alessandracurymachado rev

7/24/2019 AlessandraCuryMachado Rev

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UNIVERSIDADE DE SO PAULOFACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU

ALESSANDRA CURY MACHADO

Caracterizao do extrato de aroeira

(Myracrodruon urundeuva) e seu efeito sobre aviabilidade de fibroblastos gengivais humanos

BAURU

2013


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ALESSANDRA CURY MACHADO


(Myracrodruon urundeuva) e seu efeito sobre a

viabilidade de fibroblastos gengivais humanos

Tese apresentada Faculdade deOdontologia de Bauru da Universidade deSo Paulo para obteno do ttulo de Doutorem Cincias no Programa de CinciasOdontolgicas Aplicadas, na rea deconcentrao Biologia Oral.Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Cardoso deOliveira

Verso corrigida

Bauru

2013


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M18c Machado, Alessandra Cury


(Myracrodruon urundeuva) e seu efeito sobre a

viabilidade de fibroblastos gengivais humanos.

Alessandra Cury Machado-Bauru, 2013.

100p:il.;30 cm.

Tese (Doutorado)Faculdade de Odontologia deBauru. Universidade de So Paulo

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Cardoso de Oliveira

Nota: A verso original desta dissertao/tese encontra-se disponvel no Servio deBiblioteca e Documentao da Faculdade de Odontologia de BauruFOB/USP.

Autorizo, exclusivamente para fins acadmicos e cientficos, areproduo total ou parcial desta dissertao/tese, por processos

fotocopiadores e outros meios eletrnicos.

Assinatura:

Data:


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DEDICATRIA

Dedico meu trabalho aos meus pais, Fatima Cury Machado e Joo Machado Junior, que

estiveram sempre por perto, apoiando meus estudos por anos. Dedico tambm aos meus

irmos, Luis Fernando Cury Machado, Pedro Henrique Cury Machado, Thiago Cury

Machado, ao meu tio Zezinho, aos meus sobrinhos, Maria Eduarda, Isabelle, Raul e Ana

Beatriz. Obrigada por fazerem parte da minha vida!


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AGRADECIMENTOS

Agradeo minha vida e meus estudos a Deus. Obrigada por mostrar sempre o melhor

caminho que devo seguir, a estar por perto nas dificuldades e nos momentos de vitria.

Obrigada pelas benes em minha vida!

Agradeo ao meu namorado, Jorge Luiz Abranches por estar por perto e me apoiar durante

a escrita da tese. Obrigada pelo companheirismo, amizade e dedicao.

Agradeo ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Cardoso de Oliveira, pelo trabalho que

desempenhamos juntos. Obrigada pela parceria, dedicao e pacincia.

Agradeo professora Dra. Anne Ligia Dokkedal Bosqueiro pela parceria que acrescentou

muito ao nosso trabalho. Obrigada por todo o aprendizado com as plantas! Todo esse

conhecimento s nos somou mais conhecimento em nossas vidas. Obrigada!

Agradeo amiga e professora Dra. Carla Andreotti Damante. Obrigada pelas clulas

gentilmente cedidas em nossa pesquisa. E, obrigada pela amizade de anos, pelo carinho e

dedicao.

Agradeo as professoras da bioqumica Marilia Buzalaf e Carol Magalhes pelas disciplinas

cursadas e oportunidade de conhecimento no departamento.

Agradeo aos tcnicos do departamento de bioqumica, Aline, Larissa, Ovidio e Thelma pela

ajuda dentro do laboratrio.

Agradeo a todos os alunos do departamento de bioqumica pelo companheirismo nas

pesquisas.

Agradeo ao meu grupo de pesquisa de cultura de clulas Adriana Arruda, Camila Roque,

Flvia Amadeu pelo trabalho em equipe nesses anos. Com esforos, dificuldades e suor foi

com que realizamos nossos trabalhos. A tudo isso obtivemos amadurecimento profissional.

Agradeo ao CIP, Centro Intensivo de Pesquisa, pelo apoio e trabalho. Obrigada tambm

aos funcionrios Marcelo, Mrcia, Renato e Rafaela e ao professor Vinicius.

Agradeo ao Horto Florestal de Bauru por ter me fornecido as folhas da rvore de aroeirapara realizao da pesquisa.


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Agradeo por parte do trabalho realizado no laboratrio de Quimica de Produtos Naturais na

Unesp de Bauru, e aos alunos Leonardo Saldanha, Lais e Cate por todo aprendizado e

ajuda no processo de preparao do extrato e de anlises cromatogrficas.

Agradeo ao professor Dr. Wagner Villegas por fornecer o laboratrio de Qumica da Unesp

de Araraquara para as anlises em HPLC e Massas, e pela ajuda do aluno de mestrado

Leonardo Perez.

Agradeo ao herbrio de Rio Claro pelo depsito da excicata da aroeira.

Agradeo aos amigos Maria Herminia e Cido pela amizade, dedicao e companheirismo detodos esses anos de aprendizado esprita. Obrigada pela fora quando precisei. No

precisamos de muitos amigos s de alguns amigos verdadeiros.

Agradeo de corao Faculdade de Odontologia de Bauru, USP por ter me acolhido como

aluna de doutorado. Obrigada por todas as oportunidades e experincias enriquecedoras do

universo da pesquisa. S quem pesquisador sabe a maravilha que essa profisso.

Agradeo parceria com a Faculdade de Cincias Biolgicas da UNESP que complementou

meus estudos.

Agradeo ao rgo de fomento, CAPES, Coordenao de Aperfeioamento de Pessoa do

Nivel Superior que financiou meus estudos durante todo esse tempo.

Agradeo FAPESP, Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo por

financiar material para minha pesquisa.

Agradeo o departamento de ps-graduao e funcionria Vera por toda a ajuda cedida

com documentaes.


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EPGRAFE

" ... a ordem de Deus . E estou per suadido de qu e no h para vs

maior b em na cidade que esta m inh a obed inc ia a Deus. Na

ver dad e, no ou tr a co isa o q ue fao n estas m inhas andanas a

no ser per su adir a vs, jovens e velh os , de que no deveis cu idar

s do corpo, nem exclus ivamente das riquezas, e nem de qualqueroutr a coisa antes e mais fortemente que da alma, de modo que ela

se aperfeioe sempre, po is no do acmulo de r iquezas qu e

nasc e a virt ude, mas do aperfeioamento da alma que nasc em as

r iquezas e tudo o q ue mais impo rta ao homem e ao Estado."

* Scrat es *


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Ao Viajante

Tu que passas e ergues para mim o teu brao, antes que me faa

mal. Olha-me bem. Eu so u o c alor do teu lar nas no ites fr ias de

inverno. Eu sou a sombra amiga que tu encontras quando

caminhas sob re o sol de agora. E os m eus frutos sobre a frescura

apeti tosa que te sacia sede nos c aminhos. Eu sou a trave amiga da

tua casa, a tbua da tua mesa, a cama em que descansas , e o lenhodo teu b arco. Eu sou o cabo d a tua enxada, a porta da tua mo rada e

do teu p rpr io caixo. Eu sou o po da bond ade e a flo r da beleza.

Tu que passas olha-me bem e no me faas mal

(Texto escr ito ao lado de tr on co de rvo re den tro do Castelo de So

Jorge, monum ento nacional de Lisboa, em Portugal)


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RESUMO

A aroeira (Myracrodruon urundeuva) uma rvore cujas folhas vem sendo

estudadas com fins teraputicos na medicina e odontologia por apresentar potencialantiinflamatrio e antimicrobiano, alm de favorecer o processo de reparo e

cicatrizao. O objetivo do trabalho foi caracterizar quimicamente o extrato de

aroeira e avaliar seu efeito sobre fibroblastos gengivais humanos. Foi realizado a

caracterizao qumica da aroeira por meio do processo de triagem cromatogrfica

que consistiu na coleta das folhas sadias, macerao em metanol (MeOH) 80%,

partio entre os solventes hexano, acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (n-(BuOH))

Em seguida, realizaram-se anlises dos compostos qumicos em cromatografialiquida de alta eficincia acoplado a detector de arranjo de fotodiodo HPLC-PAD,

anlises por espectrometria de massas MS e cromatografia liquida acoplada a

espectrometria de massas (LC-MS). Posteriormente foi realizada a anlise de

citotoxicidade do extrato hidroalcolico de aroeira em fibroblastos gengivais

humanos (linhagem FGH). Para a realizao dos experimentos foram plaqueadas

2x103 clulas/poo em placas de 96 poos. O meio de cultivo foi substitudo por

meio de cultura de Eagle modificado por Dullbecco complementado por 10% soro

fetal bovino (SFB) em diferentes concentraes do extrato hidroalcolico de aroeira

(extrato bruto; 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000 e controle). As anlises de viabilidade

foram feitas nos tempos experimentais de 24, 48, 72 e 96 horas, por meio dos testes

de reduo do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazlio),

captao do vermelho neutro e colorao pelo cristal violeta. A estatstica foi

realizada em anlise de varincia de 2 critrios seguido de uma anlise de teste

Tukey (p


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apresentaram valores semelhantes sem diferena significante (p>0,05). Para o teste

do cristal violeta, os resultados encontrados seguiram o mesmo padro do vermelho

neutro: valores de absorbncia menores nos grupos do extrato bruto e 1:10, ao

contrrio dos outros grupos que apresentaram valores maiores (p


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ABSTRACT

Aroeira (M. urundeuva) is a tree whose leaves have been studied with therapeutic

purpose in dentistry and medicine, due it antimicrobial and antinflamatory potencialprotect, besides the repair and cicatrization processes. The aim of the study was

characterize the aroeiras extract and evaluate effect over human gingival fibroblast.

The aroeiras characterization was realized by meansof chromatography screenuy,

process that consists in healthy leaves maceration in 80% MeOH, partition in the

BuOH, AcOEt and hexanes solvents. Next, the chemicals compounds were

analysed in High Performance Liquide Chromatography-Photo Diode Array (HPLC-

PAD), Liquide Chromatography Mass Spectrometry (LCMS) and Mass Spectrometry

(MSs). Subsequently was realized the citotoxicitys analysis from the aroeira

hidroalcooholic extract in human gingival fibroblast (FGH lineage). For the

experiments realization was platted 2x103cels/well in 96 wells plate. The cultives

mean was substituted for Eagles means culture changed for complemented

Dullbeco for 10% bovine fetal serum in aroeiras hidroalcooholic extracts

concentrations different (brute extract, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000). The viability

analysis was carried out in experimental times 24, 48, 72 and 96 hours, by means of

MTT reductions test (brometo3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio), neutral

red captation and violet crystal). The statistics were performed for analysis of

variance in 2 criteria continue with a Tukey test analysis (p


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Keywords: phytotherapeutic, celular viability, medicinal plants, MTT, neutral red,

Myracrodruon urundeuva.


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LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1- CCD: 1- E.B. hidroalcolico; 2-Fr hex; 3-Fr AcOEt; 4-Fr BuOH; 5-Fr

aquosa. Fase mvel: BAW (6:1:2). Revelado com NP-Peg.......................................50

Figura 2- CCD: 1- E.B. hidroalcolico; 2-Fr hex; 3-Fr AcOEt; 4-Fr BuOH; 5- Fr

aquosa. Fase mvel: CHCl3: MeOH (7:3). Revelado com NP-Peg............................57

Figura 3- CCD: 1- E.B. hidroalcolica; 2-Fr hex; 3-Fr AcOEt; 4-Fr BuOH; 5-Fr

aquosa. Fase mvel: CHCl3: MeOH ( 7:3). Revelado com anisaldeido/ H2SO4.............58

Figura 4- Cromatograma de separao por HPLC-PAD dos constituintes qumicos

presentes no extrato MeOH 80% das folhas de M. urundeuva. FM: ACN + TFA 0,1%(B) e H2O + TFA 0,1% (A). Coluna Phenomenex Synergi Hydro RP18 (250 x 4.6

mm i.d.; 4 m), HPLC (Jasco), fluxo 1,0 mL min-1, = Figura 4: 280 nm, Sistema

de eluio gradiente: 0-15% B (15 min), 15-20% B (30 min), 20-30% B (30 min), 30-

100% B (5 min), 100% B (isocrtico, 5 min) perfazendo uma anlise com tempo total

de 85 min....................................................................................................................58

Figura 5- Espectro na regio do UV de padro de cido glico................................59

Figura 6- Cromatograma de separao por CLAE-PAD dos constituintes qumicos

presentes na frao 4 (BuOH) do extrato MeOH 80% das folhas de M. urundeuva.

Coluna Phenomenex Luna C18(250 x 4.6 mm d.i.; 5 m). FM: H2O + c. Frmico

0,1% (A) e MeOH + c. Frmico 0,1% (B). Gradiente exploratrio de 0-60 minutos,

de 5-100% de B em A. Fluxo 1,0 mL.min-1, volume injetado 20,0 L, forno de coluna

25C; 280 nm...........................................................................................................60

Figura 7- Bandas de mximo de absoro na regio de UV tpico de flavonide,

obtidas do pico em 16,6 min.......................................................................................60

Figura 8- Espectro de massas em full-scan da Fr 4 (BuOH) obtido por FIA-ESI-IT-

MS em modo negativo................................................................................................61

Figura 9- Espectro de massas de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MS em

modo negativo do on precursor de m/z 1091............................................................61


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modo negativo do on precursor de m/z 939..............................................................62

Figura 11- Espectro de massas de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MS emmodo negativo do on precursor de m/z 787..............................................................62

Figura 12- Estrutura qumica do 1,2,3,4,6-penta-O-galoil--D-glicose (PGG)..........63

Figura 13- Espectro de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MS em modo negativo

do on de m/z 477.......................................................................................................63


modo negativo do on precursor de m/z 609..............................................................64

Figura 15-Anlise da reduo do MTT do extrato MeOH no perodo de 24 horas..65


Figura 17-Anliseda reduo do MTT do extrato MeOH no perodo de 72 horas..66


Figura 19-Anlise da captao do vermelho neutro do extrato MeOH no perodo de

24 horas......................................................................................................................67


48 horas......................................................................................................................68


72 horas......................................................................................................................69


96 horas......................................................................................................................69

Figura 23-Anlise do cristal violeta do extrato MeOH no perodo de 24 horas........71




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LISTA DE ABREVIATURAS

Abs: Absorbncia

AcOEt: Acetato de etilaAc: cido

ACN: Acetonitrila

BAW: Butanol: cido actico: gua (v:v:v)

n-BuOH: lcool n- butlico (n-Butanol)

CCDc: Cromatografia em camada delgada comparativa

CHCl3: Clorofrmio

CLAE (HPLC): Cromatografia Lquida de alta eficincia (High Performance Liquid

Cromatography)

CLAE/EM: Cromatografia Lquida de alta eficincia/Espectrometria de Massas

CV: Cristal Violeta

C18: Carbono 18

Da: Dalton

DMEM: meio de cultura de Eagle modificado por Dullbecco

ESI: Ionizao por eletrospray

EtOH: lcool etlico (Etanol)

EB: Extrato bruto

FGH: Fibroblasto Gengival Humano

FIA:Flow injection analysis (Injeo por fluxo contnuo)

Fr: Frao

H: Hidrognio

Hex: Hexano

HRCB: Herbrio Rio Clarense do Departamento de Botnica

IR: ndice de refrao

IT: on-trap

M: massa

MeOH: lcool metlico (Metanol)

MS (EM): Espectrometria de Massas

MTT: (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazlio)

m/z: relao massa cargam1: espectro de 1 ordem


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m2: espectro de 2 ordem

nm: nanmetro

NP-Peg: Natural Products-Polyethilenglycol Reagent

PAD: Photo Diode Array Detector

PBS: Phosphate-buffered saline

PTFE: Politetrafluoretileno (Teflon)

: comprimento de onda

m: micrmetro

l: microlitro

Rf: Retention factor (Fator de reteno/Fator de retardamento)

RP18: Phase Reverse 18 (Fase Reversa 18)SFB: Soro Fetal Bovino

SPE: Solid Phase Extraction (Extrao em fase slida)

TFA: cido trifluoractico

tR: Tempo de reteno

UV: Ultravioleta

VN: Vermelho Neutro


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SUMRIO

1 INTRODUO........................................................................................................21

2 REVISO DE LITERATURA..................................................................................25

Fitoterapia...................................................................................................................27

Aroeira (M. urundeuva)...............................................................................................28

Compostos fenlicos..................................................................................................33

3 PROPOSIO........................................................................................................41

4 MATERIAL E MTODO..........................................................................................45

4.1 Etapa Botnica.....................................................................................................47

4.2 Metodologia de fracionamento e purificao das substncias.............................47

4.2.1. Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDc)................................47

4.2.2. Reveladores.....................................................................................................47

4.3 Partio 4.4.1. Cromatografia Liquida de Alta Eficincia (CLAE)........................48

4.4.1.1 CLAE analtica................................................................................................48

4.4.1.2. Anlise por FIA-ESI-IT-MS/MS......................................................................49

4.5 Etapa Qumica......................................................................................................49

4.5.1. Avaliao do Perfil Cromatogrfico da Fr BuOH..............................................50

4.6 Cultura Celular......................................................................................................50

4.6.1. Preparo dos grupos experimentais...................................................................51

4.6.2. Anlise de Viabilidade Celular..........................................................................52

4.6.3. Reduo do MTT..............................................................................................53

4.6.4. Captao do vermelho Neutro..........................................................................53

4.6.5. Cristal Violeta...................................................................................................53

5 RESULTADOS........................................................................................................55

5.1. Anlise por CCD comparativa.............................................................................57

5.1.2. Anlise por CLAE analtico...............................................................................58

5.1.3. Anlise por CLAE-PAD da Fr4 do BuOH.........................................................59

5.1.4. Anlise por FIA-ESI-IT-MSn.............................................................................60

5.2 Anlise de Viabilidade Celular..............................................................................64

5.2.1. Anlise da reduo do MTT do extrato MeOH nos perodos de 24, 48,72 e 96

horas...........................................................................................................................64


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5.2.2. Anlise da captao do vermelho neutro do extrato MeOH nos perodos de 24,

48,72 e 96 horas.........................................................................................................67

5.2.3. Anlise do cristal violeta do extrato MeOH nos perodos de 24, 48,72 e 96

horas...........................................................................................................................70

6 DISCUSSO...........................................................................................................75

7 CONCLUSO.........................................................................................................83

8 REFERNCIAS.......................................................................................................87

9 ANEXOS...............................................................................................................101


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1 Introduo


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1. Introduo

Considerando os tempos atuais, nota-se um aumento de interesse pelos

extratos de plantas, fruto da grande procura por terapias alternativas. Isto se deve

principalmente ineficcia de alguns produtos sintticos, o alto custo dos

medicamentos alopticos e a busca da populao por tratamentos menos

agressivos ao organismo humano. Os medicamentos fitoterpicos so preparaes

farmacuticas (extratos, tinturas, pomadas e cpsulas) de ervas medicinais, obtidos

a partir de uma ou mais plantas e utilizados para o tratamento de vrias doenas

(SOARES et al., 2008).

Um tero dos medicamentos mais prescritos e vendidos no mundo foram

desenvolvidos a partir de produtos naturais, estimando que 41% dos medicamentosdisponveis na teraputica atual foram desenvolvidos de fontes naturais: 25% de

plantas, 13,3% de microrganismos e 2,7% de animais (CALIXTO, 2003).

O conhecimento tradicional relata que as plantas medicinais so a base para a

medicina popular no Brasil, a qual derivada de uma mistura das influncias de

cultura brasileira indgena, europia e africana do perodo de colonizao

(CARTAXO et al., 2010).

Aliado ao componente cultural, o Brasil apresenta a maior diversidade vegetaldo mundo e h inmeras experincias vinculadas ao conhecimento popular das

plantas medicinais e tecnologia para correlacionar o saber popular e cientfico

(SANTOS et al., 2009). Neste contexto a prtica da fitoterapia vem recebendo

amparo legal significativo nos ltimos anos. Foram identificadas pouco mais de 260

plantas medicinais distribudas em cerca de 19 diferentes indicaes para uso em

odontologia. No entanto, muitos detalhes relacionados s suas propriedades

biolgicas permanecem sem esclarecimentos (SANTOS et al., 2009; BELLIK et al.,2012).

Uma das espcies brasileiras do cerrado que tem captado interesse de vrias

reas a Astronium urundeuva ou Myracrodruon urundeuva, tambm conhecida

popularmente como aroeira. Poucos estudos com o extrato da aroeira foram

realizados, mas j se apresentaram bem significativos para a odontologia. Destaca-

se o trabalho realizado com o preparo do gel tpico feito com a casca de

Myracrodruon urundeuva e o leo da folha da Lippia sidoides em ratos, onde os

autores observaram a reduo da reabsoro alveolar quando comparado com o

grupo controle, durante o experimento que induziu doena periodontal. O estudo de


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Botelho e colaboradores (2007) tambm mostrou que o mesmo gel apresentou efeito

antimicrobiano.

Alm de ser usada como antiinflamatrio na regio do nordeste do Brasil, a

aroeira, tambm mostrou efeito na atividade anti-ulcerognica e no trnsito

gastrointestinal (DESMARCHELIER, 1999). Um estudo in vivorealizado por Castelo

Branco Neto (2006) avaliou o efeito cicatrizante da administrao tpica do extrato

hidroalcolico de aroeira em feridas abertas na regio dorsocostal de ratos. Nesse

trabalho o autor concluiu que o extrato de aroeira retardou a reepitelizao das

feridas da pele dos ratos.

Em outro estudo foram avaliadas as atividades antimicrobiana, antiaderente e

antifngica da aroeira-do-serto sobre microorganismos do biofilme dental ecandidose oral. O extrato mostrou-se eficaz inibindo o crescimento das bactrias do

biofilme dental e fungos da candidose oral, sugerindo a utilizao desse extrato

como meio alternativo na teraputica odontolgica (ALVES, 2009).

Analisando os relatos acima existe ainda a necessidade de aprofundamento

cientfico (compreenso dos mecanismos e componentes do extrato de aroeira), in

vitroe in vivo,para possibilitar o uso do princpio ativo do extrato da aroeira como

possvel agente antimicrobiano e antiinflamatrio no tratamento odontolgico. Compotencial para uso como veculo usado durante cirurgias periodontais, enxaguante

bucal ps-cirrgico, curativo intracanal, entre outras possibilidades.

A caracterizao dos componentes do extrato de aroeira, aliado ao

entendimento do seu efeito (biocompatibilidade, molculas envolvidas, etc) sobre

fibroblastos gengivais humanos, pode colaborar na compreenso dos seus efeitos

ou mesmo validar efeitos j conhecidos pela cultura popular. Esse cruzamento de

informaes (componentes versus efeitos biolgicos) podero nortear estudosfuturos para estabelecimento de doses e indicaes mais seguras e efetivas do

extrato da aroeira.


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2 Reviso de Literatura


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2. Reviso de Literatura

Fitoterapia

O homem busca, desde tempos remotos, a cura ou o alvio das doenas por

meio do uso das plantas medicinais. Atualmente, diversos fitoconstituintes j so

conhecidos e estudados em modelos experimentais para entendimento de suas

atividades biolgicas in vitroe in vivo(CATO et al., 2006).

Os chamados medicamentos fitoterpicos so preparaes vegetais

padronizadas que consistem de uma mistura complexa de uma ou mais substncias

presentes na planta que so preparados adequadamente e posteriormente

prescritos em obedincia legislao vigente (DI STASI, 2007). De modo geral, os

compostos fitoterpicos podem ser utilizados nas mais variadas frmulas, comocpsulas, comprimidos, gis, pomadas, solues aquosas, solues hidroalcolicas e

infuses, que so conhecidas como chs (FRANCISCO, 2010).

De acordo com Maciel (2002), as pesquisas com plantas medicinais

envolvem investigaes da medicina tradicional e popular (etnobotnica); isolamento,

purificao e caracterizao de princpios ativos (qumica orgnica: fitoqumica);

investigao farmacolgica de extratos e dos constituintes qumicos isolados

(farmacologia); transformao qumica de princpios ativos (qumica orgnica esinttica); estudo da relao estrutura/atividade e dos mecanismos de ao dos

princpios ativos (qumica medicinal e farmacolgica) e finalmente a operao de

formulaes.

Estima-se, portanto, pela Organizao Mundial de Sade (OMS), que 65 a

80% da populao dos pases em desenvolvimento dependem das plantas

medicinais como nica forma de acesso aos cuidados bsicos de sade. Isso

porque o custo menor que os frmacos alopticos (WHO, 1998). A OMS aindaestimula e recomenda o uso daquelas plantas que tiverem comprovada eficcia,

segurana teraputica e desenvolvimento de programas que permitam cultivar e

utilizar as espcies vegetais na forma de preparaes dotadas de eficcia,

segurana e qualidade (LORENZI; MATOS, 2002). Assim, as plantas medicinais

seriam a maior e melhor fonte de obteno de frmacos para a humanidade

(SANTOS et al., 1995).

O Brasil apresenta a maior diversidade vegetal do mundo e inmeras

experincias vinculadas ao conhecimento popular das plantas medicinais e

tecnologia para correlacionar o saber popular e cientfico (CARTAXO et al., 2010).


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No contexto de uso de plantas medicinais a prtica da fitoterapia vem recebendo

amparo legal significativo nos ltimos anos. Foram identificadas pouco mais de 260

plantas medicinais distribudas em cerca de 19 diferentes indicaes para uso em

odontologia. No entanto, extratos para uso na odontologia so relatados pela

populao, mas poucos foram avaliados cientificamente quanto s suas

propriedades biolgicas. Assim, maiores detalhes de seus efeitos so necessrios

(GROPPO et al., 2008; SANTOS et al., 2009; VARONI et al., 2012).

Mesmo plantas com comprovada atividade farmacolgica, podem apresentar

alguns efeitos colaterais devido ao uso indiscriminado. o caso do ch verde

(Camellia sinensis, Theaceae) que em excesso pode causar danos ao fgado e

arritmia, alm de interagir com outros medicamentos (SOUZA, 2012).Sabemos, por exemplo, que espcies de plantas como Cravo da ndia, Rom,

Malva, Tanchagem, Amoreira, Slvia, Camomila, entre outras, so indicadas nos

casos de gengivite, abscesso na boca, inflamao e aftas. Algumas dessas afeces

vm sendo tratadas com a fitoterapia (OLIVEIRA et al., 2007).

Recentemente, extratos de plantas tm sido incorporados s frmulas de

dentifrcios, que alm de desempenhar outras funes, tem como objetivo principal

melhorar a ao antimicrobiana e atuar como agentes teraputicos (BARRETO etal., 2005). No trabalho de Ditterich et al. (2007), os autores avaliaram a atividade

antimicrobiana de vrias marcas comerciais de dentifrcios com componentes

teraputicos: Sorriso Herbal(prpolis), Malvatricinanti placa e anti-trtaro (tintura

de malva), Colgate Herbal (camomila), Gessy (extrato de ju), Sorriso (ju e

prpolis) e Paradontax (tintura de mirra e camomila). Seus resultados mostraram

que tanto o Stafilococcus aureus como a Escherichia coli foram sensveis aos

dentifrcios estudados, alm de apresentar ao inibitria similar paramicroorganismos Gram positivos e Gram negativos.

Aroeira (Myracrodruon urundeuvaAll)

Uma das espcies brasileiras do cerrado que tem captado interesse de vrias

reas a Astronium urundeuva ou Myracrodruon urundeuva. O gnero

Myracrodruonfoi descrito por Manoel Freire Allemo (FREIRE ALLEMO & FREIRE

ALLEMO 1862), baseado em M. urundeuva. Engler em 1881, subordinou este

gnero ao nvel de seco do gnero Astronium Jacq. A partir desta data, comexceo de Barroso (1984), todos os autores respeitaram a juno efetuada por


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Engler, at o trabalho de Santin e Leito Filho (1991), onde o gnero Myracrodruon

foi restabelecido Astronium foi sinonimizado a ele. Myracrodruon Freire Allemo

um pequeno gnero da famlia Anacardiaceae, distribudo restritamente Amrica

do Sul, nativas no Brasil (SANTIN & LEITO, 1991). Conhecida pelos nomes

populares de urundeuva, aroeira, aroeira-do-serto, aroeira-do-campo, aroeira-da-

serra, urindeva e arindeva. A aroeira encontrada nos Estados do Cear at o

Paran e Mato Grosso do Sul. mais freqente no nordeste do pas, oeste dos

estados da Bahia, Minas Gerais, So Paulo e sul dos estados do Mato Grosso do

Sul, Mato Grosso e Gois (LORENZI, 2002).

O uso de plantas medicinais em sade preventiva e curativa cercado de

recomendaes rigorosas quando da sua utilizao, pois segundo Veiga Jr e Pinto(2005) muitas plantas tm mostrado efeitos adversos como irritao gstrica, leses

no sistema nervoso, hemorragias, irritao na mucosa bucal (JUIZ et al., 2009).

A questo da dosagem representa um grande entrave para se garantir a

segurana e eficcia das ervas medicinais, mesmo em se tratando de plantas com

atividade biolgica confirmada, uma dose muito pequena pode no surtir efeito

algum, enquanto que uma dose maior pode induzir interaes perigosas com o

organismo (SOUZA, 2012).A aroeira do serto, uma rvore que, alm das propriedades farmacolgicas

conhecida pelo seu alto poder sensibilizante e irritante, capaz de ocasionar

alergias, reaes urticantes, eczemas e dermatites, frequentemente relatados por

indivduos que tem contado com a espcie (DIGENES e MATOS, 1999).

Alguns trabalhos identificaram compostos nos extratos com funes

particulares, como no caso encontrado na casca da Myracrodruon urundeuva de

onde foi isolada a lectina, protena estvel, que apresentou atividade larvicida contrao mosquito Aedes aegypti de acordo com o estudo feito por S (2009). Enquanto

Viana (2003) detectou a presena de chalconas dimricas presentes na casca de

Myracrodruon urundeuva, que apresentaram efeito analgsico e antiinflamatrio.

Souza (2007) tambm detectou a presena de tanino do tipo profisetidina

encontrado no extrato da casca da aroeira Myracrodruon urundeuvaque apresentou

propriedades antiinflamatrias e antiulcerognicas, em estudo induzindo leso

gstrica em roedores.

De acordo com Souza (2012), a estabilidade do extrato hidroalcolico das

folhas da aroeira apresenta facilidade de decomposio devido s caractersticas


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comuns dos galotaninos presentes, responsveis por sua classificao como taninos

hidrolisveis, onde as ligaes depsdicas (ligao entre duas unidades de cido

glico) so facilmente rompidas por solvlise (reao entre um soluto e um solvente

para formar novas substncias). As ligaes sofrem metanlise em condies

ligeiramente cidas.

Em estudo realizado no tratamento da diarria, o extrato alcolico da casca de

aroeira foi testado no trato gastrointestinal em ratos. A dose oral do extrato de 100 e

200 mg/kg inibiu significantemente a propulso gastrointestinal induzida pela

fisostigmina. Os efeitos anti-colinrgicos da planta podem justificar em parte esta

atividade anti-diarria (MENENDEZ e RAO, 1988).

Em um estudo fitoqumico com o extrato EtOH 70% das folhas e cascas daaroeira foram identificado os constituintes qumicos do extrato de aroeira. Os

principais constituintes encontrados foram o cido glico, galato de metila, galato de

etila, cido clorognico e cido protocatecuico. Sendo os trs primeiros em maiores

quantidades enquanto que os ltimos parecem substncias minoritrias (SOUZA,

2012).

Em um recente trabalho o leo essencial de trs espcies da aroeira, M.

urundeuva, Schinus terebintifolium e Schinus molle L. foram preparados, sendoestas espcies da famlia da Anacardicea (MONTANARI et al., 2012). O leo das

folhas da espcie de S. terebintifolimexibiu atividade antibacteriana e antifngica.

J o leo essencial de folhas de Schinus molle L. demonstrou um efeito protetor

contra Streptococos anatum e Streptococos enteridis. A alta atividade

antibacteriana do leo das folhas de M. urundeuva aumentou o contedo de

mega-3-carene, induzindo a peroxidao lipdica (MONTANARI et al., 2012).

O estudo do extrato EtOH (70%) das folhas de A. urundeuva indica quederivados de cidos fenlicos so os metablitos secundrios de maior ocorrncia

na espcie, em especial galotaninos, que so polmeros de cido glico com um

ncleo sacardico (um ncleo formado por uma glicose ligado a molculas de cido

glico) (SOUZA, 2012). Essas substncias so conhecidas pela sua instabilidade

frente solvlise, o que justifica um estudo criterioso no somente da composio

qumica, mas tambm da estabilidade do extrato, que pode vir a sofrer

transformaes significativas durante as etapas de extrao, armazenamento e

anlise, que podem influenciar sobremaneira na produo de um fitoterpico

(SOUZA, 2012).


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Em outro estudo, tambm recente, Carlini et al. (2013) mostraram que os

extratos da casca de Schinus terebinthifolius (aroeira-da-praia) e M. urundeuva

(aroeira-do-serto) apresentaram um potencial txico quando administrados

cronicamente. Esses foram capazes de induzir a m formao ssea nos filhotes de

ratas fmeas tratadas com esses extratos durante a gravidez. Nesse mesmo estudo

altas doses de S. terebinthifolius diminuiram significantemente o nmero de clulas

vermelhas do sangue, hemoglobina e hematcito. No caso do extrato de M.

urundeuva foi achado uma diminuio significante nos valores de hematcitos, e

houve uma diminuio no significante no nmero de eritrcitos e hemoglobina.

O estudo de Menezes e colaboradores (2010) teve como objetivos avaliar a

capacidade dos extratos de ara e de aroeira do serto em interferir com amicrodureza do esmalte dental de ratos submetidos a desafio cariognico, bem

como avaliar o efeito desses extratos sobre a microbiota cariognica implantada

desses animais, e seus possveis efeitos colaterais. O modelo animal e as condies

experimentais se mostraram adequadas para a caracterizao dos efeitos dos

extratos de ara e aroeira diludo em gua testados sobre a microdureza do

esmalte e sobre a microbiota cariognica, sendo que os dois extratos testados

produziram uma reduo substancial da microbiota cariognica nos animaisexperimentais e o consumo dos mesmos afetou positivamente a dureza superficial

do esmalte. A ingesto dos extratos no alterou significativamente os rgos dos

animais, quando comparado com o grupo controle.

Em estudo realizado com o extrato da casca de M. urundeuva foi realizado

ensaio de MTT com trs linhagens cancergenas celulares, MDA-MB-435, HCT-8,

SF-295. Nos resultados obtidos o extrato apresentou atividade citotxica em clulas

cancergenas (MAHMOUD et al., 2011).Alguns efeitos da aroeira, descritos popularmente (reduo na inflamao do

ovrio, lceras externas, bronquite, tosse) foram pesquisados por alguns autores.

Foi relatada atividade anti-ulcerognica e no trnsito gastrointestinal em ratos

(DESMARCHELIER, 1999). Outro estudo realizado in vivo, por Castelo Branco Neto

(2006), avaliou o efeito cicatrizante da administrao tpica do extrato hidroalcolico

de aroeira em feridas abertas na regio dorsocostal de ratos. Nesse trabalho o autor

concluiu que o extrato de aroeira retardou a reepitelizao das feridas da pele dos

ratos.


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Em estudo realizado por Ferreira e colaboradores (2011) foram testados 21

extratos e dentre os testados pelo ensaio do MTT, aps 72 h de incubao, apenas

o extrato etanlico obtido a partir de sementes de Myracrodruon urundeuva, o qual

apresentou traos de esterides (alcalides e fenis em sua composio),

demonstrou atividade citotxica in vitro em clulas tumorais humanas, sendo 2

vezes mais ativo sobre a linhagem leucmica HL-60 do que sobre clulas de

glioblastoma SF-295 e de sarcoma 180.

No trabalho de Machado et al. (2012), os autores avaliaram a resposta

biolgica (por meio de anlise edemognica e histopatolgica) frente ao contato

dos extratos da folha de aroeira com o tecido conjuntivo subcutneo em ratos. O

extrato aquoso de aroeira apresentou, aos 28 dias de experimentao, resultadossemelhantes ao grupo controle (soro fisiolgico): edema e reparo tecidual brando

(tecido conjuntivo de granulao composto por fibras colgenas e fibroblastos),

enquanto para o extrato hidroalcolico, houve uma relao persistente de

inflamao at os 28 dias.

Na odontologia, apesar do uso da fitoterapia ser milenar, a utilizao de plantas

medicinais para tratar doenas bucais ou sistmicas com manifestaes bucais ainda

pouco explorada (OLIVEIRA et al., 2007; VARONI et al., 2012). Entretanto, nosltimos anos as pesquisas relacionadas a produtos naturais cresceram

significantemente, frente ao aumento pela busca por produtos com menor toxicidade,

maior atividade farmacolgica e mais biocompatveis, alm de custos mais acessveis

populao (FRANCISCO, 2010).

Nos trabalhos realizados por Botelho et al. (2007 e 2008) os autores utilizaram

um preparo de gel tpico feito com a casca da aroeira (Myracrodruon urundeuva) e o

leo da folha do alecrim pimenta (Lippia sidoides). O gel foi aplicado no tecidogengival em ratos que tiveram doena periodontal induzida. Nos animais tratados

com o gel foi observada a reduo da reabsoro ssea alveolar quando comparado

com o grupo controle. Alm desses resultados, o estudo de Botelho et al. (2007)

tambm mostrou que o gel apresentou efeito antimicrobiano. Os autores ainda

destacaram a necessidade de se conhecer e pesquisar os efeitos clnicos desses

compostos (BOTELHO et al., 2007; BOTELHO et al., 2008).

Em outro estudo avaliou-se a atividade antimicrobiana, antiaderente e

antifngica in vitro da aroeira-do-serto (extrato hidroalcolico da entrecasca) sobre

microorganismos do biofilme dental e candidose oral. O extrato mostrou-se eficaz


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inibindo o crescimento das bactrias do biofilme dental e fungos da candidose oral,

sugerindo a utilizao desse extrato como meio alternativo na teraputica

odontolgica (ALVES et al., 2009).

Um outro estudo foi realizado com o fitoterpico na forma de gel, feito com o

extrato aquoso com 10% da entrecasca da aroeira. Os participantes foram

orientados a escovar os dentes com o gel durante 3 vezes ao dia por trinta dias. Em

seguida foi realizado a avaliao por meio do ndice de placa supragengival,

gengivite e sangramento gengival. Os resultados demonstraram que o gel no

apresentou efeito adicional sobre a reduo da inflamao gengival.Dois grupos do

trabalho (grupo com gel contendo 10% de Myracrodruon urundeuva e o grupo

controle - gel placebo) apresentaram reduo significante da gengivite de formasemelhante, apresentando no final do estudo uma porcentagem de reas com

sangramento gengival abaixo do nvel considervel tolervel de 20% (PEREIRA et

al., 2009).

Analisando os relatos acima existe ainda a necessidade de aprofundamento

cientfico (compreenso dos mecanismos e componentes do extrato de aroeira), in

vitroe in vivo,para possibilitar o uso do princpio ativo do extrato da aroeira como

antimicrobiano e antiinflamatrio no tratamento odontolgico para possvel veculousado durante cirurgias periodontais, enxaguante bucal ps-cirrgico, entre outras

possibilidades.

Compostos fenlicos

Os metablitos secundrios em plantas medicinais so compostos

denominados de fenlicos, alcalides e terpenides (EID et al., 2012).

Uma ampla variedade desses metablitos secundrios produzida pelosvegetais superiores, responsveis pela defesa natural da planta sob estresses

biticos e abiticos. Neste grupo de metablitos esto envolvidos compostos

nitrogenados (alcalides, aminas, aminocidos, glicosdeos cianognicos,

glicosinolatos, inibidores de proteases e lectinas) e no nitrogenados como os

terpenides, saponinas, flavonides, antocianinas, taninos, cidos fenlicos,

ligninas, lignanas e poliacetilenos (RGO JUNIOR et al., 2011).

Dentre os compostos acima citados, os cidos fenlicos pertencem classe decompostos fenlicos que apresenta estrutura simples, formada por um anel

aromtico e substituinte (em geral hidroxilas). So formados a partir de aminocidos


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fenilalanina e tirosina por meio da via de sintetizao do cido chiqumico (JARDINI

et al., 2010). Os compostos fenlicos esto distribudos em toda a planta de maneira

no uniforme, nas formas livre ou esterificados a compostos solveis

(compartimentalizados nos vacolos celulares) ou insolveis (na parede celular),

formando uma mistura complexa juntamente a carboidratos, protenas e outros

componentes de vegetais, de modo que os mtodos de anlise dependem da

natureza da matriz. Por esta razo no h um modelo padro para a extrao e

identificao destes compostos (LIMA e MANCINI-FILHO, 2005; KHODDAMI et al.,

2013).

Os fenlicos so um grupo de metablitos secundrios de plantas

encontrados amplamente em todo reino vegetal, como exemplificado no Esquema 1.Entre esses metablitos esto os flavanides, tocoferis, catequinas, cidos

fenlicos, etc (RECIO, ANDJAR e ROS, 2012).

Esquema 1:Classificao de Fitoqumicos

Adaptado de Liu, 2004.


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A eficincia dos compostos fenlicos na atividade antioxidante varivel e um

dos fatores relevantes a estrutura qumica de cada composto, contando o nmero

e o posicionamento de grupamentos hidroxila ligados ao anel aromtico (JARDINI et

al., 2010).

Os efeitos desses diversos compostos so descritos na literatura, entretanto,

muitas lacunas (mecanismos moleculares) ainda no foram totalmente preenchidas

(BELLIK et al., 2012). Vrios mecanismos de aes celulares so propostas para

explicar o modo de ao de fitoqumicos, mas poucas evidncias foram

apresentadas no sentido de explicar os efeitos in vivo desses fitoqumicos.

Provavelmente so multiplos mecanismos celulares que so modulados

(estimulados/inibidos) por vrios componentes. Em adio faltam trabalhos clnicosduplo-cego para comprovar a eficcia e segurana desses compostos (BELLIK et

al., 2012). Quando procurados trabalhos em animais ou clnicos, relacionados

preveno e tratamento em sade bucal, com uso de fenlicos, esto so

insuficientes ou mesmo inexistentes. Restando apenas evidncias em trabalhos in

vitro(VARONI et al., 2012).

As evidncias cientficas, na sua grande maioria trabalhos in vitro, tem

apontado para efeitos antiinflamatrios, antiproliferativos, antioxidantes, antitumor depolifenis (ARAIM et al., 2002; QUEIRES et al., 2006; RECIO, ANDJAR e ROS,

2012; ROMANO et al., 2013) e alguns so considerados antimicrobianos (MUKNE et

al., 2011). Os polifenis podem modular a expresso de sinais pr-inflamatrios

(RECIO, ANDJAR e ROS, 2012); regular vias de sinalizao e segundos

mensageiros (GMPc, AMPc, protena-quinases, e clcio) (CALIXTO et al., 2008);

inibir algumas enzimas como a DNA girase (CUSHNIE e LAMB, 2006; ROMANO et

al., 2013). Flavonides exercem aes anticncer por meio de uma combinao demecanismos, tais como inativao cancergena, anti-proliferao, parada do ciclo

celular, induo de apoptose, inibio da angiognese, entre outros (GIBELLINI et

al., 2011; CHAHAR et al., 2012). Em um trabalho recente (TRENTIN et al., 2013) foi

proposto que os taninos obtidos de plantas da Caatinga, entre elas a Myracrodruon

urundeuva, foram capazes de inibir a formao de biofilme por danificar a membrana

bacteriana, exibindo assim propriedades bacteriostticas.

As catequinas e epicatequinas so flavanis com atividades antioxidante,

antiinflamatria, antimicrobiana e anticarcinognica presentes principalmente em


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sementes de uvas. Esses so os principais compostos fenlicos responsveis pelo

sabor e adstringncia de vinhos e sucos de uva (ABE et al., 2007).

O cido glico tambm um cido fenlico conhecido pela sua capacidade na

induo da morte celular. Em cultura de clulas de linhagens tumorais que foram

tratadas com distintas fraes de compostos fenlicos extradas da semente da

Oenothera biennis, foi possvel verificar que aquela que continha 55% (Fr 4) de

cido glico foi a mais eficiente em diminuir a proliferao e a viabilidade celular. O

cido glico conhecido por induzir morte celular ou deter o ciclo celular em uma

variedade de clulas tumorais de maneiras diferentes, dependendo da linhagem

celular usada (PELLEGRINA et al., 2005).

Os taninos pertencem a um grupo de compostos fenlicos provenientes dometabolismo secundrio das plantas e so definidos como polmeros fenlicos

solveis em gua que precipitam protenas. Apresentam alto peso molecular (500-

3000 Da) e contm grupos hidroxilafenlicos em quantidade suficiente para permitir

a formao de ligaes cruzadas com protenas (HASLAM, 1966).

Os taninos podem ser classificados como hidrolisveis e no hidrolisveis ou

condensados (SINGLETON e KRATZER, 1973). Os taninos hidrolisveis por

hidrlise cida liberam cidos fenlicos: glico, cafico, elgico e um acar(SGARBIERI, 1996). Esses cidos fenlicos, assim como os demais compostos

fenlicos existentes em diversos vegetais, apresentam atividade antioxidante, a qual

considerada uma importante funo fisiolgica.

Por serem fenlicos, os taninos so muito reativos quimicamente, formam

pontes de hidrognio, intra e intermoleculares. Um mol de taninos pode ligar-se a

doze moles de protenas; fundamentando-se nessa propriedade podem-se identificar

taninos por teste de precipitao de gelatinas, por exemplo. Estes compostos sofacilmente oxidveis, tanto por meio de enzimas vegetais especficas quanto por

influncia de metais, como cloreto frrico, o que ocasiona o escurecimento de suas

solues (MONTEIRO et al., 2005).

Se conhece 10 classes de flavonoides, todos contendo 15 tomos de

Carbono e seu ncleo bsico em um sistema C6-C3-C6 no qual dois anis

aromticos A e B esto unidos por uma unidade de 3 carbonos que podem formar

um terceiro anel, que se caso existir, chama-se Anel C (UGAZ, 1994).

As aes antinflamatrias e antioxidantes tm aplicaes especficas por

patologias associadas com inflamao crnica sistmica de baixo grau que sustenta


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a progresso de diabetes mellitus e doena cardiovascular. Mecanismos envolvidos

dependem da estrutura dos compostos, estado redox da inflamao ao redor e

outras interaes (SOORY, 2012).

Em relao aos flavonoides, estes podem ser divididos em classes, sendo

que as propriedades qumicas e biolgicas destes subgrupos podem ser

completamente diferentes de acordo com suas estruturas (ERLUND, 2004).

Os flavonoides representam a classe mais abundante de polifenis de plantas

com mais de 6000 (seis mil) estruturas identificadas. Em recentes anos, os

flavonoides tm se tornado cada vez mais importante por seu uso potencial como

agente profiltico e teraputico em muitas doenas. Investindo em sua aplicao,

focando efeitos antioxidante, antitumoral, antimicrobiano, antinflamatrio, antiviral,antiangiognico e imunomodulador. Os efeitos biolgicos dos flavonides tm sido

relacionados sua habilidade de inibir enzimas e/ou suas propriedades

antioxidantes (GRUBESIC, 2013).

Os flavonides so capazes de influenciar a atividade do sistema nervoso

central e tambm por ligao do stio benzoadiazepina no receptor GABA resultando

em efeitos de sedao, ansioltico ou anti-convulsivo ou por ao como inibidores da

oxidase monoamina A ou B, assim trabalhando como anti-depressores ouantiparkinsons (CHOUDHARY et al., 2011; GUO et al., 2011; HERRERA-RUIZ et al.,

2011; JGERAND SAABY, 2011; JIANG et al., 2011; FERNANDEZ et al., 2012;

KARIM et al., 2012; ZHANG et al., 2012).

Salgado (2006) afirma tambm que os flavonoides mostram um conjunto

extraordinrio de aes farmacolgicas e bioqumicas dos quais sugerem efeito

antinflamatrio e modulao do sistema imune. Diversos mecanismos de ao tm

sido propostos a explicar as aes antinflamatrias de flavonoides in vivo.Flavonides tambm modulam as funes de clulas inflamatrias como linfcitos,

clulas assassinas naturais, moncitos, neutrfilos, clulas alvo e macrfagos.

Os flavonoidesainda exercem ao anti cancergena via uma combinao de

mecanismos como inativao carcinognica, antiproliferao, interrupo do ciclo

celular, induo da apoptose, inibio da angiognese e resistncia reversa de

mltiplas drogas (GIBELLINE et al., 2011; CHAHAR et al., 2012).

Chs que apresentam polifenis dispem de vrias propriedades que tm

sido caracterizadas in vitro. Uma dessas propriedades, por exemplo de que os

polifenis so 5 vezes mais efetivos, como antioxidante, que a vitamina C ou


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vitamina E e tem sido recentemente observado que o flavonoide galato de

epigalocatequina, encontrado em chs pode regular a produo de ROS pela

modulao da atividade da glutationa e da enzima citocromo P450 (QUNINONES,

2013). Tambm foram encontrados flavonoides no ch verde que apresentam

efeitos neuroprotetores, quando estudados em modelos animais e clulas

(RENDEIRO, 2011).

Alguns estudos tem demonstrado que os compostos fenlicos da rom so

possveis inibidores do crescimento de tumores de mama e de prstata (JARDINI et

al., 2010). A inibio do crescimento das clulas foi verificada por Seeram e

colaboradores (2005), em linhagens tumorais do clon, prstata e oral. Alm da

induo da apoptose e a inibio da lipoperoxidao induzida por Fe+ em modelolipossmico.

Foi descoberto que uma srie de doenas entre as quais cncer, aterosclerose,

diabetes, artrite, malria, AIDS, doenas do corao, podem estar ligadas aos danos

causados por formas de oxignio extremamente reativas denominadas de espcies

reativas do oxignio ou EROS. Estas substncias tambm esto ligadas com

processos responsveis pelo envelhecimento do corpo. Os produtos alimentcios

tambm se mostram suceptveis a estes processos oxidativos, resultando emsubstncias finais prejudiciais ou com caractersticas sensoriais indesejveis,

reduzindo com isso o prazo de validade dos produtos (DEGASPARY, 2004).

No incio dos anos 80 o interesse em encontrar antioxidantes naturais para o

emprego em produtos alimentcios ou para uso farmacutico aumentou

consideravelmente, com o intuito de substituir antioxidantes sintticos, os quais tem

sido restringidos devido ao seu potencial de carcinognese, bem como pela

comprovao de diversos outros males como: aumento do peso do fgado esignificativa proliferao do retculo endoplasmtico (DEGASPARY, 2004).

Um novo composto, isolado a partir do extrato metanlico das folhas de

Paepalanthus argenteus var (Bongard) foi caracterizado como xeractinol, um novo

diidroflavonol C-glucosilado, que corresponde a um flavonoide com atividade

antioxidante (DOKKEDAL et al., 2007) e atividade antiinflamatria (COUTINHO et

al., 2009).

Os taninos apresentam propriedades relacionadas capacidade de seqestro

de seus radicais (SILVA et al., 1991), e essas propriedades tem sido usadas contra

doenas do corao at reduo de oxidao lipdica. Os taninos apresentam


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grande variao em sua estrutura, alm de estarem em grande concentrao entre

determinadas espcies de plantas (SILVA et al., 1991).


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3 Proposio


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3. Proposio

O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar o extrato de aroeira e avaliar

seu efeito sobre fibroblastos gengivais humanos.

Objetivos especficos

1- Identificar o perfil qumico do extrato hidroalcolico de aroeira e seus

principais constituintes;

2- Analisar a influncia do extrato hidroalcolico de aroeira na viabilidade de

fibroblastos gengivais humanos da linhagem FGH.


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Material e Mtodo


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4. Material e Mtodo

4.1. Etapa Botnica

Foram coletados 640 g de folhas secas e saudveis de M. urundeuva noHorto Florestal de Bauru e preparada excicata que foi identificada e armazenada no

herbrio Rioclarense (HRCB) do Departamento de Botnica-IB-UNESP-Rio Claro

sob n de identificao da excicata-HRCB59831.

4.2. Metodologia para Anlise dos Extratos e Fraes

4.2.1. Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDc)

Foram utilizadas placas preparadas comerciais de silica gel 60 (Merck), de

tamanho 20 X 20 cm em 0,2 mm de espessura de adsorvente. As amostras foram

aplicadas por meio de capilares de vidro nas placas na forma de solues, em

solventes bastante volteis, que possam ser facilmente eliminados aps a aplicao.

Estas amostras foram aplicadas em forma de ponto de 0,3 mm de dimetro, 1,0 cm

acima da borda inferior e 1,0 cm de distncia das adjacentes. A placa introduzida

numa cuba cromatogrfica de vidro, contendo um papel de filtro para saturao com

os vapores do solvente e eludas em diferentes sistemas de solventes orgnicos(fase mvel), utilizando hexano, clorofrmio, acetato de etila, acetona, lcool (n)-

butlico, lcool metlico ou outros.

4.2.2. Reveladores

Inicialmente as placas foram visualizadas sob luz UV 254-366 nm e

posteriormente submetidas a vapores de iodo sublimado ou reveladores como

Anisaldedo/H2SO4 (Wagner, 1996): 85,0 mL de MeOH, 10,0 mL de cido actico,

5,0 mL de H2SO4, que pulverizado na placa cromatogrfica; observam-se manchas

roxas para terpenos, lils para saponinas, amareladas para flavonides, cinza para

cido glico e marrom para taninos; ou NP-Peg (WAGNER, 1996); 100,0 mg de

difenilaminoborato (NP), 500,0 mg de polietilenoglicol 2000 (PEG), 20,0 mL de

MeOH, que borrifado sobre a placa cromatogrfica e observa-se no visvel e sob

luz UV, manchas amarelas para flavonides derivadas do Kaempferol e alaranjadas

para derivados da quercetina.


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4.3. Partio

O mtodo de partio foi utilizado para um fracionamento inicial dos extratos.

Utilizou-se funil de separao, onde foram colocados dois solventes orgnicos

imisciveis, com volumes iguais, com a amostra previamente dissolvida em um dos

solventes utilizados. Aps um dia de repouso, as fases foram coletadas

separadamente, e em seguida concentradas em rotoevaporador sob presso

reduzida, em temperatura inferior a 60C. Cada frao foi transferida para vidro

tarado, deixada na capela at completa secura e pesada.

4.4.1. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

4.4.1.1. CLAE analtica

A anlise do perfil qumico (fingerprint) do extrato hidroalcolico (MeOH

80%) foi realizada em CLAE Jasco com bomba quaternria, modelo PU-2089

(Jasco) acoplado a um detector de arranjo de fotodiodos (PAD), modelo MD-2010

(Jasco) e a um injetor automtico modelo AS-2055 (Jasco). Como fase mvel foi

utilizada ACN + TFA 0,1% (B) e H2O + TFA 0,1% (A). Coluna Phenomenex

Synergi Hydro RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 4 m), fluxo 1,0 mL min-1, = 280 nm,

Sistema de eluio gradiente: 0-15% B (15 min), 15-20% B (30 min), 20-30% B (30

min), 30-100% B (5 min), 100% B (isocrtico, 5 min) perfazendo uma anlise com

tempo total de 85 min. Estes experimentos foram realizados em colaborao com o

Prof. Dr. Wagner Vilegas, no Laboratrio de Qumica de Produtos Naturais, IQ-

UNESP/Araraquara com a colaborao do aluno de Mestrado Leonardo Perez.

A anlise do perfil qumico (fingerprint) das fraes de partio de M.

urundeuvafoi realizada em cromatgrafo Jasco com bomba quaternria com forno

de coluna, detector PAD, em coluna Phenomenex Luna C18(250 x 4.6 mm d.i.; 5m). Como fase mvel utilizou-se os solventes H2O + c. Frmico 0,1% (A) e MeOH

+ c. Frmico 0,1% (B), pureza HPLC. Gradiente exploratrio de 0-60 minutos, de 5-

100% de B em A. O fluxo foi de 1,0 mL.min-1, o volume da amostra injetado foi de

20,0 L, temperatura de 25C; as anlises foram feitas monitorando no

comprimento de onda de 280 nm. Estes experimentos de fingerprint em CLAE

foram realizados no Laboratrio de Bioqumica da Faculdade de Cincias,

UNESP/Bauru com a colaborao do Prof. Dr. Valdecir Farias Ximenes e dos alunosde Mestrado Las Pierone e Luiz Leonardo Saldanha.


51/108

49

As fraes de partio foram pr-tratadas utilizando cartuchos Sep PaK (SPE)

Strata C18de 500 mg/3 mL, acoplado com filtro PTFE de 0,2 m; os cartuchos foram

pr-condicionados passando sequencialmente MeOH e H2O, ativando, assim, a fase

estacionria; em seguida, a amostra (1 mg de amostra para cada 10 mg da fase

estacionria) previamente solubilizada em pequeno volume de MeOH aplicada no

cartucho.

4.4.1.2. Anlise por FIA-ESI-IT-MS/MS

Os espectros de massas foram obtidos em um espectrmetro de massas

modelo LCQ FLEET (Thermo scientific, equipado com um dispositivo de insero

direta da amostra via anlise por injeo em fluxo contnuo (FIA). A amostra foi

analisada no modo de ionizao por electrospray (ESI) e as fragmentaes em

mltiplos estgios (MS2, MS3) realizadas em uma interface do tipo ion-trap (IT). O

modo negativo foi escolhido para a gerao e anlise dos espectros de massas em

primeira-ordem (MS), bem como para os demais experimentos em mltiplos estgios

(MSn), sob as seguintes condies: voltagem do capilar20 V, voltagem do spray5

kV, temperatura do capilar 275C, gs de arraste (N2) fluxo 12 (unidades arbitrrias).

A faixa de aquisio foi m/z 50-1000, com dois ou mais eventos de varredura

realizados simultaneamente no espectrmetro de massas LCQ. O primeiro evento foi

uma varredura completa (full-scan) do espectro de massas para adquirir os dados

dos ons na faixa m/z estabelecida. Os demais eventos foram experimentos MSn

realizados a partir dos dados da primeira varredura para ons precursores pr-

selecionados com energia de coliso entre 25 e 30% da energia total do

instrumento. O software Xcalibur verso 1.0 (Thermo scientific) foi utilizado durante

a aquisio e processamento dos dados espectromtricos. Para os experimentos de

LC-MS o equipamento foi acoplado a um cromatgrafo modelo Accela High Speed

LC (Thermo cientific). A anlise por FIA-ESI-IT-MS/MS foi realizada no Laboratrio

de Quimica da UNESP/Araraquara com a colaborao do professor Wagner Villegas

e do aluno de Mestrado Leonardo Perez Souza.

4.5. Etapa Qumica

As folhas da aroeira foram selecionadas para extrao com MeOH 80%. A

extrao foi feita por macerao da planta com o solvente orgnico por umasemana. Este procedimento foi repetido vrias vezes, at completa extrao das

substncias. Aps a extrao, o solvente foi filtrado em papel filtro e concentrado em


52/108

50

rotaevaporador sob presso reduzida em temperatura


53/108

51

Os fibroblastos foram cultivados em meio de cultura de Eagle modificado por

Dullbecco (DMEM) (Cultilab, Campinas, Brasil) e 10% soro fetal bovino (SFB

Cultilab, Campinas, Brasil), suplementado com 1% de antibitico. Assim que

atingiram a subconfluncia foi realizado o subcultivo. O meio do frasco de cultivo foi

aspirado e a monocamada celular lavada duas vezes com soluo tampo fosfato

salina PBSA, pH 7,2 (Cultilab, Campinas, Brasil).

A seguir as clulas foram separadas com 2 mL de uma soluo de tripsina a

0,25% (Cultilab, Campinas, Brasil), durante 1 minuto, a 37C. A tripsina foi inativada

com meio de cultura e as clulas em suspenso foram transferidas para um tubo

plstico do tipo Falcon (TPP) e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos, em

temperatura ambiente. O precipitado de clulas resultante da centrifugao foiressuspenso em 1mL de meio fresco, e a suspenso de clulas foi replaqueada em

frascos de cultivo T75.

4.6.1. Preparo dos grupos experimentais

Para os experimentos foram plaqueadas 2x103clulas/poo em placas de 96

poos (TPP) (sextuplicatas). Aps incubao por 24h o meio de cultivo foi

substitudo por meio DMEM complementado por 10% de SFB e 1% antibitico de

diferentes concentraes do extrato de aroeira hidroalcolico (extrato bruto; 1:10;

1:100; 1:1000; 1:10000). A ISO n 10993-5 sugere o protocolo para teste in vitrodo

extrato do material em diferentes diluies, dessa maneria nosso protocolo foi uma

adaptao desse teste da ISO. As solues hidroalcolicas de aroeira foram

previamente preparadas dentro da capela de fluxo laminar e armazenadas em

frascos esterilizados. Inicialmente 20 mg do extrato bruto hidroalcolico (MeOH) de

aroeira foi acrescentado em 20 mL de meio DMEM e 10% SFB em tubo falcon de 50

mL. Em seguida foram realizadas as diluies seriadas, do frasco menos diludo

para o mais diludo: 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000 respectivamente. As diluies

foram realizadas um dia anterior ao ensaio e armazenado na geladeira. Antes do

uso foi necessrio agitar em vrtex para homogeinizao da soluo.

Os fibroblastos foram analisados em tempos experimentais de 24, 48, 72 e 96

horas aps a adio do meio condicionado. Aps cada perodo experimental, o meio

de cultura contendo o extrato de aroeira hidroalcolico foi removido, as clulas

foram lavadas com PBSA e divididas para realizao das diferentes anlises. Cadaensaio foi repetido duas vezes.


54/108

52

Os grupos experimentais foram divididos em:

G1- ControleDMEM

G2- DMEM + extrato bruto aroeira hidroalcolico

G3- DMEM + 1:10 aroeira hidroalcolico



G6 - DMEM + 1:10000 aroeira hidroalcolico

B - Blank

4.6.2. Anlise da viabilidade celular

Das anlises de viabilidade celular foram escolhidas trs diferentes, sendo

cada uma responsvel pela colorao de uma organela e/ou funo especfica:

MTT, Vermelho Neutro e Cristal Violeta.

G1

G1

G1

G1

G1

G1

G2

G2

G2

G2

G2

G2

G3

G3

G3

G3

G3

G3

G4

G4

G4

G4

G4

G4

G5

G5

G5

G5

G5

G5

G6

G6

G6

G6

G6

G6

B

B

B

B

B

B


55/108

53

4.6.3. Reduo do MTT

O teste de atividade mitocondrial das clulas foi realizado pelo mtodo da

reduo do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazlio) que

ocorre nas mitocndrias de clulas viveis (MOSSMAN, 1983). Esse teste

quantificou a converso do MTT (Vybrant, Molecular Probes, EUA), que solvel em

gua, em um formazan insolvel. O formazan, de cor azul purprea, solubilizado e,

ento, sua concentrao determinada pela densidade ptica em espectrofotmetro

com filtro de 570 nm. As clulas foram incubadas numa soluo de 0,5 mg de

MTT/ml de DMEM sem SFB, por 4h a 37C; aps a remoo da soluo, o pigmento

insolvel reduzido intracelularmente foi extrado em 200 l de etanol/poo, sob

agitao suave por 10 min temperatura ambiente. Experimento realizado emsextuplicata. Em seguida, a absorbncia do extrato hidroalcolico de cada poo foi

mensurada a 570 nm (FluoStar OPTIMA, leitor de fluorescncia em microplacas).

4.6.4. Captao do vermelho neutro (VN)

O parmetro mais utilizado para checar toxicidade a viabilidade celular que

pode ser evidenciada com o auxlio de corantes vitais como o vermelho neutro,

solvel em gua e que passa atravs da membrana celular, concentrando-se nos

lisossomos, fixando-se por ligaes eletrostticas hidrofbicas em stios aninicos

na matriz lisossomal. Muitas substncias danificam as membranas resultando no

decrscimo de captura e ligao do vermelho neutro. Portanto possvel distinguir

entre clulas vivas e danificadas ou mortas, pela medida de intensidade de cor da

cultura celular (ROGERO et al., 2003).

A partir de uma soluo estoque de vermelho neutro 0,4% foi obtida uma

soluo de 50 g/mL de vermelho neutro em DMEM. A soluo obtida permaneceu

em estufa 37C, "overnight" para haver a precipitao de cristais, sendo ento

filtrada em filtro Millipore (0,22 m). As clulas foram tratadas com essa soluo (50

g/mL) e as placas incubadas por 3h, 37oC, para permitir a captao do corante

pelos lisossomos das clulas viveis. Elas foram lavadas com PBS-Ca+2e o corante

foi extrado numa soluo de etanol 50 % e cido actico 1%, colocando-se 200 L

dessa soluo/poo. Em seguida, determinamos a absorbncia a 540 nm (FluoStar

OPTIMA, leitor de fluorescncia em microplacas).

4.6.5. Cristal Violeta


56/108

54

O cristal violeta um corante que marca cidos nuclicos das clulas aderidas

e fixadas (KUENG etal., 1989).

Para a realizao do experimento as clulas foram plaqueadas na proporo

de 2x103clulas/poo em placas de 96 poos para os perodos de 24, 48, 72 e 96

horas. Em seguida, as clulas viveis foram lavadas com PBS e fixadas em etanol-

glacial absoluto e cido actico (3:1, vol/vol) por dez minutos a temperatura

ambiente, deixando secar ao ar, encubando 37C, envolvida em papel alumnio. As

clulas foram coradas com cristal violeta a 0,1% (peso/vol) por dez minutos a

temperatura ambiente. O excesso do corante foi removido por decantao e lavado

duas vezes com gua destilada. O corante foi extrado em cido actico a 10%

(vol/vol) e a densidade ptica foi avaliada a 550 nm (FluoStar OPTIMA, leitor defluorescncia em microplacas).

Anlise Estatstica

A estatstica foi realizada em anlise de varincia de 2 critrios seguido de uma

anlise de teste Tukey (p


57/108

5 Resultados


58/108


59/108

57

5. Resultados

5.1.1. Anlise por CCD comparativa

As fraes de partio foram submetidas cromatografia em camada

delgada (Figuras 1, 2 e 3). Observa-se nos diferentes sistemas de solventes e

reveladores que a frao 4 (BuOH) apresenta manchas roxas, quando reveladas

com NP-Peg sob luz UV, que se tornam amarelas quando reveladas com

anisaldeido/ H2SO4. Estas coloraes sugerem a presena de flavonides nesta

frao (WAGNER, 1994).

Figura 1:CCD: 1- E.B. hidroalcolico; 2-Fr hex; 3-Fr AcOEt; 4-Fr BuOH; 5-Fr aquosa. Fase mvel:

BAW (6:1:2). Revelado com NP-Peg.

Figura 2:CCD: 1- E.B. hidroalcolico; 2-Fr hex; 3-Fr AcOEt; 4-Fr BuOH; 5- Fr aquosa. Fase mvel:CHCl3: MeOH (7:3). Revelado com NP-Peg.


60/108

58

Figura 3: CCD: 1- E.B. hidroalcolico; 2-Fr hex; 3-Fr AcOEt; 4-Fr BuOH; 5-Fr aquosa. Fase mvel:CHCl3: MeOH ( 7:3). Revelado com anisaldeido/ H2SO4.

5.1.2. Anlise por CLAE analtico

Uma alquota (10 mg) do extrato MeOH 80% obtido por macerao foi

avaliada por HPLC-PAD. Foram observados, no cromatograma, dois

comportamentos distintos. Uma primeira parte com picos bem resolvidos (tr entre 0 e

45 min), seguida de uma regio com picos bastante alargados (tr entre 45 e 85 min),

quase que totalmente sobrepostos (Figura 4).

Figura 4: Cromatograma de separao por HPLC-PAD dos constituintes qumicos presentes no

extrato MeOH 80% das folhas de M. urundeuva. FM: ACN + TFA 0,1% e H2O + TFA 0,1%. Coluna

Phenomenex Synergi Hydro RP18 (250 x 4.6 mm i.d.; 4 m), HPLC (Jasco), fluxo 1,0 mL min -1,

= Figura 4: 280 nm, Sistema de eluio gradiente: 0-15% B (15 min), 15-20% B (30 min), 20-30% B(30 min), 30-100% B (5 min), 100% B (isocrtico, 5 min) perfazendo uma anlise com tempo total de

85 min.

Minutes

0 20 40 60 80

mv

0

200

400

mv

0

200

400

PDA-280 nm

Au_Alessandra


61/108

59

A evidncia da presena de derivados do cido glico foi comprovada pelas

bandas de absoro do sistema benzlico, com mximos na regio do UV em 210-

220 nm e entre 260-280 nm, conforme Figura 5(STICHER, 2008).

Figura 5: Espectro na regio do UV de padro de cido glico.

A m resoluo dos picos cromatogrficos somada s bandas de absoro

no UV sugerem que as substncias eluindo entre 45 e 85 min (Figura 5)

correspondem aos galotaninos.

Considerando que as anlises por CCD indicaram a presena de flavonides

na Fr4 da frao BuOH da partio, esta foi escolhida para anlises de CLAE-PAD e

FIA-ESI-IT-MS/MS.

5.1.3. Anlise por CLAE PAD da Fr 4 do BuOH

Por meio da separao por CLAE, com o auxlio do detector PAD (Figura 6)

foi possvel confirmar a presena dos compostos derivados de cido glico, eluindo

entre 0 e 10 min, alm de flavonides entre 16 e 31,7 min., com UV caracterstico

desta classe de substncias, que mostram bandas de absoro em 240-290 nm

(Banda II, anel A) e em 300-390 nm (Banda I, anel B) (Figura 7) (MERKEN &

BEECHER, 2000).

nm

200 250 300 350 400

mv

-200

0

200

400

mv

-200

0

200

400

216

272

354

11,23 Min

Au_Alessandra

Lambda Max


62/108

60

Figura 6: Cromatograma de separao por CLAE-PAD dos constituintes qumicos presentes na

frao 4 (BuOH) do extrato MeOH 80% das folhas de M. urundeuva. Coluna Phenomenex Luna C18

(250 x 4.6 mm d.i.; 5 m). FM: H2O + c. Frmico 0,1% (A) e MeOH + c. Frmico 0,1% (B).

Gradiente exploratrio de 0-60 minutos, de 5-100% de B em A. Fluxo 1,0 mL.min-1, volume injetado

20,0 L, forno de coluna 25C ; 280 nm.

Figura 7:Bandas de mximo de absoro na regio de UV tpico de flavonide, obtidas do pico em

16,6 min.

5.1.4. Anlise por FIA-ESI-IT-MSn

O espectro de primeira-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MS (Figura 8) indica a

presena de derivados de cido glico e galotaninos. Os sinais de m/z 1547, m/z

1091, m/z 939, m/z 787 indicam uma srie de galotaninos com at 9 unidades de

cido glico esterificando uma molcula de glicose (SOUZA, 2012). Experimentos de


63/108

61

MS2desses ons precursores mostraram perdas consecutivas de unidades de m/z

152 Da, caracterstico de grupos galoil (Figuras 9, 10e 11).

Figura 8: Espectro de massas em full-scan da Fr 4 (BuOH) obtido por FIA-ESI-IT-MS em modo

negativo.

Figura 9: Espectro de massas de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MS em modo negativo do on

precursor de m/z1091.

AlessandraAnne_AroeirameohFr4_esineg_2607201101_110726101451#1 RT:0,00 AV:1 NL:1,00E2T:ITMS - c ESI Full ms [200,00-2000,00]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

939,30

787,31

673,20

609,26477,38 708,98

1091,88336,41 567,37 1010,40

463,34 907,39 1150,68

1196,17 1309,05 1548,62

alessandra_anne_Aroeira_MeOHBuOH_filhos_esineg20V_1909201101_110919103330#249 RT:5,44 AV:1 NL:1,64T:ITMS - c ESI Full ms2 1091,00@cid20,00 [300,00-2000,00]

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

939,04

[M 152 - H]-


64/108

62

O pico intenso referente ao on de m/z 939 [M-H] sugere a presena do

composto 1,2,3,4,6-pental-O-galoil--D-glicose (Figura 9) (SOUZA, 2012),

substncia natural presente em diversas plantas medicinais (ZHANG et al., 2009).

Figura 10: Espectro de massas de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MS em modo negativo doon precursor de m/z939.

Figura 11: Espectro de massas de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MSem modo negativo do

on precursor de m/z787.

AlessandraAnne_AroeirameohFr4_esineg_2607201101_110726101451#21 RT:0,33 AV:1 NL:2,59E1T:ITMS - c ESI Full ms2 939,00@cid25,00 [255,00-1000,00]

300 400 500 600 700 800 900 1000

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

769,02

616,99

alessandra_anne_Aroeira_MeOHBuOH_filhos_esineg20V_1909201101_110919103330 #201 RT:4,49 AV: 1 NL:2,01E1T:ITMS - c ESI Full ms2 787,30@cid25,00 [215,00-2000,00]

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

635,20

617,08

465,26

[M 152H]-

152

18

152

[M152H]-


65/108

63

Figura 12: Estrutura qumica do 1,2,3,4,6-penta-O-galoil--D-glicose (PGG).

O sinal intenso de m/z 477 no espectro de primeira-ordem foi atribudo a

quercetina-3-O-glucurondeo (KAJDANOSKA et al., 2010). Fragmentao emsegunda-ordem deste on gerou o sinal de m/z 301 [M 176 H]-, sugerindo a

perda de uma unidade glucurondica no flavonide (Figura 13). Esse padro de

fragmentao confirma a presena deste composto.

Figura 13: Espectro de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MS em modo negativo do on de m/z

477.

O sinal de m/z 609 [M H]-, no espectro de primeira-ordem foi atribudo

rutina. Fragmentao em segunda-ordem deste on gerou o sinal de m/z 301 [M

308H]-, o que sugere a perda de uma unidade de hexose e uma deoxihexose (162

+ 146 = 308), confirmando a presena deste composto.

alessandra_anne_Aroeira_MeOHBuOH_filhos_esineg20V_1909201101_110919103330 #300 RT: 6,40 AV: 1 NL: 1,22E1T: ITMS - c ESI Full ms2 477,50@cid20,00 [130,00-600,00]

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

477,09

301,14


66/108

64

Figura 14:Espectro de massas de segunda-ordem obtido por FIA-ESI-IT-MSem modo negativo do

on precursor de m/z609.

5.2. Anlise de Viabilidade Celular

5.2.1. Anlise da reduo do MTT do extrato MeOH nos perodos de 24, 48, 72 e

96 horas

No primeiro perodo (24 horas), para a anlise da reduo do MTT, todos os

grupos apresentaram valores maiores que o grupo controle. Os grupos 1:100,

1:1000 e 1:10000 (absorbncias prximas 0,200) apresentaram valores

semelhantes em relao ao extrato bruto (0,180) e superiores ao grupo controle

(0,096), entretanto sem diferenas significantes (p>0,05). A nica exceo deste

perodo foi o grupo com diluio de 1:10 (0,374) que obteve maior viabilidade em

relao ao controle (p


67/108

65

(p>0,05). O grupo do extrato bruto (0,143) apresentou valor semelhante ao controle

(0,163). Na diluio de 1:10 do extrato o valor obtido foi 0 (zero) isso porque o

extrato matou todas as clulas, no apresentando viabilidade celular nesse grupo.

Nas diluies de 1:100, 1:1000 e 1:10000 os valores foram superiores ao do grupo

controle, com 0,747, 0,806 e 0,620 de absorbncia, respectivamente (Figura 17 e

Anexo 1).

No perodo de 96 horas os dois grupos com o extrato mais concentrado

(extrato bruto e 1:10) obtiveram valores inferiores ao do grupo controle (controle

1,002; extrato bruto 0,233; 1:10 0,748), entretanto apenas o extrato bruto

apresentou diferena significante do controle (p0,05). O grupo com o maior valor no perodo (1:10000 1,296) tambm

apresentou diferena do grupo controle (p


68/108

66

Figura 16:Anlise da reduo do MTT do extrato hidroalcolico de aroeira no perodo de 48 horas.* diferena significante em relao ao grupo controle (p0,05). O grupo 1:10 no apresentou leitura (0,0).

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

Controle EB MeOH 1:10 1:100 1:1000 1:10000

A570nm

Grupos

MTT

*

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

Controle EB MeOH 1:100 1:1000 1:10000

A570nm

Grupos

MTT


69/108

67

Figura 18:Anlise da reduo do MTT do extrato hidroalcolico de aroeira no perodo de 96 horas.

*diferena estatstica significante em relao ao grupo controle (p


70/108

68

maiores que o do grupo controle (controle - 0,109) e no apresentaram diferenas

significantes (p>0,05) (Figura 20 e Anexo 2). Apenas o grupo do extrato bruto

apresentou valor de absorbncia (0,016) inferior aos outros grupos (p0,05). O grupo

do extrato bruto (0,017) e o grupo da diluio de 1:10 (0,049) obtiveram valores de

absorbncia muito abaixo dos outros grupos (p0,05). Enquanto os grupos de extrato bruto

(0,054) e diluio 1:10 (0,131) apresentaram valores bem inferiores aos demais

grupos (p


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Figura 20:Anlise da captao do vermelho neutro do extrato hidroalcolico de aroeira no perodo de

48 horas. *diferena estatstica significante em relao ao grupo controle (p


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Figura 22:Anlise da captao do vermelho neutro do extrato hidroalcolico de aroeira no perodo de

96 horas. *diferena estatstica significante em relao ao grupo controle (p0,05) (Anexo 3).

No perodo de 48 horas todos os valores de absorbncia dos grupos

tratados foram inferiores ao grupo controle (0,429), no entanto no apresentaramdiferena significante (p>0,05) (Anexo 3). Os valores de absorbncia obtidos pelos

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

Controle EB MeOH 1:10 1:100 1:1000 1:10000

A540nm

Grupos

Vermelho Neutro

*

*


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grupos tratados foram crescentes de acordo com o aumento da diluio (extrato

bruto0,155 e 1:100000,326) (Figura 24).

No perodo de 72 horas, os grupos controle (1,012) e 1:10000 (0,983)

apresentaram valores semelhantes entre si, sem diferena significante

estatisticamente (p>0,05). Por outro lado, o extrato bruto (0,372) e o grupo de

diluio de 1:10 (0,550) apresentaram valores inferiores ao controle (1,012) (p0,05) (Anexo 3). A diluio 1:10 (0,364) apresentou valor

muito inferior aos outros grupos (p


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Figura 24:Anlise do cristal violeta do extrato hidroalcolico de aroeira no perodo de 48 horas. No

houve diferena significante entre os grupos (p>0,05).

Figura 25:Anlise do cristal violeta do extrato hidroalcolico de aroeira no perodo de 72 horas.

* diferena estatstica significante em relao ao grupo controle (p


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Figura 26:Anlise do cristal violeta do extrato hidroalcolico de aroeira no perodo de 96 horas.

* diferena estatstica significante em relao ao grupo controle (p


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6 Discusso


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6. Discusso

O uso de compostos de origem vegetal para o tratamento de doenas no

uma conduta nova, no entanto, nos ltimos anos vrios compostos e plantas tem

despertado o interesse de pesquisadores em todo o mundo, com potencial para a

industria farmacutica (RECIO, ANDJAR e ROS, 2012).

Alguns trabalhos tm caracterizado extratos de plantas e identificados

compostos que apresentam efeitos biolgicos de interesse para a rea da sade

(CRAGG et al., 1997). Essa identificao e padronizao do preparo de extrato de

plantas fundamental para a validao e uso desses fitoterpicos. O cuidado nesse

sentido se justifica, uma vez que, tambm so relatados na literatura efeitos

colaterais de alguns compostos e mesmo interao com outras drogas. Entre os

exemplos dessas possveis reaes adversas esto: 1) Cerca de 25% dos gneros

de Anacardiaceae so conhecidos pela sua toxicidade e por causarem dermatite de

contato, como por exemplo, Anacardium, Astronium, Blepharocarya, Cotinus,

Lithrea, Mangifera, Mauria, Myracrodruon, Schinopsis, Schinus, Semecarpus,

Spondias, Swintonia e Toxicodendron. A dermatite provocada por estas plantas

atribuda principalmente aos lipdios fenlicos (PELL, 2004); 2) Outras revises

sobre os flavonides (compostos encontrados em muitas plantas) tm demonstrado

alguns efeitos como toxicidade e hepatotoxicidade (GALATI e O'BRIEN, 2004) e 3)

Interaes adversas com drogas analgsicas (ABEBE, 2002).

Nesse sentido, os relatos da literatura demonstram efeitos biolgicos de

compostos que so encontrados na aroeira (foco do presente trabalho). Estudos

sobre a constituio qumica de Anacardiaceae relatam uma ocorrncia de

flavonides, inclundo biflavonides, terpenos, xantonas, chalconas, e

principalmente, lipdios totais e fenlicos e seus derivados (GEBARA et al., 2011

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