55

5 Resultados e Discussão

5.1. Biometria dos mexilhões Perna perna

A Tabela 3 apresenta os resultados biométricos (comprimento de concha,

largura e altura, como média ± desvio padrão) dos “pools” dos mexilhões por

estação (verão e inverno) e nas diferentes áreas de áreas: Ilha Grande (IG) e

baía de Guanabara (BG): praia do Diabo (PD), praia da Urca (PU) e praia

Vermelha (PV). Foram observadas diferenças estatisticamente significativas para

o comprimento entre as áreas, no qual os comprimentos dos mexilhões de IG

foram significativamente maiores que os comprimentos dos mexilhões das três

praias da BG. Assim, os valores foram normalizados para o comprimento médio

dos mexilhões de cada local, a fim de eliminar os efeitos secundários.

Tabela 3. Biometria dos mexilhões Perna perna (apresentados como média ± desvio padrão).

Verão Comprimento (mm) Largura (mm) Altura (mm)

IG 70,3±4,3 28,5±1,8 26,3±1,6

PD 49,3±8,9 21,9±2,9 18,3±2,1

PU 37,8±4,1 22,0±2,3 15,4±2,3

PV 49,9±6,7 24,3±2,2 17,4±2,0

Inverno Comprimento (mm) Largura (mm) Altura (mm)

IG 63,5±2,5 24,1±0,7 23,2±0,8

PD 49,9±3,0 23,3±0,8 19,3±1,4

PU 54,8±2,9 29,0±1,4 20,1±1,4

PV 35,6±1,8 16,4±0,3 13,8±0,7

56

5.2. Determinação de metais e metalóides

5.2.1. Procedimento analítico utilizado para a determinação de metais e metalóides em mexilhões

A exatidão dos procedimentos analíticos foi confirmada pela análise

paralela de material de referência certificado, DORM-4 (NRC, Canadá). O

material de referência foi analisado a cada leva de amostras e os valores obtidos

foram comparados com os valores certificados. Os resultados demonstraram

uma boa precisão e exatidão do método, pois não foram observadas diferenças

estatisticamente significativas entre os valores certificados e os valores obtidos

(Tabela 4). As recuperações variaram de 94 a 103% e foram consideradas

adequadas para o presente estudo.

Tabela 4. Concentração obtida dos elementos no DORM-4 (apresentados como média ± desvio padrão).

Elemento Valor certificado (µg g-1) Valor obtido (µg g-1)

Ni 1,36±0,22 1,28±0,15

Cu 15,9±0,9 15,6±0,5

Zn 52,2±3,2 51,5±1,7

As 6,80±0,64 7,03±0,20

Se 3,56±0,34 3,63±0,25

Cd 0,31±0,02 0,30±0,01

Hg 0,41±0,06 0,37±0,03

Pb 0,42±0,05 0,41±0,05

As concentrações de todos os elementos determinados em músculos e

glândulas dos mexilhões Perna perna, com exceção do Hg, apresentaram

valores superiores aos limites de detecção e quantificação. Sendo assim, o

método analítico utilizado, desde a digestão das amostras até a determinação

dos elementos Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd e Pb por ICP-MS, foi eficiente e

reprodutivo nas amostras de mexilhões Perna perna.

57

5.2.2. Concentração de metais e metalóides na fração total

A Baía de Ilha Grande é uma região considerada com um razoável grau

de preservação e, portanto, é uma área utilizada como referência para

comparação de contaminação ambiental por metais e metalóides com outras

áreas contaminadas (Cardoso et al., 2001; Junior et al., 2002; Lavradas et al.,

2014). Sendo assim, as concentrações de Se, As, Zn, Cu, Ni, Pb e Cd nas

amostras de músculos e glândulas dos mexilhões coletados na Baía de Ilha

Grande foram utilizadas para comparação com as concentrações dos mesmos

nas praias pertencentes à Baía de Guanabara (Praia do Diabo- PD, Praia

Vermelha- PV e Praia da Urca- PU).

As concentrações totais (verão e inverno) dos metais e metalóides totais

(expressas em peso seco, µg g-1) na fração total das amostras de músculos e

glândulas dos mexilhões Perna perna da Baía de Ilha Grande e de três praias da

Baía de Guanabara (praia do Diabo, praia da Urca e praia vermelha) estão

representadas na Figura 11, no qual o símbolo * e # mostram as diferenças

significativas nas concentrações encontradas nos músculos e glândulas,

respectivamente, dos mexilhões da BG comparadas com as encontradas em IG.

Nos músculos, as concentrações dos elementos que apresentaram

diferença significativa foram Cu, Zn, Pb, As e Cd, no qual as concentrações de

Cu foram maiores em PU e PV e as concentrações de Zn e Pb foram maiores

em PU, PV e PD quando comparados a IG. Já as concentrações de As foram

mais baixas em PU e as concentrações de Cd foram mais baixas em PD e PU

quando comparados a IG. Nas glândulas, todos os elementos determinados

apresentaram diferença significativa entre IG e as praias PD, PU e PV, no qual

as concentrações de Cu, Zn e Pb foram maiores em PD, PU e PV e as

concentrações de As foram maiores em PD quando comparados a IG. Por outro

lado, as concentrações de As, Ni e Se foram menores em PU e as

concentrações de Cd foram menores em PU e PV quando comparados a IG.

58

Figura 11. Concentrações totais dos metais e metalóides em músculos (M) e glândulas (G) dos mexilhões Perna perna de Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia

vermelha (PV).

59

É importante observar que as concentrações de Cd foram

significativamente maiores nos músculos e glândulas dos mexilhões de IG

quando comparado com as concentrações encontradas nos mexilhões da BG.

Este resultado pode ser explicado pelo fato de que sedimentos da baía da Ilha

Grande são conhecidos por conter altas concentrações deste elemento (Gomes,

F. C. et al., 2009; Gomes, F.C. et al., 2009), devido à influência de anomalias de

sulfeto provenientes da geologia da cadeia montanhosa da Serra do Mar

adjacente (Lacerda et al., 1989).

A Figura 10 também mostra que as concentrações da maioria dos

elementos determinados nos mexilhões Perna perna foram significativamente

(p< 0,05) mais elevadas nas glândulas, com a exceção de Ni e Zn, para os quais

as concentrações foram mais elevadas nos músculos. Isto está de acordo com

outros estudos realizados com diferentes bivalves, uma vez que a glândula

digestiva é conhecida como o principal órgão alvo de acumulação de metais e

metalóides devido às altas atividades metabólicas e por ter um papel central na

bioacumulação desses elementos. No entanto, existem diferentes mecanismos

de armazenamento e desintoxicação desses elementos nos diferentes

tecidos/órgãos, o que pode justificar as altas concentrações de Ni e Zn em

músculos (Jebali et al., 2014). Outra possibilidade é que a exposição crônica a

esses elementos tenha sido demais para as glândulas conseguirem lidar e

remover do corpo, resultando em acumulação nos músculos.

O cultivo de mexilhões é uma atividade econômica expressiva no Brasil,

e esses organismos são consumidos por uma grande parte da população em

praticamente todas as zonas costeiras do país. O mexilhão Perna perna é um

dos bivalves mais cultivados comercialmente no Brasil (Ibama, 2008), com uma

produção da ordem de 12.500 toneladas, nas últimas décadas, o que representa

19% do total produzido por toda a maricultura brasileira (Galvao et al., 2015).

Este organismo é considerado uma espécie sentinela, sendo adequado para o

biomonitoramento de contaminação ambiental, incluindo a exposição a metais,

uma vez que é séssil e filtrador (Gaitanaki et al., 2004; Burlando et al., 2006;

Cheung et al., 2006; Hamer et al., 2008).

Além dos efeitos sobre a saúde dos próprios mexilhões, os metais e

metalóides estudados mostram efeitos tóxicos em seres humanos quando

ingeridos acima de certos limites admissíveis. O Cd, por exemplo, pode induzir

disfunção renal e danos reprodutivos, enquanto o Pb danifica o sistema nervoso,

provoca distúrbios cerebrais, afeta o quociente de inteligência em crianças e

causa doenças cardiovasculares em adultos (Ikem e Egiebor, 2005). O Cu em

60

excesso pode causar alergias, irritações nos olhos, nariz e boca, além de

náuseas e diarréias e os sintomas podem piorar se a ingestão for via oral,

através da água e do alimento, podendo causar danos ao fígado e aos rins

(Atsdr, 2004). O Zn em excesso pode causar dores estomacais, náuseas,

vômitos, anemia, danos pancreáticos e diminuição de HDL no sangue (Oliveira,

2007). Já o Se em excesso pode causar tontura, fadiga e irritação das

membranas mucosas, edema pulmonar e bronquite (Atsdr, 2003). O As pode

causar dor de estômago, náuseas, vómitos, diarreia, diminuição da produção de

glóbulos vermelhos e brancos, que por sua vez podem causar causar fadiga,

ritmo cardíaco anormal, danos dos vasos sanguíneos, resultando em contusões,

e a função do nervo prejudicada (Atsdr, 2005). A reação mais comum de contato

com o Ni é uma erupção cutânea no local de contato, enquanto que os mais

graves efeitos nocivos à saúde da exposição ao níquel são a bronquite crônica,

redução da função pulmonar e câncer do pulmão e seio nasal (Atsdr, 2005).

Os mexilhões são geralmente ingeridos como um todo, sem separação

prévia dos tecidos. Como o presente estudo analisou tanto o tecido do músculo e

glândulas digestivas, ambas as matrizes foram comparadas com a legislação

brasileira e internacional, a fim de observar os potenciais riscos para a saúde

dos consumidores humanos, pois os mexilhões coletados das diferentes áreas

são consumidos pela população local, embora não se saiba com que

frequência..

Se as concentrações de metais e metalóides em um dos órgãos se

encontraram acima da concentração máxima admissível, foram consideradas

motivo de preocupação, uma vez que o animal é ingerido como um todo e, se a

concentração de algum elemento em um tecido ou órgão estiver acima do

permitido, significa que possivelmente a concentração do mesmo estará acima

do limite para o tecido mole, oferecendo riscos para a saúde da população

humana.

A Tabela 5 compara as concentrações totais dos metais e metalóides nos

mexilhões investigados no presente estudo, e os limites máximos recomendados

pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Agência de Proteção

Ambiental (EPA- do inglês, Environmental Protection Agency) e Organização

para a Alimentação e Agricultura das Nações Unidas (FAO – do inglês, Food and

Agriculture Organization of the United Nations) (Epa, 1996; Fao/Who, 1997;

Brasil, 1998; Fao/Who, 1999; 2000), expressos em peso úmido (µg g-1). Assim, a

fim de comparar os dados deste estudo com estes limites admissíveis,

considerou-se a massa corpórea desses organismos, que é em cerca de 70%

61

composta de água, e multiplicaram-se os valores das concentrações de metais e

metalóides obtidos para peso seco por 0,3 para obter os valores de

concentração de metais em peso úmido (Carvalho et al., 2001).

62

Tabela 5. Concentrações totais de metais e metalóides em músculos e glândulas de mexilhões comparado com as legislações brasileira e internacional (expressas como média ± média de incerteza expandida (95%) em peso úmido, µg g

-1).

Area Tecido/ógão Ni Cu Zn As Se Cd Pb

IG M 2,35±0,43 0,78±0,09 32,17±5,12* 3,90±0,19* 1,02±0,12* 0,167±0,022 0,03±0,01

G 1,43±0,09 2,63± 0,12 15,47±0,68 8,78±0,25* 1,86±0,06* 1,072±0,267* 0,08±0,01

PD M 2,57±0,34 1,04±0,09 48,21±2,17* 4,24±0,22* 0,86±0,06* 0,090±0,006 0,10±0,02

G 1,34±0,12 3,69± 0,28 21,39±0,84 11,98±0,62* 1,68±0,16* 0,428±0,084 0,29±0,04

PU M 2,30±0,19 1,98± 0,19 68,42±5,09* 2,75±0,16* 0,79±0,03* 0,036±0,003 0,28±0,06

G 0,95±0,06 5,33± 0,50 22,87±0,90 4,81±0,19* 1,40±0,06* 0,087±0,009 0,60±0,10

PV M 3,94±0,81* 1,58± 0,19 70,64±10,51* 4,50±0,31* 1,15±0,12* 0,115±0,006 1,19±0,24*

G 1,61±0,19 6,34± 0,71 30,27±3,63* 10,01±0,43* 1,88±0,16* 0,299±0,034 1,71±0,32*

ANVISA - 5,0 30,0 50,0 1,0 0,3 1,0 2,0

FAO/WHO - - 30,0 50,0 - - 1,0 2,0

EPA - - 20,0 30,0 - - 2,0 0,8

*indica diferenças estatisticamente diferentes (p< 0,05).

63

As concentrações de As e Se em músculos e glândulas dos mexilhões

Perna perna de todos os locais analisados estão acima do máximo permitido

pela ANVISA. As concentrações de Zn em músculos de PU e PV encontraram-

se acima do máximo permitido por todas as organizações de saúde citadas

(ANVISA, FAO/WHO e EPA) enquanto que as concentrações deste metal em

músculos dos mexilhões de IG e PD e nas glândulas de PV encontraram-se

acima do permitido pela EPA. As concentrações de Cd em glândulas dos

mexilhões de IG encontraram-se acima do máximo permitido pela ANVISA e

pela FAO e as concentrações de Pb em PV estão acima do máximo

recomendado pela EPA.

O Brasil tem um consumo médio diário de 25 g de peixes e frutos do mar

per capita, correspondendo a 175 g por semana. No entanto, na região

metropolitana do Rio de Janeiro, este consumo é duplicado para 355 g por

semana (Brasil, 2009). Levando isso em consideração e utilizando o peso

corporal médio de 70 kg, a ingestão dos metais e metalóides foram calculados

para um consumo semanal de mexilhões por peso corporal e comparados com o

máximo permitido pela WHO (2011) para Cu, Zn, As e Cd (3,5; 7,0; 0,05 e

0,0005 µg g-1 Kg-1, respectivamente). As concentrações destes elementos em

músculos e glândulas dos mexilhões do presente estudo foram mais elevadas

que as concentrações permitidas pela legislação internacional, indicando que os

mexilhões de ambos IG e BG não estão adequados para consumo humano. É

importante notar que a legislação não costuma levar em consideração a

especiação do elemento, o que pode levar a conclusões errôneas, pois a

toxicidade dos metais, muitas vezes, depende também da espécie encontrada

(Hung et al., 2004)

A Tabela 6 compara as concentrações totais dos metais e metalóides nos

mexilhões Perna perna do presente estudo com concentrações encontradas em

outros estudos realizados no Brasil. A tabela também mostra a classificação de

cada área a respeito de níveis de metais ambientais.

64

Tabela 6. Concentrações totais de metais e metalóides (expressas em peso seco, µg g-1

) em mexilhões de outros lugares do Brasil e em outros países.

Local Nível de

contaminação ambiental

Tecido/ Órgão

Ni Cu Zn As Se Cd Pb Referência

Baía da Ilha Grande,RJ,

Brasil

Considerada área de

referência

Músculo 2,0 - 14 1,4 - 4,3 45 - 189 10 - 16 2,0 - 4,9 0,3 - 0,8 0,03 - 0,17 Presente estudo

Glândulas 3,5 - 6,2 6,5 - 10 42 - 63 26 - 35 5,3 - 7,0 0,8 - 6,9 0,18 - 0,39

Baía de Guanabara, RJ, Brasil

Altamente contaminada

Músculo 2,8 - 25 1,6 - 9,6 105 - 364 7,5 - 20 1,6 - 5,5 0,07 - 0,5 0,12 - 7,0 Presente estudo

Glândulas 2,1 - 8,8 8,8 - 32 62 - 173 12 - 48 3,5 - 8,4 0,15 - 2,7 0,41 - 10

Baía de Ubatuba, SP,

Brasil Contaminada

Tecido mole

- 1,6 - 8,9 43 - 133 - - 1,0 - 4,6 3,9 - 60 Avelar et al.

(2000)

Ilha de Santana,

Macaé, SE, Brasil

Considerada área de

referência

Tecido mole

8,0 - 11 4,4 - 6,2 68 - 114 - - 0,3 - 0,5 1,5 - 2,2 Carvalho et al.

(2001)

Costa atlântica do sul do Brasil

Considerada área de

referência

Tecido mole

- 3,8 - 21 41 - 109 - - 0,09 - 1,0 0,35 - 1,23 Baraj et al. (2003)

Regiões costeiras, SP,

Brasil

Moderadamente contaminada

Tecido mole

- - 11 - 22 1,2 - 4,6 0,4-0,9 0,05 - 0,15 0,02 - 0,07 Catharino et al.

(2008)

65

A maioria dos elementos determinados em músculos e/ou glândulas dos

mexilhões de IG e BG foram maiores do que os elementos determinados nos

tecidos moles dos mexilhões de outras áreas no Brasil, indicando que, de fato a

BG é uma área contaminada por esses poluentes, e que IG não pode mais ser

considerado um local de referência, devido à concentração de metais tóxicos

encontrados.

A BG tem sido considerada um dos ambientes costeiros mais poluídos da

costa brasileira (Linoa et al., 2016). Estudos anteriores indicam que as

concentrações de diversos metais em sedimentos, em ruas urbanas e em

estradas em torno da Baía de Guanabara são muito elevadas e são, portanto,

uma importante fonte de poluição aos rios que desembocam na baía, com os

locais mais poluídos localizado no centro do Rio de Janeiro (onde as amostras

da BG do presente estudo foram coletadas (Pereira et al., 2007). Tintas

anticorrosivas e “primers” para navios são também uma importante fonte de Zn a

este ambiente (Baptista-Neto et al., 2005). Além disso, fontes de contaminação

de todos os metais determinados na baía incluem a Refinaria Duque de Caxias e

resíduos descartados, que depois se transformam em chorume e acabam por

lixiviar para dentro da baía, em quantidades desconhecidas, assim como

aproximadamente 813 t dia-1 de resíduos sólidos que chegam à baía, também

resultando em maior produção de chorume contaminado e os terminais de

petróleo, portos comerciais e postos de combustível em torno da baía. Embora

IG tenha sido considerada um local de referência, com diversas áreas

protegidas, dois terminais de petróleo e uma central nuclear estão localizados na

área, além de um grande número de marinas e estaleiros e o porto de Angra dos

Reis, que promovem impactos antrópicos consideráveis sobre a região e podem

ser potenciais fontes de vários metais para a área (Pinheiro et al., 2004).

66

5.3. Determinação de proteínas (MT e GSH)

5.3.1. Procedimento analítico utilizado para a determinação das concentrações de MT e GSH em mexilhões

As curvas analíticas para a determinação de MT e GSH apresentaram R2

na ordem de 0,990 a 0,999, consideradas adequados para este tipo de

quantificação. As concentrações de MT e GSH em todas as amostras analisadas

apresentaram valores superiores aos limites de detecção e quantificação. Sendo

assim, este método possui uma margem confiável para determinar MT e GSH

nas matrizes biológicas como as utilizadas neste trabalho.

5.3.2. Otimização do método de extração de MT

Foi realizada a quantificação de proteínas totais, a quantificação de MT e

a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) em amostras de músculos e

glândulas de mexilhões Perna perna homogeneizadas com dois agentes

redutores diferentes (TCEP e β-mercaptoetanol) para comparar a eficiência

destes reagentes. Estudos recentes, indicam que TCEP é mais eficiente, embora

para tecidos de peixe e não mexilhões (Tenório-Daussat et al., 2014).

As concentrações de MT (Figura 12) nas amostras de músculos e

glândulas de mexilhões Perna perna homogeneizados com os dois agentes

redutores apresentaram diferenças significativas, no qual as concentrações de

MT nas amostras homogeneizadas com TCEP foram significativamente (p<0,05)

mais elevadas que as concentrações obtidas com as amostras homogeneizadas

com β-mercaptoetanol. Sendo assim, esses resultados indicam que a extração

de MT com o reagente TCEP em amostras de mexilhões é mais eficiente.

67

Figura 12. Concentrações de MT em amostras de músculos (M) e glândulas (G) extraídas com TCEP e β-mercaptoetanol.

Cabe ressaltar que o TCEP é um potente agente redutor, versátil e

praticamente livre de odores, que tem sido amplamente utilizado no estudo de

proteínas (Ruegg et al., 1975). Um aspecto importante que merece ser

destacado é o fato de que o estado de oxidação das funções tiol das MT também

influi em sua quantificação. Outros agentes redutores, como 7-fluorobenzil-2-

oxa-1,3-diazol-4-sulfonato de amônio, por exemplo, reagem apenas com a

função tiol reduzida, e os agentes redutores mais frequentemente utilizados, DTT

e β-mercaptoetanol, possuem funções tiol e, por conseguinte, não são

adequados devido à possibilidade de competição com as proteínas do meio. Já

compostos trialquilfosfinados como o TCEP não possuem nenhuma função tiol e,

além disso, são mais estáveis em valores de pH acima de 7,5, comum em

experimentos com proteínas, são solúveis em água e são capazes de reduzir as

funções dissulfeto de acordo com a seguinte reação disposta na Figura 13 (El

Ghazi et al., 2003).

Figura 13. Reação de redução da função dissulfeto por TCEP.

68

As análises qualitativas por SDS-PAGE (Figuras 14) também

demonstraram melhores resultados nas amostras que foram purificadas com o

TCEP, visto que o eletroferograma de músculos homoneizados com este

reagente apresentou bandas mais fracas em aproximadamente 75 e 150 kDa e

bandas mais fortes em aproximadamente 15 kDa (possivelmente um dímero de

MT) e no eletroferograma de glândulas as amostras apresentaram menos

arrastes. Sendo assim, utilizou-se o reagente TCEP para extrair MT das

amostras de músculos e glândulas dos mexilhões Perna perna.

69

Figura 14. Eletroferograma da fração purificada para proteínas termoestáveis em músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões.

70

5.3.3. Concentrações de MT

As concentrações totais (verão e inverno) de MT (expressas em peso

seco, µg g-1) nas amostras de músculos e glândulas de mexilhões Perna perna

da Baía de Ilha Grande (IG) e de três praias da Baía de Guanabara (BG): praia

do Diabo (PD), praia da Urca (PU) e praia vermelha (PV) estão representados

pela Figura 15, no qual o símbolo * e # mostram as diferenças significativas nas

concentrações encontradas nos músculos e glândulas, respectivamente, dos

mexilhões da BG comparadas com as encontradas em IG.

Figura 15. Concentrações totais de MT em músculos e glândulas dos mexilhões Perna perna coletados em Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia vermelha

(PV).

As concentrações de MT em músculos dos mexilhões de IG foram

significativamente (p<0,05) maiores que as concentrações da BG neste mesmo

tecido. Não foram observadas diferenças significativas da concentração desta

metaloproteína em glândulas digestivas de todos os locais de amostragem. A

síntese de MT em mexilhões podem variar consideravelmente entre os tecidos, e

a indução mais significativa desta metaloproteína por metais foi observada por

exposição ao Cd tanto em campo quanto em experimentos laboratoriais (Raspor

et al., 1989; Raspor et al., 2015). No entanto, não existem registros em relação a

síntese de MT no tecido muscular de mexilhão, apenas em brânquias, manto,

glândulas digestivas e tecido mole (Viarengo et al., 1999; Geret e Cosson, 2002;

Mourgaud et al., 2002; Hardivillier et al., 2006; Ramsak et al., 2012). Como

discutido no tópico sobre metais nos mexilhões, as concentrações de Cd nos

músculos dos mexilhões de IG foram significativamente mais elevadas que as

71

concentrações obtidas nos músculos dos mexilhões da BG, podendo ser a causa

das concentrações de MT mais elevadas nos mexilhões deste local.

A Figura 15 também mostra que as concentrações em músculos e

glândulas não apresentaram diferença significativa (p<0,05), exceto em IG, no

qual as concentrações de MT foram maiores nos músculos. Geralmente, esta

metaloproteína está presente em quantidades mais elevadas na glândula

digestiva, quando comparado com outros tecidos e / ou órgãos, como as

brânquias, uma vez que a glândula digestiva é o equivalente do fígado e é o

principal órgão de desintoxicação do corpo (Bebianno et al., 1993; Geret et al.,

1998; Raspor et al., 1999). Interessantemente, com o melhor de nosso

conhecimento, não há relatos na literatura sobre a síntese de MT em músculos

de mexilhões. Os estudos foram conduzidos em brânquias, manto e tecidos

moles, mas não no tecido muscular (Amiard et al., 2006).

As correlações estatísticas entre as concentrações de MT e os metais e

metalóides analisados em músculos e glândulas dos mexilhões de cada local de

amostragem encontram-se na Tabela 7.

Tabela 7. Correlações estatísticas entre MT e os metais e metalóides analisados (Correlação de Pearson) no presente estudo.

Correlações IG M PD M PU M PV M IG G PD G PU G PV G

MT x Ni -0,86 -0,94 - - 0,85 -0,89 - -

MT x Cu -0,89 -0,96 - - -0,89 -0,92 - -

MT x Zn -0,87 -0,89 - - -0,83 - - -

MT x As -0,96 - - - 0,71 - - -

MT x Se -0,94 - - -0,97 -0,91 -0,92 - -0,92

MT x Cd -0,97 - - -0,98 0,95 0,96 0,98 0,99

MT x Pb -0,89 -0,99 - - -0,88 -0,96 - -0,90

As concentrações de MT em músculos foram significantemente e

negativamente correlacionados com os seguintes metais e metalóides: Ni, Cu,

Zn, As, Se, Cd e Pb (IG); Ni, Cu, Zn e Pb (PD) e Se e Cd (PV). Já nas glândulas

as concentrações de MT apresentaram as seguintes correlações: Cu, Zn, Se e

Pb (IG); Ni, Cu, Se e Pb (PD); Se e Pb (PV) (correlações negativas) e Cd (IG,

PD, PU e PV); Ni and As (IG) (correlações positivas). De acordo com Bryman e

Cramer (2011), as correlações são muito fracas quando 0,00 < r < 0,19; fracas

quando 0,20 < r < 0,39; moderadas quando 0,40 < r < 0,69; fortes quando 0,70 <

r < 0,89; e muito fortes quando 0,90 < r < 1,00.

72

No presente estudo, todas as correlações observadas entre os

parâmetros analisados foram fortes ou muito fortes, sendo a maioria das

correlações negativas, levando a crer que quanto maior for a indução de MT

menor será a concentração dos metais e metalóides no organismo. Estes dados

indicam que a MT nesta espécie pode, efetivamente, ser considerada como um

biomarcador adequado para a exposição de metais e metalóides, já

demonstrado em estudos anteriores com outras espécies, como por exemplo, o

estudo realizado por Mourgaud et al. (2002), que verificaram que as

concentrações de As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb e Zn se mostraram correlacionadas

com as de MT em mexilhões Mytilus galloprovincialis e o estudo realizado por

Purina et al. (2013), no qual verificaram que as concentrações de Cd, Pb, Hg, Cu

e Zn se mostraram correlacionadas com as de MT em mexilhões Anodonta spp.

5.3.4. Concentrações de GSH

As concentrações totais (verão e inverno) de GSH (expressas em peso

seco, µg g-1) nas amostras de músculos e glândulas de mexilhões Perna perna

da Baía de Ilha Grande (IG) e de três praias da Baía de Guanabara (BG): praia

do Diabo (PD), praia da Urca (PU) e praia vermelha (PV) estão representados

pela Figura 16, no qual o símbolo * e # mostram as diferenças significativas nas

concentrações encontradas nos músculos e glândulas, respectivamente, dos

mexilhões da BG comparadas com as encontradas em IG.

Figura 16. Concentrações totais de GSH em músculos e glândulas dos mexilhões Perna perna coletados em Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia vermelha

(PV).

73

As concentrações de GSH nos músculos dos mexilhões de IG foram

significativamente mais elevadas que em PD. Já as concentrações desta

proteína nas glândulas dos mexilhões da PU e PV foram significativamente mais

elevadas quando comparados com as concentrações encontradas nas glândulas

dos mexilhões de IG.

A Figura 16 também mostra que não foram observadas diferenças

significativas (p< 0,05) nas concentrações de GSH nos músculos e glândulas

dos mexilhões de IG, enquanto que em PD, PU e PV, as concentrações deste

biomarcador foram significativamente mais elevadas nas glândulas quando

comparado aos músculos. Não foram encontrados estudos comparando a

concentração de GSH em músculos com as concentrações em glândulas de

mexilhões, portanto não foi possível comparar estes resultados com a literatura.

As correlações estatísticas obtidas entre as concentrações de GSH e as

concentrações de MT e os metais e metalóides analisados em músculos e

glândulas dos mexilhões de cada local de amostragem encontram-se na Tabela

8.

Tabela 8. Correlações estatísticas entre GSH, MT e os metais e metalóides estudados (Correlação de Pearson).

Correlações IG M PD M PU M PV M IG G PD G PU G PV G

GSH x Ni 1,00 - - - - -0,90 - -

GSH x Cu 0,80 - - 0,98 -0,90 -0,90 - -

GSH x Zn 1,00 - - - -0,80 - - -

GSH x As - - -0,90 - - 0,82 - 0,90

GSH x Se 0,90 - -0,90 - -0,80 -0,90 - -

GSH x Cd 0,80 - -0,90 - 0,80 0,99 0,99 0,94

GSH x Pb 1,00 - -1,00 - -0,90 -0,90 - -

GSH x MT -0,80 - - 0,90 0,93 0,99 0,95

As concentrações de GSH nos músculos foram significativamente e

positivamente correlacionadas com os seguintes metais e metalóides: Ni, Cu, Zn,

Se, Cd e Pb (IG); Cu (PV), e negativamente correlacionados com As, Se, Cd e

Pb (PU), enquanto que as seguintes correlações foram observadas para as

glândulas: Cu, Zn, Se e Pb (IG); Ni, Cu, Se e Pb (PD) (correlações negativas), e

Cd (IG, PD, PU e PV); As (PD e PV) (correlações positivas). As concentrações

de GSH foram também correlacionadas positivamente com as concentrações de

MT nas glândulas e, assim como ocorreu com relação as correlações entre MT e

74

os metais no presente estudo, todas as correlações observadas foram fortes ou

muito fortes (Bryman e Cramer, 2011). As correlações negativas levam a crer

que quanto maior for a indução de GSH, menor será a concentração de metais e

metalóides no organismo, indicando que a GSH nesta espécie, além de

desempenhar um papel fundamental na defesa antioxidante não-enzimática, é

também fundamental para a eliminação de metais e metalóides do organismo

devido a sua alta afinidade com estes elementos através do grupo tiol (-SH)

(Jozefczak et al., 2012). As correlações positivas encontradas levam a crer que

quanto menor for a indução de GSH, menor será a concentração de metais e

metalóides no organismo. Cabe ressaltar que a enzima GST catalisa a

conjugação da GSH com compostos endógenos ou exógenos de poluentes, a

fim de torná-los menos tóxicos (Cogo et al., 2009). Sendo assim, a indução de

GSH por determinados elementos pode ser reduzida devido ao fato de que ela

pode estar sendo utilizada pela enzima GST no processo de detoxificação

celular e correção dos efeitos deletérios de compostos xenobióticos.

Tem sido proposto que a GSH complexa e destoxifica metais assim que

entram nas células, representando uma primeira linha de defesa contra a

citoxicidade do metal. De acordo com a literatura, a acumulação de metais nos

tecidos biológicos pode resultar na redução da disponibilidade de GSH, porém

resultados contraditórios têm sido reportados, como, por exemplo, em estudos

realizados com mamíferos e peixes, que mostraram que a acumulação de certos

metais como Cd, Pb e Hg resultaram no aumento da disponibilidade de GSH

(Canesi et al., 1999). Isto indica que os metais podem, de fato, interferir no

metabolismo de GSH, porém mais estudos para entender os mecanismos de

ação são necessários

75

5.4. Determinação das atividades de enzimas (GST e carbE)

5.4.1. Procedimento analítico utilizado para a determinação das atividades de GST e CarbE em mexilhões

As curvas analíticas para a determinação de GST e CarbE apresentaram

R2 na ordem de 0,994 a 0,999, consideradas adequadas para este tipo de

quantificação.

As atividades de CarbE em todas as amostras analisadas apresentaram

valores superiores aos limites de detecção e quantificação. Já as atividades de

GST em músculos dos mexilhões de todos os lugares de coleta (verão) e nas

glândulas dos mexilhões de IG (verão e inverno) e PV (inverno) apresentaram

valores inferiores ao limite de detecção do método. Portanto, os resultados

demonstraram que este método possui uma margem confiável para determinar

CarbE nas matrizes biológicas como as utilizadas neste trabalho, e que o mesmo

não ocorreu com GST para diversas amostras.

5.4.2. Atividades de GST

As atividades de GST para a maioria das amostras dos mexilhões

analisados apresentaram valores abaixo do limite de detecção do método, sendo

assim foi possível apenas comparar as diferentes atividades desta enzima nos

diferentes tecidos (músculos e glândulas) dos mexilhões da PD e PU (inverno).

As atividades de GST (expressas em peso úmido, U mg-1 de ptn) nas

amostras de mexilhões Perna perna da PD e PU estão representados pela

Figura 17, no qual o símbolo * e # mostram as diferenças significativas nas

concentrações encontradas nos músculos e glândulas, respectivamente, dos

mexilhões da PD comparadas com as encontradas em PU.

76

Figura 17. Atividades de GST em músculos e glândulas dos mexilhões Perna perna

coletados na Praia do Diabo (PD) e na Praia da Urca (PU).

As atividades de GST nos músculos e nas glândulas dos mexilhões

coletados na PD foram significativamente mais elevadas que as atividades

obtidas nos mexilhões da PU. O estudo realizado por Sáenz et al. (2010) avaliou

as atividades da enzima GST em glândulas de mexilhões Perna perna de

diferentes áreas e encontrou diferenças significativas entre os locais, no qual as

atividades desta enzima foram mais elevadas nos locais contaminados.

A Figura 17 também mostra que os mexilhões coletados na PU não

apresentaram diferenças significativas (p < 0,05) nas atividades de GST nos

músculos comparadas com as atividades desta enzima nas glândulas, enquanto

na PD as atividades obtidas nos músculos foram significativamente mais

elevadas que as atividades obtidas nas glândulas dos mexilhões, assim como no

estudo realizado por Nilin (2012), que encontrou maior atividade de GST nos

músculos quando comparado com as atividades nas glândulas dos mexilhões.

De acordo com Regoli et al. (1998) a exposição aos metais e ao estresse

de radicais livres inibem a atividade de GST porque provocam a desestabilização

da membrana lisossômica, podendo causar a ruptura da membrana e liberar

diversos radicais e íons ácidos, que prejudicam o funcionamento normal da

enzima. É importante ressaltar que estudos a respeito da indução de GST são

contraditórios, pois em um estudo realizado por Fitzpatrick et al. (1997) com

mexilhões coletados em áreas industriais apresentaram altas atividades desta

enzima, porém em um estudo realizado por Regoli et al. (1998) com caramujo

em um local contaminado com Cu e Hg apresentaram inibição da enzima GST.

No presente estudo, não foram encontradas correlações entre as

atividades da enzima GST com as concentrações dos metais e metalóides

77

determinados em músculos e glândulas dos mexilhões da PD e PU, indicando

que a GST em mexilhões desta espécie não aparenta ser um bom biomarcador

de contaminação ambiental por metais e metalóides. Porém, cabe ressaltar que,

neste estudo foi avaliado apenas a atividade geral usando o CDNB como

substrato, porém algumas izoenzimas podem ser inibidas e outras induzidas com

determinados substratos (Balogh e Atkins, 2011).

5.4.3. Atividades de CarbE

As atividades totais (verão e inverno) de CarbE (expressas em peso

úmido, U mg-1 de ptn) nas amostras de músculos e glândulas de mexilhões

Perna perna da Baía de Ilha Grande (IG) e de três praias da Baía de Guanabara

(BG): praia do Diabo (PD), praia da Urca (PU) e praia vermelha (PV) estão

representados pela Figura 18, no qual o símbolo * e # mostram as diferenças

significativas nas concentrações encontradas nos músculos e glândulas,

respectivamente, dos mexilhões da BG comparadas com as encontradas em IG.

Figura 18. Atividades totais de CarbE em músculos e glândulas dos mexilhões Perna perna

coletados em Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia vermelha (PV).

As atividades totais de CarbE nos mexilhões apresentaram diferenças

significativas de acordo com área de estudo. Nos músculos, as atividades desta

enzima foram significativamente mais elevadas nos mexilhões das praias da BG

(PD, PU e PV) quando comparado com as atividades nos mexilhões de IG. Nas

glândulas, as atividades de CarbE nos mexilhões das diferentes áreas de estudo

não apresentaram diferença significativa.

IG M

PD M

PU M

PV M

IG G

PD G

PU G

PV G

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

* * *

Carb

E (

U m

g-1

de p

tn)

78

A Figura 18 também mostra que as atividades de CarbE foram

significativamente (p < 0,05) mais elevadas nas glândulas que nos músculos dos

mexilhões. As CarbE são enzimas amplamente distribuídas na natureza, e são

comuns em muitas espécies. Muitas participam no metabolismo de fase I de

xenobióticos e, como a glândula é o órgão de detoxificação, é esperado

encontrar maiores atividades desta enzima nas glândulas. Os resultados do

presente estudo corroboram com relatos na literatura, que observam maior

atividade de CarbE nas glândulas de bivalves quando comparado com outros

tecidos como brânquias, manto e músculo (Escartín e Porte, 1997; Wheelock, C.

E. et al., 2008; Nilin, 2012).

Existem poucos estudos na literatura a respeito dos efeitos e

mecanismos de ação de metais e metalóides sobre esta enzima. Dentre estes,

um estudo realizado com peixes-zebra que verificou a interferência de cobre,

chumbo, ferro e cádmio nas atividades de CarbE, onde esta enzima foi inibida in

vitro apenas com uma concentração de 20 mmol L-1. In vivo, a atividade da

CarbE não se alterou em qualquer dos tempos (dois e sete dias) e as

concentrações testadas, exceto no caso de exposição ao cobre, que resultou

numa diminuição da atividade desta enzima indicando que os metais são

importantes inibidores de esterase em peixe, e devem ser considerados em

estudos de monitoramento ambiental (De Lima et al., 2013). De acordo com um

outro estudo realizado com compostos organoestânicos (tributilestanho, trifenil

estanho e dibutilestanho, um metabólito persistente), observou-se também, em

uma espécie de peixe marinho tropical, Siganus canaliculatus, inibição desta

classe de enzimas. As CarbE do fígado desta espécie se mostraram altamente

sensíveis a estes compostos, sendo significativamente inibidas após exposição a

estes poluentes, indicando que esta classe enzimática é efetivamente um bom

biomarcador molecular de contaminação por compostos organoestânicos (Al-

Ghais et al., 2000). Estes estudos citados foram realizados com peixes, pois não

foram encontrados estudos relacionando a atividade de CarbE com metais e

metaloides em mexilhões.

As correlações em ambos os tecidos analisados de cada local de

amostragem do presente estudo encontram-se na Tabela 9.

79

Tabela 9. Correlações estatísticas entre CarbE e os metais e metalóides analisados (Correlação de Pearson).

Correlações IG M PU M IG G PU G

CarbE x Ni -0,83 - - 0,96

CarbE x Cu -0,95 -1,00 - -

CarbE x Zn - - -0,97 -

CarbE x Se -0,82 - -0,97 -

CarbE x Cd -0,76 - - -

CarbE x Pb -0,84 - - -

As atividades de CarbE nos músculos dos mexilhões foram

significativamente e negativamente correlacionados com as concentrações de

Ni, Cu, Se, Cd e Pb (IG) e Cu (PU). Nas glândulas, as atividades desta enzima

foram correlacionadas positivamente com as concentrações de Ni (PU) e

negativamente correlacionado com as concentrações de Se e Zn (IG), sendo

todas as correlações observadas fortes ou muito fortes (Bryman e Cramer,

2011). Sendo assim, estes dados sugerem que a CarbE em mexilhões pode ser

considerada como um biomarcador adequado na exposição a metais e

metalóides.

5.5. Sazonalidade

5.5.1. Metais e metalóides

As concentrações (expressas em peso seco, µg g-1) de metais e

metalóides presentes em mexilhões de IG e BG coletados no verão e no inverno

encontram-se nas Figuras 19 e 20, no qual o símbolo * e # mostram as

diferenças significativas nas concentrações destes elementos em músculos e

glândulas, respectivamente, dos mexilhões coletados nas duas diferentes

estações.

80

Figura 19. Concentrações de elementos essenciais no tecido muscular (M) e glândulas digestivas (G) no mexilhão Perna perna de Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca

(PU) e Praia Vermelha (PV) no verão (ver) e no inverno (inv).

81

Figura 20. Concentrações de elementos não-essenciais no tecido muscular (M) e glândulas digestivas (G) no mexilhão Perna perna de Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca

(PU) e Praia Vermelha (PV) no verão (ver) e no inverno (inv).

82

Os resultados mostram que as concentrações dos elementos foram

significativamente mais elevadas no inverno, com a exceção de Ni nas glândulas

dos mexilhões de IG, PD e PV e de Cd nas glândulas dos mexilhões de todos

os pontos de amostragem. Isto está de acordo com estudos realizados por

diversos autores (Bat et al., 1999; Szefer et al., 2004; Hamed e Emara, 2006;

Giarratano e Amin, 2010), que também relataram maiores concentrações de

metais em mexilhões durante o inverno. De acordo com um estudo recente

(Szefer et al., 2004), o aumento da precipitação que ocorre no verão pode ser

responsável pela diluição de poluentes e redução da concentração de metais na

água e, consequentemente, em mexilhões. Este autor também relata grandes

diferenças na temperatura da água entre o verão e o inverno, o que pode afetar

a fisiologia dos mexilhões e causar alterações nas concentrações de metais

presentes nesses organismos.

Comparações também foram realizadas com as diretrizes nacionais e

internacionais, separando os dados por estação, conforme demonstrado na

Tabela 10.

83

Tabela 10. Concentrações de metais e metalóides em músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna coletados no verão e no inverno

comparado com as legislações brasileira e internacional (expressas como média ± média de incerteza expandida (95%) em peso úmido, µg.g-1

).

Area Tecido Ni Cu Zn As Se Cd Pb

IG ver M 1,1±0,2 0,54±0,04 15,8±1,1 3,4±0,1* 0,64±0,01* 0,10±0,01 0,012±0,001

G 1,68±0,04 2,3±0,1 13,6±0,3 9,2±0,3* 1,70±0,03* 1,9±0,1* 0,065±0,003

IG inv M 3,6±0,2 1,0±0,1 44,4±2,5* 4,4±0,1* 1,39±0,02* 0,22±0,01 0,047±0,002

G 1,18±0,03 3,00±0,05 17,3±0,3 8,3±0,2* 2,01±0,02* 0,28±0,01 0,101±0,004

PD ver M 1,6±0,2 0,8±0,1 47,1±3,5* 4,4±0,3* 0,7±0,1* 0,08±0,01 0,06±0,01

G 1,1±0,2 2,9±0,1 22,5±0,9 13,3±0,6* 1,21±0,04* 0,67±0,04 0,17±0,02

PD inv M 3,5±0,1 1,24±0,02 49,1±1,1* 4,1±0,2* 1,0±0,1* 0,10±0,01 0,140±0,002

G 1,5±0,1 4,5±0,1 20,6±0,9 10,7±0,3* 2,2±0,1* 0,19±0,01 0,42±0,01

PU ver M 2,1±0,2 2,3±0,2 68,9±5,8* 2,5±0,1* 0,76±0,03* 0,027±0,002 0,14±0,01

G 1,01±0,03 4,2±0,1 22,7±1,0 5,0±0,2* 1,26±0,02* 0,11±0,01 0,8±0,1*

PU inv M 2,5±0,2 1,7±0,2 67,9±5,1* 3,0±0,2* 0,8±0,1* 0,044±0,003 0,45±0,05

G 0,9±0,1 5,9±0,6 23,1±0,9 4,6±0,2* 1,5±0,1* 0,059±0,003 0,45±0,02

PV ver M 1,6±0,2 1,0±0,1 40,0±3,6* 3,7±0,2* 0,76±0,04* 0,098±0,001 0,42±0,05

G 1,14±0,05 4,3±0,4 22,4±1,2 11,1±0,3* 1,4±0,1* 0,37±0,03 0,7±0,1

PV inv M 6,3±0,3* 2,0±0,1 101,3±2,0* 5,3±0,1* 1,53±0,03* 0,125±0,002 1,8±0,1*

G 2,1±0,1 7,9±0,5 48,7±5,5* 8,9±0,2* 2,4±0,1* 0,218±0,003 2,4±0,2*

ANVISA - 5 30 50 1 0,3 1 2

FAO/WHO - - 30 50 - - 1 2

EPA - - 20 30 - - 2 0,8

*indica diferenças estatisticamente diferentes (p< 0,05).

84

As concentrações de As e Se tanto no verão e no inverno encontram-se

acima das concentrações máximas permissíveis pela ANVISA, oferecendo riscos

para os consumidores humanos, como discutido anteriormente para as

concentrações totais dos metais e metalóides.

5.5.2. Biomarcadores protéicos e enzimáticos nas diferentes estações

As concentrações (expressas em peso seco, µg g-1) dos biomarcadores

protéicos (MT e GSH) presentes nos mexilhões Perna perna coletados em IG e

BG no verão e no inverno encontram-se nas Figuras 21 e 22, no qual os

símbolos * e # mostram as diferenças significativas nas concentrações destas

proteínas em músculos e glândulas, respectivamente, dos mexilhões coletados

nas duas diferentes estações.

As concentrações de MT em músculos e glândulas dos mexilhões do

presente estudo são representadas pela Figura 21.

Figura 21. Concentrações de MT em músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna coletados em Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e praia Vermelha

(PV) separados pela estações do ano (verão-ver e inverno-inv).

As concentrações de MT em músculos e glândulas dos mexilhões de IG

e BG, foram significativamente (p< 0,05) mais elevadas no verão, exceto nos

músculos dos mexilhões de PU, que não apresentaram diferença significativa.

Isto corrobora com relatos na literatura, tais como o estudo de Viarengo e

colaboradores (1997), que também observaram maiores concentrações de MT

no verão.

As concentrações de GSH em músculos e glândulas dos mexilhões do

presente estudo são representadas na Figura 22.

85

Figura 22. Concentrações de GSH em músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna coletados em Ilha Grande (IG), praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia Vermelha

(PV) separados pela estações do ano (verão-ver e inverno-inv).

Comparando as concentrações de GSH encontradas nos mexilhões

coletados no verão e no inverno, pode ser observado que não houve diferença

significativa (p< 0,05) na concentração encontrada nos músculos dos mexilhões

de PD e PV para as diferentes estações e nos músculos dos mexilhões de IG as

concentrações foram significativamente mais elevadas no inverno. Já nas

glândulas digestivas, as concentrações de GSH nos mexilhões de todas as

quatro áreas de estudo foram significativamente mais elevadas no verão, assim

como no estudo realizado por Filho e colaboradores (2001), no qual também

foram observadas maiores concentrações de GSH nos mexilhões coletados no

verão.

As atividades (expressas em peso úmido, U mg-1 de proteína) dos

biomarcadores enzimáticos (GST e CarbE) presentes nos mexilhões coletados

em IG e BG no verão e no inverno encontram-se nas Figuras 23 e 24, no qual os

símbolos * e # mostram as diferenças significativas nas atividades destas

enzimas em músculos e glândulas, respectivamente, dos mexilhões coletados

nas duas diferentes estações. Cabe ressaltar que as atividades de GST para a

maioria das amostras dos mexilhões analisados apresentaram valores abaixo do

limite de detecção do método, sendo assim foi possível apenas comparar

diferenças nas atividades de GST de acordo com a sazonalidade nas amostras

de glândulas dos mexilhões da PD e PU.

As atividades de GST em músculos e glândulas dos mexilhões do

presente estudo são representadas na Figura 23.

86

Figura 23. Atividades de GST em glândulas (G) de mexilhões Perna perna na praia do

Diabo (PD) e na Praia da Urca (PU) separados pela estações do ano (verão-ver e inverno-inv).

As atividades de GST foram significativamente (p<0,05) mais elevadas no

verão, assim como o estudo realizado por Schmidt e colaboradores (2013) em

mexilhões, que também observaram atividades de GST mais elevadas nesta

estação.

As atividades de CarbE em músculos e glândulas dos mexilhões do

presente estudo são representadas na Figura 24.

Figura 24. Atividades de CarbE em músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna

coletados em Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia Vermelha (PV) separados pela estações do ano (verão-ver e inverno-inv).

As atividades de CabE com relação a sazonalidade não mostraram uma

tendência clara: as atividades desta enzima em músculos e glândulas dos

mexilhões da PD e PU não apresentaram diferenças significativas; nos músculos

dos mexilhões de PV e nas glândulas dos mexilhões de IG e PV as atividades

foram significativamente mais elevadas no inverno e nos músculos dos

87

mexilhões de IG as atividades foram significativamente mais elevadas no verão.

Não existem muitos relatos na literatura, porém em um estudo com mexilhões

realizado por Nilin (2012) encontram atividades de CarbE mais elevadas no

verão.

Tem sido reportado que as diferenças sazonais podem ser devido a

diversos fatores como a fisiologia e reprodução do organismo, da disponibilidade

de alimentos, da temperatura da água e das concentrações de metais nos

tecidos destes organismos (Amiard e Berthet, 1996; Wang e Dei, 1999; Mubiana

et al., 2005).

As concentrações de MT nos músculos dos mexilhões (inverno) se

mostraram significativamente correlacionadas com os seguintes metais e

metalóides: Ni (IG); Ni e Cd (PD) (correlações positivas) e Cd (PV) (correlação

negativa), enquanto nenhuma correlação significativa foi observada para este

tecido no verão. Nas glândulas, as seguintes correlações foram observadas no

inverno: As (PD) e Ni (PV) (correlações positivas), enquanto, novamente, não

foram observadas correlações significativas para este tecido no verão, e todas

as correlações obtidas foram muito fortes.

As concentrações de GSH nos músculos dos mexilhões não mostraram

correlações significativas com os metais e metalóides estudados, tanto no verão

quanto no inverno. Nas glândulas dos mexilhões coletados no verão, as

seguintes correlações foram observadas: Cd (PU ver) e Zn (PV) e no inverno Cd

(PD). Todas as correlações obtidas foram positivas e muito fortes.

As atividades de GST nos músculos dos mexilhões (verão) e nas

glândulas (verão e inverno) não mostraram correlações significativas com os

metais e metalóides determinados. Nos músculos dos mexilhões coletados no

inverno foi obtido uma correlação significativa positiva e muito forte com o Pb

(PU). Cabe ressaltar que o teste de correlação de Pearson para esta enzima

com os metais e metalóides foram realizados apenas para os mexilhões de PD e

PU, pois as atividades de GST nos mexilhões de IG e PV foram abaixo do limite

de detecção.

As atividades de CarbE nos músculos dos mexilhões coletados no verão

se mostraram significativamente correlacionadas com Cu e Cd (PV) (correlações

negativas) e no inverno se mostraram significativamente correlacionadas com Pb

(PU) (correlações positivas). Nas glândulas dos mexilhões coletados no verão,

as concentrações de CarbE se mostraram significativamente correlacionadas

com Zn e Se (IG) (correlações negativas) e Zn e Se (PV) (correlações positivas)

88

e no inverno as concentrações desta enzima se mostraram significativamente

correlacionadas com Cu (IG) (correlações positivas).

É importante ressaltar que a reprodução de mexilhões ocorre durante

todo o ano. Há, no entanto, períodos reprodutivos mais pronunciados (picos de

reprodução) correspondentes aos meses de Abril, Maio e Junho (outono),

Setembro (primavera) e Janeiro (verão), com os dois últimos sendo os mais

intensos (Marques, 1997). Relatórios anteriores indicam que os esforços

reprodutivos podem gerar ROS como sub-produtos em diversas espécies, tais

como a maturação de oócitos em lagostas por exemplo (Liñán-Cabello et al.,

2004), uma vez que estes esforços levam a um aumento da atividade

metabólica, a produção de ROS e, consequentemente, o estresse oxidativo

como resultado de energia reduzida disponível para as defesas antioxidantes

(Petes et al., 2008). Sendo assim, as variações sazonais de certos

biomarcadores podem ser devido a estes períodos reprodutivos mais

pronunciados. Portanto, estudos de monitoramento ambiental devem levar em

conta a época reprodutiva desta espécie para evitar interpretações errôneas dos

resultados destes biomarcadores.

Além disso, a indução de MT tem sido correlacionada a certos fatores

abióticos, como hipertermia, estresse hiposmótico, temperatura e oxigênio

dissolvido (Hamer et al., 2008; Gourgou et al., 2010; Jarque et al., 2014). Todos

esses fatores têm sido postulados como sendo a causa das variações sazonais

de determinados biomarcadores (Petes et al., 2008), e podem ser a fonte de

algumas das variações observadas no presente estudo com relação aos

biomarcadores utilizados, embora as correlações estatisticamente significativas

observadas entre estes parâmetros bioquímicos e certos metais e metalóides

tenham sido muito fortes, indicando um grau de relação direto entre eles.

89

5.6. Caracterização de metaloproteínas na fração termoestável de músculos e glândulas de mexilhões Perna perna

5.6.1. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

O procedimento de extração térmica utilizada para purificar a proteína MT

utilizada no presente estudo já foi utilizada em diferentes espécies e matrizes

biológicas (Erk et al., 2002; Lavradas et al., 2014; Tenório-Daussat et al., 2014;

Hauser-Davis et al., 2015). Esta proteína é termoestável e tem aproximadamente

6-7 kDa ou, quando presentes em forma de dímeros, aproximadamente 12-14

kDa (Amiard et al., 2006; Mao et al., 2012), usada como biomarcadora de

contaminação por metais e metalóides. Estudos anteriores têm indicado,

entretanto, que este procedimento também purifica outras proteínas

termoestáveis em diferentes matrizes biológicas (Tenório-Daussat et al., 2014).

Os dados obtidos na análise de SDS-PAGE no presente estudo

corroboram esta hipótese devido a presença de diversas bandas de proteínas

nos eletroferogramas das amostras de músculos e glândulas dos mexilhões

Perna perna (Figura 25). Foram observados também bandas de proteínas nas

amostras de músculos e glândulas abaixo das bandas de 10 e 15 kDa dos

padrões de peso molecular (aparentemente perto de 7 e 14 kDa

respectivamente), que pode indicar a presença de MT em suas formas

monoméricas e diméricas. No entanto, estudos com outros invertebrados, como

ostras e outras espécies de mexilhões, indicam que a MT ou proteínas

semelhantes a MT podem variar de tamanho nesses organismos (10, 13, 20 e 25

kDa, por exemplo) (Roesijadi et al., 1989; Mackay et al., 1993; Simes et al.,

2003). Como estudos envolvendo as metalotioneínas em Perna perna não foram

ainda realizados, é possível que outras bandas de diferentes tamanhos sejam

desta metaloproteína. Isto será discutido melhor na próxima seção.

O eletroferograma das glândulas digestivas demorou mais tempo para

corar quando comparado com o eletroferograma dos músculos, indicando que a

fração de proteínas termoestáveis de músculos contêm alto teor de proteínas

uma vez que foram adicionadas as mesmas quantidades de proteína total das

amostras nos géis. Isto está de acordo com estudos anteriores no qual diversas

proteínas presentes em músculos de mexilhões são mais termoestáveis e

desnaturam somente em aproximadamente 112 °C (Ovissipour et al., 2013). É

possível observar que o eletroferograma de glândulas resultou em um gel “sujo”

90

com bandas mais fracas, provavelmente devido ao maior teor de lipídeos nesta

matriz quando comparado ao tecido muscular, uma vez que nenhum

procedimento de limpeza foi usado, tal como deslipidificação (Hauser-Davis, R.

A. et al., 2012).

Diversas diferenças qualitativas podem ser observadas quando se

comparam as bandas de proteínas observadas em amostras da Ilha Grande (IG)

com as bandas presentes em amostras da Baía de Guanabara (BG) (Praia do

Diabo-PD, Praia da Urca-PU e Praia vermelha-PV). Por exemplo, no tecido

muscular, uma banda de proteína entre 100 e 150 kDa está presente nas

amostras de BG, mas não na IG, bem como uma banda de proteína logo abaixo

de 20 kDa que está presente nas amostras de IG mas não em amostras da BG.

Além disso, as faixas compreendidas entre 50 e 37 kDa e outra em 15 kDa

estavam presentes em concentrações ligeiramente mais elevadas em todos os

três locais de coleta da BG em comparação com IG. No que diz respeito às

glândulas digestivas, uma banda compreendida entre 10 e 15 kDa estavam

presentes apenas nas amostras de IG e não nas amostras da BG. Na PD, uma

banda a 100 kDa estava presente em concentrações mais elevadas quando em

comparação com os outros locais, enquanto uma banda ligeiramente mais baixa

do que 15 kDa estava presente em concentrações mais elevadas em IG. Esses

resultados indicam expressões de proteínas diferenciadas entre locais de coleta,

provavelmente devido a diferenças de contaminação ambiental.

É interessante notar também diferenças na expressão de proteínas

apresentadas no verão e no inverno. Nos músculos, uma banda de proteína em

aproximadamente 37 kDa estava presente em IG e BG no verão, mas não

estava presente no inverno. Além disso, uma banda compreendida entre 50 e 37

kDa e uma banda em aproximadamente 15 kDa dos mexilhões analisados

estavam presentes em concentrações ligeiramente mais elevadas no verão

enquanto que uma banda abaixo de 10 kDa estava presente em concentração

mais elevada no inverno. Já nas glândulas, uma banda compreendida entre 75 e

50 kDa estava presente nos mexilhões coletados no inverno. Observa-se

também que uma banda em aproximadamente 15 kDa dos mexilhões de todos

os locais de coleta estava presente em concentração ligeiramente mais elevada

no inverno enquanto que uma banda abaixo de 10 kDa estava presente em

concentração mais elevada no verão.

91

Figura 25. Eletroferogramas de músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna de Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e

Praia Vermelha (PV).

92

5.6.2. Determinação de metaloproteínas por SEC-HPLC-ICP-MS

O uso sequencial da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)

acoplado a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) permite a separação

de proteínas antes da sua detecção pelo ICP-MS e a combinação destas

técnicas permite a detecção de proteínas e elementos ao mesmo tempo

(González-Fernández et al., 2008). Por medidas online por ICP-MS é possível

determinar quais os elementos estão ligados a estas proteínas, auxiliando na

caracterização da contaminação local por metais e metalóides, se existirem, e

também em visualizar as diferenças nos perfis de metaloproteínas e

comportamento da ligação com os metais e metalóides.

A calibração da coluna foi realizada com os seguintes padrões, de acordo

com estudos anteriores (Garcia-Sevillano et al., 2012): Ferritina (440 kDa,

determinação de Fe), BSA (67 kDa, determinação de Zn), MT-I (7 kDa,

determinação de Cd) e GSH (0,3 kDa, determinação de Cu) (Figura 26).

Figura 26. Padrões usados para a calibração da coluna SuperdexTM-75.

Os perfis cromatográficos para as frações termoestáveis de músculos e

glândulas de mexilhões Perna perna dos diferentes locais de coleta mostraram

pequenas variações, porém todos os elementos estudados eluiram entre 10 e 30

min, exceto o Hg que não apresentou sinais associados a proteínas. Sinais de

93

Cu, Zn, Ni e As apresentaram-se evidentes em todas as amostras. Todas as

amostras apresentaram sinais baixos de Pb e Se, e algumas amostras

apresentaram sinais baixos de Cd. As Figuras 27 a 30 mostram o perfil

cromatográfico de músculos e glândulas de mexilhões dos diferentes locais de

coleta.

94

Figura 27. Proteínas ligadas a Ni, Cu, Zn e As observadas por SEC-HPLC-ICP-MS em músculos de mexilhões Perna perna em Ilha Grande, local de referência e nas praias

contaminadas da Baía de Guanabara (BG), em que (A) Ilha Grande (IG); (B) Praia do Diabo (PD) (C) praia da Urca (PU); (D) praia Vermelha (PV).

95

Figura 28. Proteínas ligadas a Pb, Cd e Se observadas por SEC-HPLC-ICP-MS em músculos de mexilhões Perna perna em Ilha Grande, local de referência e nas praias

contaminadas da Baía de Guanabara (BG), em que (A) Ilha Grande (IG); (B) Praia do Diabo (PD); (C) praia da Urca (PU); (D) praia Vermelha (PV).

96

Figura 29. Proteínas ligadas a Ni, Cu, Zn e As observadas por SEC-HPLC-ICP-MS em glândulas de mexilhões Perna perna em Ilha Grande, local de referência e nas praias

contaminadas da Baía de Guanabara (BG), em que (A) Ilha Grande (IG); (B) Praia do Diabo (PD); (C) Praia da Urca (PU); (D) Praia vermelha (PV).

97

Figura 30. Proteínas ligadas a Pb, Cd e Se observadas por SEC-HPLC-ICP-MS em músculos de mexilhões Perna perna em Ilha Grande, local de referência e nas praias

contaminadas da Baía de Guanabara (BG), em que (A) Ilha Grande (IG); (B) Praia do Diabo; (C) Praia da Urca (PU); (D) Praia vermelha (PV).

98

Todas as amostras purificadas de músculos e glândulas de mexilhões do

presente estudo mostraram a presença de metais e metalóides em 11, 19, 21 e

24 minutos. A Tabela 11 mostra o tempo de retenção das metaloproteínas

observadas em ambas as matrizes e os correspondentes metais e metalóides

ligados a estas proteínas em diferentes locais de amostragem. Foram

observadas proteínas de baixo e alto peso molecular ligadas à metais e

metalóides, corroborando com a análise de SDS-PAGE e também está de

acordo com os relatórios anteriores sobre os procedimentos de purificação de

proteínas térmicas em outras espécies, tal como citado anteriormente.

Foram feitas algumas comparações com relação aos metais e metalóides

ligados a proteínas nas diferentes amostras, sendo que foram injetados a

mesma quantidade de proteína total das amostras. No geral, a intensidade dos

sinais da maioria dos metais e metalóides determinados neste estudo que se

apresentaram ligados as proteínas foram mais altas nos músculos comparado a

glândula digestiva. Esses resultados corroboram com o resultado obtido na

análise de SDS-PAGE indicando o maior teor de proteína no tecido muscular.

As concentrações de metais e metalóides nas frações termoestáveis de

músculos e glândulas dos mexilhões analisados no verão e no inverno

encontram-se na Tabela 12.

99

Tabela 11. Tempo de retenção das proteínas ligadas a metais e metalóides em músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna coletados no

local de referência- Ilha Grande (IG) e nas praias contaminadas da Baía de Guanabara (BG): (praia do Diabo (PD), praia da Urca (PU) e praia Vermelha (PV)).

Local de

amostragem 11 min 19 min 21 min 24 min

IG M ver Ni, Cu, Zn, Pb, Cd Zn, Se Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

IG M inv Ni, Cu, Zn, Pb, Cd Zn, Se, Pb Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

PD M ver Ni, Cu, Zn Cu, Zn, Pb Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

PD M inv Ni, Cu, Zn Cu, Zn, Se, Pb Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

PU M ver Ni, Cu, Zn, Pb Zn, Se, Pb, Cd Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

PU M inv Ni, Cu, Zn, Pb Cu, Zn, Se, Pb, Cd Ni, As, Cu, Zn As, Se

PV M ver Ni, Cu, Zn, Pb Zn, Se, Pb Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

PV M inv Ni, Cu, Zn, Pb Zn, Se, Pb Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

IG G ver Zn, Pb Ni, Cu, Pb, Se, Cd Ni, As, Cu Ni, As, Cu, Zn, Se

IG G inv Ni, Cu, Zn, Pb Ni, Cu, Pb, Se Ni, As, Cu As, Cu, Se

PD G ver Ni, Cu, Zn, Pb Ni,Cu, Zn, Pb, Cd Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

PD G inv Ni, Cu, Zn, Pb Cu, Pb, Se Ni, As, Cu As, Se

PU G ver Zn, Pb Ni, Cu, Zn, Pb, Se, Cd Ni, As, Cu, Zn As, Cu

PU G inv Zn, Pb Ni, Cu, Zn, Pb, Se, Cd Ni, As, Cu, Zn As

PV G ver Ni, Zn, Pb Ni, Cu, Zn, Pb, Se, Cd Ni, As, Cu, Zn As, Cu, Se

PV G inv Zn, Pb Cu, Pb, Se Ni, As, Cu Ni, As, Se

100

Tabela 12. Concentrações de metais e metalóides na fração termoestável de músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna no verão (ver) e no

inverno (inv) (expressas como média ± média de incerteza expandida (95%) em peso seco, µg g-1

).

Amostras Tecidos Ni Cu Zn As Se Cd Pb

IG ver M 0,08±0,02 0,036±0,002 0,44±0,03 0,082±0,003 0,045±0,004 0,0053±0,0004 0,0010±0,0001

G 0,07±0,01 0,093±0,013 0,28±0,04 0,087±0,013 0,68±0,009 0,08±0,01 0,0007±0,0001

IG inv M 0,27±0,02 0,08±0,01 0,53±0,02 0,19±0,01 0,029±0,002 0,015±0,002 0,0012±0,0001

G 0,04±0,01 0,09±0,01 0,14±0,03 0,17±0,03 0,032±0,005 0,009±0,001 0,0017±0,0003

PD ver M 0,10±0,01 0,039±0,002 0,31±0,01 0,077±0,003 0,033±0,006 0,0010±0,0001 0,00027±0,00002

G 0,052±0,003 0,09±0,01 0,42±0,07 0,18±0,03 0,06±0,02 0,026±0,005 0,0048±0,0008

PD inv M 0,33±0,04 0,09±0,01 0,45±0,02 0,14±0,01 0,027±0,002 0,0036±0,0003 0,002±0,000

G 0,078±0,005 0,223±0,005 0,73±0,06 0,30±0,01 0,043±0,002 0,010±0,001 0,0071±0,0004

PU ver M 0,16±0,01 0,194±0,040 0,74±0,04 0,045±0,001 0,029±0,002 0,0019±0,0002 0,0045±0,0005

G 0,05±0,01 0,12±0,02 0,24±0,06 0,07±0,02 0,04±0,01 0,010±0,004 0,006±0,002

PU inv M 0,25±0,03 0,17±0,03 0,86±0,08 0,13±0,01 0,023±0,004 0,0025±0,0005 0,007±0,001

G 0,049±0,007 0,170±0,003 0,24±0,03 0,14±0,02 0,052±0,005 0,0022±0,0003 0,014±0,003

PV ver M 0,16±0,01 0,068±0,009 0,54±0,01 0,078±0,003 0,058±0,009 0,0024±0,0006 0,0066±0,0007

G 0,043±0,004 0,17±0,02 0,48±0,03 0,013±0,01 0,05±0,01 0,017±0,001 0,015±0,001

PV inv M 0,58±0,01 0,133±0,004 0,84±0,02 0,233±0,003 0,042±0,007 0,0037±0,0002 0,011±0,001

G 0,10±0,01 0,27±0,02 0,49±0,07 0,25±0,01 0,057±0,006 0,0096±0,0008 0,030±0,003

101

As concentrações de metais e metalóides nas frações termoestáveis foram

determinadas por ICP-MS e foi realizado o teste estatístico ANOVA e correlação

de Pearson. Os resultados obtidos foram comparados com os perfis qualitativos

por SEC-HPLC-ICP-MS observados em cada matriz.

As frações termoestáveis de músculos e glândulas do verão apresentaram

concentrações de Cu (IG, PD), As (PV), Cd (IG, PD, PV) e Pb (PD, PV)

significativamente (p<0,05) mais altas nas glândulas digestivas, enquanto que as

concentrações de Ni (PU, PV) e Zn (PU) foram significativamente (p<0,05) mais

altas nos músculos. Já nas amostras de inverno, as concentrações de Cu, Cd e

Pb (PD, PV), Se (PD, PU), Zn, As (PD) foram significativamente (p<0,05) mais

altas nas glândulas digestivas, enquanto que as concentrações de Ni (IG, PD,

PU, PV) e Zn (IG, PU, PV) foram significativamente (p<0,05) mais altas nos

músculos. De acordo com os resultados qualitativos (SEC-HPLC-ICP-MS)

observa-se que os mexilhões coletados no verão apresentaram Ni (PU e PV) e

Zn (PU) com mais altas intensidades ligadas as metaloproteínas em músculos e

os elementos Cd (IG, PD, PV) e Pb (PD, PV) com intensidades mais altas

ligadas as metaloproteínas em glândulas; no inverno, apenas os elementos Ni

(IG, PD, PU e PV) e Zn (IG ,PU, PV) apresentaram mais altas intensidades

ligadas as metaloproteínas em músculos e os elementos Cd (PD, PV), Se (PD,

PU) apresentaram intensidades mais altas ligadas a metaloproteínas em

glândulas. Sendo assim, foi possível estabelecer uma relação direta entre o teor

de metais e metalóides nos extratos purificados com a intensidade desses

elementos ligados as proteínas no mesmo tecido/órgão, ou seja, maior teor de

um metal em um tecido/órgão com maior intensidade deste mesmo metal ligado

a proteína.

As diferenças significativas (p< 0,05) entre as concentrações dos metais e

metalóides dos mexilhões coletados nas praias da Baía de Guanabara (PD, PU,

PV) e da Ilha Grande no verão foram as seguintes: em músculos, as

concentrações de Zn em IG foram significativamente mais altas que na PD e as

concentrações obtidas em PU foram significativamente maiores quando

comparados com IG e PV; as concentrações de As em IG foram

significativamente maiores quando comparados com PU; as concentrações de

Cd foram significativamente maiores quando comparados com os outros locais

de coleta; as concentrações de Pb foram significativamente maiores em PU e PV

quando comparados com IG e as concentrações de IG foram significativamente

maiores quando comparados com PD. Em glândulas, as concentrações de Zn

foram significativamente maiores em PV quando comparados com IG; as

102

concentrações de Cd foram significativamente maiores em IG quando

comparados com PU e PV; as concentrações de Pb foram significativamente

maiores em PD e PV quando comparados com IG.

As diferenças significativas (p<0,05) entre as concentrações dos metais e

metalóides dos mexilhões coletados nas praias da Baía de Guanabara (PD, PU,

PV) e da Ilha Grande no inverno foram as seguintes: nos músculos dos

mexilhões analisados, as concentrações de Cu em PV foram significativamente

maiores quando comparados com IG; as concentrações de Zn foram

significativamente maiores em PU e PV quando comparados com IG; as

concentrações de As foram significativamente maiores em IG quando

comparados com PD e PU e as concentrações obtidas em PV foram

significativamente mais altas quando comparado com IG; as concentrações de

Cd obtidas em IG foram significativamente maiores quando comparadas com as

praias da BG; as concentrações de Pb foram significativamente maiores nas

praias da BG quando comparados com IG. Em glândulas, as concentrações de

Ni em PD e PV foram significativamente maiores quando comparados com IG;

as concentrações de Cu foram significativamente maiores nas praias da BG

quando comparados com IG; as concentrações de Zn em PD e PV foram

significativamente mais altas quando comparadas com IG; as concentrações de

Cd em IG foram significativamente mais altas que em PU; as concentrações de

Pb foram significativamente mais altas nas praias da BG quando comparadas

com IG.

Estes resultados juntamente com os obtidos no SEC-HPLC-ICP-MS

indicam que IG mostra uma contaminação superior de Cd quando comparado

com BG, enquanto que a BG mostra uma maior contaminação de Pb

corroborando com os resultados de metais e metalóides obtidos na fração total

de músculos e glândulas dos mexilhões Perna perna analisados. Outro fato

interessante, foi que as concentrações de Zn foram mais elevadas que as

concentrações de Ni na fração total e na fração de MT de músculos e glândulas

dos mexilhões analisados, porém os níveis de Ni foram mais elevados que os

níveis de Zn ligado a proteínas. Isto pode ter ocorrido porque de acordo com

(Sreedevi et al., 1992), quando o Ni é administrado em excesso as atividades de

desintoxicação sofrem uma intereferência, alterando a síntese e a degradação

do heme celular e os níveis de glutationa.

Correlações significativas (p<0,05) entre as concentrações de metais e

metalóides nas frações totais e nas frações purificadas de músculos e glândulas

dos mexilhões foram observadas. No verão foram obtidas as seguintes

103

correlações positivas: Cu (PU) nas glândulas, As (PV) nos músculos e as

seguintes correlações negativas: Ni (PV) e As (PV) nas glândulas; no inverno

foram obtidas as seguintes correlações positivas: Cd e Pb (IG), Ni, Cu e Zn (PV)

em músculos e Cu (PD) nas glândulas e as seguintes correlações negativas: Se

(IG) nas glândulas e Ni (IG) em músculos. Isto indica uma relação entre as

concentrações destes elementos na fração total e na fração purificada.

As correlações positivas observadas no verão: Cu em PU (glândulas)

podem ser devido ao fato da concentração de Cu na fração total de glândulas

terem sido significativamente maiores em PU quando comparado com os outros

locais de coleta, embora não se tenha observado diferenças significativas nas

concentrações deste metal na fração solúvel; As em PV (músculos) porque tanto

na fração total quanto na solúvel, este metalóide foi significativamente maior em

PV quando comparado com PU, embora diferenças significativas não tenham

sido encontradas quando comparadas com PD e IG. As correlações negativas

observadas nesta mesma estação como o Ni em PV (glândulas) faz sentido uma

vez que as concentrações de Ni na fração total de glândulas em PV foram

significativamente mais baixas em PV quando comparado com IG, não

apresentaram diferença significativa em relação a PU e também não

apresentaram diferenças significativas na fração purificada. Já as concentrações

de PV (glândulas) entretanto, foram significativamente mais altas em PV em

comparação com IG e PU, não mais baixa, com diferenças não significativas nas

frações purificadas, que não explica a correlação negativa obtida neste caso.

As correlações positivas observadas no inverno como Cd em IG

(músculos) pode ser devido ao fato da concentração deste metal na fração total

e na fração purificada de músculos terem sido significativamente maiores em IG

quando comparado com os outros locais de coleta; Cu em PV (músculos) devido

as concentrações de Cu na fração total em PV terem sido significativamente

maiores quando comparado com os outros lugares e na fração solúvel terem

sido maiores quando comparados com IG e PD; Zn em PV (músculos) deve ser

porque as concentrações de Zn na fração total de músculos em PV foram

significativamente maiores quando comparado com os outros locais de coleta e

na fração solúvel foram maiores que IG e PD; Cu em PD (glândulas) porque na

fração total as concentrações em PD foram significativamente maiores quando

comparados com IG embora tenham sido significativamente maiores quando

comparadas a PD e na fração purificada as concentrações em PD foram

significativamente maiores quando comparados com IG e PU; Ni em PV

(músculos) pode ser explicada pelo fato de as concentrações deste elemento na

104

fração purificada de músculos terem sido significativamente mais altas em PV

quando comparado com os outros lugares, embora não tenha tido diferença

significativa na fração total enquanto que Pb em IG (músculos) não pode ser

explicado porque as concentrações deste metal tanto na fração total quanto na

fração purificada foram significativamente mais baixas em IG quando

comparados com os outros lugares. Já as correlações negativas observadas

nesta mesma estação como Se em IG (glândulas) deve ser porque as

concentrações deste elemento em IG foram significativamente menores que em

PV embora tenham sido maiores que as concentrações obtidas em PU; Ni em IG

(músculos) porque na fração total as concentrações de Ni na fração total de

músculos dos mexilhões de IG foram significativamente menores quando

comparados com PU e na fração purificada foram significativamente menores

quando comparado com PV. Estes resultados indicam que as concentrações de

metais e metalóides na fração total de músculos e glândulas dos mexilhões

analisados em alguns casos estão diretamente relacionadas com as

concentrações destes elementos na fração purificada. Cabe ressaltar que existe

a necessidade de uma investigação mais profunda sobre isso e mais estudos

controlados precisam ser realizados.

Alguns elementos como o Zn, Cu, Ni e Se são essenciais para diversos

organismos, mas podem ser tóxicos quando presentes em altas quantidades.

Em contraste, a exposição aos elementos tais como o Cd, As e Pb, tem sido

associado aos efeitos prejudiciais e tóxicos para a saúde dos organismos

(Heath, 1991). A presença de Zn, Cu, Se e Ni ligados a proteínas nas amostras,

é então esperado, uma vez que os elementos essenciais são necessários a

muitos processos metabólicos e desempenham um importante papel como

cofator de diversas metaloproteínas e enzimas na maioria dos seres vivos. Os

outros elementos estudados (Pb, Cd, As e Hg), entretanto, são não essenciais e

a presença destes metais e metaloides ligados as proteínas devem indicar a

destoxificação destes poluentes.

A destoxificação de metais e metalóides ocorrem através de diversos

mecanismos, como por exemplo, a ligação destes elementos com a proteína

GSH, e diversos estudos demonstram a indução de complexos metal-GSH em

diferentes organismos após exposição a metal, através do grupamento sulfidrila

(Rabestein et al., 1985). De fato, tem sido proposto que a GSH é capaz de

complexar com os metais, e então, destoxificar os organismos logo após a

entrada destes elementos na célula, representando uma primeira linha de defesa

contra a citoxicidade dos metais (Canesi et al., 1999). Neste contexto, no

105

presente trabalho, muitas metaloproteínas eluíram aproximadamente no tempo

de retenção do padrão de GSH (0,3 kDa), o que pode indicar que este

tripeptídeo também ajuda na desintoxicação de elementos tóxicos.

Outro mecanismo de destoxificação é a indução da síntese de

metalotioneína, causado pela ruptura da homeostase dos organismos, pela

presença de altas concentrações intracelular de metais essenciais ou pela

presença de metais tóxicos. Estas metaloproteínas ligadas a metais, na tentativa

de desintoxicação estão presentes na maioria dos seres vivos, incluindo os

mexilhões (George, 1983). O padrão de MT-I usado na calibração da coluna

eluiu em aproximadamente 18 minutos, enquanto todas as amostras do presente

estudo mostraram sinais de metaloproteínas logo após esse tempo de retenção,

em 19 minutos. A maioria das amostras de músculos apresentaram esta

metaloproteína ligadas a Zn, Se e Pb e a maioria das amostras de glândulas

ligadas a Ni, Cu, Pb, Se e Cd. Isto é um forte indicativo que este sinal pode

corresponder a metalotioneína uma vez que: 1) MTs em mexilhões tem

mostrado ter diversos tamanhos nas diferentes espécies, como citado

anteriormente; 2) A coluna SEC não é capaz de separar isoformas de MT

(Lobinski et al., 1998); 3) As MTs são conhecidas por se ligarem a todos os

metais e metalóides investigados (Sevcikova et al., 2011; Mao et al., 2012;

Ramsak et al., 2012; Asare et al., 2013; Kovendan et al., 2013) e 4) não foram

encontrados estudos sobre a expressão de metaloproteínas em mexilhões Perna

perna.

Com relação a caracterização da contaminação ambiental, no presente

estudo, todas as metaloproteínas presentes em ambas as matrizes se

apresentaram ligadas a pelo menos um metal ou metalóide não essencial, como

o Pb, As e Cd. A única exceção foram as metaloproteínas eluídas em 11 minutos

em músculos de mexilhões da PD que se apresentaram ligadas aos elementos

essenciais Ni, Zn e Cu, podendo ser um indicativo de processos metabólicos e

homeostase normal. As metalorproteínas eluídas neste mesmo tempo nas

amostras de músculos dos outros locais de coleta e de todas as glândulas

estavam ligadas também a Pb, que indicam que todos os mexilhões de todos os

lugares de coleta estão contaminados por este metal tóxico. Cabe ressaltar que

todas as amostras coletadas na IG, considerada como uma área de referência

também mostraram proteínas ligadas a metais e metaloides tóxicos, como o Pb,

Cd e As, indicando uma tentativa de destoxificação e levantando a hipótese de

que este lugar não é um local de referência para contaminação de metais e

metalóides. As concentrações destes elementos nas amostras de músculos e

106

glândulas dos mexilhões também corroboram com esta hipótese, uma vez que

os elementos não essenciais também foram detectados.

Futuramente, pretende-se realizar uma caracterização mais detalhada na

fração termoestável das amostras de mexilhões Perna perna, como por

exemplo, a identificação das diferentes bandas de proteínas obtidas por técnicas

como a espectrometria de massa, para identificar as proteínas termoestáveis

presentes nas amostras, levando a uma compreensão mais detalhada sobre a

expressão de metaloproteína nesta espécie devido a contaminação ambiental

diferenciada nas diferentes matrizes e nos diferentes locais de coleta.

5.7. Zimografia e caracterização de serino-preoteases

Ao comparar os diferentes tempos de incubação e quantidade de proteína,

verificou-se que os melhores resultados zimográficos foram obtidos utilizando

aproximadamente 60 µg das amostras de músculos e 40 µg das amostras de

glândulas dos mexilhões analisados, com 16 horas de incubação dos géis no

tampão de incubação, devido a observação de bandas mais nítidas nestas

condições (Figura 31). Assim, todos os ensaios subseqüentes foram realizados

nestas condições.

107

Figura 31. Zimogramas de comparação entre as massas de proteínas (40, 50 e 60 µg) das amostras de músculos (M) e glândulas (G) dos mexilhões Perna perna e entre os tempos de incubação (16 e 18hs)

dos géis de zimografia.

O perfil zimográfico obtido com as amostras de glândulas não ficou tão

nítido quanto o perfil zimográfico obtido com as amostras de músculos,

possivelmente devido a atividades elevadas de proteases nas glândulas.

Portanto todos os zimogramas obtidos foram incubados por 16hs ao longo deste

trabalho e foram utilizados 60 µg de proteína das amostras de músculos e 40 µg

de proteína das amostras de glândulas. Cabe ressaltar que os resultados com as

amostras de glândulas obtidos nestas condições são preliminares já que estudos

de otimização precisam ser aprimorados. Os zimogramas obtidos nas condições

citadas acima com as amostras de músculos e glândulas dos mexilhões Perna

perna coletados na Ilha Grande (IG) e na Baía de Guanabara (Praia do Diabo-

PD, Praia da Urca-PU e Praia vermelha-PV) estão representados na Figuras 32.

108

Figura 32. Zimogramas das amostras de músculos (M) e glândulas (G) de mexilhões Perna perna de

Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia Vermelha (PV).

As comparações entre as amostras de músculos e glândulas dos

mexilhões coletados no local considerado de referência (IG) e nos locais

considerados contaminados (PD, PU, PV), foi conduzida qualitativamente,

verificando a presença ou ausência de bandas líticas dos géis entre as

diferentes localidades.

Os zimogramas das amostras de músculos mostraram bandas

gelationolíticas presentes entre 50 e 75 kDa (IG) e logo abaixo de 37 kDa (IG,

PD, PU e PV), sendo esta útima banda com intensidade ligeiramente mais

elevada em PD quando comparado com todos os três locais de coleta. Já os

zimogramas das amostras de glândulas mostraram diversas bandas

gelationolíticas presentes entre 20 e 250 kDa, no qual a banda em

aproximadamente 150 kDa, a banda logo acima de 37 kDa e a banda entre 20

25 kDa apresentaram intensidades ligeiramente mais elevadas nas praias da BG

quando comparado com IG. Estes resultados mostram as diferenças nas

expressões das proteases entre o local considerado de referência (IG) e as

praias da BG (PD, PU, PV), consideradas contaminadas, indicando uma possível

influência da contaminação ambiental na expressão dessas enzimas.

As proteases são enzimas proteolíticas, ou seja, quebram as ligações

peptídicas das proteínas, e pertencem ao grupo das hidrolases as quais tem em

109

comum o envolvimento da água na formação do produto. Estas enzimas são

encontradas em todas as células e tecidos e degradam as proteínas que se

tornaram desnecessárias ou danificadas (Whitaker, 1994; Lehninger et al.,

1995). As proteases podem ser subdividas de acordo com o grupo reativo no

sítio ativo envolvido com a catálise em: serino-proteases, cisteíno-proteases,

aspártico-proteases e metaloproteases (Neurath, 1989). Infelizmente, no

presente trabalho foi possível caracterizar apenas as serino-proteases, devido a

um problema no scanner de géis chegando ao final do trabalho, porém pretende-

se identificar as outras classes de protease em futuros trabalhos.

Para identificar a presença de serino-proteases nas amostras de músculos

e glândulas de mexilhões foi investigado o efeito do PMSF, um inibidor

específico deste tipo de protease (Figuras 33 e 34).

Figura 33. Zimogramas das amostras de músculos (M) de mexilhões Perna perna de Ilha Grande (IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia Vermelha (PV) sem inibor e com o inibidor de

serino-proteases (PMSF).

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Figura 34. Zimogramas das amostras de glândulas (G) de mexilhões Perna perna de Ilha Grande

(IG), Praia do Diabo (PD), Praia da Urca (PU) e Praia Vermelha (PV) sem inibor e com o inibidor de

serino-proteases (PMSF).

Os zimogramas obtidos com as amostras de músculos dos mexilhões

Perna perna das diferentes áreas de estudo (IG e BG) mostram que o PMSF

inibiu completamente a banda de aproximadamente 37 kDa, e os zimogramas

obtidos com as amostras de glândulas dos mexilhões analisados mostram que o

PMSF inibiu uma banda abaixo de 20 kDa em IG, entre 25 e 20 em todos os

lugares, acima de 250 kDa em PU e PV, e reduziu a intensidade de algumas

bandas entre 25 e 150 kda, porém isto não está muito nítido devido a alta

quantidade de proteases nesta matriz.

As proteases são cruciais para a regulação de mecanismos imunológicos,

tais como apresentação de antígeno, a migração de células imunitárias e

inflamatórias e de ativação (Puente et al., 2003). Nos vertebrados, as serino-

proteases tem sido estudadas e desempenham um papel importante na

regulação de várias funções fisiológicas tais como a coagulação do sangue, a

fibrinólise, a ativação do complemento e remodelamento de tecidos. Em

invertebrados, estas proteases estão envolvidas em papéis fundamentais

fisiológicos como a cascata de coagulação, resposta imune inata, troca de

exoesqueleto e a cascata de profenoloxidase (Imamura et al., 2007). Cabe

ressaltar que as serino proteases já foram implicadas em processos

111

imunológicos de diversos invertebrados, inclusive o mexilhão Perna perna.

Sabe-se que o sistema imunológico reage ao ambiente, especialmente a

contaminação ambiental. Sendo assim, as diferenças nas expressões destas

proteases nos mexilhões das diferentes áreas deste estudo podem estar

relacionadas com os diferentes níveis de contaminação, demonstrando o alto

potencial tanto deste tipo de técnica analítica quanto deste tipo de enzima na

busca por novos biomarcadores de contaminação ambiental e da expressão de

proteases neste contexto. Não existem relatos deste tipo de estudo com

mexilhões Perna perna, dificultando, portanto, a discussão dos dados, porém

demonstrando os resultados inéditos dispostos no presente trabalho. Assim

sendo, próximos estudos irão aprofundar-se mais nesta questão de

caracterização por zimografia.