurodegeneracioacuten
(Iwatsubo et al 1996 Hashimoto y Masliah 1999 Trojanowski et al 1998
Lansbury 1999) En un reciente estudio donde se utilizoacute un modelo de ratoacuten
transgeacutenico para EP expresando una forma aberrante de la proteiacutena αs se
observaron alteraciones relacionadas con el traacutefico intracelular donde la
liberacioacuten de dopamina fue afectada por un fenoacutemeno de redistribucioacuten de las
proteiacutenas SNARE involucradas en el proceso de neuroexocitosis El efecto
dantildeino de la agregacioacuten de αs causoacute la redistribucioacuten de SNAP25 sintaxina 1 y
sinaptobrevina 2 (Garcia-Reitboumlck et al 2010) Asimismo la sobreexpresioacuten de
αs aberrante o de sus formas mutadas en ceacutelulas PC12 como modelo para EP
promueve el aumento citosoacutelico de catecolaminas al interferir con su liberacioacuten
mecanismo mediado a traveacutes de la disfuncioacuten causada sobre los uacuteltimos pasos
de la exocitosis (Larsen et al 2006 Mosharov et al 2006 Cookson y van der
Brug 2008) Tambieacuten se sabe que la sobreexpresioacuten de αs inhibe la
competencia de secrecioacuten o ldquoprimingrdquo de las vesiacuteculas sinaacutepticas (Fortin et al
2005 Larsen et al 2006 Nemani 2010) Esto se puede explicar por el papel
de la proteiacutena αs que puede actuar como chaperona para el correcto
plegamiento de proteiacutenas SNARE ligadas al proceso sinaacuteptico (Chua y Tang
2006 Cooper et al 2006) o por su participacioacuten en el ensamblaje de estos
mismos complejos necesarios para la fusioacuten de las vesiacuteculas sinaacutepticas con la
membrana plasmaacutetica (Gitler et al 2008)
Gitler y colaboradores hallaron en modelos neuronales de EP que la
sobreexpresioacuten de las proteiacutenas Rab3A (especiacutefica de neuronas) (Gurkan et
al 2005) y Rab8A (Rab maacutes cercanamente relacionada con Rab1 en
homologiacutea de secuencia) las cuales estaacuten involucradas en la regulacioacuten de
pasos tardiacuteos de la viacutea secretora pueden tener efecto defensivo ante el
REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA
88
proceso de neurodegeneracioacuten inducido por los niveles toacutexicos de αs (Gitler et
al 2008)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
91
V MATERIALES Y MEacuteTODOS
1 REACTIVOS UTILIZADOS En las siguientes tablas se describen todos los materiales utilizados
en las diferentes teacutecnicas
Tabla 2 Anticuerpos primarios usados en inmunofluorescencia
ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIOacuteN FIJADOR Anti-Rab1A Conejo Santa Cruz Biotechnology
Inc California USA 125 PFA 4
Anti-Rab2A Cabra Santa Cruz Biotechnology Inc California USA 130 PFA 4
Anti-Rab6 Conejo Santa Cruz Biotechnology Inc California USA 130 PFA 4
Anti-Rab8 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
135 PFA 4
Anti-Rab27A Conejo ProteinTech Group Inc Chicago EEUU 180 PFA 4
Anti-GS15 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
140 PFA 4
Anti-GS27 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
140 PFA 4
Anti-Membrina Ratoacuten Stressgen Bioreagents Victoria Canadaacute 140 PFA 4
Anti-GS28 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
140 PFA 4
Anti-YKT6p Cabra Santa Cruz Biotechnology Inc California USA 140 PFA 4
Anti-rBet1 Ratoacuten Stressgen Bioreagents Victoria Canadaacute 140 PFA 4
Anti-Sintaxina5 Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 125 PFA 4
Anti-Sec22 Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 150 PFA 4
Anti-Sintaxina6 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
140 PFA 4
Anti-p58 Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 130 Metanol
absoluto
Anti-p115 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
160 PFA 4
MATERIALES Y MEacuteTODOS
92
ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIOacuteN FIJADOR
Anti-GM130 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
1400 PFA 4
Anti-GRASP65 Conejo Abcam Cambridge UK 1400 PFA 4
Anti-Golgina84 Conejo Dr G Warren Yale University USA 1100 PFA 4
Anti-Giantina Ratoacuten Alexis Biochemicals San Diego USA 140 PFA 4
Anti-Manosidasa II Conejo Dr K Moremen University of Georgia Atenas Grecia 1300 PFA 4
Anti-Manosidasa II Ratoacuten BABCO California USA 1200 PFA 4
Anti-TGN-38 Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
130 PFA 4
Anti-COP II (sec23) Conejo Affinity BioReagents USA 17 PFA 4
Anti-β-COP (M3A5) Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis EEUU 150 PFA 4
Anti-β-COP (CM1A10) Ratoacuten Dr AA Mironov Mario
Negri Sud Italia 150 PFA 4
Anti-KDELr Conejo Stressgen Bioreagents Victoria Canadaacute 120 PFA 4
Anti-KDELr Ratoacuten Calbiochem Darmstadt Germany 170 PFA 4
Anti-α-Tubulina Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 1100 Metanol
absoluto Anti-α-Tubulina acetilada Ratoacuten Abcam Cambridge UK 115 Metanol
absoluto
Anti-β-Tubulina III Conejo Sigma Chemicals Co St Louis USA 180 Metanol
absoluto Anti-Dineiacutena cadena pesada Conejo Santa Cruz Biotechnology
Inc California USA 115 Metanol absoluto
Anti-Kinesina cadena ligera Goat Santa Cruz Biotechnology
Inc California USA 125 Metanol absoluto
Anti-Kinesina cadena pesada Ratoacuten Abcam Cambridge UK 130 Metanol
absoluto Anti-α-sinucleiacutena Ratoacuten Abcam Cambridge UK 1100 PFA 4
Anti-α-sinucleiacutena Ratoacuten BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
130 PFA 4
Anti-α-sinucleiacutena Conejo Sigma Chemicals Co St Louis EEUU 140 Metanol
absoluto
Anti-Caspasa 3 activa Conejo GenWay Biotech Inc USA 1120 PFA 4
Anti-Ubiquitina Ratoacuten Santa Cruz Biotechnology Inc California USA 140 PFA 4
MATERIALES Y MEacuteTODOS
93
Tabla 3 Anticuerpos primarios usados en Western Blot
ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIOacuteN PM BLOQUEO GEL
Anti-Rab1A Conejo Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
1100 23 kDa TBS-TBSA 5
BisTris MOPS
Anti-Rab2 Conejo Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
1100 24 kDa TBS-TBSA 3
BisTris MOPS
Anti-Rab3A Conejo Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
1100 25 kDa TBS-TBSA 2
BisTris MOPS
Anti-Rab6 Conejo Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
1100 25 kDa TBS-TBSA 2
BisTris MOPS
Anti-Rab8 Ratoacuten
BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
1200 24 kDa TBS-TBSA 5
BisTris MOPS
Anti-Rab27A Conejo ProteinTech Group Inc Chicago USA 1300 27 kDa TBS-TBSA
3 BisTris MOPS
Anti-GS15 Ratoacuten
BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
150 15 kDa TBS-TBSA 05
BisTris MOPS
Anti-Membrina Ratoacuten Stressgen Bioreagents Victoria Canadaacute
11000 27 kDa TBS-TBSA 5
BisTris MOPS
Anti-GS28 Ratoacuten
BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
11000 28 kDa TBS-TBSA 5
BisTris MOPS
Anti-YKT6p Cabra Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
1100 23 kDa TBS-TBSA 05
BisTris MOPS
Anti-rBet1 Ratoacuten LIFESPAN Biosciences Inc USA
1150 17 kDa TBS-TBSA 2
BisTris MOPS
Anti-Sintaxina5 Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 1100 34 kDa TBS-TBSA
3 BisTris MOPS
Anti-Sec22 Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 1100 24 kDa TBS-TBSA
1 BisTris MOPS
Anti-Sintaxina6 Ratoacuten
BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
1100 35 kDa TBS-TBSA 3
BisTris MOPS
Anti-p58 Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 1100 58 kDa TBS-TBSA
1 BisTris MOPS
Anti-p115 Ratoacuten
BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
12000 115 kDa TBS-TBSA 25
Tris Acetato
Anti-GM130 Ratoacuten
BD Transduction Laboratories Erembodegem Belgium
1150 130 kDa TBS-TBSA 1
Tris Acetato
MATERIALES Y MEacuteTODOS
94
ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIOacuteN PM BLOQUEO GEL
Anti-GRASP65 Conejo Abcam Cambridge UK 1150 46 kDa TBS-TBSA
3 BisTris MOPS
Anti-COP II (sec23) Conejo Affinity
BioReagents USA 1200 85 kDa TBS-TBSA 1
BisTris MOPS
Anti-β-COP (M3A5) Ratoacuten Sigma Chemicals
Co St Louis USA 150 110 kDa TBS-TBSA 1
BisTris MOPS
Anti-KDELr Ratoacuten Calbiochem Darmstadt Germany
1100 25 kDa TBS-TBSA 1
BisTris MOPS
Anti-α-Tubulina Ratoacuten Sigma Chemicals Co St Louis USA 11000 50 kDa TBS-TBSA
5 BisTris MOPS
Anti-β-Tubulina III Conejo Sigma Chemicals Co St Louis USA 11500 50 kDa TBS-TBSA
5 BisTris MOPS
Anti- α-sinucleiacutena Ratoacuten Abcam Cambridge
UK 1600 19 kDa TBS-TBSA 3
BisTris MOPS
Anti- α-sinucleiacutena Conejo Sigma Chemicals
Co St Louis USA 1800 19 kDa TBS-TBSA 5
BisTris MOPS
Tabla 4 Anticuerpos secundarios usados en inmunofluorescencia y Western Blot
ANTICUERPO FUENTE PROCEDENCIA DILUCIOacuteN
Anti-conejo IgG Alexareg 568 Cabra Molecular Probes Eugene USA 1400
Anti-conejo IgG Alexareg 568 Burro Molecular Probes Eugene USA 1400
Anti-conejo IgG Alexareg 488 Pollo Molecular Probes Eugene USA 1400
Anti-conejo-TRICT Cabra Sigma Chemicals Co St Louis USA 1300
Anti-Ratoacuten IgG Alexareg 488 Cabra Molecular Probes Eugene USA 1400
Anti-Ratoacuten IgG Alexareg 568 Cabra Molecular Probes Eugene USA 1400
Anti-Ratoacuten IgG Alexareg 568 Conejo Molecular Probes Eugene USA 1400
Anti-Cabra IgG Alexareg 488 Burro Molecular Probes Eugene USA 1400
MATERIALES Y MEacuteTODOS
95
Tabla 5 Reactivos generales usados en este proyecto
Reactivo Dilucioacuten cantidad o concentracioacuten
de uso Cataacutelogo Procedencia
6-hidroxidopamina 100 μM H116-5MG Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Acetato de uranilo 4 22400 Electron Microscopy Sciences Hatfield EEUU
Agua esteacuteril - W1503 Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Alcohol absoluto - 1310861611 Panreac Barcelona Espantildea
Brefeldina A (BFA) 1 μgml B6542
Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
BSA 01 A4503 Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
BSA-acetilada 01 B2518 Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Catalasa de hiacutegado de ratoacuten 20 U C8531-
10MG Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Cicloheximida 20 μgml C1988
Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Formvar 12 9823 Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Glutaraldehido 02 1909 Polysciences Inc Eppelheim Alemania
Medio de montaje para fluorescencia 10 μlcubre 10 mm S3023 DAKO Glostrup Denmark
Metanol 995 PS - 1610900616 Panreac Barcelona Espantildea
Methamphetamine hydrochloride 50 μM M8750-5G Sigma-ALDRICH Inc St
Louis USA
Paraformaldehido 4 15710 Electron Microscopy Sciences Hatfield USA
PBS 1X p4417-50TAB
Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Poly-D-lysine hydrobromide 01 mgml P7405-5MG Sigma-ALDRICH Inc St
Louis USA
Proteiacutena A-oro 10 nm (1 65) - Departamento Biologiacutea Celular Universidad de Utrecht Holanda
Proteiacutena A-oro 15 nm (1 70) - Departamento Biologiacutea Celular Universidad de Utrecht Holanda
Saponina 01 47036-50G-F
Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Tris 50 mM 1419401211 Panreac Barcelona Espantildea
Tweenreg20 005 152312 Panreac Barcelona Espantildea
MATERIALES Y MEacuteTODOS
96
Tabla 6 Productos utilizados en la amplificacioacuten purificacioacuten y transfeccioacuten de plaacutesmidos
Producto Dilucioacuten o
concentracioacuten de uso
Cataacutelogo Procedencia
Ampicilina soacutedica 100 μgml A0166 Sigma-ALDRICH Inc St Louis USA
Bacterias competentes Ecoli DH5-alpha 20 μlplaacutesmido 18263-012 INVITROGEN Carlsbad
USA Kanamicina 40 μgml 11815-024 GibcoPaislley UK Kit de purificacioacuten de plaacutesmidos Maxiprep - NA0310-1KT Sigma-ALDRICH Inc St
Louis USA Kit de purificacioacuten de plaacutesmidos Miniprep - NA0150-1KT Sigma-ALDRICH Inc St
Louis USA LB-agar (LENNOX) 35 g100 ml 108300 Pronadisa Basel Suiza Lipofectaminatrade 2000 14 PN 52758 INVITROGENCarlsbadUSA Medio OPTI-MEMreg I - 31985 Gibco Paislley UK Medio SOB 307 g100 ml 154100 Pronadisa Basel Suiza Tubos para el cultivo de bacterias - 62515028 SARSTEDT AG amp Co
Nuumlmbrecht Alemania
Tabla 7 Productos utilizados para Western Blot
Producto Dilucioacuten cantidad o concentracioacuten
de uso Cataacutelogo Procedencia
Complete mini (inhibidor de proteasas) 1 tableta 10ml 11836-153-
001 ROCHE Diagnostics GmbH Mannheim Germany
Iodoacetamida BioUltra 10 mM I1149 Sigma-ALDRICHInc St Louis USA
NuPAGEreg Agente reductor 1X NP0009 INVITROGEN Paisley-
Scotland UK
NuPAGEreg Tampoacuten LDS 1X NP0007 INVITROGEN Paisley-Scotland UK
NuPAGEreg Gel de Bis-Tris 4-12 NP0321 INVITROGEN Carlsbad
CA USA NuPAGEreg Gel de Tris-acetato 4-12 EA0375 INVITROGEN Carlsbad
CA USA NuPAGEreg Tampoacuten de corrido MOPS SDS 1X NP0001 INVITROGEN Carlsbad
CA USA NuPAGEreg Tampoacuten de corrido Tris-Acetato SDS
1X LA0041 INVITROGEN Carlsbad CA USA
NuPAGEreg Tampoacuten de transferencia 1X NP0006-1 INVITROGEN Carlsbad
CA USA
Marcador HiMarcktrade 4 μl LC5699 INVITROGEN Carlsbad CA USA
MATERIALES Y MEacuteTODOS
97
Producto Dilucioacuten o
concentracioacuten de uso
Cataacutelogo Procedencia
Marcador SeeBluereg plus 2 4 μl LC5925 INVITROGEN Carlsbad
CA USA
Pircereg BCA kit - 23225 Therno Scientific Rockford IL USA
Membrana de transferencia PVDF - IPVH00010
Immobilonreg- P Millipore Corporation Billerica MA USA
Tabla 8 Productos utilizados en los cultivos celulares
Producto Dilucioacuten
cantidad o concentracioacuten
de uso Cataacutelogo Procedencia
Penicilina-estreptomicina 100 Uml 100 μgml 15140-122 INVITROGEN Carlsbad USA
Medio DMEM+GlutaMAXtradeI 45gL D glucosa 825 - 99 31966 Gibco Paislley UK
PBS pH 74 esteacuteril - 10010 Gibco Paislley UK
Factor de crecimiento neural (NGF) 50 ngml 13257-019 INVITROGEN Carlsbad
USA
Suero de caballo 15 - 1 B15-122 PAA Laboratories GmbH Pasching Austria
Suero fetal Bovino 250 A15-151 PAA Laboratories GmbH Pasching Austria
Tripsina 005 15400-054 Gibco Paisley-Scotland UK
Tabla 9 Plaacutesmidos y pequentildeos RNAs de interferencia
Producto Resistencia Vector o cataacutelogo Procedencia
Rab1A-GFP Kanamicina pEGFP-N1 Dr Garciacutea Borroacuten Universidad de Murcia Espantildea
Rab2-GFP Ampicilina pCMV6-AC-GFP
OriGene TechnologiesInc Maryland USA
Rab8A-GFP Ampicilina pCMV6-AC-GFP
OriGene TechnologiesInc Maryland USA
Rab27A-GFP Ampicilina pCMV6-AC-GFP
OriGene TechnologiesInc Maryland USA
MATERIALES Y MEacuteTODOS
98
Producto Resistencia Vector o cataacutelogo Procedencia
VSVg-GFP Kanamicina pEGFP-N1 Addgene Inc Cambridge Massachusetts USA
Syntaxin5-GFP Ampicilina pCMV6-AC-GFP
OriGene TechnologiesInc Maryland USA
siRNA-Rab1A - sc-41809 Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
siRNA-Rab2A - sc-41811 Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
siRNA-Rab8A - sc-41828 Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
Control-siRNA - sc-36869 Santa Cruz Biotechnology Inc California USA
2 CULTIVO CELULARES
Ceacutelulas PC12 indiferenciadas (Greene y Tischler 1976) fueron cultivadas
en monocapa utilizando frascos de 75 cm2 y 25 cm2 con superficie tratada para
adhesioacuten procedentes de la casa comercial PAA (PAA Laboratories GmbH
Pasching Austria) Para la fase de proliferacioacuten donde las ceacutelulas adquieren
una morfologiacutea redondeada similar a ceacutelulas cromafines inmaduras
procedentes de la meacutedula adrenal (Figura 7) se utilizoacute medio DMEM 45 g
glucosal enriquecido con suero de caballo al 15 y suero fetal bovino al
25 ambos inactivados por calor (56 ordmC durante 30 minutos) finalmente se
agregoacute 100 UIml de penicilina maacutes 100 microgml de estreptomicina (Tabla 8) Los
pases se efectuaron tras alcanzar una confluencia del 85 con la finalidad de
mantener el clon congelar ceacutelulas o continuar con la fase de diferenciacioacuten
ademaacutes el medio fue reemplazado cada 3 diacuteas para evitar cambios
inadecuados de pH Para la fase de diferenciacioacuten las ceacutelulas se expusieron
durante 4 a 5 diacuteas al factor de crecimiento nervioso (NGF 50 ngml) para que
cesaran su divisioacuten celular y extendieran sus neuritas adoptando gradualmente
caracteriacutesticas de neuronas dopamineacutergicas maduras (Figura 7) en medio
DMEM suplementado con suero de caballo al 1 e igual concentracioacuten de los
antibioacuteticos anteriormente descritos Tanto para la fase de proliferacioacuten como
para la de diferenciacioacuten las ceacutelulas fueron incubadas en un ambiente de 5
MATERIALES Y MEacuteTODOS
99
de CO2 95 de humedad relativa y 37 degC en estufa INCO2-MEMMERT
(MEMMERT Bremen Alemania)
Todos los estudios fueron realizados con ceacutelulas PC12 en su estado
neuronal Para los estudios de microscopiacutea oacuteptica las ceacutelulas fueron
transferidas inicialmente a cubreobjetos de vidrio esteacuteriles de 10 mm de
diaacutemetro procedentes de la casa Nahita (Nahita-Auxilab SL Navarra
Espantildea) dentro de placas de Petri esteacuteriles (Nunc) doblemente tratadas con
poli-D-lisina (PMgt300000) (15 mlplaca de petri de 35 mm) como sustrato
para permitir su adhesioacuten siguiendo las condiciones del protocolo
recomendado por la casa comercial Para los estudios por microscopiacutea
electroacutenica y los ensayos de western blot las ceacutelulas se sembraron en frascos
de 75 cm2 bajo las mismas condiciones de tratamiento mencionadas
anteriormente
3 TRATAMIENTOS
El tratamiento con las diferentes drogas fue llevado a cabo con una
confluencia entre el 70-80 para conseguir la adecuada diferenciacioacuten
celular Se realizoacute tratamiento con las neurotoxinas 6-hidroxidopamina (6-
OHDA) a una concentracioacuten de 100 microM (250 mgdl) maacutes 20 U de catalasa
murina o metanfetamina (MET) a la concentracioacuten de 50 microM (093 mgdl)
Ambas sustancias fueron agregadas al medio de cultivo de diferenciacioacuten
conteniendo NGF (50 ngml) durante 3-5 diacuteas y bajo las mismas condiciones
ambientales utilizadas para la proliferacioacuten y diferenciacioacuten celular Igualmente
el medio de cultivo en esta fase fue reemplazado al segundo o tercer diacutea para
evitar cambios indeseables del pH Estos paraacutemetros de tratamiento fueron
seleccionados basaacutendose en resultados de estudios dosis respuesta con objeto
de obtener la mayor cantidad de agregados intracelulares y el miacutenimo de
muerte celular (Figura 7)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
100
A B C
Figura 7 Cambios morfoloacutegicos en la liacutenea celular PC12 A Fase de proliferacioacuten celular
Se observan ceacutelulas redondas indiferenciadas en crecimiento hiperplaacutesico B Fase de
diferenciacioacuten celular Ceacutelulas despueacutes de 3 diacuteas de exposicioacuten al NGF (50 ngml) se observa
abundante crecimiento de neuritas y formacioacuten de conexiones sinaacutepticas sin cambios en la
proliferacioacuten C Fase de tratamiento con 6-OHDA (100 microM) maacutes 20 U de catalasa murina o
MET (50 microM) Ceacutelulas con aspecto robusto y con una microarquitectura menos angulosa se
pierde gran cantidad de conexiones sinaacutepticas
4 ENSAYOS DEL TRANSPORTE
41 Anaacutelisis del transporte retrogrado y anteroacutegrado mediante el uso de brefeldina A
La brefeldina A (BFA) es una herramienta muy utilizada para estudiar el
transporte celular La BFA es una droga fuacutengica que inhibe la actividad de la
GTPasa Arf1 lo cual impide la generacioacuten de vesiacuteculas con cubierta tipo
COP I desencadenando la formacioacuten de tuacutebulos del aparato de Golgi que
terminan fusionaacutendose con el RE
Para llevar a cabo el anaacutelisis del transporte retrogrado las ceacutelulas PC12
fueron tratadas con BFA (1 μgml) fijadas durante diferentes intervalos de
tiempo con paraformaldehiacutedo (PFA) 4 e inmunomarcadas doblemente con
manosidasa II y GM130 Asimismo para el anaacutelisis del transporte anteroacutegrado
las ceacutelulas fueron incubadas a la misma concentracioacuten de BFA durante 40
MATERIALES Y MEacuteTODOS
101
minutos lavadas y nuevamente incubadas con medio completo previamente
atemperado y sin la droga Estas ceacutelulas fueron fijadas a intervalos diferentes
de tiempo e inmunomarcadas de igual forma como se realizoacute en el estudio del
transporte retrogrado
42 Ensayos del transporte utilizando la proteiacutena G del virus de la estomatitis vesicular (VSVg-GFP)
Adicionalmente en los ensayos del traacutefico intracelular de membranas se
utilizoacute como marcador del transporte anteroacutegrado el mutante de la proteiacutena G
del virus de la estomatitis vesicular (Tabla 9) En estos experimentos las
ceacutelulas PC12 en su estado neuronal fueron tratadas con metanfetamina (50
microM) hasta el cuarto diacutea en este momento se quimiotransfectaron con el
plaacutesmido VSVg-GFP utilizando el meacutetodo de Lipofectaminatrade 2000 y siguiendo
las recomendaciones del fabricante Pasadas 18-24 horas las ceacutelulas fueron
incubadas en oscuridad durante una hora a 40ordmC (temperatura no permisiva)
impidiendo el plegamiento correcto de la proteiacutena y por tanto su acumulacioacuten
en el RE A continuacioacuten permanecieron 30 minutos adicionales bajo las
mismas condiciones en presencia de cicloheximida (20 μgml) para inhibir la
siacutentesis proteica Posteriormente fueron incubadas a 32ordmC (temperatura
permisiva) donde tiene lugar el plegamiento correcto de la proteiacutena y su
transporte a lo largo de la viacutea secretora Finalmente las ceacutelulas fueron fijadas a
diferentes intervalos de tiempo
5 INMUNOFLUORESCENCIA
La inmunofluorescencia indirecta se realizoacute sobre la monocapa de ceacutelulas
sembradas sobre cubreobjetos de vidrio esteacuteriles como se mencionoacute en el
apartado 2 en confluencia final de entre el 60 al 80 En funcioacuten del tipo de
anticuerpo a ensayar se hicieron diferentes tipos de fijacioacuten yo
permeabilizacioacuten
MATERIALES Y MEacuteTODOS
102
Inicialmente se eliminoacute cuidadosamente el medio de cultivo y las ceacutelulas
fueron fijadas con PFA 4 en PBS durante 10 minutos a temperatura
ambiente excepto en los experimentos con brefeldina A donde el fijador fue
previamente atemperado Seguidamente las ceacutelulas fueron lavadas 3 veces en
PBSBSA al 01 durante 15 minutos y luego se bloquearon los grupos
aldehiacutedos con una solucioacuten filtrada de PBSGlicina al 002 M durante 10
minutos para ser posteriormente permeabilizadas con saponina al 01
diluida en PBSBSA al 01 durante 10 minutos Por el contrario otros
inmunoensayos exigieron un meacutetodo diferente de fijacioacuten donde las ceacutelulas en
monocapa sobre cubreobjetos de vidrio fueron simultaacuteneamente fijadas y
permeabilizadas con metanol absoluto durante 3 segundos a temperatura
ambiente a continuacioacuten se lavaron en solucioacuten filtrada de PBS por 10
minutos y despueacutes se bloquearon las uniones inespeciacuteficas con PBS
suplementado al 1 con albuacutemina seacuterica bovina durante 20 minutos Este
meacutetodo conjunto de fijacioacuten y permeabilizacioacuten se utilizoacute baacutesicamente para
visualizar los microtuacutebulos proteiacutenas motoras asociadas al citoesqueleto y el
inmunomarcaje para la proteiacutena α -sinucleiacutena Tras el uacuteltimo paso de los dos
sistemas de fijacioacuten y permeabilizacioacuten las ceacutelulas fueron incubadas con el
anticuerpo primario (Tabla 2) en un marcaje simple o bien con una mezcla de
anticuerpos primarios en el caso de dobles marcajes durante 60 minutos a
temperatura ambiente o toda la noche a 4 ordmC Los anticuerpos fueron diluidos a
la concentracioacuten de trabajo en una solucioacuten de BSA-acetilada al 01 diluida
en PBSGlicina 002 M Posteriormente las ceacutelulas fueron lavadas tres veces
con PBS para luego permanecer 45 minutos incubadas en oscuridad y a
temperatura ambiente con el anticuerpo secundario especiacutefico marcados con
fluoroacuteforos que emitiacutean o bien en el espectro verde (AlexaFluorreg 488) o bien en
el rojo (AlexaFluorreg 568) Por uacuteltimo las ceacutelulas fueron lavadas en solucioacuten de
PBS durante 15 minutos y las preparaciones en cubreobjetos se montaron
sobre portaobjetos utilizando 10 microl cubre del medio de montaje especial para
fluorescencia DAKO
Para detectar el inmunomarcaje las preparaciones se visualizaron en el
microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot con objetivo 100 X acoplado a
MATERIALES Y MEacuteTODOS
103
una caacutemara digital (Leica DC 500) y para su anaacutelisis se contaron al menos 50
ceacutelulas en cinco replicas diferentes en los estudios sobre la fragmentacioacuten del
aparato de Golgi yo la formacioacuten de inclusiones intracelulares Tambieacuten se
utilizoacute el microscopio confocal Leica TCS SP2 utilizando el laser ArVis a 488
nm para los AlexaFluorreg 488 y el HeNe a 561 nm para los AlexaFluorreg 568
El procesamiento y anaacutelisis de imaacutegenes se llevo a cabo utilizando el programa
Adobe PhotoShop CS2 versioacuten 90 (Adobe Systems SanJose CA) y el
programa Imaris (Bitplane AG Zurich Switzerland) para obtener la
reconstruccioacuten en 3D del aparato de Golgi y de las inclusiones intracelulares
6 ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR
Se realizaron ensayos de viabilidad celular a las 24 48 72 96 y 120
horas desde el inicio de los tratamientos Para determinar la viabilidad celular
se empleoacute el meacutetodo de inmunomarcaje para la proteiacutena caspasa-3 activa de
una de las viacuteas de apoptosis celular (Sesso et al 1999 Mancini et al 2000
Walker et al 2004 Sutterlin et al 2005) donde se cuantificaron las ceacutelulas con
marcaje positivo y estos valores se compararon con aquellos obtenidos para
las ceacutelulas controles en los tiempos correspondientes
7 INMUNODETECCIOacuteN DE PROTEIacuteNAS POR WESTERN BLOTTING
71 Extraccioacuten de proteiacutenas
Las ceacutelulas PC12 fueron sembradas en frascos de 75 cm2 y al tercer y
quinto diacutea de tratamiento con metanfetamina yo transfectadas con pequentildeos
RNAs de interferencia fueron lavadas suavemente con una solucioacuten de PBS
esteacuteril atemperada a 4 ordmC y seguidamente congeladas a -20 ordmC en seco para
ser homogeneizadas posteriormente Las ceacutelulas en un ambiente de 4 ordmC
fueron rascadas del interior del frasco y solubilizadas en medio de tampoacuten de
MATERIALES Y MEacuteTODOS
104
lisis consistente en Tris-HCl 50 mM pH 88 EDTA 1 mM pH 80 Igepal 1 y
una mezcla de inhibidores de proteasas seguacuten la concentracioacuten especificada
por el fabricante (Tabla 7) Cada lisado fue centrifugado durante 20 minutos a
15000 g en una centrifuga Labofuge 400R (Heraeus Buckinghamshire
England) a 4 ordmC La fraccioacuten soluble fue recogida y se cuantificoacute la
concentracioacuten de proteiacutenas utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico del aacutecido
bicinconiacutenico-BCATM siguiendo las recomendaciones de la casa comercial
Para la obtencioacuten de la fraccioacuten insoluble el cual contiene principalmente los
agregados proteicos se recogioacute el precipitado y fue resuspendido en una
solucioacuten al 2 de SDS en el tampoacuten de solubilizacioacuten anteriormente descrito
al que se le agregoacute adicionalmente iodoacetamida 10 mM y fue sonicado
durante 10 segundos todos estos pasos se realizaron en friacuteo Al igual que
antes se utilizoacute el meacutetodo de cuantificacioacuten proteica de BCA para medir la
concentracioacuten de proteiacutenas La deteccioacuten colorimeacutetrica de las muestras se
midioacute en el espectrofotoacutemetro S-22 UVVis BOECO y su anaacutelisis en el
programa GraphPad Prismreg versioacuten 40 (Graph Software CA USA)
72 Electroforesis
La electroforesis de proteiacutenas se efectuoacute siguiendo un protocolo
estandarizado seguacuten el manual de instrucciones que se reuacutene en la guiacutea
teacutecnica de NuPAGEreg versioacuten E del 2003 (Invitrogentrade) (Tabla 7) Las muestras
solubilizadas de proteiacutenas fueron mezcladas siguiendo las proporciones
indicadas y en condiciones reductoras a pH neutro con el tampoacuten de carga
LDS el agente reductor y en su caso agua deionizada A continuacioacuten fueron
desnaturalizadas a 70 ordmC en termobloque durante 10 minutos y se cargoacute entre
15-25 μg de proteiacutena en geles de Bis-Tris 4 ndash12 de 10 mm de grosor oacute Tris-
Acetato 3-8 de 10 mm de grosor (NuPAGEreg Novexreg) acorde al peso
molecular de la proteiacutena de intereacutes en detectar Se utilizoacute un marcador de
pesos moleculares pretentildeido (marcador SeeBlueplusreg 2 para los geles de Bis-
tris y marcador HiMarkreg para los geles de Tris-Acetato) con el fin de comparar
las mediciones entre controles y tratamientos despueacutes del revelado
MATERIALES Y MEacuteTODOS
105
Posteriormente se cargoacute el sistema discontinuo de tampones NuPAGEreg en el
recipiente de electroforesis (XCellSureLocktrade Electrophoresis Cell-Invitrogen)
MOPS SDS 1X para los geles Bis-Tris y tampoacuten de recorrido Tris-Acetato SDS
1X para los geles de Tris-Acetato asimismo en la caacutemara interna de la cubeta
se adicionoacute 500 microl de antioxidante para mantener las proteiacutenas en forma
reducida mientras migran a traveacutes del gel durante la electroforesis
Seguidamente se sometioacute a electroforesis 200 voltios50 minutos para el
sistema de Bis-Tris y 150 voltios1 hora para el sistema de tris-Acetato
73 Western Blot
Para la transferencia de proteiacutenas a membrana se utilizoacute un sistema de
transferencia electroforeacutetico de tipo huacutemedo siguiendo un protocolo
estandarizado seguacuten el manual de instrucciones que se reuacutene en la guiacutea
teacutecnica de NuPAGEreg versioacuten E del 2003 (Invitrogen) (Tabla 7) Se utilizoacute una
condicioacuten estaacutendar de trabajo de 30 voltios durante 1 hora sobre membranas
de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con poro de 045microm activadas por 30
segundos en metanol lavadas en agua y mantenidas durante 5 minutos en
tampoacuten de transferencia NuPAGEreg antildeadieacutendose 500 microl de antioxidante a la
caacutemara interna (XCell IItrade Blot Module-Invitrogen) de la cubeta de
electroforesis Posteriormente las membranas fueron bloqueadas en una
solucioacuten salina de TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 74 150 mM NaCl 005
Tween 20) conteniendo 3 de albumina seacuterica bovina durante 2 horas a
temperatura ambiente oacute a 4 ordmC toda la noche en agitacioacuten suave
74 Inmunodeteccioacuten
Despueacutes del bloqueo las membranas se incubaron durante 60 minutos a
temperatura ambiente en agitacioacuten suave con diferentes anticuerpos primarios
(la casa comercial y sus diluciones se especifican en la Tabla 3) Todos los
anticuerpos usados en esta teacutecnica fueron diluidos en TBS-T Tras la
MATERIALES Y MEacuteTODOS
106
incubacioacuten con el anticuerpo primario se realizaron 4 lavados con TBS-T
durante 20 minutos Posteriormente fueron incubadas con el respectivo
anticuerpo secundario conjugado a AlexaFluorreg 488 oacute 568 durante 60 minutos
a temperatura ambiente en agitacioacuten suave y protegidas de la luz (Tabla 4)
Finalmente la deteccioacuten de las proteiacutenas inmunomarcadas se realizoacute en el
aparato Typhoon 9410 Variable Mode Imager (Amersham Biosciences) La
cuantificacioacuten especiacutefica de cada una de las bandas (intensidad de marcaje
relativo) se llevo a cabo a traveacutes del programa ImageQuant TL
8 AMPLIFICACIOacuteN PURIFICACIOacuteN Y TRANSFECCIOacuteN DE PLAacuteSMIDOS
81 Transformacioacuten y multiplicacioacuten de bacterias
Se prepararon con anterioridad las diluciones de antibioacuteticos necesarias y
la dilucioacuten y esterilizacioacuten de los diferentes medios de cultivos a utilizar (Tabla
6) asiacute
- Ampicilina concentracioacuten de trabajo de 1 microlml de medio = 100 microgml
- Kanamicina concentracioacuten de trabajo de 4 microlml de medio = 40 microgml
- Medio SOB (307 g100 ml de agua MilliQ) Para el maxicultivo se
emplearon 150 mlplaacutesmido en matraz-erlenmeyer de 500 ml tapados
con torundas de algodoacuten con gasa y para los minicultivos se emplearon
4 mlcolonia
- LB-agar (35 g100 ml de agua milliQ) tras autoclavar el medio fue
llevado al bantildeo a 50 ordmC para disminuir la temperatura e impedir su
solidificacioacuten (~ 45ordmC) Se agregoacute la cantidad especiacutefica de antibioacutetico en
el agar preparado y eacuteste sobre cada placa cubrieacutendola seguidamente
se dejoacute solidificar durante unos minutos Una vez en las placas con su
respectivo antibioacutetico se guardaron para su posterior uso a 4ordmC
MATERIALES Y MEacuteTODOS
107
invertidas para evitar su contaminacioacuten por condensacioacuten y selladas
con parafilm
82 Transformacioacuten de bacterias competentes y cultivo en placas
1 Se descongelaron las bacterias E coli cepa DH5-α en hielo Se mezcloacute
25 ng del plaacutesmido maacutes 20 μl de bacterias
2 Se dejoacute 30 minutos en hielo la mezcla anterior con el tapoacuten del tubo
cerrado
3 Se realizoacute choque teacutermico durante 45 segundos a 42 ordmC
4 Se dejaron los tubos despueacutes del choque teacutermico durante 2 minutos en
hielo
5 Se antildeadieron a cada tubo 180 microl del medio SOC
6 La recuperacioacuten de las bacterias se realizoacute a 37 ordmC durante 1 hora en
agitador a 225 rpm con el tapoacuten de tubos en posicioacuten intermedia para
permitir la oxigenacioacuten En este paso se introdujeron las placas de
cultivo a 37 ordmC en estufa
7 Posteriormente 90 a 200 microl de bacterias fueron sembradas en placa e
incubadas en posicioacuten invertida a 37 ordmC toda la noche
83 Multiplicacioacuten de bacterias
Al segundo diacutea posterior al crecimiento en placas se realizaron los
cultivos para la amplificacioacuten de las bacterias transformadas asiacute
1 Al medio SOB previamente preparado y autoclavado se le agregoacute el
antibioacutetico especiacutefico dependiente de la resistencia transferida por cada
plaacutesmido 4 ml de medio SOB fueron utilizados por colonia y fueron
cultivadas por duplicado
MATERIALES Y MEacuteTODOS
108
2 Se picoacute con palillo previamente autoclavado una coloniatubo que
estuviera separada y con buena apariencia La multiplicacioacuten de
bacterias se llevo a cabo en agitador a 280 rpm y 37 ordmC toda la noche
3 Para el maxicultivo se utilizaron 15 ml de medio provenientes del
minicultivo los cuales fueron agregados a 150 ml del medio SOB
previamente autoclavado al que se le adicionoacute la cantidad requerida y
especiacutefica del antibioacutetico al que el plaacutesmido le confiere resistencia
Todos estos procedimientos anteriormente mencionados se efectuaron bajo la
llama
84 Purificacioacuten del ADN plasmiacutedico
La purificacioacuten de los plaacutesmidos se realizoacute mediante el uso especiacutefico de
kits comerciales para extraccioacuten en bacterias Ecoli Se utilizoacute especialmente el
kit denominado Maxiprep siguiendo las recomendaciones aconsejadas por la
casa comercial (Tabla 6) asiacute
1 Se centrifugoacute durante 10 minutos cada 50 ml del medio SOB del
maxicultivo con las bacterias hasta completar los 150 ml totales y se
eliminoacute el sobrenadante
4 El precipitado final de bacterias fue resuspendido a traveacutes de agitacioacuten
tipo voacutertex en la dilucioacuten de resuspensioacuten + ARNasa a razoacuten de 12ml
por tubo (ARNasa 608 microl12 ml de solucioacuten de resuspensioacuten)
5 Preparacioacuten de la solucioacuten de lavado dos del kit comercial (1 ml de
etanol 95-100 por cada 025 ml de solucioacuten de lavado dos)
6 Las bacterias fueron lisadas al agregarles a cada tubo 12 ml de
solucioacuten de lisis
7 Se realizoacute el neutralizado de lisis agregando a cada tubo 12 ml de
solucioacuten neutralizante previamente atemperada a 4 ordmC
MATERIALES Y MEacuteTODOS
109
8 Tras el paso anterior se agregoacute a cada tubo 9 ml de solucioacuten de unioacuten
Inmediatamente fueron puestos en la jeringa con sus filtros y se dejoacute
asentar durante 5 minutos
9 En falcoacuten nuevo esteacuteril se puso la columna y se agregaron 12 ml de la
solucioacuten de preparacioacuten de columna Se sometioacute a centrifugacioacuten
3000 g durante 2 minutos y se descartoacute el efluente
10 Posteriormente se ubicaron la jeringa sobre la columna y se comprimioacute
suavemente con el eacutembolo para aplicar una presioacuten que permitioacute el
paso del liacutequido aclarado sobre la columna Se llevoacute a centrifugacioacuten
3000 g por 2 minutos y se descartoacute el efluente
11 Se realizoacute el primer lavado al agregar a cada tubo 12 ml de solucioacuten de
lavado uno sobre la columna y se centrifugoacute a 3000 g por 2 minutos se
descartoacute el efluente
12 El segundo lavado se llevo a cabo al agregar a cada tubo 12 ml de
solucioacuten de lavado dos previamente preparado sobre la columna y se
centrifugoacute a 3000 g durante 2 minutos se descartoacute el efluente
13 Por uacuteltimo las columnas fueron transferidas a tubos nuevos para la
coleccioacuten del ADN plasmiacutedico a los que fue agregado 3 ml de solucioacuten
de elucioacuten por columna a continuacioacuten se centrifugoacute a 1000 g durante
5 minutos para obtener la maacutexima concentracioacuten se recobroacute el efluente
y luego se centrifugoacute una segunda vez a 3000 g durante 5 minutos
para obtener el maacutexima volumen de plaacutesmido
La medicioacuten del ADN plasmiacutedico se realizoacute en el instrumento cuantificador
de ADNARN GeneQuant II (PharmaciaBiotech Europe GmbH Sevilla
Espantildea) y el valor de concentracioacuten promedio arrojado fue de 530 ngmicrol y entre
17 - 178 los valores del Ratio
85 Transfeccioacuten transitoria
Para las transfecciones se utilizaron cuatro vectores de expresioacuten de
ADNc (Tabla 9) Tres de ellos codificaban para unas proteiacutenas especiacuteficas
todas unidas a GFP y pertenecientes a la familia de las Rab GTPasas que
MATERIALES Y MEacuteTODOS
110
regulan el traacutefico entre los diferentes compartimentos celulares Otro de los
vectores utilizados codificaba para la sintaxina-5 proteiacutena SNARE que participa
en la mediacioacuten de procesos de fusioacuten de membranas en la viacutea secretora
temprana La concentracioacuten y pureza obtenida de estos plaacutesmidos esta
especificada en la tabla 10
El meacutetodo utilizado de quimiotransfeccioacuten se realizoacute a traveacutes del sistema
de Lipofectaminatrade 2000 y para tal efecto se siguieron las recomendaciones
sugeridas por la casa comercial Para ello las ceacutelulas fueron transfectadas al
cuarto diacutea de tratamiento con una confluencia promedio del 75 y en una
proporcioacuten de Lipofectaminatrade 2000 ADN de 31 respectivamente Despueacutes de
6-8 horas de incubacioacuten con las ceacutelulas se retiraron los complejos de
transfeccioacuten y se antildeadioacute medio fresco a las mismas y en el caso de los
tratamientos la droga se antildeadioacute a las concentraciones de rutina Los
experimentos se realizaron 18-24 horas despueacutes de la expresioacuten proteica
especiacutefica tras lo cual las ceacutelulas fueron fijadas en PFA 4 o metanol
absoluto e inmunomarcadas con anti-GM130 anti-GRASP65 oacute anti-α-
sinucleiacutena
Tabla 10 Concentracioacuten y purificacioacuten de plaacutesmidos
PLAacuteSMIDO CONCENTRACIOacuteN ngmicrol RATIO
Rab1A-GFP 6460 1781
Rab2-GFP 6756 1783
Rab8A-GFP 6950 1799
Rab27A-GFP 3150 1765
Sintaxina5-GFP 3210 1758
MATERIALES Y MEacuteTODOS
111
9 ARNs DE INTERFERENCIA (siRNA)
Tanto el control siRNA (conjugado a fluoresceiacutena) como los siRNA para
Rab1A Rab2A Rab8A y syntaxin-5 (Tabla 9) se transfectaron al cuarto diacutea de
tratamiento con metanfetamina (50 microM) en una concentracioacuten final de 80
pmoles utilizando el sistema del agente de transfeccioacuten Lipofectaminetrade 2000
y siguiendo las instrucciones del fabricante Las ceacutelulas fueron sembradas en
frascos de cultivo de 75 cm2 o en cubreobjetos dependiendo si eran para
teacutecnicas de western blot o inmunocitoquiacutemica respectivamente Fueron
mantenidas hasta el quinto diacutea de tratamiento con la neurotoxina MET donde
fueron lisadas y procesadas para teacutecnicas de western blot ye
inmunocitoquiacutemica Para el anaacutelisis inmunohistoquiacutemico las ceacutelulas en
cubreobjetos de vidrio fueron fijadas y doblemente inmunomarcadas con su
respectivo anti-Rab o anti-sintaxina-5 maacutes un marcador de Golgi o
alternadamente con α-sinucleiacutena
10 MICROSCOPIacuteA ELECTROacuteNICA DE TRANSMISIOacuteN
101 Microscopiacutea convencional
Las ceacutelulas PC12 fueron sembradas en frascos de cultivo de 75 cm2 al
70 de confluencia y mantenidas durante las fases de proliferacioacuten
diferenciacioacuten y tratamiento de acuerdo a las condiciones de rutina Tras un
lavado raacutepido con tampoacuten de PBS previamente atemperado a 37 ordmC fueron
fijadas con glutaraldehiacutedo al 2 en tampoacuten cacodilato 02M durante 2h
Seguidamente se levantaron del interior del frasco en un medio soluble de
PBS-Glicina 002M y gelatina al 1 mediante la ayuda de un rascador de
ceacutelulas Estas muestras fueron centrifugadas y el precipitado celular obtenido
se post-fijoacute con una mezcla de tetraoacutexido de osmio al 2 y ferricianuro potaacutesico
al 3 en una relacioacuten (11) durante 2 horas a 4ordmC Posteriormente las
muestras fueron lavadas en tampoacuten cacodilato 02M y procesadas para su
posterior inclusioacuten en Epon-812 Se contrastaron con acetato de uranilo veronal
MATERIALES Y MEacuteTODOS
112
a 0ordmC durante 1 hora luego se deshidrataron mediante concentraciones
crecientes de etanol durante 10 minutos en cada solucioacuten se bantildearon en
alcohol absoluto y sulfato de cobre 10 minutos en cada uno Tras esto las
muestras fueron tratadas con oacutexido de propileno durante 15 minutos Por
uacuteltimo se incluyeron en una mezcla de Epon y oacutexido de propileno (1 1) durante
1 hora y en la misma mezcla pero en proporcioacuten (21) una hora adicional para
ser incluidas en resina de Epon puro toda la noche y al diacutea siguiente fabricar
los bloques Las secciones ultrafinas 40 a 60 nm fueron cortadas en un
ultramicroacutetomo (Ultracut Reichert Jung) y depositadas en rejillas de cobre que
se contrastaron posteriormente con acetato de uranilo durante 4 minutos y
citrato de plomo durante 1 minuto La observacioacuten de las secciones se realizoacute
en un microscopio de transmisioacuten JEOL 1011 operado a 80 kV y conectado a
caacutemara CCD Gatan BioScan 792 oacute en el microscopio Philips Tecnai 12
acoplado a caacutemara MegaView III propiedad del Servicio de Microscopiacutea de la
Universidad de Murcia
102 Crioultramicroscopiacutea
Las ceacutelulas fueron fijadas con una mezcla de paraformaldehido al 2 y
glutaraldehido al 02 diluidos en tampoacuten fosfato 01M y pH 74 durante 2h
Tras lavar suavemente con PBS las ceacutelulas fueron levantadas en un medio
soluble de PBS-Glicina 002M y gelatina al 1 mediante la ayuda de un
rascador El precipitado de ceacutelulas obtenido mediante centrifugacioacuten se incluyoacute
en una solucioacuten acuosa de gelatina al 10 que se enfrioacute a 4ordmC durante un
periodo de 30 minutos a 1 hora para que la gelatina se solidificara Con la
ayuda de un bisturiacute y bajo la lupa se cortoacute el precipitado de ceacutelulas hasta
obtener bloques de 1 mm3 aproximadamente Estos bloques se embebieron en
una solucioacuten de sacarosa 23 M al menos durante 2 horas a 4 ordmC Finalmente
los bloques se montaron sobre portamuestras (pins) especiales y se
congelaron en nitroacutegeno liacutequido donde permanecen almacenados hasta que
fueron cortados en un crioultramicroacutetomo (Leica Ultracut TFCS) a -120 ordmC con
cuchilla de diamante (Druker) Se obtuvieron cortes ultrafinos de
MATERIALES Y MEacuteTODOS
113
aproximadamente 50 nm El procedimiento para recogerlas se realizoacute con un
asa impregnada en una mezcla 11 de metilcelulosa 2 y sacarosa 23 M
siguiendo las recomendaciones descritas por Liou et al 1996 Las
criosecciones fueron depositadas sobre rejillas de cobre recubiertas con una
peliacutecula de formvar y carboacuten (Carbon Coater CC7650)
103 Crioinmunocitoquiacutemica
Para la inmunolocalizacioacuten ultraestructural de ciertas proteiacutenas
involucradas en el traacutefico intracelular las criosecciones se procesaron para
teacutecnicas inmunocitoquiacutemicas de dos o tres capas seguacuten el anticuerpo primario
fuera policlonal o monoclonal respectivamente Inicialmente las rejillas se
trataron con PBS-Glicina 002 M durante 5 minutos Tras bloquear los posibles
puntos de unioacuten inespeciacutefica del anticuerpo con PBS-BSA 01 durante 5
minutos se incubaron las muestras con el anticuerpo primario durante 30
minutos Los anticuerpos fueron diluidos a la concentracioacuten de trabajo en una
solucioacuten de BSA-acetilada 01 y glicina 002 M en PBS Tras esta
incubacioacuten las muestras fueron lavadas 3 veces en PBS y se volvieron a
incubar 5 minutos con PBS-BSA 01 Seguidamente se incubaron con la
proteiacutena A-oro (10 nm) durante 20 minutos En el caso de las teacutecnicas de tres
capas previo a la proteiacutena A-oro se incuboacute con un anticuerpo secundario
conejo anti-ratoacuten Tras lavar las muestras exhaustivamente con PBS se
trataron con glutaraldehido al 1 durante 5 minutos Posteriormente se
lavaron las muestras en agua durante 20 minutos y finalmente las secciones
fueron contrastadas con acetato de uranilo a pH 70 y protegidas con una
peliacutecula de metilcelulosa y acetato de uranilo a pH 40 (91) (Slot et al 1991
Martiacutenez-Menaacuterguez et al 1999)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
114
11 ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se aplicoacute la prueba parameacutetrica del test t de Student asiacute como la de
ANOVA (analysis of variance) para el estudio comparativo entre diferentes
grupos En general para todas las pruebas se utilizaron valores de Plt005 para
determinar la significatividad estadiacutestica
RESULTADOS
117
VI RESULTADOS
Como se ha descrito en apartados anteriores la liacutenea celular PC12
representa un modelo vaacutelido para el estudio de enfermedades
neurodegenerativas (Malagelada y Greene 2008) Con el fin de reproducir lo
maacutes cercanamente posible las alteraciones del traacutefico celular que puedan
ocurrir de forma natural en la EP nos hemos valido de una de las propiedades
de estas ceacutelulas su capacidad de respuesta al estiacutemulo del factor de
crecimiento nervioso Este desencadena una cascada de eventos que se
reflejan en mecanismos especiacuteficos de diferenciacioacuten celular permitieacutendole a
estas ceacutelulas adoptar muchas de las caracteriacutesticas que definen a las neuronas
adreneacutergicas del sistema nervioso autoacutenomo simpaacutetico Asimismo en su
estado de diferenciacioacuten neuronal las ceacutelulas PC12 adquieren propiedades
relevantes que se asimilan a las de las neuronas dopamineacutergicas del sistema
nervioso central incluyendo la produccioacuten y liberacioacuten de dopamina como su
principal catecolamina (Fornai et al 2007) Ademaacutes como neuronas las
ceacutelulas PC12 incrementan su capacidad endoacutegena de expresioacuten de αs (Larsen
et al 2006) cualidad inherente que hemos aprovechado para poder relacionar
los dantildeos en el traacutefico intracelular con la sobreexpresioacuten yo agregacioacuten de esta
proteiacutena
RESULTADOS
118
1 MECANISMOS DE NEUROTOXICIDAD
En el presente estudio se utilizoacute la capacidad neurotoacutexica que poseen las
sustancias 6-OHDA y MET con el propoacutesito de mimetizar los rasgos citopaacuteticos
de la EP
Debido a las similitudes con la dopamina la toxina 6-OHDA se acumula
en el citoplasma promoviendo la generacioacuten de altos niveles de radicales libres
con gran contenido de H2O2 (Blandini et al 2008) En los ensayos preliminares
la muerte celular masiva inducida por esta neurotoxina nos impidioacute realizar
ensayos croacutenicos pero la administracioacuten de catalasa murina al medio de cultivo
nos permitioacute aumentar la supervivencia celular al anular en grado variable los
efectos citotoacutexicos del peroacutexido de hidroacutegeno (Saito et al 2007) Al remontar
este obstaacuteculo se nos posibilitoacute el desarrollo de experimentos en periodos
prolongados de tiempo hasta de 8 diacuteas
La administracioacuten de MET al medio de cultivo induce un incremento en la
concentracioacuten de dopamina libre en citosol la cual a su vez puede generar un
desequilibrio de la capacidad celular para responder al ataque de radicales
libres Ademaacutes el aumento de los niveles de dopamina citosoacutelica incrementa
las probabilidades de esta amina bioacutegena para acoplarse a la forma protofibrilar
de la proteiacutena αs lo cual promueve la formacioacuten de inclusiones intracelulares
(Lazzeri et al 2007)
2 CAMBIOS EN LA DISTRIBUCIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA α-SINUCLEIacuteNA
Para identificar los posibles cambios que pudiera sufrir la proteiacutena αs
monitorizamos los efectos de ambas neurotoxinas en su distribucioacuten En las
ceacutelulas no tratadas esta proteiacutena fue localizada en pequentildeos puntos
distribuidos de forma difusa por todo el citoplasma incluyendo las
proyecciones neuriacuteticas de las ceacutelulas PC12 diferenciadas (Figura 8A B)
RESULTADOS
119
Como hemos indicado anteriormente en los ensayos realizados con la
neurotoxina 6-OHDA se utilizoacute catalasa murina la cual fue agregada al medio
de cultivo desde el comienzo de la fase de diferenciacioacuten tanto para las ceacutelulas
control como en las tratadas Seguacuten lo esperado no se encontroacute alteracioacuten en
el patroacuten de distribucioacuten de la proteiacutena αs en ceacutelulas control a las cuales se les
agregoacute 20 unidades de catalasa murina (Figura 8A)
Tras cuatro diacuteas de tratamiento se empezaron a observar grandes
agregados citoplasmaacuteticos aunque teniacutean una menor intensidad de
inmunomarcaje fluorescente comparados con aquellos presentes en ceacutelulas
tratadas por 5 oacute maacutes diacuteas Al quinto diacutea de incubacioacuten con las neurotoxinas 6-
OHDA o MET se indujo la formacioacuten de inclusiones yuxtanucleares compactas
(Figura 9A B) este efecto toacutexico se observoacute en ~30 de la poblacioacuten celular
tratada (Figura 10) Tanto para el tratamiento con 6-OHDA como para el de
MET el nuacutemero de ceacutelulas que presentaban inclusiones intracelulares no
aumentoacute despueacutes de periacuteodos maacutes prolongados de exposicioacuten a estas
neurotoxinas
Tambieacuten pudimos observar que en ambos tratamientos un elevado
nuacutemero de ceacutelulas presentoacute agregados en las terminales neuriacuteticas
(correspondiente a una terminal axoacutenica) los cuales podiacutean estar o no
acompantildeados de una gran inclusioacuten yuxtanuclear (Figura 11A B) Estos
hallazgos estaacuten acorde con los datos descritos en la literatura (Kawahara et al
2008) donde refieren la formacioacuten de oligoacutemeros de la proteiacutena α -sinucleiacutena y
sus forma protofibrilares como las precursores de lesioacuten retrograda con
posterior agregacioacuten de αs filamentosa inc luyendo el desarrollo de neuritas de
Lewy
Por motivos teacutecnicos no se realizoacute el estudio cuantitativo de las
inclusiones anaacutelogas a los neuritas de Lewy dado que la manipulacioacuten de
estas ceacutelulas durante las fases de diferenciacioacuten y tratamiento fijacioacuten y
marcaje producen el desenganche de las ramificaciones con su posterior
ruptura lo que deja visible solo pocas ceacutelulas con estas caracteriacutesticas para su
evaluacioacuten
RESULTADOS
120
En una manera dependiente del tiempo ambos tratamientos indujeron la
formacioacuten de inclusiones intracelulares similares en aspecto cuando las ceacutelulas
fueron inmunomarcadas para la proteiacutena α-sinucleiacutena A nuestro conocimiento
(ver tambieacuten Schober et al 2004) esta es la primera descripcioacuten de
inclusiones intracelulares en ceacutelulas neuronales PC12 tratadas con 6-OHDA
probablemente debido a la utilizacioacuten de catalasa que permitioacute realizar ensayos
en periacuteodos maacutes prolongados Interesantemente el momento de inicio de
formacioacuten de inclusiones y el porcentaje de ceacutelulas afectadas que mostraron
este fenoacutemeno fueron muy similares para ambas neurotoxinas a los cinco diacuteas
de tratamiento (Figura 10) En ambos casos las inclusiones reaccionaron al
inmunomarcaje contra la proteiacutena α s proteiacutenas del citoesqueleto y proteiacutenas
motoras asociadas al citoesqueleto (ver apartado 6) indicando ciertas
similitudes con los cuerpos de Lewy los cuales se encuentran presentes de
forma natural en la EP Asimismo a nivel ultraestructural estas inclusiones
fueron ocupadas por un fino material granular y rodeadas por numerosos
lisosomas (Figura 12)
RESULTADOS
121
Figura 8 Distribucioacuten de la proteiacutena α -sinucleiacutena en ceacutelulas control de tratamientos con 6-OHDA (A) y MET (B) (A) Esta proteiacutena muestra un patroacuten de
distribucioacuten punteado difuso por todo el citoplasma que no se modificoacute tras antildeadir 20
unidades de catalasa murina al compararla con la figura B Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
122
Figura 9 Cambios en la distribucioacuten de la proteiacutena α-sinucleiacutena en ceacutelulas PC12 expuestas durante 5 diacuteas a la accioacuten neurotoacutexica (A) Tratamiento con 6-OHDA +
20U de catalasa Se observa la formacioacuten de grandes agregados yuxtanucleares de
alta intensidad fluorescente (B) Tratamiento con MET Se aprecia la similitud de rasgos
entre tratamientos donde la distribucioacuten de αs estaacute claramente afectada agregaacutendose
en una regioacuten compacta adyacente al nuacutecleo Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
123
Figura 10 Anaacutelisis cuantitativo de la aparicioacuten de inclusiones en el tiempo Se
puede apreciar que al cuarto diacutea de tratamiento con 6-OHDA o MET se hace patente
la aparicioacuten de agregados inmunomarcados para la proteiacutena α s aunque el porcentaje
de ceacutelulas con inclusiones es significativamente mayor en el tratamiento con 6-OHDA
Sin embargo no se hallaron diferencias significativas entre ambos tratamientos en el
quinto diacutea El asterisco indica que las diferencias son significativas (ANOVA p lt 005)
0
10
20
30
40
DIacuteAS 1 2 3 4 5
6-OHDA MET
RESULTADOS
124
Figura 11 Cambios en la distribucioacuten de la proteiacutena α-sinucleiacutena en ceacutelulas PC12 tratadas durante 5 diacuteas bajo la accioacuten neurotoacutexica de ambas sustancias (A)
Tratamiento con 6-OHDA + 20U de catalasa Se mantiene el patroacuten tiacutepico de punteado
difuso en el soma neuronal sin embargo a nivel de la terminal nerviosa se observa αs
de forma agregada extendieacutendose a lo largo de la proyeccioacuten axonal (B) Tratamiento
con MET Esta imagen muestra grandes similitudes con los cambios observados en la
distribucioacuten de αs para el tratamiento con 6 -OHDA En este caso se puede ver la
presencia de ambos tipos de inclusiones Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
125
Figura 12 Ultraestructura de ceacutelulas PC12 como modelo de enfermedad de Parkinson Se muestra despueacutes de 5 diacuteas de tratamiento con MET una gran inclusioacuten
yuxtanuclear (asterisco) N = nuacutecleo Barra de calibrado 02 microm
RESULTADOS
126
3 ESTUDIO DE VIABILIDAD CELULAR
Apoyados en los hallazgos obtenidos de los ensayos efectuados en un
periodo de 8 diacuteas de tratamiento con ambas neurotoxinas concluimos que 5
diacuteas correspondiacutea al tiempo ideal para realizar todos los experimentos periodo
en el cual se produjo el mayor nuacutemero de ceacutelulas con inclusiones intracelulares
mientras que tratamientos maacutes prolongados no aumentaban la tasa de
agregacioacuten Adicionalmente observamos que despueacutes de 6 diacuteas de tratamiento
con 6-OHDA o MET se comprometiacutea seriamente la viabilidad celular
apareciendo un nivel progresivo de muerte celular con caracteriacutesticas
necroacuteticas
Ceacutelulas PC12 en su estado neuronal (ceacutelulas diferenciadas) fueron
tratadas con diferentes concentraciones y tiempo de exposicioacuten con las
neurotoxinas 6-OHDA y MET a fin de inducir un fenotipo de EP (es decir
sobreexpresioacuten y agregacioacuten de la proteiacutena α -sinucleiacutena con formacioacuten de
inclusiones citoplasmaacuteticas) sin comprometer la viabilidad celular Bajo las
condiciones de trabajo previamente establecidas las ceacutelulas mostraron una
morfologiacutea sin signos de muerte celular por apoptosis o necrosis incluso
despueacutes del tratamiento croacutenico llevado a cabo durante cinco o maacutes diacuteas (ver
apartado 4) Estas observaciones fueron confirmadas por el estudio de
viabilidad realizado a traveacutes del inmunomarcaje para caspasa 3 activa donde
el nuacutemero de ceacutelulas que sufrieron muerte por apoptosis presentoacute valores muy
bajos (menos de 01) en el periacuteodo de estudio
4 FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI
Para realizar un estudio detallado de los cambios en la arquitectura del
AG en ceacutelulas PC12 sometidas al tratamiento con las neurotoxinas 6-OHDA y
MET inicialmente realizamos un anaacutelisis morfoloacutegico mediante teacutecnicas de
inmunofluorescencia Ambas toxinas indujeron la fragmentacioacuten del AG
RESULTADOS
127
raacutepidamente proceso que fue progresando draacutesticamente en funcioacuten del
tiempo (Tabla 11) Asiacute tras cinco diacuteas de tratamiento maacutes del 80 de las
ceacutelulas mostraron un complejo de Golgi alterado De nuevo el patroacuten de
alteracioacuten fue similar para ambas toxinas aunque la fragmentacioacuten del AG
comenzoacute antes en las ceacutelulas tratadas con MET (Tabla 11)
Para comprobar la fragmentacioacuten del AG utilizamos una bateriacutea de
anticuerpos contra marcadores especiacuteficos del AG como son enzimas de
glicosilacioacuten proteiacutenas de matriz proteiacutenas SNARE proteiacutenas Rab GTPasas
entre otras confirmando que esta fragmentacioacuten afecta a todas las cisternas de
este orgaacutenulo aunque menos dramaacutetico a nivel del TGN (Figura 13) No
observamos modificaciones en la distribucioacuten (deslocalizacioacuten) de estas
proteiacutenas Asimismo el anaacutelisis morfoloacutegico mediante inmunofluorescencia de
las proteiacutenas seleccionadas no mostroacute indicios de agregacioacuten citoplasmaacutetica
A nivel ultraestructural los complejos de Golgi de ceacutelulas PC12 no
tratadas mostraron una morfologiacutea tiacutepica es decir cisternas apiladas rodeadas
por elementos tubulovesiculares (Figura 14A) El AG de ceacutelulas tratadas
tambieacuten presenta esta morfologiacutea (Figura 14B) demostrando que la
fragmentacioacuten del AG no es consecuencia de la muerte inducida por apoptosis
A diferencia de los dictiosomas que se observaron en las ceacutelulas control
en las ceacutelulas tratadas estos apilamientos presentaban una reduccioacuten
significativa en la longitud de las cisternas formando lo que se denominan
minidictiosomas (ldquoministacksrdquo) (Figura 14B) El patroacuten general de la morfologiacutea
del aparato de Golgi en ceacutelulas tratadas con ambas neurotoxinas fue similar a
minidictiosomas como aquellos descritos despueacutes de la despolimerizacioacuten de
microtuacutebulos mediante la droga nocodazole (Storrie et al 1998) Igualmente la
distribucioacuten de estos minidictiosomas presentoacute un patroacuten disperso ocupando
en citoplasma aproximadamente el doble o el triple del aacuterea de un complejo de
Golgi normal Tambieacuten observamos en un porcentaje bajo de ceacutelulas tratadas
que los dictiosomas estaban dispersos por el citoplasma
Mediante teacutecnicas de crioinmunocitoquiacutemica para microscopiacutea
electroacutenica observamos que el inmunomarcaje contra GM130 estaba
RESULTADOS
128
restringido a la cara cis del AG en ceacutelulas tratadas confirmando que la
polarizacioacuten de estos minidictiosomas no se habiacutea alterado por el tratamiento
(Figura 15) Estos hallazgos permanecieron en coherencia con estudios
previos donde se demuestra que la fragmentacioacuten del AG debido al ataque de
formas alteradas de la proteiacutena αs no induce cambios en la polaridad cis-trans
de este orgaacutenulo (Gosave et al 2002)
Diacuteas de Tratamiento
FRAGMENTACIOacuteN DEL GOLGI
6-OHDA MET
1 0 140 plusmn 07
2 20 plusmn 06 300 plusmn 04
3 110 plusmn 13 405 plusmn 05
4 620 plusmn 19 725 plusmn 03
5 830 plusmn 22 825 plusmn 06
Tabla 11 Anaacutelisis de la cineacutetica de fragmentacioacuten del complejo de Golgi en el presente modelo celular de enfermedad de Parkinson Valoracioacuten de la morfologiacutea
del AG realizado por inmunofluorescencia utilizando GM130 como marcador La
fragmentacioacuten del AG sucede maacutes tempranamente bajo el tratamiento con MET Sin
embargo no se presentan diferencias significativas entre neurotoxinas despueacutes del
cuarto diacutea de exposicioacuten Los datos representan el porcentaje (media plusmn SEM) de las
ceacutelulas con AG fragmentados Se contaron al menos 300 ceacutelulas para cada tiempo y
tratamiento
RESULTADOS
129
Figura 13 Anaacutelisis comparado de la morfologiacutea del Golgi entre ceacutelulas control y tratadas durante 5 diacuteas con las neurotoxinas 6-OHDA o MET Las ceacutelulas fueron
inmunomarcadas para GM130 GRASP65 manosidasa II GS28 β-COP p115 p58
Rab1 GS15 sintaxina 6 KDELr y TGN38 Se muestran los cambios en la distribucioacuten
tiacutepica compacta del AG donde el patroacuten de fragmentacioacuten prevalece en ambos
tratamientos KDELr se observa disperso con distribucioacuten homogeacutenea por todo el
citoplasma en ambos tratamientos Los cambios para el inmunomarcaje contra la
proteiacutena TGN38 son menos dramaacuteticos si se comparan con los demaacutes marcajes
Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
130
Figura 13 Continuacioacuten
RESULTADOS
131
Figura 13 Continuacioacuten
RESULTADOS
132
Figura 13 Continuacioacuten
RESULTADOS
133
Figura 13 Continuacioacuten
RESULTADOS
134
Figura 13 Continuacioacuten
RESULTADOS
135
Figura 14 Ultraestructura de ceacutelulas PC12 como modelo de enfermedad de Parkinson (A) Ceacutelulas control donde el complejo de Golgi muestra el tiacutepico
apilamiento de cisternas (B) ceacutelulas tratadas con MET durante 5 diacuteas En neuronas
PC12 tratadas el AG es mucho maacutes pequentildeo formando minidictiosomas en
comparacioacuten a las ceacutelulas control G = complejo de Golgi N = nuacutecleo Barra de
calibrado 02 microm
RESULTADOS
136
Figura 15 Crioinmunocitoquiacutemica ultraestructural de ceacutelulas PC12 tratadas con metanfetamina como modelo de enfermedad de Parkinson Se observa como el
marcador de la cara cis del Golgi GM130 estaacute restringido a un lado del
minidictiosoma G = complejo de Golgi N = nuacutecleo Barra de calibrado 02 microm
RESULTADOS
137
5 RELACIOacuteN ENTRE LA FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI Y FORMACIOacuteN DE AGREGADOS
Seguidamente analizamos la relacioacuten entre la fragmentacioacuten del AG y la
formacioacuten de inclusiones inmunoreactivas para la proteiacutena α s Como puede
verse en la figura 16 la aparicioacuten del AG fragmentado precedioacute a la formacioacuten
de inclusiones intracelulares Los hallazgos encontrados en este estudio
confirman investigaciones previas (Gosavi et al 2002) Sin embargo en
contraste con este estudio hemos encontramos que el 100 de las ceacutelulas que
conteniacutean inclusiones mostraban un AG fragmentado (Figura 16 y 17)
A diferencia de los hallazgos descritos en el estudio llevado a cabo en
ceacutelulas de rintildeoacuten (COS-7) (Gosavi et al 2002) no observamos agregados
prefibrilares de la proteiacutena αs con ninguno de los dos tratamientos Los
experimentos de doble inmunomarcaje mostraron claramente que las
inclusiones ricas en α-sinucleiacutena aparecieron rodeadas por fragmentos del
complejo de Golgi (Figura 17) Esto fue especialmente evidente tras la
reconstruccioacuten tridimensional de las imaacutegenes de microscopiacutea confocal
mediante deconvolucioacuten (Figura 18)
Asiacute pues nuestros resultados indican que la formacioacuten de inclusiones se
produce dentro del aacuterea del AG probablemente debido a que tanto la
localizacioacuten de este orgaacutenulo como la posicioacuten de las inclusiones son
dependientes del centrosoma (ver discusioacuten)
RESULTADOS
138
Figura 16 Anaacutelisis cuantitativo de los efectos neurotoacutexicos de 6-OHDA y MET a lo largo del tiempo Los datos estaacuten expresados como el porcentaje (plusmn SEM) de las
ceacutelulas que exhiben fragmentacioacuten del complejo de Golgi o formacioacuten de inclusiones
intracelulares inmunoreactivas para α-sinucleiacutena 300 ceacutelulas fueron contadas por
ensayo de toxina especiacutefica en cada diacutea de tratamiento
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
DIacuteAS 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
GOLGI FRAGMENTADO INCLUSIONES
RESULTADOS
139
Figura 17 Evaluacioacuten morfoloacutegica de la relacioacuten entre la fragmentacioacuten del AG y la formacioacuten de inclusiones intracelulares Ceacutelulas neuronales PC12 tratadas
durante 5 diacuteas con las neurotoxinas 6-OHDA o MET Las ceacutelulas fueron doblemente
inmunomarcadas para GM130 (rojo) y αs (verde) Ambos tratamientos indujeron la
formacioacuten de inclusiones yuxtanucleares y fragmentacioacuten del AG El AG presentoacute
modificaciones en su patroacuten tiacutepico perinuclear pasando de una estructura compacta a
estar organizada por pequentildeos fragmentos dispersos alrededor de las inclusiones
Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
140
Figura 18 Reconstruccioacuten en tres dimensiones (3D) del complejo de Golgi e inclusiones intracelulares mediante la teacutecnica de deconvolucioacuten a partir de imaacutegenes obtenidas por microscopiacutea confocal El AG fue inmunomarcado contra GM130 (rojo) y las inclusiones contra la proteiacutena α -sinucleiacutena (verde) Las imaacutegenes del doble inmunomarcaje muestran que el AG en ceacutelulas tratadas con MET estaacute compuesto de muacuteltiples fragmentos distribuidos alrededor de una gran inclusioacuten citoplasmaacutetica En la figura inferior se observa una ceacutelula sin alteracioacuten (flecha) con el AG intacto y muacuteltiples fracciones de la proteiacutena α -sinucleiacutena distribuidas por todo lo que seriacutea el citoplasma Al contrario las ceacutelulas con presencia de agregados muestran alteracioacuten en la distribucioacuten de la proteiacutena α -sinucleiacutena donde disminuye considerablemente su presencia punteada en citoplasma (cabeza de flecha)
RESULTADOS
141
6 MECANISMOS DE FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI
Hay muchas alteraciones que pueden inducir la fragmentacioacuten del AG
(revisado por Mironov y Beznoussenko 2011) Se ha postulado que la
alteracioacuten del citoesqueleto de microtuacutebulos y el desequilibrio entre el
transporte anteroacutegrado y retroacutegrado son posibles causas de este fenoacutemeno en
los modelos de la EP En primer lugar analizamos por inmunofluorescencia la
apariencia de la red de microtuacutebulos en las ceacutelulas tratadas con las
neurotoxinas 6-OHDA y MET en un periodo de 1 a 5 diacuteas Hasta la formacioacuten
de grandes inclusiones al cuarto diacutea de tratamiento (4 ordm diacutea) el citoesqueleto
aparentemente permanecioacute intacto (Figuras 19 y 20) Lo mismo pasoacute tambieacuten
para microtuacutebulos estables (Figura 21) Los datos bioquiacutemicos tambieacuten
mostraron que la agregacioacuten de la proteiacutena α-tubulina se produce en etapas
posteriores (ver maacutes adelante)
Las inclusiones intracelulares inmunoreactivas para la proteiacutena α s
tambieacuten reaccionaron con anticuerpos contra α -tubulina El tratamiento durante
5 diacuteas con ambas neurotoxinas produjeron las mismas caracteriacutesticas En las
ceacutelulas tratadas se observoacute un gran agregado yuxtanuclear mostrando el resto
del citoplasma una menor intensidad de marcaje lo cual indica que la
distribucioacuten de α -tubulina se afecta en alto grado (Figura 19) Ademaacutes la
morfologiacutea externa de un alto porcentaje de ceacutelulas que presentaban
inclusiones citoplasmaacuteticas se tornoacute de un aspecto redondeado perdiendo asiacute
las caracteriacutesticas arquitectoacutenicas de las ceacutelulas PC12 en su estado neuronal
(Figuras 9 17 19 y 20)
Tambieacuten realizamos un estudio morfoloacutegico del patroacuten de distribucioacuten de
la proteiacutena β -tubulina en ceacutelulas PC12 con diferenciacioacuten neuronal bajo
tratamiento con ambas neurotoxinas Al igual de lo que ocurre con las proteiacutenas
αs y α-tubulina β-tubulina se agrega siendo el inmunomarcaje menos intenso
por fuera del espacio de agregacioacuten yuxtanuclear (Figura 20) lo que puede
estar indicando que un nivel significativo de la proteiacutena sintetizada estaacute siendo
secuestrada por alguacuten mecanismo en el aacuterea que corresponde al centrosoma
RESULTADOS
142
lo que dejariacutea menos cantidad de proteiacutena para dar lugar a la organizacioacuten de
la red de microtuacutebulos
Asimismo realizamos ensayos de doble inmunomarcaje para las
proteiacutenas del citoesqueleto de microtuacutebulos y αs con el fin de evaluar la posible
colocalizacioacuten en los agregados Como era de esperar estas proteiacutenas estaban
presentes en la misma localizacioacuten yuxtanuclear (Figuras 22 y 23)
Adicionalmente en el estudio de proteiacutenas asociadas al citoesqueleto
encontramos que las proteiacutenas motoras kinesina de cadena pesada y dineiacutena
de cadena pesada tambieacuten se agregaban (Figura 24) pero no asiacute con kinesina
y dineiacutena de cadena ligera Ademaacutes realizamos ensayos de doble
inmunomarcaje para estas proteiacutenas y αs con el propoacutesito de evaluar su
posible colocalizacioacuten en los agregados Igual que para las proteiacutenas del
citoesqueleto de microtuacutebulos estas tambieacuten estaban presentes en la misma
localizacioacuten yuxtanuclear (Figura 25)
Dado que la fragmentacioacuten del AG comenzoacute tan pronto como el primer
diacutea parece muy poco probable que la formacioacuten de minidictiosomas se deba a
una alteracioacuten sobre el sistema del citoesqueleto
RESULTADOS
143
Figura 19 Efectos del tratamiento neurotoacutexico sobre el citoesqueleto de microtuacutebulos Imaacutegenes de inmunofluorescencia representativas de la distribucioacuten de
la proteiacutena α-tubulina en ceacutelulas control y ceacutelulas tratadas durante 3 y 5 diacuteas No se
observan diferencias en la distribucioacuten de α-tubulina a los tres diacuteas de tratamiento con
las neurotoxinas Sin embargo despueacutes de cinco diacuteas de tratamiento los
componentes microtubulares se concentran en una gran inclusioacuten yuxtanuclear Barra
de calibrado 25 microm
RESULTADOS
144
Figura 20 Efectos del tratamiento neurotoacutexico sobre el citoesqueleto de microtuacutebulos Las imaacutegenes de inmunofluorescencia muestran la distribucioacuten de la
proteiacutena β-tubulina en ceacutelulas control y ceacutelulas tratadas con MET durante 5 diacuteas Se
observan diferencias en la distribucioacuten de β -tubulina a los 5 diacuteas de tratamiento con
MET donde al igual de lo que ocurre con α-tubulina aparece agregada en un aacuterea
limitada al espacio yuxtanuclear Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
145
Figura 21 Efectos del tratamiento neurotoacutexico sobre el citoesqueleto estable de microtuacutebulos Imaacutegenes de inmunofluorescencia que muestran la distribucioacuten de la
proteiacutena α-tubulina acetilada en ceacutelulas control y ceacutelulas tratadas durante 3 y 5 diacuteas
No se observan diferencias en la distribucioacuten de α-tubulina acetilada a los tres diacuteas de
tratamiento En el quinto diacutea de tratamiento se incrementa la compactacioacuten de esta
proteiacutena del citoesqueleto en la regioacuten perinuclear Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
146
Figura 22 Distribucioacuten comparada de las proteiacutenas del citoesqueleto de microtuacutebulos y α -sinucleiacutena Las imaacutegenes del doble inmunomarcaje muestran la
distribucioacuten de las proteiacutenas αs (verde) y α -tubulina (rojo) en ceacutelulas control y ceacutelulas
tratadas durante 5 diacuteas con MET Es evidente el cambio en la distribucioacuten de ambas
proteiacutenas al quinto diacutea de tratamiento donde ambas proteiacutenas colocalizan en la
formacioacuten de agregados yuxtanucleares Se observa como en una de las ceacutelulas
inmunoreactiva para la proteiacutena α s (flecha) se estaacute iniciando la formacioacuten de un
agregado el cual no muestra auacuten evidencias de agregacioacuten de proteiacutenas del
citoesqueleto Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
147
Figura 23 Distribucioacuten comparada de las proteiacutenas del citoesqueleto de microtuacutebulos y α -sinucleiacutena Las imaacutegenes del doble inmunomarcaje muestran la
distribucioacuten de las proteiacutenas α s (verde) y β-tubulina (rojo) en ceacutelulas control y ceacutelulas
tratadas durante 5 diacuteas con MET Se muestra el cambio en la distribucioacuten de ambas
proteiacutenas al quinto diacutea de tratamiento donde ambas proteiacutenas colocalizan en
agregados yuxtanucleares Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
148
Figura 24 Efectos del tratamiento neurotoacutexico sobre proteiacutenas motoras asociadas al citoesqueleto Las imaacutegenes de inmunofluorescencia muestran la
distribucioacuten de las proteiacutenas dineiacutena de cadena pesada (DHC) kinesina de cadena
pesada (KHC) y kinesina de cadena ligera (KLC) en ceacutelulas control y ceacutelulas tratadas
durante 5 diacuteas con MET Las proteiacutenas DHC y KHC aparecen formando agregados
yuxtanucleres Sin embargo despueacutes de cinco diacuteas de tratamiento no se observan
diferencias en la distribucioacuten de KLC Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
149
Figura 25 Distribucioacuten comparada de las proteiacutenas motoras asociadas al citoesqueleto y α-sinucleiacutena Las imaacutegenes del doble inmunomarcaje muestran la
distribucioacuten de las proteiacutenas α -sinucleiacutena (verde) y KHC (rojo) en ceacutelulas control y
ceacutelulas tratadas durante 5 diacuteas con MET La imagen inferior donde se muestra la
mezcla de ambos inmunomarcajes hace visible el hecho de que tanto αs como KHC
colocalizan en la gran inclusioacuten que se ha formado adyacente al nuacutecleo Veacutease
ademaacutes el cambio en la morfologiacutea externa de la ceacutelula donde ese aspecto de
contorno redondeado como reflejo del efecto citopaacutetico de MET no afectoacute la
continuidad de las proyecciones celulares Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
150
7 ESTUDIO DE LA ALTERACIOacuteN DEL TRANSPORTE INTRACELULAR
A continuacioacuten exploramos una segunda hipoacutetesis donde se postula que
la alteracioacuten del traacutefico induce la fragmentacioacuten del AG De acuerdo con este
argumento analizamos la cineacutetica del transporte en las viacuteas secretoras
tempranas despueacutes de tres y cinco diacuteas de tratamiento con la neurotoxina
MET Hemos seleccionado estos tiempos porque a los tres diacuteas de tratamiento
se generoacute fragmentacioacuten del AG pero no inclusiones mientras que a los cinco
diacuteas se desarrollo fragmentacioacuten extensa del AG y se formaron agregados
intracelulares De este modo podriacuteamos analizar estos fenoacutemenos de forma
independiente
El ensayo del transporte retroacutegrado el cual se evaluacutea despueacutes de agregar
al medio de cultivo BFA fue monitorizado a traveacutes de la aparicioacuten de la enzima
del AG manosidasa II en retiacuteculo endoplaacutesmico Es bien sabido que esta droga
induce la fusioacuten del AG en el RE un fenoacutemeno que se cree es representativo
del traacutefico retroacutegrado entre estos compartimentos (Klausner et al 1992)
Tambieacuten estudiamos el reensamblaje del AG despueacutes del lavado de BFA
como indicativo del transporte anteroacutegrado Con el propoacutesito de analizar el
transporte anteroacutegrado las ceacutelulas neuronales PC12 fueron incubadas con
BFA durante 40 minutos posteriormente la droga fue retirada al lavar y cultivar
las ceacutelulas en medio fresco punto desde el cual se realizoacute de forma seriada en
el tiempo la fijacioacuten e inmunomarcaje para manosidasa II En ambos casos las
ceacutelulas neuronales PC12 fueron tratadas con 1 μgml de BFA La droga se
utilizoacute al final de los periodos de tratamiento con MET los cuales fueron
realizados al tercer y quinto diacutea de exposicioacuten a la neurotoxina Tras la fijacioacuten
las ceacutelulas fueron inmunomarcadas doblemente para las proteiacutenas del AG
GM130 y manosidasa II
El anaacutelisis del tiempo transcurrido desde la aparicioacuten de la enzima del AG
en el RE (transporte retroacutegrado) y reensamblaje del AG (transporte
anteroacutegrado) en las ceacutelulas control y tratadas durante 3 diacuteas con
metanfetaminas demostroacute que el transporte no estaacute alterado bajo esta
RESULTADOS
151
condicioacuten (Figuras 26 27 y 28A) Asiacute los valores obtenidos en cada punto
especiacutefico de tiempo fueron muy similares entre ceacutelulas control y tratadas (el
40 de las ceacutelulas tratadas habiacutea fragmentado el complejo de Golgi para este
momento figura 16) Estos datos demuestran que tras 3 diacuteas de tratamiento ni
el transporte retroacutegrado ni el anteroacutegrado estaacuten alterados Dado que la
fragmentacioacuten del AG ocurre desde el primer diacutea de tratamiento con la
neurotoxina nuestros resultados indican que esta fragmentacioacuten no se debe al
efecto directo de alteraciones importantes en el transporte entre el RE-Golgi
Al contrario de lo ocurrido en los ensayos del transporte retroacutegrado a 3
diacuteas de exposicioacuten a la neurotoxina la cineacutetica del transporte despueacutes de cinco
diacuteas presentoacute marcadas alteraciones El transporte retroacutegrado resultoacute
significativamente retrasado en ceacutelulas tratadas durante 5 diacuteas con la
neurotoxina MET El anaacutelisis cuantitativo demuestra que el transporte
retroacutegrado medido por el uso de BFA presentoacute un retraso significativo en
ceacutelulas tratadas en comparacioacuten con las ceacutelulas control (Figuras 28B y 29)
donde el marcaje con manosidasa II alcanzoacute el RE en todas las ceacutelulas control
entre 25-30 minutos mientras que necesitoacute maacutes de 40 minutos en las ceacutelulas
tratadas con metanfetamina durante cinco diacuteas (Figura 29) lo que demuestra la
presencia de un retraso significativo en este modelo neuronal de EP
Asimismo los resultados del anaacutelisis cuantitativo demostraron que el
transporte anteroacutegrado fue significativamente maacutes acelerado en las ceacutelulas
tratadas con MET durante 5 diacuteas Al contrario de lo que ocurre con las ceacutelulas
tratadas durante 3 diacuteas con MET al quinto diacutea de tratamiento el transporte
anteroacutegrado fue alterado por el efecto citopaacutetico de la neurotoxina siendo
ligeramente maacutes raacutepido en comparacioacuten con las ceacutelulas control (Figuras 30 y
31) Este resultado contrasta con estudios previos realizados en otros modelos
donde el transporte se ve retrasado (Cooper et al 2006 Thayanidhi et al
2010) (ver discusioacuten)
Para confirmar el estado alterado del transporte anteroacutegrado en nuestro
modelo en el quinto diacutea de tratamiento con la neurotoxina MET recurrimos al
anaacutelisis del transporte del mutante sensible a temperatura ts045 de la proteiacutena
G del virus de la estomatitis vesicular (VSVg) (Figura 32) El transporte
RESULTADOS
152
anteroacutegrado despueacutes del quinto diacutea de tratamiento fue monitorizado a traveacutes
del anaacutelisis en el tiempo de la aparicioacuten en el AG de la sentildeal fluorescente
emitida por la moleacutecula GFP unida a la proteiacutena VSVg El transporte de esta
proteiacutena desde RE hasta el aparato de Golgi fue iniciado al cambiar las
condiciones de incubacioacuten de las ceacutelulas transfectadas con VSVg-GFP desde
la temperatura no permisiva (40 ordmC) a la temperatura permisiva (32 ordmC) La
proteiacutena se trasladoacute desde el RE al compartimento intermedio y a
continuacioacuten al AG Medimos en diferentes tiempos el porcentaje de ceacutelulas en
las que la proteiacutena viral habiacutea alcanzado el complejo de Golgi (Figura 32) En
las ceacutelulas control la proteiacutena viral necesitoacute 15 minutos para alcanzar el AG
mientras que en las ceacutelulas tratadas se observa su aparicioacuten despueacutes de 5
minutos de incubacioacuten a la temperatura permisiva (Figura 33) confirmando los
resultados obtenidos en los ensayos realizados con la droga BFA
Considerando que nuestros resultados demuestran claramente que el
transporte anteroacutegrado estaacute afectado tras cinco diacuteas de tratamiento
postulamos que estas alteraciones podriacutean deberse a cambios en las vesiacuteculas
revestidas de COP II Para analizar esta hipoacutetesis realizamos inmunomarcaje
contra la proteiacutena Sec13 como marcador de las cubiertas de vesiacuteculas tipo
COP II Los resultados revelaron que al minuto 25 despueacutes del lavado de
brefeldina A (-BFA) en un 25 de las ceacutelulas se produciacutea el acuacutemulo de
vesiacuteculas COP II alrededor de lo que posiblemente es una gran inclusioacuten
yuxtanuclear aacuterea que representa el sitio donde se tendriacutea que dar la
organizacioacuten del compartimento intermedio y posterior ensamblaje de la cara
cis del AG (Figura 34) Esta acumulacioacuten de vesiacuteculas alrededor de la zona
donde se localiza el aparato de Golgi y las inclusiones podriacutea explicar la
aceleracioacuten del transporte anteroacutegrado
RESULTADOS
153
Figura 26 Ensayos del transporte retroacutegrado al tercer diacutea de tratamiento con MET Se muestra el marcaje con manosidasa II La cineacutetica de fusioacuten AG-RE fue
similar en ceacutelulas control y tratadas con la neurotoxina La fusioacuten completa AG-RE se
alcanzoacute tanto para ceacutelulas control como para ceacutelulas tratadas entre 25 a 30 minutos
de exposicioacuten a BFA Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
154
Figura 26 Continuacioacuten
RESULTADOS
155
Figura 27 Ensayos del transporte anteroacutegrado al tercer diacutea de tratamiento con metanfetamina Se muestra el marcaje con manosidasa II La cineacutetica de
recuperacioacuten del AG tras eliminar la BFA fue similar en ceacutelulas control y tratadas con
la neurotoxina Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
156
Figura 27 Continuacioacuten
RESULTADOS
157
Figura 27 Continuacioacuten
RESULTADOS
158
Figura 28 Anaacutelisis cuantitativo del transporte retroacutegrado al tercero y quinto diacutea
de tratamiento con la neurotoxina MET Se muestra el porcentaje (plusmnSEM) de las
ceacutelulas inmunomarcadas para manosidasa II despueacutes de la adicioacuten de brefeldina A
(+BFA) que muestra un patroacuten citoplasmaacutetico (distribucioacuten en RE) (A) Al tercer diacutea de
tratamiento el transporte retroacutegrado estaacute praacutecticamente inalterado (B) El anaacutelisis
cuantitativo demuestra que el transporte retrogrado al quinto diacutea de tratamiento estaacute
significativamente alterado 300 ceacutelulas fueron contadas para cada periodo de tiempo
El asterisco indica que las diferencias son significativas (ANOVA p lt 005)
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20 25 30 35 40
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20 25 30 35 40
Control 3 diacuteas Tratamiento 3 diacuteas
Control 5 diacuteas Tratamiento 5 diacuteas
+ BFA
+ BFA
A
B
RESULTADOS
159
Figura 29 Ensayos del transporte retroacutegrado al quinto diacutea de tratamiento con la neurotoxina MET Se muestra el marcaje con manosidasa II Se observan aparatos
de Golgi intactos despueacutes de 25 minutos de exposicioacuten a BFA en ceacutelulas tratadas
mientras que en este punto especiacutefico de tiempo el marcaje con manosidasa II estaacute
presente en el RE de ceacutelulas control indicando que el transporte retroacutegrado AG-RE
estaacute retrasado en el modelo de Parkinson Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
160
Figura 29 Continuacioacuten
RESULTADOS
161
Figura 30 Anaacutelisis cuantitativo del transporte anteroacutegrado Se evaluacutea el
porcentaje (plusmnSEM) de ceacutelulas con patroacuten citoplasmaacutetico (distribucioacuten en retiacuteculo
endoplasmaacutetico) inmunomarcadas para manosidasa II tras la eliminacioacuten de la droga
BFA (-BFA) Al tercer diacutea de tratamiento el transporte retroacutegrado permanece intacto
Sin embargo el anaacutelisis demuestra que el transporte anteroacutegrado estaacute afectado
significativamente despueacutes de cinco diacuteas de tratamiento 300 ceacutelulas fueron contadas
en cada espacio de tiempo Los asteriscos indican que las diferencias son
significativas (ANOVA p lt 005)
0
20
40
60
80
100
2 5 10 15 20 2 5 10 15
Control Tratamiento
- BFA 3 diacuteas - BFA 5 diacuteas
RESULTADOS
162
Figura 31 Ensayos del transporte anteroacutegrado al quinto diacutea de tratamiento con la neurotoxina metanfetamina Se muestra el inmunomarcaje para manosidasa II
Destacar que esta enzima del AG despueacutes de 10 minutos sin BFA se encuentra en el
AG mientras que en las ceacutelulas control permanece auacuten en el RE Despueacutes de 35
minutos del lavado de BFA las ceacutelulas tratadas empiezan a mostrar signos de
fragmentacioacuten que se presenta al quinto diacutea de tratamiento mientras que las ceacutelulas
control recuperan progresivamente la arquitectura normal del AG Barra de calibrado
25 microm
RESULTADOS
163
Figura 31 Continuacioacuten
RESULTADOS
164
Figura 31 Continuacioacuten
RESULTADOS
165
Figura 32 Anaacutelisis cuantitativo del transporte anteroacutegrado al quinto diacutea de tratamiento con metanfetamina mediante el uso del VSVg-GFP Los valores
representan el porcentaje (plusmn SEM) de las ceacutelulas en las que se identificoacute fluorescencia
en el aacuterea perinuclear como indicativo que la proteiacutena viral alcanzoacute el AG El anaacutelisis
demuestra claramente que el transporte anteroacutegrado esta acelerado tras 5 diacuteas de
exposicioacuten a la neurotoxina MET 300 ceacutelulas fueron contadas en cada espacio de
tiempo El asterisco indica que las diferencias son significativas (ANOVA p lt 005)
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
Control Tratamiento
RESULTADOS
166
Figura 33 Ensayos del transporte anteroacutegrado en el quinto diacutea de tratamiento con MET usando VSVg-GFP Se observa la fluorescencia de la proteiacutena g del virus
de la estomatitis vesicular unida a GFP A los 5 minutos posteriores a la incubacioacuten en
la temperatura permisible aparece un punteado disperso de mayor intensidad
fluorescente en ceacutelulas tratadas que se corresponden con el compartimiento
intermedio A los 10 minutos esta proteiacutena viral ya se encuentra localizada en un aacuterea
perinuclear (AG) mientras que en las ceacutelulas control se presenta como un patroacuten
disperso por todo el citoplasma Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
167
Figura 34 Ensayos del transporte anteroacutegrado en el quinto diacutea de tratamiento con la neurotoxina MET Se muestra inmunomarcaje para Sec13 (COP II) a los 25
minutos sin BFA en ceacutelulas tratadas (A) Ceacutelula PC12 que muestra una acumulacioacuten
de vesiacuteculas tipo COP II (cabeza de flecha) alrededor de un espacio no reactivo (B)
El aacuterea no reactiva (flecha doble) posiblemente ocupada por un agregado
yuxtanuclear donde a su alrededor se agrupan las vesiacuteculas tipo COP II Barra de
calibrado 25 microm
RESULTADOS
168
8 BUacuteSQUEDA DE PROTEIacuteNAS IMPLICADAS EN LA FRAGMENTACIOacuteN DEL COMPLEJO DE GOLGI
Se ha descrito que la fragmentacioacuten del AG puede ser debida a la
sobreexpresioacuten o deplecioacuten (disminucioacuten en la expresioacuten) de proteiacutenas
especiacuteficas (Mironov y Beznoussenko 2011) En el presente estudio medimos
en ceacutelulas control y ceacutelulas tratadas a diferentes intervalos de tiempo los
niveles de expresioacuten de proteiacutenas de importancia relevante en las funciones
de mantenimiento de la estructura del AG asiacute como aquellas involucradas en
los procesos de regulacioacuten del traacutefico intracelular De especial intereacutes fue el
anaacutelisis a traveacutes del perfil bioquiacutemico de las proteiacutenas Rab GTPasas y SNARE
asociadas al transporte RE-Golgi ya que existen fuertes evidencias que las
involucra en la geacutenesis del desarrollo citopaacutetico que se presenta en la EP
El anaacutelisis cuantitativo resultoacute de la medicioacuten de las sentildeales emitidas en
cada inmunoblot donde el nivel de expresioacuten proteica fue comparado entre
ceacutelulas control y ceacutelulas tratadas con la neurotoxina MET durante tres y cinco
diacuteas (Tabla 12)
Para confirmar la utilidad de nuestro modelo primero medimos los niveles
relativos de expresioacuten de la proteiacutena α s en las fracciones soluble e insoluble
(veacutease materiales y meacutetodos) indicativos de no agregacioacuten y de la presencia
de componentes de inclusioacuten respectivamente (Figura 35) Tras tres diacuteas de
tratamiento el nivel de expresioacuten de α -sinucleiacutena reflejada en la fraccioacuten
soluble se incrementoacute aproximadamente un 50 en comparacioacuten a las
muestras control demostrando que la neurotoxina induce soacutelo una limitada
sobreexpresioacuten de esta proteiacutena Tras cinco diacuteas de tratamiento los niveles de
α-sinucleiacutena decrecieron en la fraccioacuten soluble sin embargo de forma
concomitante se produjo un aumento en la fraccioacuten insoluble Este resultado
corrobora que la agregacioacuten de αs no se genera al tercer diacutea de tratamiento lo
que concuerda con nuestros datos de inmunofluorescencia Igualmente como
se ha descrito para los cuerpos de Lewy (Wakabayashi et al 2007) la proteiacutena
del citoesqueleto de microtuacutebulos α -tubulina estuvo presente en la fraccioacuten
insoluble al quinto diacutea de tratamiento
RESULTADOS
169
Los niveles de expresioacuten de muchas de las proteiacutenas analizadas
cambiaron tras de cinco diacuteas de tratamiento con MET (Figura 35) Rab1A
Rab27A GS15 YKT6 el componente de cubierta COPII Sec13 el receptor de
KDEL (KDELr) y la proteiacutena de matriz del AG GM130 aumentaron mientras
que Rab2A las proteiacutenas SNARE rBet1 sintaxinas 5 y 6 y el componente de
cubierta COP I β-COP disminuyeron Sin embargo Rab3A y 6 las SNARE
GS27 GS28 y sec22B el marcador de ERGIC p58 la proteiacutena de
acercamiento p115 y la proteiacutena de AG GRASP65 no cambiaron
Interesantemente despueacutes de tres diacuteas de tratamiento soacutelo las proteiacutenas Rab
1A 2A y 8 y la Golgi SNARE sintaxina-5 estaban alteradas De estas uacuteltimas
proteiacutenas mencionadas soacutelo Rab1A aumentoacute su nivel Dado que en este
momento existe fragmentacioacuten del AG pero no agregacioacuten proteica estas
cuatro proteiacutenas fueron buenas candidatas para ser responsables del efecto
dantildeino observado en la arquitectura del AG
Como control en los ensayos bioquiacutemicos realizamos una prueba sobre
las muestras control (que resultaron de la incubacioacuten paralela de ceacutelulas PC12
con diferenciacioacuten neuronal durante los ensayos de tratamiento a 1 3 y 5
diacuteas) donde usamos el inmunomarcaje para la GTPasa Rab1A como
indicadora de error en nuestros experimentos Rab1A fue seleccionada como
la proteiacutena a evaluar ya que eacutesta presenta cambios draacutesticos desde el primer
diacutea y valores con diferencias significativas desde el tercer diacutea de tratamiento El
resultado de la cuantificacioacuten de Rab1A no mostroacute diferencias significativas
entre los tres grupos controles (Figura 36) revelando que los datos obtenidos
en los diferentes experimentos poseen la suficiente seguridad para continuar
con anaacutelisis posteriores en la buacutesqueda de proteiacutenas involucradas en la
alteracioacuten del transporte en este modelo de EP
RESULTADOS
170
PROTEIacuteNA 3 DIacuteAS 5 DIacuteAS
α-sinucleiacutenafraccioacuten soluble banda 19 kDa 148plusmn48 75plusmn30
α-sinucleiacutenafraccioacuten soluble banda ~70-75 kDa 116plusmn41 91plusmn21
α-sinucleiacutenafraccioacuten insoluble - 164plusmn54
α-tubulina - 77plusmn74 β-tubulina - -
Rab1A 140plusmn47 126plusmn23 Rab2A 63plusmn23 66plusmn34 Rab3A - - Rab6 - - Rab8 62plusmn97 79plusmn68
Rab27A - 155plusmn68 GS27 - - GS28 - - GS15 - 139plusmn96 YKT6p - 115plusmn09 rBet1 - 62plusmn82
Sintaxina5 89plusmn23 75plusmn47 Sec22B - -
Sintaxina6 - 36plusmn100 p58 - - p115 - -
GM130 - 160plusmn87 GRASP65 - 117plusmn31
Sec13 (COP II) - 129plusmn66 β-COP (COP I) - 66plusmn117
KDELr - 180plusmn67
Tabla 12 Resultados del anaacutelisis bioquiacutemico por western blotting Se muestran
los datos de todos los tratamientos realizados durante 1 3 y 5 diacuteas los cuales son
comparados con las muestras control es decir aquellas provenientes de ceacutelulas no
tratadas (valor arbitrario del 100) Los valores representan la cuantificacioacuten
densitomeacutetrica (expresada como el porcentaje plusmn SEM) No se muestran los
porcentajes con valores estadiacutesticamente no significativos los cuales son
reemplazados en la tabla por un guioacuten (ANOVA plt005) FS = fraccioacuten soluble FI =
fraccioacuten insoluble A la derecha se muestran las inmunodetecciones maacutes
representativas por western blotting C= control T= tratamiento
RESULTADOS
171
Figura 35 Anaacutelisis cuantitativo de niveles de expresioacuten de proteiacutenas relevantes involucradas en el transporte entre el RE-AG Los valores representan la
cuantificacioacuten densitomeacutetrica (expresada como el porcentaje plusmn SEM) obtenida para
cada proteiacutena a traveacutes de ensayos bioquiacutemicos por western blot Se evaluacutean los
cambios al tercer y quinto diacutea de tratamiento en comparacioacuten con las muestras
provenientes de ceacutelulas no tratadas (valor arbitrario del 100) Los datos
estadiacutesticamente no significativos fueron excluidos de la graacutefica (ANOVA plt005)
FS = fraccioacuten soluble FI = fraccioacuten insoluble
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200 3 DIacuteAS 5 DIacuteAS
RESULTADOS
172
Figura 36 Inmunodeteccioacuten por western blotting comparado de las muestras control El inmunomarcaje para Rab1A no reveloacute diferencias significativas entre
controles a tiempos variables de cultivo ANOVA (p=067)
5 DIacuteAS 1 DIacuteA 3 DIacuteA
Rab1ACONTROLES
RESULTADOS
173
9 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIOacuteN O DEPLECIOacuteN DE PROTEIacuteNAS RAB GTPasas ESPECIacuteFICAS Y LA SNARE SINTAXINA-5 SOBRE LA MORFOLOGIacuteA DEL COMPLEJO DE GOLGI
Nuestros resultados sugieren que la fragmentacioacuten del AG puede ser
debida a niveles alterados de las proteiacutenas reguladoras del traacutefico Rab1A 2A
y 8 asiacute como la proteiacutena SNARE sintaxina 5 Para comprobar esta hipoacutetesis
sobreexpresamos estas proteiacutenas y analizamos si eran capaces de restaurar la
morfologiacutea del aparato de Golgi (Figuras 37 38 y 39) El uso del plaacutesmido de
fusioacuten de estas proteiacutenas con GFP permitioacute analizar especiacuteficamente las
ceacutelulas que sobreexpresaron la proteiacutena de intereacutes En experimentos paralelos
inducimos la deplecioacuten de estas proteiacutenas mediante el uso de sus
correspondientes ARNs de interferencia (Figuras 37 41 y 42) El porcentaje de
deplecioacuten medido por Inmunodeteccioacuten por western Blot resultoacute entre el 30 al
50 (Figura 40) Para el anaacutelisis de deplecioacuten usamos la teacutecnica de
inmunofluorescencia contra las referidas proteiacutenas lo que nos permitioacute
identificar exclusivamente las ceacutelulas con ausencia de expresioacuten especiacutefica
(Figuras 41 y 42) En ambos experimentos la morfologiacutea del AG se comproboacute
mediante el uso de inmunomarcaje para GM130 Los resultados obtenidos
demuestran una amplia correlacioacuten entre los niveles de estas proteiacutenas y la
morfologiacutea del AG
Interesantemente la sobreexpresioacuten de las GTPasas Rab1A y 8 asiacute
como la deplecioacuten de Rab2 y sintaxina-5 teniacutean la capacidad de restaurar la
morfologiacutea del AG (Figuras 37 38 y 41) Tambieacuten hallamos que la deplecioacuten
de Rab1A y Rab8 (Figura 42) asiacute como la sobreexpresioacuten de Rab2 y sintaxina-
5 (Figura 39) generaban fragmentacioacuten del AG (Figura 37) Los niveles de
restauracioacuten fueron muy altos llegando a 90 en el caso de sobreexpresioacuten de
la GTPasa Rab1A En conjunto nuestros datos apoyan que el desequilibrio
entre proteiacutenas Rab y SNARE inducido por el efecto neurotoacutexico es
responsable de la fragmentacioacuten del AG
RESULTADOS
174
Figura 37 Anaacutelisis cuantitativo de la sobreexpresioacuten y deplecioacuten de Rab GTPasas y SNARE en la morfologiacutea del complejo de Golgi Las ceacutelulas PC12 con
diferenciacioacuten neuronal fueron tratadas durante 5 diacuteas con MET La transfeccioacuten
transitoria se realizoacute al cuarto diacutea de tratamiento Los valores representan el
porcentaje (plusmn SEM) de las ceacutelulas que exhibieron un AG con morfologiacutea normal y que
mostraron expresioacuten de la proteiacutena especiacutefica unida a GFP o al contrario mostrando
deplecioacuten para esas mismas proteiacutenas El control representa los experimentos
realizados sobre ceacutelulas tratadas con MET durante 5 diacuteas pero no transfectadas
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control Rab1A Rab2A Rab8A Sintaxina5
SOBREEXPRESIOacuteN (GFP) DEPLECIOacuteN (siRNA)
RESULTADOS
175
Figura 38 Efectos de la sobreexpresioacuten de la GTPasas Rab1A y 8 sobre la morfologiacutea del complejo de Golgi en ceacutelulas tratadas Tratamiento con MET
durante 5 diacuteas Transfeccioacuten transitoria al cuarto diacutea con los plaacutesmidos especiacuteficos
para Rab1A y 8 unidos a GFP Al quinto diacutea de tratamiento las ceacutelulas fueron fijadas e
inmunomarcadas para GM130 como marcador de Golgi Se observa claramente que la
sobreexpresioacuten de Rab1A y 8 restaura la morfologiacutea del AG Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
176
Figura 39 Efectos de la sobreexpresioacuten de la GTPasa Rab2A y la SNARE sintaxina-5 sobre la morfologiacutea del complejo de Golgi en ceacutelulas tratadas con metanfetamina durante 5 diacuteas Transfeccioacuten transitoria al cuarto diacutea con los
plaacutesmidos especiacuteficos para Rab2A y sintaxina-5 unidos a GFP Al quinto diacutea de
tratamiento las ceacutelulas fueron fijadas e inmunomarcadas para GM130 como marcador
del AG La sobreexpresioacuten de Rab2A y sintaxina 5 en ceacutelulas tratadas aumenta la
fragmentacioacuten del AG Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
177
Figura 40 Inmunodeteccioacuten por western blotting para determinar el porcentaje de deplecioacuten de las proteiacutenas a evaluar Tratamiento con MET durante 5 diacuteas
Transfeccioacuten transitoria al cuarto diacutea con el siRNA especiacutefico Se muestran 4 columnas
para los controles (izquierda) e igual nuacutemero de columnas para los tratamientos
(derecha) Se cuantifica mediante densitometriacutea y se comparan los controles con sus
respectivos tratamientos
CONTROL TRATAMIENTO
Control de carga
siRab1A
siRab2A
siRab8
siSintaxina 5
RESULTADOS
178
Figura 41 Efectos de la deplecioacuten de Rab2A y la SNARE sintaxina-5 sobre la morfologiacutea del complejo de Golgi en ceacutelulas tratadas con metanfetamina durante 5 diacuteas Transfeccioacuten al cuarto diacutea con su especiacutefico siRNA Al quinto diacutea las ceacutelulas fueron fijadas y doblemente inmunomarcadas para su correspondiente proteiacutena silenciada (para identificar las ceacutelulas con deplecioacuten) y con GM130 como marcador de Golgi La deplecioacuten de Rab2A y sintaxina 5 en ceacutelulas tratadas restaura la morfologiacutea del AG Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
179
Figura 42 Efectos de la deplecioacuten de las GTPasas Rab1A y 8 sobre la morfologiacutea del complejo de Golgi en ceacutelulas tratadas con metanfetamina durante 5 diacuteas Transfeccioacuten al cuarto diacutea con su especiacutefico siRNA Al quinto diacutea las ceacutelulas fueron
fijadas y doblemente inmunomarcadas para su correspondiente proteiacutena silenciada y
con GM130 como marcador del AG La deplecioacuten de Rab1A y 8 en ceacutelulas tratadas
aumenta la fragmentacioacuten del AG Barra de calibrado 25 microm
RESULTADOS
180
10 EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIOacuteN DE RAB GTPasas SOBRE LA FORMACIOacuteN DE INCLUSIONES INTRACELULARES
La formacioacuten de agregados podriacutea estar al menos en parte promovida por la
fragmentacioacuten del AG Maacutes auacuten este fenoacutemeno podriacutea ser explicado por los niveles
alterados de las proteiacutenas GTPasas reguladoras del traacutefico Rab 1 2 y 8 asiacute como de
la proteiacutena SNARE sintaxina 5 En consideracioacuten a los resultados tan sorprendentes
obtenidos con Rab1A respecto a su capacidad en la restauracioacuten del AG en ceacutelulas
PC12 tratadas con MET decidimos enfocar primariamente nuestros esfuerzos en este
estudio con esta proteiacutena Por tanto para comprobar esta hipoacutetesis sobreexpresamos
Rab1A y analizamos si era capaz de bloquear o incrementar la produccioacuten de
agregados citoplasmaacuteticos (Figura 43) El uso del vector de expresioacuten de esta proteiacutena
unido a GFP permitioacute analizar especiacuteficamente las ceacutelulas que la sobreexpresaron
Asimismo usamos la teacutecnica de inmunofluorescencia contra la proteiacutena αs lo que nos
permitioacute identificar las ceacutelulas transfectadas con ausencia o presencia de acuacutemulos
proteicos
La sobreexpresioacuten de la GTPasa Rab1A posee la capacidad de bloquear
completamente la formacioacuten de los grandes agregados yuxtanucleares en este modelo
de EP lo que demuestra que esta GTPasa ademaacutes de rescatar la morfologiacutea del AG
tambieacuten bloquea la agregacioacuten proteica (Figura 43)
RESULTADOS
181
Figura 43 Efectos de la sobreexpresioacuten de la GTPasa Rab1A sobre el desarrollo de inclusiones intracelulares en ceacutelulas tratadas con metanfetamina durante 5 diacuteas Transfeccioacuten transitoria al cuarto diacutea con el plaacutesmido especiacutefico Rab1A unido a
GFP Al quinto diacutea de tratamiento las ceacutelulas fueron fijadas e inmunomarcadas para α -
sinucleiacutena como marcador de agregados Se observan ceacutelulas sobreexpresando Rab1A las cuales no presentan formacioacuten de inclusiones yuxtanucleares Barra de
calibrado 25 microm
DISCUSIOacuteN
185
VII DISCUSIOacuteN
1 Liacutenea celular PC12 como modelo neuronal de enfermedad de Parkinson
Los resultados que hemos obtenido utilizando el presente modelo
neuronal de enfermedad de Parkinson han aportado informacioacuten crucial para el
entendimiento de eventos citopatogeacutenicos concernientes a los dantildeos
generados sobre el traacutefico intracelular Entre las toxinas disponibles para
inducir neurodegeneracioacuten las elegidas promovieron efectos citopaacuteticos
sorprendentemente similares de hecho fue para nosotros destacable poder
reproducir inclusiones intracelulares en ceacutelulas PC12 a traveacutes de la exposicioacuten
croacutenica a la toxina 6-OHDA en contraste con estudios previos (Schober et al
2004) pese a que es una de las sustancias maacutes utilizadas en modelos
animales y celulares de EP La formacioacuten de inclusiones en ceacutelulas PC12
mediante la neurotoxina MET no fue un hallazgo sorpresa para nosotros
porque conociacuteamos la capacidad de esta sustancia para reproducir agregados
en la liacutenea celular Sin embargo nos llamoacute la atencioacuten el hecho de que en
algunos estudios los investigadores describen la aparicioacuten eventual de un gran
agregado perinuclear (Gosavi et al 2002 Fornai et al 2003) cuando en
nuestros experimentos la reproduccioacuten de este patroacuten de inclusioacuten se mostroacute
de forma constante sin producir cambios aparentes en la cineacutetica de
formacioacuten incluso para el tratamiento con 6-OHDA Asimismo la integridad
morfoloacutegica del AG se altera en enfermedades neurodegenerativas un proceso
que tambieacuten se observoacute en el presente modelo y el cual nos permitioacute analizar
la relacioacuten entre la fragmentacioacuten del AG y la formacioacuten de agregados
intracelulares
DISCUSIOacuteN
186
2 Mecanismo citopaacutetico de la proteiacutena α-sinucleiacutena
Se ha demostrado que animales nulos para la proteiacutena αs son resistentes
a la accioacuten toacutexica de sustancias como MPTP y 6-OHDA (Dauer et al 2002
Alvarez-Fischer et al 2008) sugiriendo que esta proteiacutena es un efector
primario de los eventos citopaacuteticos que se pueden presentar de forma natural
en todas las denominadas sinucleopatiacuteas Gitler y colaboradores (2008)
demostraron que niveles toacutexicos de la proteiacutena αs se relacionan con una
marcada disminucioacuten en la liberacioacuten de vesiacuteculas sinaacutepticas Estos autores
observaron que el incremento anormal de αs indujo colocalizacioacuten de la misma
con vesiacuteculas secretoras indicando efectos de inactivacioacuten neuroexociacutetica por
alteracioacuten de la maquinaria del transporte (Gitler et al 2008) Ademaacutes tanto la
sobreexpresioacuten (Larsen et al 2006) como la carencia (Abeliovich et al 2000)
de esta proteiacutena causan alteracioacuten en la liberacioacuten de catecolaminas fenoacutemeno
que tambieacuten se ha demostrado en ceacutelulas PC12 La sobreexpresioacuten la
expresioacuten de formas alteradas y la agregacioacuten de αs se acompantildean de lesiones
graves a nivel de las terminales nerviosas fenoacutemeno que es promovido por
una redistribucioacuten de las proteiacutenas SNARE sinaacutepticas SNAP-25 sintaxina-1 y
sinaptobrevina (Garciacutea-Reitboumlck et al 2010) En general esta cascada de
eventos anoacutemalos se traduce en la liberacioacuten alterada de dopamina
arrastrando a la ceacutelula a un desbalanceado nivel de ROS En nuestro modelo la
neurotoxina MET indujo un incremento potencialmente toacutexico en los niveles de
expresioacuten de αs tal y como se ha descrito previamente en este tipo celular
(Mauceli et al 2006) incremento que se podriacutea asociar con alteraciones del
transporte y liberacioacuten de las vesiacuteculas de nuacutecleo denso al afectar su unioacuten y
fusioacuten En consecuencia el acuacutemulo anormal de estas vesiacuteculas podriacutea inducir
un incremento en la auto-oxidacioacuten de la dopamina retenida a nivel intracelular
Esta secuencia de eventos citopaacuteticos que incluye la alteracioacuten temprana de la
morfologiacutea del AG podriacutean ser el desencadenante de la aparicioacuten de
inclusiones intracelulares observados despueacutes del cuarto diacutea de tratamiento
Es importante recordar que la neurotoxicidad de MET esta mediada por la
dopamina endoacutegena producida almacenada y liberada por la ceacutelula asiacute el
bloqueo de la siacutentesis de eacutesta amina protege contra la toxicidad de MET
DISCUSIOacuteN
187
(Mauceli et al 2006) La cineacutetica de fibrilacioacuten de αs depende de muacuteltiples
factores los cuales muy seguramente en este modelo de EP sean la variacioacuten
grave del pH y los eventos de estreacutes oxidativo inducidos por el tratamiento
neurotoacutexico Asiacute ante el incremento de los niveles de expresioacuten de αs y del
cambio dantildeino en el ambiente redox intracelular esta proteiacutena altera su funcioacuten
y modifica su forma nativa que carece de una estructura estable (plegamiento
anormal) lo cual desencadena el proceso de oligomerizacioacuten y fibrilacioacuten En
nuestro modelo hemos demostrado despueacutes del cuarto diacutea de tratamiento
evidencias de agregacioacuten tanto en forma de un gran acuacutemulo yuxtanuclear
como agregados a nivel neuriacutetico estos uacuteltimos anaacutelogos a los neuritas de
Lewy Dichos factores producen cambios de la conformacioacuten de la proteiacutena αs
La conformacioacuten parcialmente plegada puede ser transitoria pero ante la
presencia croacutenica de estos factores se hace estable y da lugar a los pasos
subsecuentes hasta la forma fibrilar de hecho se sabe que en un periodo corto
de tiempo pasa de una conformacioacuten parcialmente plegada a formaciones
oligomeacutericas prefibrilares que terminan en agregados fibrilares (Uversky et al
2001)
Es sabido que NGF en ceacutelulas PC12 incrementa a traveacutes de mecanismos
de diferenciacioacuten los niveles de expresioacuten de la proteiacutena αs aunque sin afectar
la funcionalidad celular ni hacerlas maacutes propensas a morir (Stefanis et al
2001) Hemos encontrado que las ceacutelulas PC12 en su estado neuronal
responden a los efectos citotoacutexicos de ambas neurotoxinas con un incremento
de la expresioacuten de αs hasta niveles verdaderamente toacutexicos para la ceacutelula lo
cual puede ser demostrado por las graves alteraciones del transporte celular en
el quinto diacutea de tratamiento que coinciden en el tiempo con la formacioacuten de
grandes agregados inmunoreactivos para αs asiacute como en la alteracioacuten en los
niveles de expresioacuten de un alto nuacutemero de proteiacutenas involucradas en el traacutefico
intracelular
Aunque soacutelo hemos realizado ensayos bioquiacutemicos para MET es faacutecil
deducir que este fenoacutemeno tambieacuten se estaacute reproduciendo bajo el tratamiento
con 6-OHDA ya que en los ensayos realizados con esta neurotoxina
encontramos un patroacuten morfoloacutegico de distribucioacuten de αs ideacutentico al hallado
DISCUSIOacuteN
188
para MET donde se produce un gran agregado yuxtanuclear inmunoreactivo
para αs en el quinto diacutea de tratamiento Tambieacuten en ambos casos se observan
ceacutelulas con agregados de αs en las terminales neuriacuteticas de las ceacutelulas PC12 y
su marcaje disperso en citoplasma se ve disminuido para cualquiera de los dos
tratamientos
3 Fragmentacioacuten del complejo de Golgi iquestconsecuencia de apoptosis
La fragmentacioacuten del AG es un signo temprano de neurodegeneracioacuten no
asociado a muerte apoptoacutetica (Gonatas et al 2006) Hasta ahora existe gran
controversia respecto al mecanismo que genera el efecto letal de ceacutelulas PC12
sometidas a la accioacuten toacutexica de las sustancias 6-OHDA y MET (ver apartados
3211 y 3212 de la revisioacuten bibliograacutefica) No obstante nuevos hallazgos
apuntan a que la muerte inducida por apoptosis es miacutenima (Woodgate et al
1999) En el presente estudio los resultados obtenidos apoyan que el proceso
degenerativo induce un miacutenimo de muerte por apoptosis Cuando se
desencadena el mecanismo fisioloacutegico de la apoptosis el AG sufre
fragmentacioacuten de forma irreversible (Aslan y Thomas 2009) proceso que
involucra la accioacuten de varias caspasas que rompen la matriz proteica asociada
al AG (Sesso et al 1999 Mancini et al 2000 Walker et al 2004 Sutterlin et al
2005 Mukherjee y Shields 2009) Por el contrario nuestros hallazgos
demuestran que la fragmentacioacuten del AG en ceacutelulas tratadas es un fenoacutemeno
reversible dado que la modificacioacuten en los niveles de expresioacuten de ciertas
proteiacutenas especiacuteficas induce su recuperacioacuten (ver apartado 5 fragmentacioacuten
del complejo de Golgi) Los experimentos de viabilidad celular realizados
mediante el uso de caspasa 3 activa confirman las observaciones
anteriormente descritas puesto que el nuacutemero de ceacutelulas que sufrieron muerte
por apoptosis presentoacute valores inferiores al 01
DISCUSIOacuteN
189
Durante la apoptosis se pueden observar cambios morfoloacutegicos como
crenacioacuten celular con preservacioacuten de organelas compactacioacuten de cromatina
(Stefanis et al 2001) y eventual aparicioacuten de cuerpos apoptoacuteticos (Woodgate
et al 1999) La fragmentacioacuten del AG coincide con la aparicioacuten de estructuras
apoptoacuteticas en el centro organizador de microtuacutebulos lo cual se debe a la
accioacuten de proteiacutenas motoras asociadas al citoesqueleto (Aslan y Thomas
2009) Como efecto de este proceso aparecen fragmentos de organelas
apoptoacuteticas como mitocondrias que coalescen en la proximidad del AG
induciendo importantes modificaciones morfoloacutegicas de este orgaacutenulo donde el
apilamiento de cisternas desaparece y es reemplazado por agrupaciones de
vesiacuteculas ideacutenticas a las observadas en la divisioacuten mitoacutetica (Gonatas et al
2006) Examinamos pues los cambios morfoloacutegicos del AG a nivel
ultraestructural encontrando que los complejos de Golgi aunque maacutes
pequentildeos permanecieron aparentemente normales es decir dictiosomas
apilados rodeados por elementos tubulovesiculares Igualmente no
descubrimos cambios a nivel nuclear o indicios de fragmentos de organelas
apoptoacuteticas Estos hallazgos confirman que la fragmentacioacuten del complejo de
Golgi no fue consecuencia de la muerte inducida por apoptosis
4 La fragmentacioacuten del complejo de Golgi precede a los dantildeos en el citoesqueleto
Se ha postulado que la sobreproduccioacuten de αs y su posterior agregacioacuten
induce alteracioacuten del citoesqueleto de microtuacutebulos al promover co-
agregacioacuten con las tubulinas y otras proteiacutenas como parkina (Kawahara et al
2008) lo que se traduce en fragmentacioacuten del AG y deterioro del traacutefico celular
(Lee et al 2006) Los datos obtenidos en este estudio revelan diferencias
significativas en el nuacutemero de ceacutelulas con presencia de agregados
yuxtanucleares inmunoreactivos para la proteiacutena α -tubulina comparados con
aquellos reactivos para αs Esta observacioacuten se repiti oacute para las proteiacutenas
motoras asociadas al citoesqueleto dineiacutena y kinesina ambas de cadena
DISCUSIOacuteN
190
pesada En todos los casos fue mucho mayor el nuacutemero de ceacutelulas con
agregados inmunoreactivos para αs lo que sugiere al menos en este modelo
celular de EP que primero ocurre la agregacioacuten de αs y posteriormente la de
otras proteiacutenas Este resultado se confirmoacute en experimentos de doble
inmunomarcaje para αs y cada una de las proteiacutenas del sistema de
citoesqueleto o sus proteiacutenas motoras asociadas obteniendo que el 100 de
las inclusiones inmunoreactivas para las proteiacutenas del citoesqueleto tambieacuten lo
fueron para αs sin embargo esto no ocurrioacute al contrario Tambieacuten hemos
observado que un alto porcentaje de ceacutelulas que han desarrollado inclusioacuten
citoplasmaacutetica presentan un cambio draacutestico en su morfologiacutea Este fenoacutemeno
se observa despueacutes del cuarto diacutea de tratamiento con las neurotoxinas 6-
OHDA y MET aunque es maacutes evidente al quinto diacutea donde los agregados son
maacutes compactos y de mayor intensidad de inmunomarcaje Estos resultados
pueden estar indicando que el acuacutemulo primario de la proteiacutena α s induce
alteracioacuten de diferentes sistemas entre estos el citoesqueleto fomentando la
agregacioacuten de tubulinas Estas observaciones sobre la morfologiacutea alterada se
relacionan a su vez con los datos obtenidos en el estudio bioquiacutemico de las
proteiacutenas del citoesqueleto Como mencionaremos maacutes a fondo en apartados
siguientes estas estructuras anoacutemalas de agregacioacuten estaacuten asociadas al
centrosoma (Horton et al 2005) lo que trae consigo efectos devastadores
para la funcioacuten y salud celular Estos trastornos son mucho maacutes graves para
neuronas de tipo dopamineacutergicas las cuales estaacuten expuestas a la accioacuten auto-
oxidativa de la dopamina que da lugar a la formacioacuten de radicales libres en
niveles difiacuteciles de antagonizar los cuales pueden ser los iniciadores de una
cascada de eventos citopaacuteticos con posibilidades limitadas de reversioacuten
En nuestro modelo la fragmentacioacuten del AG precedioacute cualquier aparicioacuten
anormal en la distribucioacuten de la trama microtubular lo que sugiere que la
posible despolimerizacioacuten de microtuacutebulos por agregacioacuten proteica
desencadenada por αs u otros fenoacutemenos no fue la causa principal de
fragmentacioacuten Las neurotoxinas utilizadas en este estudio fomentaron un
incremento significativo de la expresioacuten endoacutegena de la GTPasa Rab1 Aunque
es conocido que las proteiacutenas Rab GTPasas estaacuten involucradas en muchos
eventos celulares incluyendo la interaccioacuten del citoesqueleto a las membranas
DISCUSIOacuteN
191
donde especiacuteficamente esta GTPasa guarda relacioacuten con el citoesqueleto la
alteracioacuten en sus niveles de expresioacuten no indujo cambios observables en la
arquitectura del citoesqueleto Sin embargo no se puede excluir por completo
que la alteracioacuten producida sobre proteiacutenas Rab pueda inducir modificaciones
locales del citoesqueleto que son indetectables a traveacutes de las teacutecnicas
utilizadas en el presente estudio
Nuestro modelo demuestra que en un momento determinado del proceso
citopaacutetico desencadenado por un efecto neurotoacutexico se inducen lesiones
neuronales que alteran de forma inevitable la organizacioacuten del AG y su
polarizacioacuten asiacute como dantildeos en el sistema del citoesqueleto que a su vez
aumenta el desperfecto causado sobre la maquinaria de transporte intracelular
5 Alteraciones del traacutefico intracelular
Los resultados obtenidos al quinto diacutea de tratamiento demuestran claras
evidencias de alteracioacuten en el transporte Para nuestro conocimiento este es el
primer estudio donde se describe alteracioacuten del transporte retroacutegrado en un
modelo de EP Adicionalmente el presente modelo tambieacuten muestra que el
transporte anteroacutegrado se encuentra acelerado como efecto del tratamiento con
la neurotoxina Hasta ahora los estudios del traacutefico han sido enfocados en el
transporte anteroacutegrado de levadura y de ceacutelulas de mamiacuteferos no neuronales
las cuales no expresan αs endoacutegena y no poseen las peculiaridades del
transporte presente en las neuronas (Outeiro y Lindquist 2003 Cooper et al
2006) Por tanto las diferencias obtenidas pueden deberse a los modelos
utilizados Por otra parte los niveles de sobreexpresioacuten de αs podriacutean afectar
significativamente los ensayos del transporte en esos modelos
En trabajos publicados recientemente se ha logrado restablecer el traacutefico
entre el RE-AG (alterado por sobreexpresioacuten o expresioacuten de formas aberrantes
de la proteiacutena αs ) al sobreexpresar las proteiacutenas SNARE implicadas en el
transporte RE-AG Sin embargo la SNARE maacutes efectiva en este rescate fue
DISCUSIOacuteN
192
YKT6 (Thayanidhi et al 2010) SNARE que en nuestro modelo no
encontramos alterada en el periodo de estudio Sin embargo el resultado del
anaacutelisis de los niveles de expresioacuten reveloacute una alteracioacuten importante de
sintaxina-5 SNARE presente en todos los pasos que median el transporte
vesicular de la ruta secretora temprana Por tanto como se ha sugerido para
las proteiacutenas SNARE no es de extrantildear que los niveles alterados o la forma
anormal inducida por tratamiento neurotoacutexico de sintaxina-5 contribuyan de
manera importante en la fragmentacioacuten del AG en etapas tempranas del
proceso citopaacutetico trayendo consigo en etapas posteriores alteraciones graves
del transporte en la ruta secretora temprana
El otro mecanismo que podriacutea explicar las alteraciones en el transporte
seriacutea por un efecto de tipo mecaacutenico donde obstaacuteculos fiacutesicos generados por
el desarrollo de una gran inclusioacuten yuxtanuclear produciriacutean un impedimento
fiacutesico que afectariacutea el proceso de acercamiento de vesiacuteculas asiacute como su
posterior unioacuten y fusioacuten Esta teoriacutea en nuestro modelo no puede explicar por
completo este fenoacutemeno dado que los resultados obtenidos muestran
formacioacuten de agregados a partir del cuarto diacutea de tratamiento mientras que
solo al quinto diacutea de exposicioacuten a la neurotoxina se induce alteracioacuten del
transporte Auacuten maacutes la aparicioacuten de inclusiones yuxtanucleares no supera el
30 de las ceacutelulas en el quinto diacutea de tratamiento sin embargo para este
tiempo el porcentaje de ceacutelulas con fragmentacioacuten del AG o patroacuten alterado de
distribucioacuten de vesiacuteculas con cubierta tipo COP II estaacute por encima del 80 Por
tanto sugerimos que para estas ceacutelulas muy probablemente posterior a la
formacioacuten de las inclusiones se establecen nuevas autopistas por donde
discurren los elementos vesiculares daacutendole un nuevo respiro a la funcioacuten
celular
Por otra parte la formacioacuten de la cubierta vesicular orquesta una
secuencia de eventos que incluyen su propio ensamblaje seleccioacuten del cargo y
moleacuteculas SNARE asiacute como la deformacioacuten de la membrana hasta la
gemacioacuten de la vesiacutecula Es interesante notar que despueacutes de cinco diacuteas de
tratamiento con la neurotoxina MET disminuyen los niveles de la proteiacutena de
cubierta β-COP (COP I) la cual estaacute implicada en el transporte retroacutegrado
DISCUSIOacuteN
193
contrariamente Sec13 (COPII) que participa en el transporte anteroacutegrado RE-
AG se encuentra incrementada Sin embargo no se encontraron diferencias
significativas en el tercer diacutea de tratamiento coincidiendo con un transporte
normal Por tanto las modificaciones en el transporte observadas para este
modelo podriacutean estar directamente relacionadas con los niveles de expresioacuten
de proteiacutenas de cubierta
Rab1 es una GTPasa crucial en los procesos que implican la regulacioacuten
del traacutefico entre el RE-AG y de especial intereacutes en este apartado el
direccionamiento de las vesiacuteculas producidas desde el REt La interaccioacuten
entre Rab1 y p115 permite el acercamiento de vesiacuteculas con cubierta tipo
COP II asiacute como la subsecuente asociacioacuten entre v y t SNARE para dar lugar
a la formacioacuten del ERGIC (Short et al 2005) El nivel alterado de expresioacuten de
la proteiacutena de acercamiento p115 causa fallos graves en el transporte
anteroacutegrado (Aacutelvarez et al 1999) y fragmentacioacuten del AG (Sohda et al 2005)
El anaacutelisis del perfil bioquiacutemico no exhibioacute alteracioacuten en los niveles de
expresioacuten para esta proteiacutena descartando cualquier participacioacuten de p115 en
los desordenes causados a la morfologiacutea del AG o del transporte Sin embargo
la expresioacuten de la pequentildea GTPasa Rab1 siacute mostroacute incremento significativo
desde el tercer diacutea de tratamiento Aparentemente bajo el microscopio de
fluorescencia y electroacutenico la morfologiacutea del RE vesiacuteculas tipo COP II y
compartimento intermedio no resultaron afectadas por el tratamiento aunque si
se produjo una alteracioacuten en su distribucioacuten Las vesiacuteculas tipo COP II se
organizaron alrededor de las inclusiones citoplasmaacuteticas distribucioacuten que fue
acompantildeada a su vez con la formacioacuten de pequentildeos dictiosomas aislados Por
tanto estos hallazgos sugieren que las vesiacuteculas con cubierta tipo COP II estaacuten
emergiendo desde RE y que en grado variable alcanzan sus membranas
dianas aunque es posible que se produzca una reduccioacuten en la capacidad de
reclutamiento de estas Muy probablemente la ceacutelula intenta superar esta
deficiencia en el transporte incrementando los niveles de Rab1 aunque parece
que esta respuesta fisioloacutegica no es suficiente para antagonizar el efecto
citotoacutexico al que se encuentra sometida
DISCUSIOacuteN
194
En nuestro estudio no hemos analizado el transporte post-Golgi sin
embargo en el quinto diacutea de tratamiento con la neurotoxina MET encontramos
una represioacuten importante en la expresioacuten de sintaxina-6 SNARE que interactuacutea
con golginas especiacuteficas del TGN la cual no presentoacute signos de agregacioacuten Es
conocido que la interaccioacuten de golginas especiacuteficas del TGN con sintaxina-6
permite mantener la estabilidad estructural y la dinaacutemica del TGN (Luke et al
2003) Asiacute que estos hallazgos se interpretan como mecanismo de alteracioacuten
del traacutefico en la porcioacuten del AG encargada de recibir y clasificar cargo en enviacuteos
especiacuteficos No obstante sabemos que al quinto diacutea de tratamiento el dantildeo en
el traacutefico puede ser desencadenado por un efecto multifactorial debido a la
gran alteracioacuten que sucede sobre diferentes proteiacutenas que se encuentran
implicadas en el mantenimiento y regulacioacuten del transporte intracelular de
membranas
6 Fragmentacioacuten del complejo de Golgi y niveles de expresioacuten de proteiacutenas
El anaacutelisis de las ceacutelulas tratadas con las neurotoxinas 6-OHDA y MET a
lo largo del tiempo nos ha permitido identificar de forma independiente los
cambios en la morfologiacutea del AG y del transporte RE-AG asiacute como la cineacutetica
de agregacioacuten de la proteiacutena αs De hecho los resultados obtenidos a traveacutes
del estudio morfoloacutegico nos brindo la informacioacuten de partida para emprender la
buacutesqueda de posibles proteiacutenas involucradas en este fenoacutemeno
Es conocido que numerosos factores pueden alterar la estructura en cinta
del AG una de estas condiciones es la alteracioacuten en los niveles de expresioacuten
de determinadas golginas (Satoh et al 2003 Horton et al 2005 Puthenveedu
et al 2006 Marra et al 2007) Los datos obtenidos demuestran fragmentacioacuten
del AG desde el primer diacutea de tratamiento con MET siendo mucho maacutes
llamativo despueacutes de tres diacuteas de exposicioacuten No obstante al tercer diacutea de
tratamiento el anaacutelisis del perfil bioquiacutemico no arrojoacute valores alterados en el
nivel de expresioacuten de golginas evaluadas durante el tiempo de exposicioacuten a la
DISCUSIOacuteN
195
neurotoxina apuntando que la fragmentacioacuten del AG se debe a otras causas
Sin embargo en ceacutelulas tratadas durante 5 diacuteas con MET siacute se observoacute
alteracioacuten significativa para este tipo de proteiacutenas
Tambieacuten se ha postulado que durante el desarrollo de inclusiones
citoplasmaacuteticas se produce un secuestro importante de proteiacutenas (Waxman y
Giasson 2009) que incluyen aquellas reguladoras del traacutefico asiacute como de
proteiacutenas de acercamiento y proteiacutenas SNARE (Lashuel y hirling 2006)
fenoacutemeno que podriacutea inducir fragmentacioacuten del AG ademaacutes de una grave
deficiencia para llevar a cabo los procesos normales del transporte Sin
embargo nuestros resultados muestran ausencia de signos de agregacioacuten para
este tipo de proteiacutenas durante todo el periacuteodo de tratamiento con ambas
neurotoxinas por lo que pensamos que la fragmentacioacuten del AG no es
provocado por el efecto del secuestro de proteiacutenas involucradas en el
transporte ademaacutes como profundizaremos maacutes adelante la fragmentacioacuten
precede a la formacioacuten de inclusiones intracitoplasmaacuteticas
Los datos resultantes demuestran que en nuestro modelo la morfologiacutea
de este compartimiento estaacute directamente relacionada con los niveles de
expresioacuten de un nuacutemero limitado de proteiacutenas reguladoras del traacutefico
denominadas Rab GTPasas asiacute como de la proteiacutena SNARE sintaxina-5 La
sobreexpresioacuten de Rab1A y 8 y la deplecioacuten de Rab2 y sintaxina-5 restituyeron
la morfologiacutea del AG Por el contrario la sobreexpresioacuten de Rab2 y sintaxina-5
y la deplecioacuten de Rab1 y Rab8 incrementaron el dantildeo de este orgaacutenulo Las
GTPasas Rab1 2 y 8 se localizan en el AG aunque no se limitan a esta
estructura Rab1 y 2 regulan el transporte entre RE-AG La GTPasa Rab 2
abundantemente identificada en ceacutelulas neuronales PC12 (Tachibana et al
1992) juega un importante papel en los procesos de diferenciacioacuten neuronal
(Ayala et al 1990) Rab8 GTPasa enriquecida en el cerebro y la cual es
esencial en el control del transporte en ceacutelulas polarizadas como las neuronas
(Ng y Tang 2008) estaacute involucrada en el traacutefico post-Golgi (Stenmark 2009)
En nuestro modelo no se encontroacute participacioacuten en el proceso citopatogeacutenico
de otras proteiacutenas Rab residentes del AG como Rab6 oacute involucradas en la
exocitosis neuronal como Rab3A Estos experimentos demuestran claramente
DISCUSIOacuteN
196
que Rab1 2 y 8 son importantes en eacuteste y otros modelos de la EP Rab1 y 8
han sido implicados anteriormente en la citopatologiacutea de la enfermedad de
Parkinson sin embargo esto no puede excluir el papel de otras proteiacutenas Rab
Pese a la ausencia de alteracioacuten en los niveles de expresioacuten de otras proteiacutenas
Rab en este modelo no podemos asegurar que la funcioacuten de estas no estaacute
afectada ya que dichas proteiacutenas dependen de modificaciones especiales
desencadenadas por activacioacuten o inhibicioacuten Nuevos estudios seraacuten necesarios
para rechazar esta posibilidad
Nuestros hallazgos demuestran que estas proteiacutenas Rab estaacuten
involucradas en otros procesos celulares no descritos anteriormente asociados
a la referida entidad patoloacutegica A nuestro entender no hay precedentes que
impliquen a la proteiacutena Rab2 en la EP debido muy posiblemente a que esta
GTPasa no estaacute presente en la levadura (Pereira-Leal y Seabra 2001) o tal vez
porque juega un papel diferente a los de Rab1 y 8 Es notorio que la
sobreexpresioacuten de Rab2 en contraste con los de Rab1 y 8 tenga un efecto
toacutexico sobre las ceacutelulas tratadas con la neurotoxina MET lo que puede explicar
en parte porque su papel ha sido enmascarado Igualmente nuestros
resultados muestran claramente que los experimentos de sobreexpresioacuten no
son suficientes para analizar las proteiacutenas potencialmente implicadas en la
patologiacutea de la EP por lo que fue necesario realizar un estudio de
comprobacioacuten mediante deplecioacuten a traveacutes de ensayos con especiacuteficos ARNs
de interferencia
El efecto maacutes potente en la morfologiacutea del AG se ha observado con Rab1
proteiacutena necesaria para el mantenimiento de la arquitectura y funcioacuten del AG
(Haas et al 2010) Nuestros resultados sugieren que el correcto balance de
estas proteiacutenas Rab es necesario para mantener la morfologiacutea normal de este
orgaacutenulo Las proteiacutenas Rab GTPasas son interruptores moleculares que
controlan el traacutefico de membranas mediante la interaccioacuten con sus proteiacutenas
efectoras incluyendo proteiacutenas de matriz del AG que participan directamente
en la unioacuten lateral de los dictiosomas Este es el caso de p115 Giantina o
Golgina-84 (Mironov y Beznoussenko 2011) que interactuacutean con Rab1
(Stenmark et al 2009) La interaccioacuten Rab1Golgina-84 es crucial en el
DISCUSIOacuteN
197
mantenimiento de la estructura del AG (Satoh et al 2003) Asimismo Rab1 es
importante para mantener la estructura del AG al permitir que los componentes
propios de este orgaacutenulo asiacute como el cargo puedan ser transferidos desde el
RE Es faacutecil pues imaginar que la disfuncioacuten de proteiacutenas Rab o la variacioacuten
anormal en los niveles de estas proteiacutenas provocados por diferentes causas
puede afectar seriamente la arquitectura del AG
La implicacioacuten de la sobreexpresioacuten de Rab2 en la fragmentacioacuten del AG
o la deplecioacuten en su restauracioacuten puede ser explicada analizando el
mecanismo de su propio funcionamiento La pequentildea GTPasa Rab 2 participa
activamente en el reclutamiento del coatoacutemero a intermediarios pre-Golgi
(Tisdale y Balch 1996 Tisdale y Jackson 1998 Tisdale 2000) indicando que
Rab2 es esencial para la correcta maduracioacuten de los intermediarios pre-Golgi
Por tanto nuestros resultados sugieren que la accioacuten sostenida de Rab2 en la
forma sobreexpresada causa un persistente reclutamiento de COP I en
intermediarios pre-Golgi los cuales en uacuteltima instancia secuestrariacutean el cargo
debido a la inhabilidad de estas membranas para desensamblar su cubierta
Esta alteracioacuten del transporte induciriacutea la fragmentacioacuten del AG
En el presente estudio tambieacuten examinamos el perfil bioquiacutemico de las
proteiacutenas SNARE que pudieran estar implicadas en la fragmentacioacuten del AG
por induccioacuten neurotoacutexica Dos complejos SNARE operan en la viacutea secretora
temprana (Volchuk et al 2004) De las siete proteiacutenas que forman estos
complejos soacutelo sintaxina-5 mostroacute alteracioacuten despueacutes del tercer diacutea de
tratamiento Curiosamente sintaxina-5 participa en los dos complejos SNARE
asociados con el transporte entre RE-AG y el transporte intra-Golgi Por tanto
se convierte en un elemento necesario para mantener la funcionalidad del
transporte y la morfologiacutea del AG Como hemos descrito para la proteiacutena
GTPasa Rab2 tambieacuten la deplecioacuten de sintaxina-5 restaura la morfologiacutea del
AG mientras que un exceso de esta induce fragmentacioacuten Niveles normales
de expresioacuten de su forma aberrante inhiben el proceso de ensamblaje de los
complejos SNARE (Thayanidhi et al 2010) Los niveles de sintaxina-5 despueacutes
del tercer diacutea de tratamiento con MET fueron significativamente inferiores
comparados con las muestras control lo que sugiere el intento celular de
DISCUSIOacuteN
198
adaptacioacuten fisioloacutegica como mecanismo protector de concentraciones nocivas
de sintaxina-5 bajo estas condiciones especiacuteficas de induccioacuten citopaacutetica
Estudios previos han revelado que dominios especiacuteficos de las proteiacutenas
SNARE sintaxina 1 y 5 actuacutean como potentes inhibidores del proceso de
ensamblaje de los complejos SNARE tanto a nivel de la exocitosis (Calakos et
al 1994 Nicholson et al 1998) como en el transporte RE-AG (Xu et al
2000) Igualmente es conocido que la ceacutelula requiere de mecanismos
especiacuteficos para el bloqueo de estos dominios con capacidad de regulacioacuten
inhibitoria sin embargo es posible que bajo ciertas condiciones citopatoloacutegicas
este proceso se vea alterado funcionando deficientemente Nuestro modelo
demuestra que de alguna forma la actividad de sintaxina-5 estaacute actuando
negativamente en ceacutelulas tratadas Es asiacute como el 100 de las ceacutelulas que
sobreexpresaron la proteiacutena sintaxina-5 mostraron un AG fragmentado por
tanto la sobreexpresioacuten de esta importante SNARE incrementa la
fragmentacioacuten del AG Quizaacutes debido a este fenoacutemeno igual que hemos
mencionado anteriormente la ceacutelula responde disminuyendo los niveles de
expresioacuten de sintaxina 5 como sentildeal de adaptacioacuten
7 Relacioacuten entre la fragmentacioacuten del complejo de Golgi inclusiones intracitoplasmaacuteticas y alteracioacuten del traacutefico celular
Estudios anteriores han mostrado que el efecto primario de la agregacioacuten
de la proteiacutena αs se relaciona con la alteracioacuten del transporte entre el RE y el
AG debido a la inhibicioacuten del proceso de ensamblaje de complejos SNARE el
cual es dependiente de la proteiacutena Rab1 El efecto toacutexico de αs se puede
bloquear al inducir la sobreexpresioacuten de las GTPasas Rab3A y 8 lo que
sugiere alteracioacuten del transporte a niveles post-Golgi (Gitler et al 2008) En
general la sobreexpresioacuten de estas pequentildeas GTPasas tiene la capacidad de
restaurar el transporte RE-AG en el modelo de levadura y otros modelos
animales (Cooper et al 2006 Gitler et al 2008) Por otra parte se ha postulado
que la fragmentacioacuten del AG es el resultado de la formacioacuten de agregados
DISCUSIOacuteN
199
prefibrilares de αs (Gosavi et al 2002) yo el desequilibrio del traacutefico entre RE-
AG (Lashuel y Hirling 2006) En contraste con estos estudios hemos
descubierto en este modelo neuronal de EP que la fragmentacioacuten del AG es un
evento que ocurre en etapas tempranas del proceso citopaacutetico el cual precede
a la agregacioacuten de la proteiacutena αs asiacute como cualquier dantildeo del citoesqueleto de
microtuacutebulos o alteracioacuten del traacutefico celular Esto no es sorprendente dado que
el mantenimiento en la funcionalidad del AG en estado fragmentado se ha
demostrado en ceacutelulas tratadas con el agente despolimerizante de microtuacutebulos
nocodazol (Storrie et al 1998) De hecho no estaacute claro por queacute la mayoriacutea de
las ceacutelulas de mamiacuteferos contienen un AG en cinta esto es dictiosomas unidos
lateralmente En neuronas esta estructuracioacuten podriacutea estar relacionada con el
mantenimiento de la polarizacioacuten (Horton et al 2005) La fragmentacioacuten del AG
fue significativamente mayor despueacutes del tercer diacutea de tratamiento con ambas
neurotoxinas lo que puede ser explicado por el avance en la alteracioacuten de los
niveles de expresioacuten de un alto nuacutemero de proteiacutenas asociadas al transporte
entre el retiacuteculo endoplaacutesmico y el aparato de Golgi y viceversa asiacute como de
proteiacutenas implicadas en el mantenimiento de la arquitectura de este orgaacutenulo
Nuestros resultados sugieren adicionalmente que las formas insolubles de la
proteiacutena αs halladas al quinto diacutea de tratamiento tienen un efecto mucho maacutes
dantildeino sobre la maquinaria del transporte que el incremento en los niveles de
expresioacuten de su forma monomeacuterica puesto que el nivel de expresioacuten de αs
resultoacute incrementado al tercer diacutea de tratamiento con la neurotoxina MET
aunque el transporte no presentoacute alteraciones significativas Sin embargo
teniendo en cuenta las alteraciones observadas en el transporte en el quinto
diacutea de tratamiento con ambas neurotoxinas apoyamos la idea donde se
considera que el acuacutemulo de αs asiacute como el incremento en sus niveles de
expresioacuten son nefastos en un momento determinado del proceso
citopatogeacutenico para la funcioacuten correcta del traacutefico intracelular
Para poder correlacionar los dantildeos en el transporte con la formacioacuten de
inclusiones realizamos experimentos usando la droga BFA donde
inmunomarcamos contra la proteiacutena αs para identificar la formacioacuten de
agregados intracelulares y con un marcador del AG para examinar los cambios
en la cineacutetica de reensamblaje del AG (-BFA) en presencia de este gran
DISCUSIOacuteN
200
obstaacuteculo mecaacutenico Los ensayos realizados sobre ceacutelulas expuestas durante
tres diacuteas con la neurotoxina MET no mostraron cambios comparados con las
ceacutelulas control guardando concordancia con los datos a tres diacuteas que
muestran ausencia de inclusiones Sin embargo al quinto diacutea de tratamiento
se observaron grandes diferencias en la cineacutetica de reensamblaje del AG entre
las ceacutelulas que presentaban inclusiones y las que teniacutean ausencia de estas En
contraste con el estudio realizado por Gosavi y colaboradores (Gosavi et al
2002) nuestros resultados muestran que el 100 de las ceacutelulas que
desarrollaron agregados exhibieron un patroacuten de Golgi en pequentildeos
fragmentos alrededor de una gran inclusioacuten Estos hallazgos indican que el
dantildeo en el transporte o la respuesta celular se produce de forma concomitante
con la aparicioacuten de inclusiones intracelulares
Por otra parte en nuestros resultados hemos mencionado la presencia de
agregados a nivel de las terminales axoacutenicas o en las proyecciones neuriacuteticas
de las ceacutelulas PC12 tratadas con 6-OHDA y MET lo cual se podriacutea asociar a
eventos citopaacuteticos lesivos que obedecen a un fenoacutemeno retroacutegrado que
comienza con un grave dantildeo a nivel de las terminales axoacutenicas y se extiende
hasta el soma causando alteraciones serias del transporte y de la funcioacuten
celular como se ha sugerido extensamente en estudios previos (Iwatsubo et
al 1996 Trojanowski et al 1998 Hashimoto y Masliah 1999 Lansbury 1999
Orimo et al 2008 Greffard et al 2010) Sin embargo el presente estudio
reveloacute que fue mucho mayor el nuacutemero de ceacutelulas tratadas que presentaron
inclusiones citoplasmaacuteticas no acompantildeadas de agregados a nivel de la
terminal axoacutenica lo que sugiere que la lesioacuten producida en las neuronas
dopamineacutergicas no depende necesariamente de una secuencia de eventos
citopatogeacutenicos generados por un proceso retrogrado No obstante nuestros
hallazgos apoyan la idea que el dantildeo inducido por el tratamiento neurotoacutexico
puede reflejarse en alteraciones sobre la maquinaria del transporte a nivel de la
viacutea de secrecioacuten temprana y tardiacutea concomitantemente como se ha descrito
anteriormente pero de forma aislada (Cooper et al 2006 Thayanidhi et al
2010 Garciacutea Reitboumlck et al 2011)
DISCUSIOacuteN
201
En conclusioacuten nosotros consideramos que hay una correlacioacuten entre
fragmentacioacuten del AG inclusiones intracitoplasmaacuteticas y alteracioacuten del traacutefico
intracelular en ceacutelulas neuronales PC12 tratadas con 6-OHDA oacute MET La
fragmentacioacuten del AG reflejo en la alteracioacuten de las proteiacutenas reguladoras del
transporte Rab1 2 y 8 asiacute como la SNARE sintaxina-5 es la puerta que
permite la aparicioacuten de cuerpos de inclusioacuten dantildeo del sistema del citoesqueleto
y generacioacuten de alteraciones del traacutefico intracelular
Un hallazgo muy significativo fue el efecto positivo de la sobreexpresioacuten
de la GTPasa Rab1A sobre el desarrollo de inclusiones intracelulares ya que
nuestros resultados sugieren que la fragmentacioacuten del AG entre otras causas
facilita la formacioacuten de agregados Los datos demuestran que la GTPasa
Rab1A posee la capacidad de bloquear la formacioacuten de agregados celulares
indicando que esta GTPasa ademaacutes de rescatar la morfologiacutea del AG tambieacuten
bloquea la agregacioacuten proteica
Aunque αs estaacute presente en muchas partes del cerebro (Lashuel y Hirling
2006) la agregacioacuten de esta proteiacutena en la EP ocurre primariamente sobre
neuronas dopamineacutergicas por lo que αs por siacute sola no puede explicar la
degeneracioacuten selectiva de este tipo de neuronas por tanto el efecto toacutexico de
la sobreexpresioacuten expresioacuten de formas aberrantes o mutadas de la proteiacutena
αs viene acompantildeado de condiciones que facilitan la aparicioacuten de los dantildeos
provocados a nivel celular Especiacuteficamente en este modelo neuronal de EP
inducido por el tratamiento neurotoacutexico se produjo sobreexpresioacuten de αs lo
que estimuloacute una serie de cambios adaptativos en un intento por superar el
ataque toacutexico Muy probablemente el incremento en los niveles de expresioacuten de
la proteiacutena Rab1 fue clave de este mecanismo de defensa aunque no fue lo
suficientemente potente como para impedir por completo el desarrollo de
inclusiones citoplasmaacuteticas Sin embargo la sobreexpresioacuten de Rab1 por
induccioacuten exoacutegena por si sola tuvo la capacidad de restaurar la morfologiacutea del
AG e impedir la formacioacuten de agregados proteicos Postulamos que la
sobreexpresioacuten de Rab1 puede frenar el ataque de las formas oligomeacutericas y
protofibrilares de la proteiacutena αs ya que es conocido que estas formas
anoacutemalas de αs pueden ser mucho maacutes criacuteticas que las mismas inclusiones en
DISCUSIOacuteN
202
la patogeacutenesis de la EP (Wakabayashi et al 2007) Asiacute las ceacutelulas
sobrevivientes seriacutean aquellas con mejor respuesta adaptativa o simplemente
desarrollariacutean inclusiones como parte del proceso donde eacutestas uacuteltimas estaacuten
destinadas igualmente a morir lo cual puede ser demostrado por el nuacutemero tan
constante de neuronas dopamineacutergicas de la SNc con presencia de cuerpos de
Lewy de cerebros de pacientes parkinsonianos comprendidos entre variadas
edades y diferentes estadios de la enfermedad
8 Consideraciones finales
De alguna manera la fragmentacioacuten del AG y la agregacioacuten de α-
sinucleiacutena estaacuten relacionadas Obseacutervese que en el doble inmunomarcaje
αsGM130 todas las ceacutelulas con presencia de inclusiones mostraron un AG
fragmentado el cual estaba ubicado alrededor del agregado Puesto que la
fragmentacioacuten del AG precede a la formacioacuten de las inclusiones
yuxtanucleares parece muy probable que los agregados se desarrollan en el
centro de organizacioacuten de la cinta de dictiosomas Considerando que la
biogeacutenesis de los cuerpos de Lewy es un evento relacionado con agresomas
(McNaught et al 2002) muy posiblemente la posicioacuten del AG e inclusiones
estaacute determinada por el centrosoma Se ha postulado que la agregacioacuten de γ-
tubulina en los cuerpos de Lewy asiacute como el reclutamiento de proteiacutenas
anormales en el centrosoma puede provocar la desorganizacioacuten del mismo con
la subsecuente alteracioacuten en sistema del citoesqueleto y desensamblaje
posterior del AG (Diacuteaz-Corrales et al 2005) Sin embargo nuestros resultados
apuntan en otra direccioacuten donde explicamos como la rotura del AG puede ser
una especie de sentildeal indicativa de alguacuten tipo de lesioacuten intracelular lo que
activa la maquinaria celular de defensa la cual incluye la formacioacuten de
cuerpos intracelulares semejantes a agresomas Asiacute la fragmentacioacuten de este
compartimiento facilitariacutea la agregacioacuten de αs y detraacutes de esta el acuacutemulo de
muchas otras lo que seguidamente provocariacutea las alteraciones en el
transporte
CONCLUSIONES
205
XIII CONCLUSIONES
1 La liacutenea celular de feocromocitoma de rata PC12 en su estado neuronal es
un excelente modelo para reproducir las alteraciones de la ruta secretora
temprana que se presentan de forma natural en la enfermedad de Parkinson
2 Los eventos citopaacuteticos de las neurotoxinas 6-hidroxidopamina y
metanfetamina conducen a la sobreexpresioacuten y fibrilacioacuten de la proteiacutena α -
sinucleiacutena y a la formacioacuten de agregados citoplasmaacuteticos en ceacutelulas PC12
diferenciadas lo que permitioacute relacionarlos con las alteraciones de la
morfologiacutea del aparato de Golgi y del traacutefico celular
3 El tratamiento prolongado con neurotoxinas induce graves alteraciones del
transporte anteroacutegrado y retroacutegrado en la viacutea secretora temprana
desorganizacioacuten del citoesqueleto y modificaciones importantes en el nivel
de expresioacuten de proteiacutenas asociadas con el aparato de Golgi
4 La fragmentacioacuten del complejo de Golgi es un indicador temprano de
neurodegeneracioacuten que precede a las alteraciones del transporte en la ruta
secretora temprana y del citoesqueleto
5 La arquitectura del aparato de Golgi en ceacutelulas tratadas con neurotoxinas
depende de los niveles de expresioacuten de unas pocas moleacuteculas reguladoras
del traacutefico intracelular como son Rab1 2 y 8 y sintaxina-5 confirmando la
estrecha relacioacuten entre eacuteste y el desarrollo de la enfermedad de Parkinson
6 La integridad morfofuncional del aparato de Golgi y el desarrollo de
inclusiones citoplasmaacuteticas estaacuten iacutentimamente relacionadas siendo la
proteiacutena Rab1 clave en la regulacioacuten de este proceso
CONCLUSIONES
206
7 Nuestros resultados apoyan la hipoacutetesis de que la fragmentacioacuten del aparato
de Golgi es una sentildeal que indica que la maquinaria de defensa de la ceacutelula
debe activarse incluyendo la formacioacuten de agregados citoplasmaacuteticos del
tipo agresoma
ABSTRACT
209
IX ABSTRACT
The pathological hallmark of PD is the formation of intracellular protein
inclusions known as Lewy bodies of which α-synuclein (α-syn) is the major
component In recent years it has become clear that the primary effect of α-syn
overexpression andor aggregation is the alteration of early events of the
secretory pathway Aggregates of α-syn may inhibit ER-to-Golgi transport
reducing the levels of vesicular monoamine transporter to synapse This results
in the accumulation of toxic dopamine in the cytosol causing oxidative stress
and finally cell death In yeast the overexpression of specific Rab SNARE and
COPII coat-related proteins protects against α-syn-induced damage Thus
proteins mediating the specific binding between transport carriers and target
membranes in the early secretory pathway are the keys to understanding the
molecular mechanisms that trigger PD neurodegeneration One of the
consequences of alterations in the ER-to-Golgi trafficking induced by α-syn-
overexpressionaggregation may be breakage of the Golgi ribbon
Fragmentation of this organelle has been reported in many neurodegenerative
disorders The imbalance of incoming and outgoing transport could lead to
Golgi fragmentation in dopaminergic neurons
In the present study we analyze the mechanisms involved in Golgi
fragmentation in differentiated PC12 cells treated with 6-hydroxidopamine or
methamphetamine as cellular models of Parkinsonacutes disease Our data
demonstrate that Golgi fragmentation precedes and might trigger aggregation of
-synuclein and the formation of inclusions alterations in anterograde and
retrograde transport between the endoplasmic reticulum and Golgi complex
and cytoskeleton damage In contrast fragmentation is directly related with
alterations in the levels of Rab1 2 and 8 and the SNARE protein syntaxin 5
Thus overexpression of Rab1 and 8 and depletion of Rab 2 and syntaxin 5
rescue Golgi morphology In conclusion the homeostasis of a limited number of
Rab and SNARE proteins is important for understanding cytopathology of
Parkinsonacutes disease The breakage of the Golgi ribbon may be a sort of signal
ABSTRACT
210
indicative that something in the cell is amiss so that the cell defense machinery
must be started which could include the formation of aggresome-like bodies
BIBLIOGRAFIacuteA
213
X BIBLIOGRAFIacuteA
Abdel-Salam OM (2008) Drugs used to treat Parkinsons disease present
status and future directions CNS Neurol Disord Drug Targets 4 321-342
Abeliovich A Schmitz Y Farinas I Choi-Lundberg D Ho WH Castillo PE
Shinsky N Verdugo JM Armanini M Ryan A Hynes M Phillips H Sulzer D
Rosenthal A (2000) Mice lacking alpha-synuclein display functional deficits in
the nigrostriatal dopamine system Neuron 25 239 ndash252
Ahn BH Rhim H Kim SY Sung YM Lee MY Choi JY Wolozin B Chang JS
Lee YH Kwon TK Chung KC Yoon SH Hahn SJ Kim MS Jo YH Min DS
(2002) α-Synuclein interacts with phospholipase D isozymes and inhibits
pervanadate-induced phospholipase D activation in human embryonic kidney-
293 cells J Biol Chem 277 12334ndash12342
Allan BB Moyer BD Balch WE (2000) Rab1 recruitment of p115 into a
cisSNARE complex programming budding COPII vesicles for fusion Science
289 444-448
Alvarez C Fujita H Hubbard A Sztul E (1999) ER to Golgi transport
Requirement for p115 at a pre-Golgi VTC stage J Cell Biol 6 1205ndash1222
Alvarez-Fischer D Henze C Strenzke C Westrich J Ferger B Hoglinger GU
Oertel WH Hartmann A (2008) Characterization of the striatal 6-OHDA model
of Parkinsonrsquos disease in wild type and a-synuclein-deleted mice Exp Neurol
210 182ndash193
Anderson JP Walker DE Goldstein JM de Laat R Banducci K Caccavello RJ
Barbour R Huang J Kling K Lee M Diep L Keim PS Shen X Chataway T
Schlossmacher MG Seubert P Schenk D Sinha S Gai WP Chilcote TJ
(2006) Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of
alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease J Biol Chem 281
29739ndash52
BIBLIOGRAFIacuteA
214
Antkiewicz-Michaluk L (2002) Endogenous risk factors in Parkinsonrsquos disease
dopamine and tetrahydroisoquinolines Pol J Pharmacol 54 567ndash572
Arias P Cudeiro J (2008) Effects of rhythmic sensory stimulation (auditory
visual) on gait in Parkinsons disease patients Exp Brain Res 4 589-601
Aridor M Balch WE (1996) Membrane fusion timing is everything Nature 383
220-221
Artalejo AR (2005) La maquinaria molecular de la exocitosis en las ceacutelulas
cromafines de la meacutedula adrenal Anal Real Acad Nac Farm 71 127-151
Ashery U Varoqueaux F Voets T Betz A Thakur P Koch H Neher E Brose
N Rettig J (2000) Munc13-1 acts as a priming factor for large-dense core
vesicles in bovine chromaffin cells EMBO J 19 3586-3596
Aslan JE Thomas G (2009) Death by committee organellar trafficking and
communication in apoptosis Traffic 10 1390-1404
Ayala J Touchot N Zahraoui A Tavitian A Prochiantz A (1990) The product of
rab2 a small GTP binding protein increases neuronal adhesion and neurite
growth in vitro Neuron 5 797-805
Baumlck N Soinila S Joh TH Rechardt L (1987) Catecholamine-synthesizing
enzymes in the rat pituitary An immunohistochemical study Histochemistry 5
459-64
Bahema-Trujillo R Gonzalo JA Arias M (2000) Dopamina Siacutentesis liberacioacuten
y receptores en el Sistema Nervioso Central Rev Biomed 1 39-60
Baik JH Picetti R Saiardi A Thiriet G Dierich A Depaulis A Le Meur M
Borrelli E (1995) Parkinsonian-like locomotor impairment in mice lacking
dopamine D2 receptors Nature 6548 424-428
Bannykh SI Rowe T Balch WE (1996) The organization of endoplasmic
reticulum export complexes J Cell Biol 135 19-35
BIBLIOGRAFIacuteA
215
Bar Am O Amit T Youdim MB (2004) Contrasting neuroprotective and
neurotoxic actions of respective metabolites of anti-Parkinson drugs rasagiline
and selegiline Neurosci Lett 3 169-72
Barlowe C (1998) COPII and selective export from the endoplasmic reticulum
Biochim Biophys Acta 1404 67-76
Barlowe C Orci L Yeung T Hosobuchi M Hamamoto S Salama N Rexach
MF Ravazzola M Amherdt M Schekman R (1994) COPII a membrane coat
formed by Sec proteins that drive vesicle budding from the endoplasmic
reticulum Cell 77 895-907
Barlowe C Schekman R (1993) SEC12 encodes a guanine-
nucleotideexchange factor essential for transport vesicle budding from the ER
Nature 365 347-349
Basma AN Heikkila RE Saporito MS Philbert M Geller HM Nicklas WJ
(1992) 1-Methyl-4- 2 -ethylphenyl -1236-tetrahydropyridine-induced toxicity in
PC12 cells is enhanced by preventing glycolysis J Neurochem 58 1052ndash
1059
Bassham DC Blatt MR (2008) SNAREs Cogs and Coordinators in Signaling
and Development1 Plant Physiology 147 1504-1515
Battaglia G Fornai F Busceti CL Aloisi G Cerrito F De Blasi A Melchiorri D
Nicoletti F (2002) Selective blockade of mGlu5 metabotropic glutamate
receptors is protective against methamphetamine neurotoxicity J Neurosci 22
2135ndash2141
Beal MF (2001) Experimental models of Parkinsons disease Nat Rev
Neurosci 5 325-34
Ben Tekaya H Miura K Pepperkok R and Hauri H P (2005) Live imaging of
bidirectional traffic from the ERGIC J Cell Sci 118 357-367
Bennet MK Calakos NY Scheller RH (1992) Syntaxin a synaptic protein
implicated in docking of synaptic vesicles at presynaptic active zones Science
257 255-259
BIBLIOGRAFIacuteA
216
Betarbet R Sherer TB Greenamyre JT (2002) Animal models of Parkinsons
diseaseBioessays 4 308-18
Betarbet R Sherer TB MacKenzie G Garcia-Osuna M Panov AV
Greenamyre JT (2000) Chronic systemic pesticide exposure reproduces
features of Parkinsons disease Nat Neurosci 12 1301-1306
Bezard E Porras G Blesa J Obeso JA (2010) Compensatory Mechanisms in
Experimental and Human Parkinsonism Potential for New Therapies Handbook
of Basal Ganglia Structure and Function Elsevier BV 641-652
Binolfi A Rodriguez EE Valensin D DAmelio N Ippoliti E Obal G Duran R
Magistrato A Pritsch O Zweckstetter M Valensin G Carloni P Quintanar L
Griesinger C Fernaacutendez CO (2010) Bioinorganic chemistry of Parkinsons
disease structural determinants for the copper-mediated amyloid formation of
alpha-synuclein Inorg Chem 22 10668-10679
Block MR Glick BS Wilcox CA Wieland FT Rothman JE (1988) Purification of
an N-ethylmaleimide-sensitive protein catalyzing vesicular transport Proc Natl
Acad Sci U S A 85 7852-7856
Bock JB Marten HT Peden AA Scheller RH (2001) A genomic perspective on
membrane compartment organization Nature 409 839-841
Bonuccelli U (2003) Comparing dopamine agonists in Parkinsonrsquos disease
Curr Opin Neurol S1 13ndash19
Budnik A Stephens DJ (2009) ER exit sites-localization and control of COPII
vesicle formation FEBS Lett 23 3796-3803
Burton EA Glorioso JC Fink DJ (2003) Gene therapy progress and prospects
PD Gene Ther 10 1721ndash1727
Cabin DE Shimazu K Murphy D Cole N Gottschalk W McIlwain K Orrison B
Chen A Ellis C Paylor R Lu B Nussbaum RL (2002) Synaptic vesicle
depletion correlates with attenuated synaptic Responses to prolonged repetitive
stimulation in mice lacking alpha-synuclein J Neurosci 22 8797ndash8807
BIBLIOGRAFIacuteA
217
Cadet JL Katz M Jackson-Lewis V Fahn S (1989) Vitamin E attenuates the
toxic effects of intrastriatal injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in rats
behavioral and biochemical evidence Brain Res 1 10-15
Calakos N Bennett MK Peterson KE Scheller RH (1994) Protein-protein
interactions contributing to the specificity of intracellular vesicular trafficking
Science 5150 1146ndash1149
Cardenas S Perez-Pastene C Couve E Segura-Aguilar J (2008) The DT-
diaphorase prevents the aggregation of a-synuclein induced by aminochrome
Neurotoxicity Res 13 136
Cebriaacuten C Parent A Prensa L (2005) Patterns of axonal branching of neurons
of the substantia nigra pars reticulata and pars lateralis in the rat J Comp
Neurol 492 349ndash369
Cebriaacuten C Prensa L (2009) Basal Ganglia and Thalamic Input From Neurons
Located Within the Ventral Tier Cell Cluster Region of the Substantia Nigra Pars
Compacta in the Rat J Comparative Neurology 518 1283-1300
Chanat E Dittie AS Tooze SA (1998) Analysis of sorting of secretory proteins
to the regulated secretory pathway A subcellular fragtionation approach
Methods Cell Biol 88 285-324
Chandra S Fornai F Kwon HB Yazdani U Atasoy D Liu X Hammer RE
Battaglia G German DC Castillo PE dhof TC (2004) Double-knockout mice
for α and β synucleins Effect on synaptic functions PNAS 41 14966ndash14971
Chen L Jin J Davis J Zhou Y Wang Y Liu J Lockhart PJ Zhang J (2007)
Oligomeric a-synuclein inhibits tubulin polymerization Biochemical and
Biophysical Research Communications 356 548ndash553
Chen Q Thorpe J Keller J (2005) Alpha-synuclein alters proteasome function
protein synthesis and stationary phase viability J Biol Chem 280 30009-
30017
BIBLIOGRAFIacuteA
218
Chen XC Zhu YG Zhu LA Huang C Chen Y Chen LM Fang F Zhou YC
Zhao CH (2003) Ginsenoside Rg1 attenuates dopamine-induced apoptosis in
PC12 cells by suppressing oxidative stress Eur J Pharmacol 1 1-7
Chen YA Scales SJ Scheller RH (2001) Sequential SNARE assembly
underlies priming and triggering of exocytosis Neuron 30 161-170
Choi WS Palmiter RD Xia Z (2011) Loss of mitochondrial complex I activity
potentiates dopamine neuron death induced by microtubule dysfunction in a
Parkinsons disease model J Cell Biol 5 873-82
Chua CE Tang BL (2006) alpha-synuclein and Parkinsonrsquos disease the first
roadblock J Cell Mol Med 4 837ndash846
Cicchetti F Brownell AL Williams K Chen YI Livni E Isacson O (2002)
Neuroinflammation of the nigrostriatal pathway during progressive 6-OHDA
dopamine degeneration in rats monitored by immunohistochemistry and PET
imaging Eur J Neurosci 15 991ndash998
Ciechanover A Brundin P (2003) The ubiquitin proteasome system in
neurodegenerative diseases sometimes the chicken sometimes the egg
Neuron 40 427-446
Clarke CE (2008) Are delayed-start design trials to show neuroprotection in
Parkinsonrsquos disease fundamentally flawed Mov Disord 23 784ndash89
Clary DO Griff IC Rothman JE (1990) SNAPs a family of NSF attachment
proteins involved in intracellular membrane fusion in animals and yeast Cell 61
709-721
Clayton D George J (1999) Synucleins in synaptic plasticity and
neurodegenerative disorders J Neurosci Res 58 120ndash129
Clermont Y Rambourg A Hermo L (1994) Connections between the various
elements of the cis- and mid-compartments of the Golgi apparatus of early rat
spermatids Anat Rec 240 469-480
BIBLIOGRAFIacuteA
219
Cockcroft S (2001) Signalling roles of mammalian phospholipase D1 and D2
Cell Mol Life Sci 58 1674ndash1687
Conway KA Lee SJ Rochet JC Ding TT Williamson RE Lansbury PT (2000)
Acceleration of oligomerization not fibrillization is a shared property of both
alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinsonrsquos disease
implications for pathogenesis and therapy Proc Natl Acad Sci USA 97
571ndash576
Conway KA Rochet JC Bieganski RM Lansbury PT (2001) Kinetic
stabilization of the alpha-synuclein protofibril by a dopamine alpha-synuclein
adduct Science 294 1346ndash1349
Cookson MR (2003) Neurodegeneration How does parkin prevent Parkinsonrsquos
disease Curr Biol 13 522-524
Cookson MR van der Brug M (2008) Cell systems and the toxic mechanisms
of alpha-synuclein Exp Neurol 209 5-11
Cookson MR Xiromerisiou G Singleton A (2005) How genetics research in
Parkinsons disease is enhancing understanding of the common idiopathic
forms of the disease Curr Opin Neurol 18 706-711
Cooper AA Gitler AD Cashikar A Haynes CM Hill KJ Bhullar B Liu K Xu K
Strathearn KE Liu F Cao S Caldwell KA Caldwell GA Marsischky G
Kolodner RD LaBaer J Rochet JC Bonini NM Lindquist S (2006) Alpha-
synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinsons
models Science 313 324-328
Cubells JF Rayport S Rajendran G Sulzer D (1994) Methamphetamine
neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-
dependent intracellular oxidative stress J Neurosci 14 2260ndash2271
Dahlstedt E Euler U Lishajko F and Ostlund E (1959) Observations on the
distribution and action of substance P in marine animals Acta Physiol Scand
15 124-30
BIBLIOGRAFIacuteA
220
Daniel J Erdelyi ME Phillips B (2011) Urine catecholamines in paediatrics
Arch Dis Child Educ Pract 96 107-111
Darios F Ruipeacuterez V Loacutepez I Villanueva J Gutierrez LM Davletov B (2010)
Alpha-synuclein sequesters arachidonic acid to modulate SNARE-mediated
exocytosis EMBO Rep 11 528-533
Dauer W Kholodilov N Vila M Trillat AC Goodchild R Larsen KE Staal R
Tieu K Schmitz Y Yuan C Rocha M Jackson-Lewis V Hersch S Sulzer D
Przedborski S Burke R Hen R (2002) Resistance of alpha - synuclein null
mice to the parkinsonian neurotoxin MPTP Proc Natl Acad Sci U S A 99
14524-14529
Dauer W Przedborski S (2003) Parkinsons disease mechanisms and models
Neuron 6 889-909
Davidson WS Jonas A Clayton DF George JM (1998) Stabilization of a -
synuclein secondary structure upon binding to synthetic membranes J Biol
Chem 273 9443ndash9449
de Lau LM Breteler MM (2006) Epidemiology of Parkinsons disease Lancet
Neurol 5 525-535
del Olmo MF Cudeiro J (2005) Temporal variability of gait in Parkinson
disease effects of a rehabilitation programme based on rhythmic sound cues
Parkinsonism Relat Disord 1 25-33
DePina AS Langford GM (1999) Vesicle transport the role of actin filaments
and myosin motors Microsc Res Tech 47 93-106
Di Rocco A Rogers JD Brown R Werner P Bottiglieri T (2000) S-Adenosyl-
Methionine improves depression in patients with Parkinsons disease in an
open-label clinical trial Mov Disord 6 1225-1229
Diao A Rahman D Pappin DJ Lucocq J Lowe M (2003) The coiled-coil
membrane protein golgin-84 is a novel rab effector required for Golgi ribbon
formation J Cell Biol 160 201-212
BIBLIOGRAFIacuteA
221
Diaz-Corrales FJ Asanuma M Miyazaki I Miyoshi K Ogawa N (2005)
Rotenone induces aggregation of gamma-tubulin protein and subsequent
disorganization of the centrosome relevance to formation of inclusion bodies
and neurodegeneration Neurosci 133 117-135
Drukarch B Jongenelen CA Schepens E Langeveld CH Stoof JC (1996)
Glutathione is involved in the granular storage of dopamine in rat PC 12
pheochromocytoma cells implications for the pathogenesis of Parkinsons
disease J Neurosci 19 6038-45
Duty S Jenner P (2011) Animal models of Parkinsons disease a source of
novel treatments and clues to the cause of the disease Br J Pharmacol 4
1357-1391
Egea G Lazaro-Dieguez F Vilella M (2006) Actin dynamics at the Golgi
complex in mammalian cells Curr Opin Cell Biol 18 168-178
Eggert K Schlegel J Oertel W Wurz C Krieg JC Vedder H (1999) Glial cell
linederived neurotrophic factor protects dopaminergic neurons from 6-
hydroxydopamine toxicity in vitro Neurosci Lett 269 178ndash82
Esselink RA de Bie RM de Haan RJ Lenders MW Nijssen PC van Laar T
Schuurman PR Bosch DA Speelman JD (2009) Long-term superiority of
subthalamic nucleus stimulation over pallidotomy in Parkinson disease
Neurology 2 151-153
Etminan M Carleton BC Samii A (2008) Non-steroidal anti-inflammatory drug
use and the risk of Parkinson disease a retrospective cohort study J Clin
Neurosci 15 576ndash577
Fabre E Monserrat J Herrero A Barja G Leret ML (1999) Effect of MPTP on
brain mitochondrial H2O2 and ATP production and on dopamine and DOPAC in
the striatum J Physiol Biochem 4 325-31
Fan J Hu Z Zeng L Lu W Tang X Zhang J Li T (2008) Golgi apparatus and
neurodegenerative diseases Int J Devl Neurosci 26 523-534
BIBLIOGRAFIacuteA
222
Fan J Hu Z Zeng L Lu W Tang X Zhang J Li T (2008) Golgi apparatus and
neurodegenerative diseases Int J Devl Neurosci 26 523-534
Farquhar MG Palade GE (1981) The Golgi apparatus (complex)-(1954-1981)
from artifact to center stage J Cell Biol 91 77-103
Fasshauer D (2003) Structural insights into the SNARE mechanisms Biochim
Biohys Acta 1641 87-97
Faull RL Laverty R (1969) Changes in dopamine levels in the corpus striatum
following lesions in the substantia nigra Exp Neurol 3 332-340
Feaga HA Maduka RC Foster MN Szalai VA (2011) Affinity of Cu+ for the
copper-binding domain of the amyloid-β peptide of Alzheimers disease Inorg
Chem 5 1614-1618
Finberg JP Youdim MB (1983) Selective MAO A and B inhibitors their
mechanism of action and pharmacology Neuropharmacology 22 441ndash446
Fleming L Mann JB Bean J Briggle T Sanchez-Ramos JR (1994) Parkinsons
disease and brain levels of organochlorine pesticides Ann Neurol 1 100-103
Foley P Gerlach M Double KL Riederer P (2004) Dopamine receptor agonists
in the therapy of Parkinsonrsquos disease J Neural Transm 111 1375ndash1446
Fornai F Lenzi P Gesi M Soldani P Ferrucci M Lazzeri G Capobianco L
Battaglia G De Blasi A Nicoletti F Paparelli A (2004) Methamphetamine
produces neuronal inclusions in the nigrostriatal system and in PC12 cells J
Neurochem 88 114ndash123
Fornai F Lenzi P Lazzeri G Ferrucci M Fulceri F Giorgi FS Falleni A
Ruggieri S Paparelli A (2007) Fine ultrastructure and biochemistry of PC12
cells a comparative approach to understand neurotoxicity Brain Res 1 174-
190
Forno LS DeLanney LE Irwin I Langston JW (1993) Similarities and
differences between MPTP-induced parkinsonsim and Parkinsons disease
Neuropathologic considerations Adv Neurol 60 600-608
BIBLIOGRAFIacuteA
223
Forno LS Langston JW DeLanney LE Irwin I (1988) An electron microscopic
study of MPTP-induced inclusion bodies in an old monkey Brain Res 448
150ndash157
Fortin DL Nemani VM Voglmaier SM Anthony MD Ryan TA Edwards RH
(2005) Neural activity controls the synaptic accumulation of alpha-synuclein J
Neurosci 25 10913-10921
Fricker-Gates RA Gates MA (2010) Stem cell-derived dopamine neurons for
brain repair in Parkinsons disease Regen Med 2 267-78
Fujita Y Ohama E Takatama M Al-Sarraj S Okamoto K (2006) Fragmentation
of Golgi apparatus of nigral neurons with alpha-synuclein-positive inclusions in
patients with Parkinsons disease Acta Neuropathol 112 261-265
Fujiwara H Hasegawa M Dohmae N Kawashima A Masliah E Goldberg MS
Shen J Takio K Iwatsubo T (2002) Alpha-Synuclein is phosphorylated in
synucleinopathy lesions Nat Cell Biol 4 160-164
Gao H Kotzbauer P Uryu K Leight S Trojanowski J Lee V (2008)
Neuroinflammation and oxidationnitration of alpha-synuclein linked to
dopaminergic neurodegeneration J Neurosci 23 7687-98
Garcia-Reitboumlck P Anichtchik O Bellucci A Iovino M Ballini C Fineberg E
Ghetti B Della Corte L Spano P Tofaris GK Goedert M Spillantini MG (2010)
SNARE protein redistribution and synaptic failure in a transgenic mouse model
of Parkinsons disease Brain 7 2032-2044
Gash DM Zhang Z Ovadia A Cass WA Yi A Simmerman L Russell D Martin
D Lapchak PA Collins F Hoffer BJ Gerhardt GA (1996) Functional recovery
in parkinsonian monkeys treated with GDNF Nature 6571 252-255
Gassen M Gross A Youdim MB (1998) Apomorphine enantiomers protect
cultured pheochromocytoma (PC12) cells from oxidative stressinduced by
H2O2 and 6-hydroxydopamine Mov Disord 13 661-667
Gaweda-Walerych K Maruszak A Safranow K Bialecka M Klodowska-Duda
G Czyzewski K Slawek J Rudzinska M Styczynska M Opala G Drozdzik M
BIBLIOGRAFIacuteA
224
Canter JA Barcikowska M Zekanowski C (2008) Mitochondrial DNA
haplogroups and subhaplogroups are associated with Parkinsons disease risk
in a Polish PD cohort J Neural Transm 11 1521-1526
Gerfen CR (2006) Indirect-pathway neurons lose their spines in Parkinson
disease Nat Neurosci 9 157-158
Gerfen CR Engber TM Mahan LC Susel Z Chase TN Monsma FJ Jr Sibley
DR (1990) D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of
striatonigral and striatopallidal neurons Science 250 1429ndash1432
Gesi M Lazzeri G Ferrucci M Pellegrini A Lenzi P Ruggieri S Fornai F
Paparelli A (2006) Inclusion dynamics in PC12 is comparable between
amphetamines and MPTP Ann NY Acad Sci 1074 315-319
Giasson BI Lee VM (2003) Are ubiquitination pathways central to Parkinsons
disease Cell 114 1-8
Gitler AD Bevis BJ Shorter J Strathearn KE Hamamichi S Su LJ Caldwell
KA Caldwell GA Rochet JC McCaffery JM Barlowe C Lindquist S (2008)
The Parkinsons disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab
homeostasis Proc Natl Acad Sci USA 105 145-150
Gleeson PA Lock JG Luke MR Stow JL (2004) Domains of the TGN Coats
Tethers and G Proteins Traffic 5 315-326
Glinka YY Gassen M Youdim MB (1997) Mechanism of 6-hydroxydopamine
neurotoxicity J Neural Transm Suppl 50 55-66
Glinka YY Youdim MBH (1995) Inhibition of mitochondrial complexes I and IV
by 6-hydroxydopamine Eur J Pharmacol Environ Toxicol Pharmacol
Section 292 329ndash332
Golbe LI Di Iorio G Bonavita V Miller DC Duvoisin RC (1990) A large kindred
with autosomal dominant Parkinsons disease Ann Neurol 27 276-282
BIBLIOGRAFIacuteA
225
Gonatas NK Stieber A Gonatas JO (2006) Fragmentation of the Golgi
apparatus in neurodegenerative diseases and cell death J Neurol Sci 246
21-30
Gonzaacutelez LJr Scheller RH (1999) Regulation of membrane trafficking
structural insights from a Rabeffector complex Cell 96 755-758
Gorell JM Johnson CC Rybicki BA Peterson EL Richardson RJ (1998) The
risk of Parkinsonrsquos disease with exposure to pesticides farming well water and
rural living Neurology 50 1346ndash1350
Gosavi N Lee HJ Lee JS Patel S Lee SJ (2002) Golgi fragmentation occurs
in the cells with prefibrillar alpha-synuclein aggregates and precedes the
formation of fibrillar inclusion J Biol Chem 277 48984-48992
Grasse PP (1957) Ultrastructure polarity and reproduction of Golgi apparatus
C R Hebd Seances Acad Sci 245 1278-1281
Greene LA Rein G (1977) Release of (eh) norepinephrine from a clonal line of
pheochromocytoma cells (PC12) by nicotinic cholinergic stimulation Brain Res
138 521-528
Greene LA Tischler AS (1976) Establishment of adrenergic clonal line of rat
adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor Proc
Natl Acad Sci USA 73 2424-2428
Griffiths G (2000) Gut thoughts on the Golgi complex Traffic 1 738-745
Gurkan C Lapp H Alory C Su AI Hogenesch JB Balch WE (2005) Large-
scale profiling of Rab GTPase trafficking networks The membrome Mol Biol
Cell 16 3847ndash3864
Haas AK Yoshimura S Stephens DJ Preisinger C Fuchs E Barr FA (2007)
Analysis of GTPase-activating proteins Rab1 and Rab43 are key Rabs required
to maintain a functional Golgi complex in human cells J Cell Sci 120 2997-
3010
BIBLIOGRAFIacuteA
226
Hald A Lotharius J (2005) Oxidative stress and inflammation in Parkinsons
disease is there a causal link Exp Neurol 193 279ndash90
Hanrott K Gudmunsen L ONeill MJ Wonnacott S (2006) 6-Hydroxydopamine-
induced apoptosis is mediated via extracellular auto-oxidation and caspase 3-
dependent activation of protein kinase Cdelta J Biol Chem 2815373ndash5382
Hardy J Gwinn-Hardy K (1998) Genetic classification of primary
neurodegenerative Disease Science 6 1075-1079
Harrison MB Wiley RG Wooten GF (1990) Selective localization of striatal D1
receptors to striatonigral neurons Brain Res 528 317ndash322
Harrower TP Michell AW Barker RA (2005) Lewy bodies in Parkinsonrsquos
disease protectors or perpetrators Exp Neurol 195 1ndash6
Hasegawa E Kang D Sakamoto K Mitsumoto A Nagano T Minakami S
Takeshige K (1997) A dual effect of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+)-
analogs on the respiratory chain of bovine heart mitochondria Arch Biochem
Biophys 1 69-74
Hasegawa H Zinsser S Rhee Y Vik-Mo EO Davanger S Hay JC (2003)
Mammalian ykt6 is a neuronal SNARE targeted to a specialized compartment
by its profilin-like amino terminal domain Mol Biol Cell 14 698-720
Hashimoto M Masliah E (1999) a-Syn in LBD and AD Brain Pathol 9 707ndash
720
Hashimoto M Rockenstein E Mante M Crews L Bar-On P Gage FH Marr R
Masliah E (2004) An antiaggregation gene therapy strategy for LBD utilizing szlig -
syn lentivirus in a transgenic model Gene Ther 11 1713ndash1723
Hattori N Shimura H Kubo S Suzuki T Tanaka K Mizuno Y (2000)
Autosomal recessive juvenile parkinsonism its pathogenesis is involved in the
ubiquitin-proteasome pathway Rinsho Shinkeigaku 40 1293-1296
Hauri HP Kappeler F Andersson H Appenzeller C (2000) ERGIC-53 and
traffic in the secretory pathway J Cell Sci 113 587-596
BIBLIOGRAFIacuteA
227
Hauri HP Schweizer A (1992) The endoplasmic reticulum-Golgi intermediate
compartment Curr Opin Cell Biol 4 600-608
Heikkila RE Manzino L Cabbat FS Duvoisin RC (1984) Protection against the
dopaminergic toxicity of 1-methyl-1256-tetrahydro pyridine by monoamine
oxidase inhibitors Nature 311 467ndash469
Herrero MT Hirsch EC Kastner A Ruberg M Luquin MR Laguna J Javoy-
Agid F Obeso JA Agid Y (1993) Does neuromelanin contribute to the
vulnerability of catecholaminergic neurons in monkeys intoxicated with MPTP
Neuroscience 2 499-511
Hirata Y Nagatsu T (2005) Rotenone and CCCP inhibit tyrosine hydroxylation
in rat striatal tissue slices Toxicology 1 9-14
Hirschberg K Miller CM Ellenberg J Presley JF Siggia ED Phair RD
Lippincott-Schwartz J (1998) Kinetic analysis of secretory protein traffic and
characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living
cells J Cell Biol 143 1485-1503
Hoang T Choi DK Nagai M Wu DC Nagata T Prou D Wilson GL Vila M
Jackson-Lewis V Dawson VL Dawson TM Chesselet MF Przedborski S
(2009) Neuronal NOS and cyclooxygenase-2 contribute to DNA damage in a
mouse model of Parkinson disease Free Radic Biol Med 7 1049-1056
Hong W (2005) SNAREs and traffic Biochim Biophys Acta 1744 120-144
Horton AC Racz B Monson EE Lin AL Weinberg RJ Ehlers MD (2005)
Polarized secretory trafficking directs cargo for asymmetric dendrite growth and
morphogenesis Neuron 48 757-771
Hou JG Lin LF Mytilineou C (1996) Glial cell line-derived neurotrophic factor
exerts neurotrophic effects on dopaminergic neurons in vitro and promotes their
Survival and regrowth after damage by 1-methyl-4-phenylpyridinium J
Neurochem 66 74ndash82
BIBLIOGRAFIacuteA
228
Iwatsubo T Yamaguchi H Fujimuro M Yokosawa H Ihara Y Trojanowski JQ
Lee VM (1996) Purification and characterization of Lewy bodies from brains of
patients with diffuse LBD Am J Pathol 148 1517ndash1529
Iwatsubo T Yamaguchi H Fujimuro M Yokosawa H Ihara Y Trojanowski JQ
Lee VM (1996) Purification and characterization of Lewy bodies from brains of
patients with diffuse LBD Am J Pathol 148 1517ndash1529
Jaber M Robinson SW Missale C Caron MG (1996) Dopa mine receptors and
brain function Neuropharmacology 35 1503ndash1519
Javitch JA DrsquoAmato RJ Strittmatter PK Snyder SH (1985) Parkinsonism-
inducing neurotoxin N-methyl-4-phenyl-1236-tetrahydropyridine Uptake of
the metabolite N-methyl-4-phenylpyridine by dopamine neurons explains
selective toxicity PNAS 82 2173ndash2177
Jenco JM Rawlingson A Daniels B Morris AJ (1998) Regulation of
phospholipase D2 selective inhibition of mammalian phospholipase D
isoenzymes by α- and β-synuclein Biochemistry 37 4901ndash4909
Jenner P (2003) Oxidative stress in Parkinsons disease Ann Neurol 53
Suppl 3 26ndash36
Jenner P Olnaw C (1996) Oxidative stress and the pathogenesis of
Parkinsonrsquos disease Neurology 47 161-176
Jensen PH Nielsen MH Jakes R Dotti CG Goedert M (1998) Binding of a -
synuclein to rat brain vesicles is abolished by familial Parkinsonrsquos disease
mutation J Biol Chem 73 26292ndash26294
Jeon BS Jackson-Lewis V Burke RE (1995) 6-hydroxydopamine lesion of the
rat substantia nigra Time course and morphology of cell death
Neurodegeneration 4 131ndash137
Jia H Liu Z Li X Feng Z Hao J Li X Shen W Zhang H Liu J (2010)
Synergistic anti-Parkinsonism activity of high doses of B vitamins in a chronic
cellular model Neurobiol Aging 4 636-46
BIBLIOGRAFIacuteA
229
Jo E Fuller N Rand RP St George-Hyslop P Fraser PE (2002) Defective
membrane interactions of familial Parkinsonrsquos disease mutant A30P a -
synuclein J Mol Biol 315 799ndash807
Jo E McLaurin JA Yip CM St George-Hyslop PH Fraser P (2000) a-
Synuclein membrane interactions and lipid specificity J Biol Chem 275
34328ndash34334
Johnson RG (1988) Accumulation of biological amines into chromaffin
granules a model for hormone and neurotransmitter transport Physiol Rev 1
232-307
Kaiser CA Schekman R (1990) Distinct sets of SEC genes govern transport
vesicle formation and fusion early in the secretory pathway Cell 61 723733
Karecla PI Kreis TE (1992) Interaction of membranes of the Golgi complex
with microtubules in vitro Eur J Cell Biol 2 139ndash146
Kawahara K Hashimoto M Bar-On P Ho GJ Crews L Mizuno H Rockenstein
E Imam SZ Masliah E (2008) Alpha-Synuclein aggregates interfere with
Parkin solubility and distribution role in the pathogenesis of Parkinson disease
J Biol Chem 14 6979-6987
Kepes F Rambourg A Satiat-Jeunemaitre B (2005) Morphodynamics of the
secretory pathway Int Rev Cytol 242 55ndash120
Kitamura Y kakimura J Taniguchi T (2002) Antiparkinsonian Drugs and Their
Neuroprotective Effects Biol Pharm Bull 3 284-290
Kitamura Y Taniguchi T Shimohama S Akaike A Nomura Y (2003)
Neuroprotective mechanisms of antiparkinsonian dopamine D2-receptor
subfamily agonists Neurochem Res 28 1035ndash1040
Klaidman LK Adams JD Jr Leung AC Kim SS Cadenas E (1993) Redox
cycling of MPP+ evidence for a new mechanism involving hydride transfer with
xanthine oxidase aldehyde dehydrogenase and lipoamide dehydrogenase
Free Radic Biol Med 2 169-179
BIBLIOGRAFIacuteA
230
Klausner RD Donaldson JG Lippincott-Schwartz J (1992) Brefeldin A insights
into the control of membrane traffic and organelle structure J Cell Biol 116
1071-1080
Klumperman J (2000) Transport between ER and Golgi Curr Opin Cell Biol
12 445-449
Klumperman J Schweizer A Clausen H Tang BL Hong W Oorschot V Hauri
HP (1998) The recycling pathway of protein ERGIC-53 and dynamics of the
ER-Golgi intermediate compartment J Cell Sci 111 3411-3425
Knebel W Rao N Uchimura T Mori A Fisher J Gastonguay MR Chaikin P
(2011) Population pharmacokinetic analysis of istradefylline in healthy subjects
and in patients with Parkinsons disease J Clin Pharmacol 1 40-52
Korsching S (1993) The neurotrophic factor concept a reexamination J
Neurosci13 2739-2748
Kosaka K (2010) Dementia with Lewy Bodies and Parkinson Disease with
Dementia Within the Spectrum of Lewy Body Disease Neuropsychiatric
Disorders Springer 255-259
Kreitzer AC Malenka RC (2007) Endocannabinoid-mediated rescue of striatal
LTD and motor deficits in Parkinsons disease models Nature 7128 643-647
Krijnse-Locker J Ericsson M Rottier PJ Griffiths G (1994) Characterization of
the budding compartment of mouse hepatitis virus evidence that transport from
the RER to the Golgi complex requires only one vesicular transport step J Cell
Biol 124 55-70
Kuehn MJ Schekman R (1997) COPII and secretory cargo capture into
transport vesicles Curr Opin Cell Biol 9 477-483
Ladinsky MS Kremer JR Furcinitti PS McIntosh JR Howell KE (1994) HVEM
tomography of the trans-Golgi network structural insights and identification of a
lace-like vesicle coat J Cell Biol 127 29-38
BIBLIOGRAFIacuteA
231
Lang AE Lozano AM (1998a) Parkinsonrsquos disease First of two parts N Engl
J Med 339 1044ndash1053
Lang AE Lozano AM (1998b) Parkinsonrsquos disease Second of two parts N
Engl J Med 339 1130ndash1143
Langston JW Ballard PA (1993) Parkinsons disease in a chemist working with
1-methyl-4-phenyl-1256-tetrahydropyridine N Engl J Med 5 310
Lanoix J Ouwendijk J Stark A Szafer E Cassel D Dejgaard K Weiss M
Nilsson T (2001) Sorting of Golgi resident proteins into different subpopulations
of COPI vesicles a role for ArfGAP1 J Cell Biol 155 1199-1212
Lansbury PTJ (1999) Evolution of amyloid What normal protein folding may tell
us about fibrillogenesis and disease Proc Natl Acad Sci USA 96 3342ndash
3344
Larsen K Schmitz Y Troyer M Mosharov E Dietrich P Quazi A Savalle M
Nemani V Chaudhry F Edwards R Stefanis L Sulzer D (2006) Alpha-
synuclein overexpression in PC12 and chromaffin cells impairs catecholamine
release by interfering with a late step in exocytosis J Neurosci 26 11915ndash
11922
Lashuel H Petre B Wall J (2002) Alfa-Synuclein especially the Parkinsonrsquos
disease-associated mutants forms pore-like annular and tubular protofibrils J
Mol Biol 322 1089ndash1102
Lashuel HA Hirling H (2006) Rescuing defective vesicular trafficking protects
against alpha-synuclein toxicity in cellular and animal models of Parkinsons
disease ACS Chem Biol 1 420-424
Laurie C Reynolds A Coskun O Bowman E Gendelman HE Mosley RL
(2007) CD4+ T cells from Copolymer-1 immunized mice protect dopaminergic
neurons in the 1-methyl-4-phenyl-1236-tetrahydropyridine model of
Parkinsons disease J Neuroimmunol 1-2 60-8
BIBLIOGRAFIacuteA
232
LaVoie MJ Ostaszewski BL Weihofen A Schlossmacher MG Selkoe DJ
(2005) Dopamine covalently modifies and functionally inactivates parkin Nat
Med 11 1214ndash1221
Lazzeri G Lenzi P Busceti CL Ferrucci M Falleni A Bruno V Paparelli A
Fornai F (2007) Mechanisms involved in the formation of dopamine-induced
intracellular bodies within striatal neurons J Neurochem 101 1414-1427
Lee HJ Khoshaghideh F Lee S Lee SJ (2006) Impairment of microtubule-
dependent trafficking by overexpression of alpha-synuclein Eur J Neurosci
11 3153ndash3162
Lee HJ Khoshaghideh F Lee S Lee SJ (2006) Impairment of microtubule-
dependent trafficking by overexpression of alpha-synuclein Eur J Neurosci
24 3153-3162
Lee MC Miller EA Goldberg J Orci L Schekman R (2004) Bi-directional
protein transport between the ER and Golgi Annu Rev Cell Dev Biol 20 87-
123
Leroy E Boyer R Auburger G Leube B Ulm G Mezey E Harta G Brownstein
M Jonnalagada S Chernova T Dehejia A Lavedan C Gasser T Steinbach
PJ Wilkinson K Polymeropoulos MH (1998) The ubiquitin pathway in
Parkinsons disease Nature 395 451-452
Lewy FH (1912) Paralysis agitans I pathologische anatomie In Lewandowsky
M Handbuch der Neurologie Berlin Springer 920-958
Liberatore GT Jackson-Lewis V Vukosavic S Mandir AS Vila M McAuliffe
WG Dawson VL Dawson TM Przedborski S (1999) Inducible nitric oxide
synthase stimulates dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of
Parkinson disease Nat Med 12 1403-9
Lin LF Doherty DH Lile JD Bektesh S Collins F (1993) GDNF a glial cell line-
derived Neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons Science 260
1130ndash1132
BIBLIOGRAFIacuteA
233
Lindqvist M Magnusson T (1957) 34-Dihydroxyphenylalanine and 5-
hydroxytryptophan as reserpine antagonists Nature 4596 1200
Link CD (2001) Transgenic invertebrate models of age-associated
neurodegenerative diseases Mech Ageing Dev 14 1639-1649
Linstedt AD Jesch SA Mehta A Lee TH Garcia-Mata R Nelson DS Sztul E
(2000) Binding relationships of membrane tethering components The giantin N
terminus and the GM130 N terminus compete for binding to the p115 C
terminus J Biol Chem 275 10196-10201
Liou HH Tsai MC Chen CJ Jeng JS Chang YC Chen SY Chen RC (1997)
Environmental risk factors and Parkinsons disease a case-control study in
Taiwan Neurology 6 1583-1588
Liou W Geuze HJ Slot JW (1996) Improving structural integrity of cryosections
for immunogold labeling Histochem Cell Biol 1 41-58
Lippincott-Schwartz J (2001) The secretory membrane system studied in real-
time Robert Feulgen Prize Lecture 2001 Histochem Cell Biol 116 97-107
Lippincott-Schwartz J Donaldson JG Schweizer A Berger EG Hauri HP Yuan
LC Klausner RD (1990) Microtubule-dependent retrograde transport of
proteins into the ER in the presence of brefeldin A suggests an ER recycling
pathway Cell 60 821-836
Liscovitch M Czarny M Fiucci G Tang X (2000) Phospholipase D molecular
and cell biology of a novel gene family Biochem J 345 401ndash415
Liu B Gao HM Hong JS (2003) Parkinsonrsquos disease and exposure to
infectious agents and pesticides and the occurrence of brain injuries role of
neuroinflammation Environ Health Perspect 111 1065ndash1073
Liu D Jin L Wang H Zhao H Zhao C Duan C Lu L Wu B Yu S Chan P Li
Y Yang H (2008) Silencing alpha-synuclein gene expression enhances
tyrosine hydroxylase activity in MN9D cells Neurochem Res 33 1401ndash9
BIBLIOGRAFIacuteA
234
Lonze BE Ginty DD (2002) Function and regulation of CREB family
transcription factors in the nervous system Neuron 35 605ndash623
Lotharius J Barg S Wiekop P Lundberg C Raymon HK Brundin P (2002)
Effect of mutant a -synuclein on dopamine homeostasis in a new human
mesencephalic cell line J Biol Chem 277 38884ndash38894
Lotharius J Brundin P (2002) Impaired dopamine storage resulting from α-
synuclein mutations may contribute to the pathogenesis of Parkinsonrsquos disease
Hum Mol Genet 11 2395ndash2407
Lotharius J Brundin P (2002) Pathogenesis of Parkinsonrsquos disease Dopamine
vesicles and alpha-synuclein Nat Rev Neurosci 3 932ndash942
Love HD Lin CC Short CS Ostermann J (1998) Isolation of functional
Golgiderived vesicles with a possible role in retrograde transport J Cell Biol
140 541-551
Lu XH Fleming SM Meurers B Ackerson LC Mortazavi F Lo V Hernandez D
Sulzer D Jackson GR Maidment NT Chesselet MF Yang XW (2009)
Bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing a truncated mutant
parkin exhibit age-dependent hypokinetic motor deficits dopaminergic neuron
degeneration and accumulation of proteinase K-resistant alpha-synuclein J
Neurosci 7 1962-76
Luke MR Kjer-Nielsen L Brown DL Stow JL Gleeson PA (2003) GRIP
domain-mediated targeting of two new coiled -coil proteins GCC88 and
GCC185 to subcompartments o f the trans-Golgi network J Biol Chem 6
4216ndash4226
Lupashin V Sztul E (2005) Golgi tethering factors Biochim Biophys Acta
1744 325-339
Luthman J Fredriksson A Sundstrom E Jonsson G Archer T (1989) Selective
lesion of central dopamine or noradrenaline neuron systems in the neonatal rat
motor behavior and monoamine alterations at adult stage Behav Brain Res
33 267ndash277
BIBLIOGRAFIacuteA
235
Ma D Wang X Han J (2000) NIH 3T3 cells or engineered NIH 3T3 cells stably
expressing GDNF can protect primary dopaminergic neurons Neurol Res 22
538ndash44
Malagelada C Greene LA (2008) PC12 cells as a model for Parkinson disease
research In Parkinosnacutes Disease molecular and therapeutic insights from
model systems Elsevier Inc 375-387
Malagelada C Ryu EJ Biswas SC Jackson-Lewis V Greene LA (2006)
RTP801 is elevated in Parkinson brain substantia nigral neurons and mediates
death in cellular models of Parkinsons disease by a mechanism involving
mammalian target of rapamycin inactivation J Neurosci 39 9996-10005
Malhotra V Serafini T Orci L Shepherd JC Rothman JE (1989) Purification of
a novel class of coated vesicles mediating biosynthetic protein transport through
the Golgi stack Cell 58 329-336
Mandal PK Pettegrew JW Masliah E Hamilton RL Mandal R (2006)
Interaction between Abeta peptide and alpha synuclein molecular mechanisms
in overlapping pathology of Alzheimers and Parkinsons in dementia with Lewy
body disease Neurochem Res 9 1153-62
Markey SP Johannessen JN Chiueh CC Burns RS Herkenham MA (1984)
Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced
parkinsonism Nature 5985 464-467
Marongiu R Spencer B Crews L Adame A Patrick C Trejo M Dallapiccola B
Valente EM Masliah E (2009) Mutant Pink1 induces mitochondrial dysfunction
in a neuronal cell model of Parkinsons disease by disturbing calcium flux J
Neurochem 108 1561-74
Maroteaux L Campanelli JT Scheller RH (1988) Synuclein a neuronspecific
protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal J Neurosci 8
2804ndash2815
Marra P Salvatore L Mironov A Di Jr Campli A Di Tullio G Trucco A
Beznoussenko G Mironov A De Matteis MA (2007) The biogenesis of the
BIBLIOGRAFIacuteA
236
Golgi ribbon the roles of membrane input from the ER and of GM130 Mol Biol
Cell 18 1595-1608
Martin TF Grishanin RN (2003) PC12 cells as a model for studies of regulated
secretion in neuronal and endocrine cells Methods Cell Biol 71 267-286
Martiacutenez-Alonso E Egea G Ballesta J Martiacutenez-Menaacuterguez JA (2005)
Structure and dynamics of the Golgi complex at 15 degrees C low temperature
induces the formation of Golgi-derived tubules Traffic 1 32-44
Martiacutenez-Alonso E Tomaacutes M Ballesta J Martiacutenez-Menaacuterguez JA (2007) Low
temperature (15 degrees C) induces COPII dissociation from membranes and
slow exit from the endoplasmic reticulum in HeLa cells Histochem Cell Biol 4
379-384
Martinez-Menarguez JA Geuze HJ Slot JW Klumperman J (1999) Vesicular
tubular clusters between the ER and Golgi mediate concentration of soluble
secretory proteins by exclusion from COPI- coated vesicles Cell 1 81-90
Martinez-Menarguez JA Prekeris R Oorschot VM Scheller R Slot JW Geuze
HJ Klumperman J (2001) Peri-Golgi vesicles contain retrograde but not
anterograde proteins consistent with the cisternal progression model of intra-
Golgi transport J Cell Biol 155 1213-1224
Masliah E Rockenstein E Adame A Alford M Crews L Hashimoto M
Seubert P Lee M Goldstein J Chilcote T Games D Schenk D (2005) Effects
of A-Synuclein Immunization in a Mouse Model of Parkinsonrsquos Disease Neuron
46 857ndash868
Mauceli G Soldani P Busceti CI Lenzi P Pellegrini A Paparelli A Fornai F
(2006) Overexpression of -Synuclein following Methamphetamine Is It Good or
Bad Ann NY Acad Sci 1074 191ndash197
Mayer RA Kindt MV Heikkila RE (1986) Prevention of the nigrostriatal toxicity
of 1-methyl-4-phenyl-1236-tetrahydropyridine by inhibitors of 34-
dihydroxyphenylethylamine transport J Neurochem 47 1073ndash1079
BIBLIOGRAFIacuteA
237
Mayo JC Sainz RM Uria H Antolin I Esteban MM Rodriacuteguez C (1998)
Melatonin prevents apoptosis induced by 6-hydroxydopamine in neuronal cells
implications for Parkinsonrsquos disease J Pineal Res 24 179-192
McNaught KS Shashidharan P Perl DP Jenner P Olanow CW (2002)
Aggresome-related biogenesis of Lewy bodies Eur J Neurosci 16 2136-
2148
Mellman I Simons K (1992) The Golgi complex in vitro veritas Cell 68 829-
840
Meuer K Pitzer C Teismann P Kruumlger C Goumlricke B Laage R Lingor P Peters
K Schlachetzki JC Kobayashi K Dietz GP Weber D Ferger B Schaumlbitz WR
Bach A Schulz JB Baumlhr M Schneider A Weishaupt JH (2006) Granulocyte-
colony stimulating factor is neuroprotective in a model of Parkinsons disease J
Neurochem 3 675-86
Miller EA Beilharz TH Malkus PN Lee MC Hamamoto S Orci L Schekman R
(2003) Multiple cargo binding sites on the COPII subunit Sec24p ensure
capture of diverse membrane proteins into transport vesicles Cell 114 497-
509
Minghetti L (2004) Cyclooxygenase-2 (COX-2) in inflammatory and
degenerative brain diseases J Neuropathol Exp Neurol 63 901ndash10
Mironov AA Beznoussenko GV (2011) Molecular mechanisms responsible for
formation of Golgi ribbon Histol Histopathol 26 117-133
Mironov AA Beznoussenko GV Nicoziani P Martella O Trucco A Kweon HS
Di Giandomenico D Polishchuk RS Fusella A Lupetti P Berger EG Geerts
WJ Koster AJ Burger KN Luini A (2001) Small cargo proteins and large
aggregates can traverse the Golgi by a common mechanism without leaving the
lumen of cisternae J Cell Biol 155 1225-1238
Mironov AA Mironov AA Jr Beznoussenko GV Trucco A Lupetti P Smith JD
Geerts WJ Koster AJ Burger KN Martone ME Deerinck TJ Ellisman MH
BIBLIOGRAFIacuteA
238
Luini A (2003) ER-to-Golgi carriers arise through direct en bloc protrusion and
multistage maturation of specialized ER exit domains Dev Cell 5 583-594
Mizuno Y Hasegawa K Kondo T Kuno S Yamamoto M (2010) Clinical
efficacy of istradefylline (KW-6002) in Parkinsons disease a randomized
controlled study Mov Disord 10 1437-43
Moe MC Varghese M Danilov AI Westerlund U Ramm-Pettersen J Brundin
L Svensson M Berg-Johnsen J Langmoen IA (2005) Multipotent progenitor
cells from the adult human brain neurophysiological differentiation to mature
neurons Brain 9 2189-2199
Moore DJ Dawson VL Dawson TM (2003) Role for the ubiquitin-proteasome
system in Parkinsons disease and other neurodegenerative brain amyloidoses
Neuromol Med 4 95-108
Morales-Garcia JA Redondo M Alonso-Gil S Gil C Perez C Martinez A
Santos A Perez-Castillo A (2011) Phosphodiesterase 7 Inhibition Preserves
Dopaminergic Neurons in Cellular and Rodent Models of Parkinson Disease
PLoS ONE 2
Moratalla R Quinn B DeLanney LE Irwin I Langston JW Graybiel AM (1992)
Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix
dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1236-
tetrahydropyridine Proc Natl Acad Sci U S A 9 3859-3863
Morgese MG Cassano T Cuomo V Giuffrida A (2007) Anti-dyskinetic effects
of cannabinoids in a rat model of Parkinsons disease role of CB(1) and TRPV1
receptors Exp Neurol 1 110-119
Mossessova E Bickford LC Goldberg J (2003) SNARE selectivity of the COPII
coat Cell 114 483-495
Mourelatos Z Gonatas NK Stieber A Gurney ME Dal Canto MC (1996) The
Golgi apparatus of spinal cord motor neurons in transgenic mice expressing
mutant Cu Zn superoxide dismutase becomes fragmented in early preclinical
stages of the disease Proc Natl Acad Sci USA 11 5472ndash5477
BIBLIOGRAFIacuteA
239
Mukherjee S Shields D (2009) Nuclear import is required for the p ro-apoptotic
function of the Golgi protein p115 J Biol Chem 284 1709-1717
Murillo E Palomero M Millaacuten D Arias O Drucker R (2011) Administration of
URB597 Oleoylethanolamide or Palmitoylethanolamide Increases Waking and
Dopamine in Rats PLoS One 7 e20766
Murphy DD Rueter SM Trojanowski JQ Lee VM (2000) Synucleins are
developmentally expressed and a ndashsynuclein regulates the size of the
presynaptic vesicular pool in primary hippocampal neurons J Neurosci 20
3214ndash2310
Nemani VM (2010) Increased expression of alpha-synuclein reduces
neurotransmitter release by inhibiting synaptic vesicle reclustering after
endocytosis Neuron 65 66-79
Nicholson KL Munson M Miller RB Filip TJ Fairman R Hughson FM (1998)
Regulation of SNARE complex assembly by an N-terminal domain of the t-
SNARE Sso1p Nat Struct Biol 9 793-802
Nicklas WJ Vyas I Heikkila RE (1985) Inhibition of NADH-linked oxidation in
brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine a metabolite of the
neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1256-tetrahydropyridine Life Sci 26 2503-
2508
Nie G Cao Y Zhao B (2002) Protective effects of green tea polyphenols and
their major component (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on 6-
hydroxydopamine-induced apoptosis in PC12 cells Redox Rep 3 171-177
NINDS - National Institute of Neurological disorders and Stroke Parkinsons
Disease symptoms diagnosis biochemistry causes treatments history
prevalence organisations toxic causes genetic causes Office of
Communications and Public Liaison (2009) Bethesda MD 20892
Nisticograve R Mehdawy B Piccirilli S Mercuri N (2011) Paraquat- and rotenone-
induced models of Parkinsons disease Int J Immunopathol Pharmacol 2
313-322
BIBLIOGRAFIacuteA
240
Norazit A Meedeniya AC Nguyen MN Mackay-Sim A (2010) Progressive loss
of dopaminergic neurons induced by unilateral rotenone infusion into the medial
forebrain bundle Brain Res 1360 119-129
Norris EH Giasson BI Hodara R Xu S Trojanowski JQ Ischiropoulos H Lee
VM (2005) Reversible inhibition of alpha-synuclein fibrillization by
dopaminochrome-mediated conformational alterations J Biol Chem 280 212ndash
219
Obata T (2003) Calcium overload enhances hydroxyl radical generation by 1-
methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP) in rat striatum Brain Res 965 287ndash289
Ochu EE Rothwell NJ Waters CM (1998) Caspases mediate 6-
hydroxydopamine-induced apoptosis but not necrosis in PC12 cells J
Neurochem 70 2637ndash2640
Oertel WH Ellgring H (1995) Parkinsons disease-medical education and
psychosocial aspects Patient Educ Couns 26 71ndash79
Olanow CW Perl DP DeMartino GN McNaught KS (2004) Lewy-body
formation is an aggresome-related process a hypothesis Lancet Neurol 3
496ndash503
Orci L Amherdt M Ravazzola M Perrelet A Rothman JE (2000) Exclusion of
golgi residents from transport vesicles budding from Golgi cisternae in intact
cells J Cell Biol 150 1263-1270
Orci L Palmer DJ Ravazzola M Perrelet A Amherdt M Rothman JE (1993)
Budding from Golgi membranes requires the coatomer complex of non-clathrin
coat proteins Nature 362 648-652
Orci L Schekman R Perrelet A (1996) Interleaflet clear space is reduced in
the membrane of COP I and COP II-coated budsvesicles Proc Natl Acad Sci
U S A 93 8968-8970
Orci L Tagaya M Amherdt M Perrelet A Donaldson JG LippincottSchwartz J
Klausner RD Rothman JE (1991) Brefeldin A a drug that blocks secretion
BIBLIOGRAFIacuteA
241
prevents the assembly of non- clathrin-coated buds on Golgi cisternae Cell 64
1183-1195
Orimo S Uchihara T Nakamura A Mori F Kakita A Wakabayashi K
Takahashi H (2008) Axonal alpha-synuclein aggregates herald centripetal
degeneration of cardiac sympathetic nerve in Parkinsons disease Brain 3 642-
650
Outeiro TF Klucken J Bercury K Tetzlaff J Putcha P Oliveira LM Quintas A
McLean PJ Hyman BT (2009) Dopamine-induced conformational changes in
alpha-synuclein PLoS One 4 e6906
Outeiro TF Lindquist S (2003) Yeast cells provide insight into alpha-synuclein
biology and pathobiology Science 302 1772ndash 1775
Pagano A Letourneur F Garcia-Estefania D Carpentier JL Orci L Paccaud JP
(1999) Sec24 proteins and sorting at the endoplasmic reticulum J Biol Chem
274 7833-7840
Palacino JJ Sagi D Goldberg MS Krauss S Motz C Wacker M Klose J Shen
J (2004) Mitochondrial dysfunction and oxidative damage in parkin-deficient
mice J Biol Chem 18 18614-18622
Palade GE (1975) Intracellular aspects of the process of protein synthesis
Science 189 347-358
Palade GE (1956) The endoplasmic reticulum J Biophys Biochem Cytol 2
85-98
Panet H Barzilai A Daily D Melamed E Offen D (2001) Activation of nuclear
transcription factor kappa B (NF-kappaB) is essential for dopamine-induced
apoptosis in PC12 cells J Neurochem 2 391-8
Paris I Lozano J Perez C Muntildeoz P Segura J (2009) Molecular and
Neurochemical Mechanisms in PD Pathogenesis Neurotox 16 271ndash279
Pelham HR Rothman JE (2000) The debate about transport in the Golgi--two
sides of the same coin Cell 102 713-719
BIBLIOGRAFIacuteA
242
Perumal AS Gopal VB Tordzro WK Cooper TB Cadet JL (1992) Vitamin E
attenuates the toxic effects of 6-hydroxydopamine on free radical scavenging
systems in rat brain Brain Res Bull 5 699-701
Pfeffer SR (1999) Transport-vesicle targeting tethers before SNAREs Nat
Cell Biol 1 E17-E22
Pfeirffer RF (2005) The phenotypic spectrum of Parkinsonrsquos disease Animal
Models of Movement Disorders Elsevier Aca Press 127-137
Polishchuk EV Di Pentima A Luini A Polishchuk RS (2003) Mechanism of
constitutive export from the golgi bulk flow via the formation protrusion and en
bloc cleavage of large trans-golgi network tubular domains Mol Biol Cell 14
4470-4485
Polymeropoulos MH Higgins JJ Golbe LI Johnson WG Ide SE Di Iorio G
Sanges G Stenroos ES Pho LT Schaffer AA Lazzarini AM Nussbaum RL
Duvoisin RC (1996) Mapping of a gene for Parkinsons disease to chromosome
4q21-q23 Science 274 1197-1199
Polymeropoulos MH Lavedan C Leroy E Ide SE Dehejia A Dutra A Pike B
Root H Rubenstein J Boyer R Stenroos ES Chandrasekharappa S
Athanassiadou A Papapetropoulos T Johnson WG Lazzarini AM Duvoisin
RC Di Iorio G Golbe LI Nussbaum RL (1997) Mutation in the alpha-synuclein
gene identified in families with Parkinsons disease Science 5321 2045-2047
Poon HF Frasier M Shreve N Calabrese V Wolozin B Butterfield DA (2005)
Mitochondrial associated metabolic proteins are selectively oxidized in A30P
alpha-synuclein transgenic mice--a model of familial Parkinsons disease
Neurobiol Dis 3 492-498
Prensa L Gimeacutenez-Amaya JM Parent A Bernaacutecer J Cebriaacuten C (2009) The
nigrostriatal pathway axonal collateralization and compartmental specificity J
Neural Transm Suppl 73 49-58
Presley JF Cole NB Schroer TA Hirschberg K Zaal KJ ppincottSchwartz J
(1997) ER-to-Golgi transport visualized in living cells Nature 389 81-85
BIBLIOGRAFIacuteA
243
Przedborski S Levivier M Jiang H Ferreira M Jackson-Lewis V Donaldson D
Togasaki DM (1995) Dose-dependent le sions of the dopaminergic nigrostriatal
pathway induced by intrastri atal injection of 6-hydroxydopamine Neuroscience
67 631ndash647
Przedborski S Vila M (2003) The 1-methyl-4-phenyl-1236-tetrahydropyridine
mouse model a tool to explore the pathogenesis of Parkinsons disease Ann
NY Acad Sci 991 189-198
Puthenveedu MA Bachert C Puri S Lanni F Linstedt AD (2006) GM130 and
GRASP65-dependent lateral cisternal fusion allows uniform Golgi-enzyme
distribution Nat Cell Biol 8 238-248
Radad K Gille G Rausch WD (2005) Short review on dopamine agonists
insight into clinical and research studies relevant to Parkinsonrsquos disease
Pharmacological reports 57 701-712
Reim K Mansour M Varoqueaux F McMahon HT Suumldhof TC Brose N
Rosenmund C (2001) Complexins regulate a late step in Ca 2+ -dependent
neurotransmitter release Cell 104 71-81
Rein U Andag U Duden R Schmitt HD Spang A (2002) ARF-GAPmediated
interaction between the ER-Golgi v-SNAREs and the COPI coat J Cell Biol
157 395-404
Rexach MF Latterich M Schekman RW (1994) Characteristics of endoplasmic
reticulum-derived transport vesicles J Cell Biol 126 11331148
Rios RM Sanchis A Tassin AM Fedriani C Bornens M (2004) GMAP-210
recruits gamma-tubulin complexes to cis-Golgi membranes and is required for
Golgi ribbon formation Cell 118 323-335
Rochet JC Outeiro TF Conway KA Ding TT Volles MJ Lashuel HA Bieganski
RM Lindquist SL Lansbury PT (2004) Interactions among alpha-synuclein
dopamine and biomembranes some clues for understanding
neurodegeneration in Parkinsonrsquos disease J Mol Neurosci 23 23ndash34
BIBLIOGRAFIacuteA
244
Rojas P Rios C (1993) Increased striatal lipid peroxidation after
intracerebroventricular MPP +administration to mice Pharmacol Toxicol 72
364ndash368
Rosenmund C Sigler A Augustin I Reim K Brose N Rhee JS (2002)
Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc 13
isoforms Neuron 33 411-424
Ryu EJ Angelastro JM Greene LA (2005) Analysis of gene expression
changes in a cellular model of Parkinson disease Neurobiol Dis 1 54-74
Ryu EJ Harding HP Angelastro JM Vitolo OV Ron D Greene LA (2002)
Endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response in cellular
models of Parkinsons disease J Neurosci 24 10690-8
Saha AR Ninkina NN Hanger DP Anderton BH Davies AM Buchman VL
(2000) Induction of neuronal death by alpha-synuclein Eur J Neurosci 12
3073ndash7
Saito Y Nishio K Ogawa Y Kinumi T Yoshida Y Masuo Y Niki E (2007)
Molecular mechanisms of 6-hydroxydopamine-induced cytotoxicity in PC12
cells involvement of hydrogen peroxide-dependent and -independent action
Free Radic Biol Med 42 675-685
Sannerud R Marie M Nizak C Dale HA Pernet-Gallay K Perez F Goud B
Saraste J (2006) Rab1 defines a novel pathway connecting the pre-Golgi
intermediate compartment with the cell periphery Mol Biol Cell 4 1514-1526
Saraste J Kuismanen E (1992) Pathways of protein sorting and membrane
traffic between the rough endoplasmic reticulum and the Golgi complex Semin
Cell Biol 3 343-355
Satoh A Wang Y Malsam J Beard MB Warren G (2003) Golgin-84is a Rab
Binding Partner Involved in Golgi Structure Traffic 4153-161
Sauer H Oertel WH (1994) Progressive degeneration of ni grostriatal
dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-
BIBLIOGRAFIacuteA
245
hydroxydopamine A combined retrograde tracing and immunocytochemical
study in the rat Neurosci 59 401ndash415
Savitt JM Dawson VL Dawson TM (2006) Diagnosis and treatment of
Parkinson disease molecules to medicine J Clin Invest 7 1744-1754
Savitt JM Dawson VL Dawson TM (2008) Parkinson Disease Molecular
Insigths Elsevier Inc 221-239
Scales SJ Pepperkok R Kreis TE (1997) Visualization of ER-to-Golgi transport
in living cells reveals a sequential mode of action for COPII and COPI Cell 90
1137-1148
Schekman R Orci L (1996) Coat proteins and vesicle budding Science 271
1526-1533
Schneeberger A Mandler M Mattner F Schmidt W (2010) AFFITOMEreg
technology in neurodegenerative diseases the doubling advantage Hum
Vaccin 11 948-52
Schneider JS Sendek S Daskalakis C Cambi F (2010) GM1 ganglioside in
Parkinsons disease Results of a five year open study J Neurol Sci 2 45-51
Schober A (2004) Classic toxin-induced animal models of Parkinsons disease
6-OHDA and MPTP Cell Tissue Res 1 215-224
Schonn JS Maximov A Lao Y Suumldhof TC Soslashrensen JB (2008)
Synaptotagmin-1 and -7 are functionally overlapping Ca2+ sensors for
exocytosis in adrenal chromaffin cells Proc Natl Acad Sci USA 105 3998-
4003
Sciaky N Presley J Smith C Zaal KJ Cole N Moreira JE Terasaki M Siggia
E Lippincott-Schwartz J (1997) Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin
A visualized in living cells J Cell Biol 139 1137-1155
Segev N (2001) Cell biology A TIP about Rabs Science 292 1313-1314
Seidler A Hellenbrand W Robra BP Vieregge P Nischan P Joerg J Oertel
WH Ulm G Schneider E (1996) Possible environmental occupational and
BIBLIOGRAFIacuteA
246
other etiologic factors for Parkinsonrsquos disease a casecontrol study in Germany
Neurology 46 1275ndash1284
Sesso A Fujiwara DT Jaeger M Jaeger R Li TC Monteiro MM Correa H
Ferreira MA Schumacher RI Belisa J Kachar B Chen EJ (1999) Structural
elements common to mitosis and apoptosis Tissue Cell 3 357ndash371
Shimura H Hattori N Kubo S Mizuno Y Asakawa S Minoshima S Shimizu N
Iwai K Chiba T Tanaka K Suzuki T (2000) Familial Parkinson disease gene
product parkin is a ubiquitin-protein ligase Nat Genet 25 302-305
Shimura H Schlossmacher MG Hattori N Frosch MP Trockenbacher A
Schneider R Mizuno Y Kosik KS Selkoe DJ (2001) Ubiquitination of a new
form of alphasynuclein by parkin from human brain implications for Parkinsons
disease Science 293 263-269
Shorter J Beard MB Seemann J Dirac-Svejstrup AB Warren G (2002)
Sequential tethering of Golgins and catalysis of SNAREpin assembly by the
vesicle-tethering protein p115 J Cell Biol 1 45ndash62
Shun Y Ueda K and Chan P (2005) α-Synuclein and dopamine metabolism
Molecular Neurobiology 31 243-254
Siebzehnrubl FA Vedam-Mai V Azari H Reynolds BA Deleyrolle LP (2011)
Isolation and characterization of adult neural stem cells Methods Mol Biol 750
61-77
Simon DK Pankratz N Kissell DK Pauciulo MW Halter CA Rudolph A Pfeiffer
RF Nichols WC Foroud T (2010) Parkinson Study Group-PROGENI
Investigators Maternal inheritance and mitochondrial DNA variants in familial
Parkinsons disease BMC Med Genet 1 1153
Simons K van Meer G (1988) Lipid sorting in epithelial cells Biochemistry 27
6197-6202
Sirinathsinghji DJ Kupsch A Mayer E Zivin M Pufal D Oertel WH (1992)
Cellular localization of tyrosine hydroxylase mRNA and cholecystokinin mRNA-
BIBLIOGRAFIacuteA
247
containing cells in the ventral mesencephalon of the common marmoset effects
of 1-methyl-4-phenyl-1236-tetrahydropyridine Brain Res Mol 1-3 267-74
Slot JW Geuze HJ Gigengack S Lienhard GE James DE (1991)
Immunolocalization of the insulin regulatable glucose transporter in brown
adipose tissue of the rat J Cell Biol 1 123-135
Smith WW Margolis RL Li X Troncoso JC Lee MK Dawson VL Dawson TM
Iwatsubo T Ross CA (2005) Alpha-synuclein phosphorylation enhances
eosinophilic cytoplasmic inclusion formation in SH-SY5Y cells J Neurosci 23
5544-5552
Sohda M Misumi Y Yoshimura SI Nakamura N Fusano T Sakisaka S Ogata
S Jujimoto N Kiyokawa N Ikehara Y (2005) Depletion of vesicle-tethering
factor p115 causes mini-stacked Golgi fragments with delayed protein transport
Biochem Biophys Res Commun 2 1268ndash1274
Sollner T Whiteheart SW Brunner M Erdjument-Bromage H Geromanos S
Tempst P Rothman JE (1993) SNAP receptors implicated in vesicle targeting
and fusion Nature 362 318-324
Somsel RJ Wandinger-Ness A (2000) Rab GTPases coordinate endocytosis
J Cell Sci 113 Pt 2 183-192
Sonsalla PK Younster SK Kindt MV Heikkila RE (1987) Characteristics of 1-
methyl-4- 2 -methylphenyl -1236-tetrahydropyridineinduced neurotoxicity in
the mouse J Pharmacol Exp Ther 242 850ndash857
Sorensen JB (2003) Formation stabilisation and fusion of the readily
releasable pool of vesicles Pfluumlgers Arch448 347-362
Spallantini MG Schmidt ML Lee Y Goedert M Jakes R (1997) Alpha
synuclein in lewy Bodies Nature 388 839-840
Spillantini MG Crowther RA Jakes R Hasegawa M and Goedert M (1998)
Alpha-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinsonrsquos
disease and dementia with lewy bodies Proc Natl Acad Sci USA 95 6469ndash
6473
BIBLIOGRAFIacuteA
248
Spillantini MG Schmidt ML Lee VM Trojanowski JQ Jakes R Goedert M
(1997) Alpha-synuclein in Lewy bodies Nature 388 839ndash840
Springer S Schekman R (1998) Nucleation of COPII vesicular coat complex by
endoplasmic reticulum to Golgi vesicle SNAREs Science 281 698700
Stathis P Konitsiotis S Tagaris G Peterson D (2011) Levetiracetam for the
management of levodopa-induced dyskinesias in Parkinsons disease Mov
Disord 2 264-70
Stefanis L Kholodilov N Rideout HJ Burke RE Greene LlA (2001) Synuclein-
1 is selectively up-regulated in response to nerve growth factor treatment in
PC12 cells J Neurochem 76 1165ndash1176
Stefanis L Larsen KE Rideout HJ Sulzer D Greene LlA (2001) Expression of
A53T Mutant But Not Wild-Type α-Synuclein in PC12 Cells Induces Alterations
of the Ubiquitin-Dependent Degradation System Loss of Dopamine Release
and Autophagic Cell Death J Neurosci 24 9549ndash9560
Steimle PA Fulcher FK Patel YM (2005) A novel role for myosin II in
insulinstimulated glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes Biochem Biophys Res
Commun 331 1560-1565
Stenmark H (2009) Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic Nature
Reviews Molecular cell Biology 10 513-525
Stephens DJ Lin-Marq N Pagano A Pepperkok R Paccaud JP (2000) COPI-
coated ER-to-Golgi transport complexes segregate from COPII in close
proximity to ER exit sites J Cell Sci 113 2177-2185
Stieber A Mourelatos Z Gonatas NK (1996) In Alzheimerrsquos disease the Golgi
apparatus of a population of neurons without neurofibrillary tangles is
fragmented and atrophic Am J Pathol 2 415ndash426
Storrie B White J Rottger S Stelzer EH Suganuma T Nilsson T (1998)
Recycling of golgi-resident glycosyltransferases through the ER reveals a novel
pathway and provides an explanation for nocodazole-induced Golgi scattering
J Cell Biol 143 1505-1521
BIBLIOGRAFIacuteA
249
Storrie B White J Roumlttger S Stelzer EH Suganuma T Nilsson T (1998) Recycling of golgi-resident glycosyltransferases through the ER reveals a novel pathway and provides an explanation for nocodazole-induced Golgi scattering J Cell Biol 143 1505-1521
Suumldhof TC (2000) The synaptic vesicle cycle revisited Neuron 28 317-320
Suumldhof TC (2002) Synaptotagmins why so many J Biol Chem 277 7629-
7632
Suumldhof TC (2004) The synaptic vesicle cycle Annu Rev Neurosci 27 509-
547
Sullivan AM Toulouse A (2011) Neurotrophic factors for the treatment of
Parkinsonrsquos disease Cytokine Growth Factor Rev 3 157-165
Tachibana K Umezawa A Takano T (1992) Detection and characterization of
mRNA and proteins encoded by human rab2 low molecular weight GTP-binding
protein gene Biochem Int1 181-189
Tanaka Y Engelender S Igarashi S Rao RK Wanner T Tanzi RE Sawa A
Dawson V Dawson TM Ross CA (2001) Inducible expression of mutant alpha-
synuclein decreases proteasome activity and increases sensitivity to
mitochondria-dependent apoptosis Hum Mol Genet 9 919-26
Tang BL Low SH Hauri HP Hong W (1995) Segregation of ERGIC53 and the
mammalian KDEL receptor upon exit from the 15 degrees C compartment Eur
J Cell Biol 68 398-410
Tang J Maximov A Shin OH Dai H Rizo J Suumldhof TC (2006) A
complexinsynaptotagmin 1 switch controls fast synaptic vesicle exocytosis
Cell 126 1175-1187
Teng KK Angelastro JM Cunningham ME Farinelli SE Greene LA (1998)
Cultured PC12 cells A model for neuronal function differentiation and survival
Academic Press Orlando FL
BIBLIOGRAFIacuteA
250
Thayanidhi N Helm JR Nycz DC Bentley M Liang Y Hay JC (2010) Alpha-
synuclein delays endoplasmic reticulum (ER)-to-Golgi transport in mammalian
cells by antagonizing ERGolgi SNAREs Mol Biol Cell 11 1850-1863
Thayanidhi N Helm JR Nycz DC Bentley M Liang Y Hay JC (2010) Alpha-
synuclein delays endoplasmic reticulum (ER)-to-Golgi transport in mammalian
cells by antagonizing ERGolgi SNAREs Mol Biol Cell 21 1850-1863
Tisdale EJ (2000) Rab2 requires PKC iotalambda to recruit beta-COP for
vesicle formation Traffic 9 702-12
Tisdale EJ Balch WE (1996) Rab2 is essential for the maturation of pre-Golgi
intermediates J Biol Chem 46 29372-29379
Tisdale EJ Jackson MR (1998) Rab2 protein enhances coatomer recruitment
to pre-Golgi intermediates J Biol Chem 27 17269-17277
Toomre D Keller P White J Olivo JC Simons K (1999) Dual-color
visualization of trans-Golgi network to plasma membrane traffic along
microtubules in living cells J Cell Sci 112 21-33
Tooze SA (1998) Biogenesis of secretory granules in the trans-Golgi network of
neuroendocrine and endocrine cells Biochim Biophys Acta 2 231-244
Torres EM Monville C Gates MA Bagga V Dunnett SB (2007) Improved
survival of young donor age dopamine grafts in a rat model of Parkinsons
disease Neuroscience 4 1606-1607
Trimble WS Cowan DM Scheller RH (1988) VAMP-1 a synaptic vesicle
associated integral membrane protein Proc Natl Acad Sci USA 85 4538-
4542
Trojanowski J Goedert M Iwatsubo T Lee V (1998) Fatal attractions
abnormal protein aggregation and neuron death in PD and lewy body dementia
Cell Death Differ 5 832ndash837
Trucco A Polishchuk RS Martella O Di Pentima A Fusella A Di
Giandomenico D San Pietro E Beznoussenko GV Polishchuk EV Baldassarre
BIBLIOGRAFIacuteA
251
M Buccione R Geerts WJ Koster AJ Burger KN Mironov AA Luini A (2004)
Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-
compartments Nat Cell Biol 6 1071-1081
Tsuboi T (2008) Molecular mechanism of docking of dense-core vesicles to
the plasma membrane in neuroendocrine cells Med Mol Morphol41 68ndash75
Ungerstedt U (1968) 6-Hydroxydopamine induced degeneration of central
monoamine neurons Eur J Pharmacol 5 107ndash110
Uversky VN Lee HJ Fink AL Lee SJ (2001) Stabilization of Partially Folded
Conformation during -Synuclein Oligomerization in Both Purified and Cytosolic
Preparations Journal of Biological Chemistry 23 43495ndash43498
Uversky VN (2007) Neuropathology Biochemistry and Biophysics of A-
synuclein Aggregation Journal of Neurochemistry 103 17ndash37
Valldeoriola F Morsi O Tolosa E Rumiagrave J Martiacute MJ Martiacutenez-Martiacuten P (2007)
Prospective comparative study on cost-effectiveness of subthalamic stimulation
and best medical treatment in advanced Parkinsons disease Mov Disord 15
2183-2191
Vanover KE Betz AJ Weber SM Bibbiani F Kielaite A Weiner DM Davis RE
Chase TN Salamone JD (2008) A 5-HT2A receptor inverse agonist ACP-103
reduces tremor in a rat model and levodopa-induced dyskinesias in a monkey
model Pharmacol Biochem Behav 4 540-544
Varastet M Riche D Maziere M Hantraye P (1994) Chronic MPTP treatment
reproduces in baboons the differential vulnerability of mesencephalic
dopaminergic neurons observed in Parkinsons disease Neuroscience 1 47-56
Vivero-Salmeroacuten G Ballesta J Martiacutenez-Menaacuterguez JA (2008) Heterotypic
tubular connections at the endoplasmic reticulum-Golgi complex interface
Histochem Cell Biol 4 709-717
Volakakis N Kadkhodaei B Joodmardi E Wallis K Panman L Silvaggi J
Spiegelman BM Perlmann T (2010) NR4A orphan nuclear receptors as
BIBLIOGRAFIacuteA
252
mediators of CREB-dependent neuroprotection Proc Natl Acad Sci USA
107 12317ndash12322
Volchuk A Ravazzola M Perrelet A Eng WS Di Liberto M Varlamov O
Fukasawa M Engel T Soumlllner TH Rothman JE Orci L (2004) Countercurrent
distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the
Golgi stack Mol Biol Cell 15 1506-1518
Volles M Lee S Rochet J Shtilerman M Ding T Kessler J Lansbury P (2001)
Vesicle permeabilization by protofibrillar alpha-synuclein implications for the
pathogenesis and treatment of Parkinsonrsquos disease Biochemistry 40 7812ndash
7819
Wakabayashi K Tanji K Mori F Takahashi H (2007) The Lewy body in
Parkinsons disease molecules implicated in the formation and degradation of
alpha-synuclein aggregates Neuropathology 27 494-506
Wakamatsu M Iwata S Funakoshi T Yoshimoto M (2008) Dopamine receptor
agonists reverse behavioral abnormalities of alpha-synuclein transgenic mouse
a new model of Parkinsons disease J Neurosci Res 3 640-646
Walker A Ward C Sheldrake TA Dransfield I Rossi AG Pryde JG Haslett C
(2004) Golgi fragmentation during Fas-mediated apoptosis is associated with
the rapid loss of GM130 Biochem Biophys Res Commun 1 6ndash11
Walkinshaw G Waters CM (1994) Neurotoxin-induced cell death in neuronal
PC12 cells is mediated by induction of apoptosis Neuroscience 63 975ndash987
Walkinshaw G Waters CM (1995) Induction of apoptosis in catecholaminergic
PC12 cells by L-DOPA Implications for the treatment of Parkinsons disease J
Clin Invest 6 2458-64
Wang G Qi C Fan GH Zhou HY Chen SD (2005) PACAP protects neuronal
differentiated PC12 cells against the neurotoxicity induced by a mitochondrial
complex I inhibitor rotenone FEBS Lett 18 4005-11
BIBLIOGRAFIacuteA
253
Wang Y Zhang Y Wei Z Li H Zhou H Zhang Z Zhang Z (2009) JNK inhibitor
protects dopaminergic neurons by reducing COX-2 expression in the MPTP
mouse model of subacute Parkinsons disease J Neurol Sci 2 172-177
Waragai M Wei J Fujita M Nakai M Ho GJ Masliah E Akatsu H Yamada T
Hashimoto M (2006) Increased level of DJ-1 in the cerebrospinal fluids of
sporadic Parkinsons disease Biochem Biophys Res Commun 7 967-972
Warren G Mellman I (1999) Bulk flow redux Cell 98 125-127
Waters MG Griff IC Rothman JE (1991) Proteins involved in vesicular
transport and membrane fusion Curr Opin Cell Biol 3 615-620
Waters MG Pfeffer SR (1999) Membrane tethering in intracellular transport
Curr Opin Cell Biol 11 453-459
Waxman EA Giasson BI (2009) Molecular mechanisms of alpha-synuclein
neurodegeneration Biochim Biophys Acta 7 616ndash 624
Weintraub D Chen P Ignacio RV Mamikonyan E Kales HC (2011) Patterns
and trends in antipsychotic prescribing for Parkinson disease psychosis Arch
Neurol 7 899-904
Winner B Rockenstein E Lie DC Aigner R Mante M Bogdahn U Couillard-
Despres S Masliah E Winkler J (2008) Mutant alpha-synuclein exacerbates
age-related decrease of neurogenesis Neurobiol Aging 29 913-925
Woodgate A MacGibbon M Walton M dragunow M (1999) The toxicity of 6-
hydroxydopamine on PC12 and P19 cells Molecular Brain Research 69 84ndash92
Wright JA Wang X Brown DR (2009) Unique copper-induced oligomers
mediate alpha-synuclein toxicity FASEB J 8 2384-2393
Wu Y Blum D Nissou MF Benanid AL Verna JM (1996) Unlike MPP
apoptosis induced by 6OHDA in PC12 cells is independent of mitochondrial
inhibition Neurosci Lett 221 69ndash71
Xu D Joglekar AP Williams AL Hay JC (2000) Subunit Structure of a
Mammalian ERGolgi SNARE Complex J biol Chem 50 39631ndash39639
BIBLIOGRAFIacuteA
254
Xu J Kao SY Lee FJ Song W Jin LW Yankner BA (2002) Dopamine-
dependent neurotoxicity of a -synuclein a mechanism for selective
neurodegeneration in Parkinsonrsquos disease Nature Med 8 600ndash606
Xu J Wei C Xu C Bennett MC Zhang G Li F Tao E (2007) Rifampicin
protects PC12 cells against MPP+-induced apoptosis and inhibits the
expression of an alpha-Synuclein multimer Brain Res 30 1139220-225
Yang L Calingasan NY Wille EJ Cormier K Smith K Ferrante RJ Beal MF
(2009) Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces
additive neuroprotective effects in models of Parkinsons and Huntingtons
diseases J Neurochem 5 1427-39
Yang WL Sun AY (1998) Paraquat-induced cell death in PC12 cells J
Neurochem Res 11 1387-94
Yasuda T Miyachi S Kitagawa R Wada K Nihira T Ren YR Hirai Y Ageyama
N Terao K Shimada T Takada M Mizuno Y Mochizuki H (2007) Neuronal
specificity of alpha-synuclein toxicity and effect of Parkin co-expression in
primates Neuroscience 144 743ndash53
Yoshihisa T Barlowe C Schekman R (1993) Requirement for a GTPase
activating protein in vesicle budding from the endoplasmic reticulum Science
259 1466-1468
Yoshimoto Y Nakaso K Nakashima K (2005) L-dopa and dopamine enhance
the formation of aggregates under proteasome inhibition in PC12 cells FEBS
Letters 579 1197ndash1202
Youdim MB (1991) PC12 cells as a window for the differentiationof neural
crest into adrenergic nerve endings and adrenal medulla J Neural Transm
Suppl 3 61ndash67
Zarranz J Alegre J Goacutemez-Esteban J Lezcano E Ros I Ampuero I Vidal L
Hoenicka J Rodriacuteguez O Atareacutes B Llorens V Goacutemez Tortosa E Muntildeoz D de
Yebenes J Zarranz J (2004) The new mutation E46K of alpha-synuclein
causes Parkinson and Lewy body dementia Ann Neurol 55 164ndash173
BIBLIOGRAFIacuteA
255
Zhang Y Gao J Chung KK Huang H Dawson VL Dawson TM (2000) Parkin
functions as an E2-dependent ubiquitin- protein ligase and promotes the
degradation of the synaptic vesicle-associated protein CDCrel-1 Proc Natl
Acad Sci U S A 97 13354-13359
Zhao L Helms JB Brugger B Harter C Martoglio B Graf R Brunner J
Wieland FT (1997) Direct and GTP-dependent interaction of ADP ribosylation
factor 1 with coatomer subunit beta Proc Natl Acad Sci U S A 94 4418-
4423
Zhou W Milder JB Freed CR (2008) Transgenic mice overexpressing tyrosine-
to-cysteine mutant human alpha-synuclein a progressive neurodegenerative
model of diffuse Lewy body disease J Biol Chem 15 9863-9870
Zhou W Schaack J Zawada W M amp Freed C R (2002) Overexpression of
human a -synuclein causes dopamine neuron death in primary human
mesencephalic culture Brain Res 926 42ndash50
- Wilson Orlando Rendoacuten Rodriacuteguez Beneficiario COLFUTURO 2008
- TESIS DOCTORAL WILSON RENDOacuteNpdf