1

1 INTRODUÇÃO

A obesidade é um distúrbio multifatorial definido como um acúmulo excessivo de

gordura no tecido adiposo devido a um balanço energético positivo (SUASTIKA, 2006). De

acordo com PEREIRA, FRANCISCHI e LANCHA JR (2003), o sedentarismo e os hábitos

nutricionais, como a dieta hiperlipídica, parecem ser os principais responsáveis pelo

desenvolvimento da obesidade.

É senso comum que a adiposidade corporal é um importante fator de risco para

diversas doenças, mas é o tecido adiposo visceral que possui maior co-relação com o

desenvolvimento de alterações metabólicas, como: resistência à insulina (ROSA,

ZANELLA, RIBEIRO e KOHLMANN JUNIOR, 2005; CHAN, WATTS, SUSSEKOV,

BARRETT, YANG, HUA e SONG, 2004), diabetes tipo 2, aterosclerose e síndrome

metabólica (GOODPASTER, THAETE e KELLEY, 2000).

VAGUE em 1956 já evidenciava a existência de diferentes padrões de distribuição da

adiposidade corporal, relatando que o padrão andróide, com deposição acentuada de gordura

na parte superior do corpo, estaria relacionado com distúrbios metabólicos como

hiperuricemia, dislipidemia e alterações do metabolismo da glicose. Mais recentemente foi

realizada uma compartimentalização mais minuciosa do tecido adiposo na qual foi

classificada como gordura abdominal o tecido adiposo subcutâneo e a gordura

intraabdominal. Faz parte do tecido adiposo intraabdominal, por sua vez, a gordura omental

e mesentérica e a gordura retroperitoneal localizada dorsalmente (WAJCHENBERG, 2000).

Em ratos a gordura visceral é composta principalmente pelos depósitos epididimal e

retroperitoneal e o subcutâneo pelo depósito inguinal (MAUER, HARRIS E BARTNESS,

2001).

Em função dos distúrbios ocasionados pelo aumento da adiposidade visceral, muito se

tem feito para investigar quais os mecanismos responsáveis por tais alterações. Neste

sentido, algumas proteínas expressas pelo tecido adiposo e pelo músculo esquelético

parecem estar relacionadas aos mecanismos pelos quais este acúmulo de tecido adiposo e o

aumento das concentrações de ácidos graxos livres circulantes resultariam no

desenvolvimento da resistência à insulina e no diabetes tipo 2.

Dentre as diversas proteínas expressas, três serão abordadas neste estudo: PPARα,

PPARγ e PGC-1α. Elas foram escolhidas por possuírem uma estreita relação com síntese e

2

apoptose de adipócitos, além de estarem relacionadas com uma maior sensibilidade á ação

da insulina.

O PPARα é um receptor localizado no núcleo da célula expresso principalmente no

tecido muscular esquelético e sua ação estimula a regulação de genes envolvidos no

metabolismo hepático, na oxidação de ácidos graxos no músculo esquelético e na resistência

à insulina (PATSOURIS, MULLER e KERSTEN, 2004). O PPARγ é receptor nuclear

essencialmente necessário para adipogênese e sensibilidade à insulina, sua expressão é maior

no tecido adiposo branco quando comparado ao músculo esquelético e pâncreas

(SPIEGELMAN, 1998) e é um mediador essencial na manutenção da sensibilidade à

insulina corporal (KINTSCHER & LAW, 2005). O PGC-1α é um coativador da PPAR e sua

ação tem sido fortemente relacionada ao desenvolvimento do diabetes tipo 2 (RODGERS,

LERIN, GERHART-HINES e PUIGSERVER, 2008).

O estudo das relações entre o tecido adiposo visceral e a resistência à insulina pode ser

feito através da diminuição do depósito de gordura corporal e da análise das mudanças no

comportamento metabólico. Dentre as diversas estratégias que podem modular a atividade

destes estoques, abordaremos duas: a atividade física e a lipectomia (retirada cirúrgica de

parte do tecido adiposo).

Pouquíssimos estudos foram feitos abordando a influência da lipectomia na resistência

à insulina, mas a literatura disponível indica profundas mudanças em função dessa estratégia

(GABRIELY, MA, YANG, ATZMON, RAJALA, BERG, SCHERER, ROSSETTI e

BARZILAI, 2002). No estudo de BARZILAI, SHE, LIU, VUGUIN, COHEN, WANG e

ROSSETTI (1999), realizado em ratos idosos, após a remoção de parte do tecido adiposo

visceral foi verificado que a resistência à insulina voltou aos padrões de ratos praticamente

jovens - padrão este que não se repete quando a gordura do tecido adiposo subcutâneo é

retirada.

Nenhum dos estudos em que a lipectomia foi utilizada, entretanto, o fez em associação

à atividade física e nem com a expressão gênica da PPARα, PPARγ e PGC-1α. Tendo em

vista este procedimento (lipectomia) ser relativamente recente e devido aos poucos estudos

existentes, consideramos essa estratégia de grande importância para verificar as possíveis

relações entre a resistência à insulina e a adiposidade corporal.

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Obesidade

A obesidade é hoje considerada um mal que acomete mais pessoas no mundo que a

desnutrição. Em conseqüência disso, as doenças – e mortes – relacionadas a esse distúrbio

têm aumentado vertiginosamente. De acordo com BOUCHARD (2001), a obesidade pode

levar ao desenvolvimento de uma série de co-morbidades, dentre elas: distúrbios do sono e

do humor, osteoartrite, hipertensão, alguns tipos de câncer, dislipidemias, gota, distúrbios

alimentares, dislipidemias, doenças cardíacas e diabetes tipo 2.

Os principais fatores apontados como desencadeantes da obesidade são: herança

genética, inatividade física, problemas hormonais, envelhecimento e alguns padrões de

ingestão alimentar (GABRIELY, MA et al., 2002). No entanto, a causa mais comum para a

ocorrência da obesidade é um pequeno, porém crônico – pode perdurar por anos –

desbalanceamento energético positivo. Esse desbalanceamento ocorre quando o consumo

alimentar excede o gasto energético. O excesso de energia, nesse caso, será armazenado sob

a forma de gordura, ocasionando aumento do peso corporal. Se, entretanto, o gasto

energético for maior que o consumo, os estoques de gordura serão utilizados para suprir essa

demanda – o que acarretará numa diminuição do peso corporal (SUASTIKA, 2006). Em

seu estudo JEFFERY, RYDELL, DUNN, HARNACK, LEVINE, PENTEL, BAXTER e

WALSH (2007) relatam que com o passar do tempo houve mudanças na quantidade de

gordura corporal acumulada pelo homem e afirmam que tais mudanças estão intimamente

relacionadas aos padrões alimentares e ao nível de atividade física. Os autores apontam

ainda que é o consumo alimentar excessivo – e não a inatividade física – o principal

responsável pelo aumento da obesidade.

Dentre os padrões alimentares, podemos relacionar a obesidade ao aumento da

utilização de dietas ricas em lipídios. KHOR (2003) relata que a maior fonte de lipídios da

dieta são os óleos vegetais, mas ressalta que, do total de calorias ingeridas, o consumo de

gordura animal aumentou de 8%, em 1960, para 13%, em 1990. De fato, estudos apontam a

dieta hiperlipídica como uma das principais causas do excesso de gordura corporal tanto em

animais (MARTIN, ALQUIER, ASAKURA, FURUKAWA, PREITNER e KAHN, 2006)

quanto em humanos (MOBBS, MASTAITIS, YEN, SCHWARTZ, MOHAN, POPLAWSKI

e ISODA, 2007).

4

Os mecanismos pelos quais a dieta hiperlipídica ocasiona a obesidade ainda não estão

completamente elucidados, mas existem algumas hipóteses.

De acordo com MOBBS, MASTAITIS et al. (2007), as dietas ricas em gordura

ocasionam a obesidade, em parte, porque, por caloria, os lipídios possuem menor efeito

termogênico (pós-prandial) quando comparado ao da glicose. A hiperfagia ocasionada por

esse tipo de dieta também tem sido bastante discutida.

O estudo de SAVASTANO & COVASA (2005) relata que a ingestão crônica de uma

dieta hiperlipídica leva, a curto-prazo, a um excessivo consumo de alimentos calóricos e

ricos em gordura. Isso se deve ao fato dessa dieta apresentar reduzida sensibilidade a alguns

sinais da saciedade, como a CCK (colecistoquinina). Em condições normais, esta proteína

atua como hormônio neurotransmissor estimulando a saciedade. Estudos verificaram que a

infusão intravenosa de um precursor da CCK reduziu o tamanho da porção consumida e,

também, a duração da refeição (KISSILEFF, CARRETTA, GELIEBTER e PI-SUNYER,

2003). WARWICK, MCGUIRE, BOWEN e SYNOWSKI (2000) relataram que os animais

que receberam dieta líquida rica em lipídios consumiram mais calorias e tiveram maior

ganho de peso do que os submetidos à dieta líquida rica em carboidratos de mesma

densidade energética. Encontraram também que a hiperfagia ocasionada pela dieta

hiperlipídica se manifestou numa maior porção alimentar e num menor intervalo entre as

refeições – o que indica que este tipo de dieta pode acarretar aumento do peso corporal e da

adiposidade (MARTIN, ALQUIER et al., 2006).

Além do conteúdo de gordura da dieta, o tipo de gordura parece ser decisivo para o

aumento da adiposidade corporal. Ratos submetidos a sete semanas de dieta hiperlipídica

(58% das calorias) rica em gordura saturada desenvolveram maior adiposidade corporal,

tanto quando comparados a animais alimentados com dietas ricas em ômega-3 ou ômega-6,

quanto quando comparados ao grupo controle, que foi submetido a uma dieta isocalórica

pobre em gordura (WANG, STORLIEN e HUANG, 2002).

Estudo que utilizou ratas no período de gestação submetidas à dieta hiperlipídica

verificou que o consumo de uma dieta com 16% de gordura por seis semanas ocasionou

aumento prematuro da adiposidade e disfunção cardiovascular e metabólica nos filhotes

(SAMUELSSON, MATTHEWS, ARGENTON, CHRISTIE, MCCONNELL, JANSEN,

PIERSMA, OZANNE, TWINN, REMACLE, ROWLERSON, POSTON e TAYLOR,

2007).

5

Além do aumento do peso e adiposidade corporal, a dieta hiperlipídica também

ocasiona distúrbios no metabolismo dos carboidratos. Em 1979, LAVAU, FRIED, SUSINI e

FREYCHET (1979) relataram que a habilidade da insulina em estimular o metabolismo da

glicose mostra-se seriamente comprometida no tecido adiposo de ratos submetidos à dieta

hiperlipídica.

RAUBENHEIMER, NYIRENDA e WALKER (2006) utilizaram, por 8 semanas, dieta

com 45% de gordura em ratos e observaram, ao final do período, aumento do peso corporal,

aumento das concentrações triacilglicerol em 171%, além de hiperinsulinemia e intolerância

à glicose. Já NASCIMENTO, FODOR, VAN DER ZON, JAZET, MEINDERS, VOSHOL,

VLASBLOM, BAAN, ECKEL, MAASSEN, DIAMANT e OUWENS (2006) demonstraram

que animais alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram menor fosforilação de uma

proteína da cascata de sinalização da insulina, PKB/Akt (PRAS40), denotando reduzida ação

e resistência à insulina induzida pela dieta.

Há evidências de que o fator desencadeante esteja associado não apenas ao aumento da

adiposidade, mas também ao local desse acúmulo, sendo o aumento da adiposidade visceral

o principal responsável pela diminuição da sensibilidade e da resistência à ação da insulina

(GOODPASTER, THAETE et al., 2000; EINSTEIN, ATZMON, YANG, MA, RINCON,

RUDIN, MUZUMDAR e BARZILAI, 2005; LEBOVITZ & BANERJI, 2005).

2.2 Tecido Adiposo Visceral e Sensibilidade à Insulina

O tecido adiposo visceral (TAV) está localizado na parte interior da cavidade

abdominal e seu acúmulo está intimamente relacionado ao desenvolvimento de doenças

como diabetes tipo 2, aterosclerose, dislipidemias e doenças cardiovasculares (GARG, 2004;

DESPRES & LEMIEUX, 2006).

O acúmulo deste tecido é mais acentuado nos homens do que nas mulheres pré-

menopausa, que possuem maior tendência de acúmulo de tecido adiposo subcutâneo (TAS)

na região do quadril. Entretanto, a partir do período pós-menopausa ocorre uma alteração

metabólica nas mulheres que resulta, assim como nos homens, na maior ocorrência de

gordura na região intra-abdominal (GOWER, MUNOZ, DESMOND, HILARIO-HAILEY e

JIAO, 2006).

As possíveis diferenças entre os depósitos de tecido adiposo vem sendo analisadas

após ter sido verificado que o acúmulo de tecido adiposo subcutâneo seria menos

6

prejudicial, e até mesmo protetor (MAUER, HARRIS et al., 2001) em comparação ao tecido

adiposo visceral (EINSTEIN, ATZMON et al., 2005). Uma evidência do efeito protetor

deste depósito se baseia na hipótese de que esta seria a região preferencial do organismo

para estocar os lipídios, protegendo-o de um depósito ectópico de gordura em outros locais,

como o tecido adiposo visceral, fígado e músculo esquelético (WEISS, BRANDAUER,

KULAPUTANA, GHIU, WOHN, PHARES, SHULDINER e HAGBERG, 2007).

Indivíduos com obesidade visceral possuem maior chance de desenvolver resistência à

insulina e hiperinsulinemia quando comparados a indivíduos com outros tipos de obesidade

(GABRIELY, MA et al., 2002; RAVUSSIN, KLIMES, SEBOKOVA e HOWARD, 2002).

A insulina é um hormônio que atua na captação de glicose pelas células, permitindo sua

conversão em energia ou seu estoque na forma de glicogênio (RAVUSSIN, 2002). A

resistência à insulina se caracteriza por uma resposta glicêmica abaixo do normal à insulina,

o que pode levar a uma hiperglicemia crônica com distúrbios do metabolismo dos

carboidratos, lipídios e proteínas. A resposta metabólica compensatória para a resistência à

insulina é a hiperinsulinemia, cujo propósito é a manutenção da glicemia (COLAGIURI,

2002)

Acredita-se que o local primário da resistência à insulina situe-se em algum ponto

entre o receptor insulínico, a cascata de ação da insulina, e a proteína transportadora de

glicose (OLEFSKY & NOLAN, 1995; SHULMAN, 1999). DEFRONZO (1997) cita os

possíveis mecanismos: diminuição na atividade da enzima glicogênio sintetase, obesidade,

aumento no conteúdo de triacilgliceróis e ácidos graxos livres, aumento na atividade do

sistema nervoso simpático, diminuição na atividade da enzima ATPase cálcio dependente,

aumento da atividade na bomba sódio-potássio.

Embora a obesidade seja apontada como a causa mais comum da resistência à insulina,

nem todos os indivíduos obesos desenvolvem esta alteração. De acordo com diversos

autores (NIELSEN, GUO, JOHNSON, HENSRUD e JENSEN, 2004; LEBOVITZ &

BANERJI, 2005; WEISS, BRANDAUER et al., 2007) o que irá determinar tal alteração

metabólica será o local de acúmulo da adiposidade corporal, sendo a deposição de gordura

visceral um dos principais responsáveis (WEISS, BRANDAUER et al., 2007).

Atualmente, sabe-se que o TAV difere do TAS sob diversos aspectos: ele possui

células maiores, mais responsivas às enzimas lipolíticas e, em parte, resistentes à insulina

(FRUHBECK, GOMEZ-AMBROSI, MURUZABAL e BURRELL, 2001; TRAYHURN &

7

BEATTIE, 2001; GIUSTI, SUTER, VERDUMO, GAILLARD, BURCKHARDT e

PRALONG, 2004; NIELSEN, GUO et al., 2004; ROSA, ZANELLA et al., 2005). De

acordo com BJORNTORP (1998) estas características poderão determinar o aumento na

liberação de ácidos graxos livres (AGL) na circulação portal que, por sua vez, poderão

ocasionar uma piora na sensibilidade à insulina no músculo esquelético, diminuição na

captação hepática de captar glicose e insulina, aumento da gliconeogênese e da produção

hepática de lipídios (VLDL-triacilgliceróis) e prejuízos na secreção pancreática de insulina.

Ou seja, este depósito – que possui altos níveis de retorno de lipídios, com alta capacidade

lipolítica em momentos de estresse ou jejum e alta capacidade de síntese e estoque de

triacilglicerol em momentos de repouso – estaria constantemente exportando ácidos graxos

para outros tecidos (RAVUSSIN & SMITH, 2002) como o fígado, pâncreas e músculo

esquelético (WEISS, BRANDAUER et al., 2007). Estes tecidos, por sua vez, possuem uma

capacidade limitada de oxidar e estocar lipídios e, quando esta capacidade é atingida, ocorre

o chamado efeito lipotóxico dos lipídios (LELLIOTT & VIDAL-PUIG, 2004).

Esta lipotoxicidade dos lipídios já foi evidenciada no trabalho de SHULMAN (1999),

no qual o autor relata que os AGL poderiam estar ocasionando a resistência à insulina

através da diminuição da atividade de uma proteína da cascata de sinalização da insulina, a

IRS-1 (substrato do receptor da insulina 1), prejudicando o transporte de glicose. Os AGL

também podem prejudicar a translocação e síntese do transportador de glicose (GLUT4) no

músculo esquelético e no tecido adiposo (RUSSELL, LI, COVEN, PYPAERT, ZECHNER,

PALMERI, GIORDANO, MU, BIRNBAUM e YOUNG, 2004).

Estudo realizado por KIM, VAN DE WALL, LAPLANTE, AZZARA, TRUJILLO,

HOFMANN, SCHRAW, DURAND, LI, LI, JELICKS, MEHLER, HUI, DESHAIES,

SHULMAN, SCHWARTZ E SCHERER (2007) testou a hipótese de que a inabilidade do

tecido adiposo subcutâneo se expandir seria a principal razão para o desenvolvimento da

resistência à insulina e a falência da célula beta pancreática. Eles utilizaram o rato ob/ob,

modelo que apresenta deficiência na leptina, e induziram a superexpressão de adiponectina.

Os animais, apesar de terem desenvolvido obesidade mórbida, apresentaram concentrações

normais de glicose e insulina e diminuídas concentrações de TG. Os autores relataram ainda

que os animais apresentaram aumento na expressão gênica de PPARγ e uma redução na

infiltração de macrófagos e na inflamação sistêmica. Deste modo, pode-se considerar que o

8

acúmulo de tecido adiposo subcutâneo exerceu um papel protetor na manutenção da

homeostase metabólica.

Deste modo, o TAV parece ser um dos principais responsáveis pelo desenvolvimento

da intolerância à glicose, dislipidemias e resistência à insulina, a chamada Síndrome

Metabólica (DESPRES, 1993). De acordo com a I DIRETRIZ BRASILEIRA DE

DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DA SÍNDROME METABÓLICA (SBC, 2005), esta

Síndrome se caracteriza pela presença de três ou mais dos cinco critérios descritos a seguir:

- Obesidade abdominal (visceral), medida através da circunferência abdominal –

Homens > 102 cm e Mulheres > 88 cm;

- Triacilgliceróis ≥ 150 mg/dL;

- HDL Colesterol, Homens < 40 mg/dL e Mulheres <50 mg/dL;

- Pressão arterial ≥130 mmHg ou ≥ 85 mmHg e;

- Glicemia de jejum ≥ 110 mg/dL.

Além das diferenças supra mencionadas, a contribuição do tecido adiposo visceral no

desenvolvimento da Síndrome Metabólica pode estar relacionada a sua capacidade secretora

(WAJCHENBERG, 2000), uma vez que a função endócrina do tecido adiposo também é

distinta entre os depósitos viscerais e subcutâneos (MICHEL & CABANAC, 1999). A

leptina, por exemplo, possui maior expressão gênica no tecido adiposo subcutâneo quando

comparada ao visceral em humanos (VAN HARMELEN, REYNISDOTTIR, ERIKSSON,

THORNE, HOFFSTEDT, LONNQVIST e ARNER, 1998). Já o angiotensinogênio –

metabólito ligado ao aumento da pressão arterial via sistema renina-angiotensina – apresenta

concentração cerca de duas vezes maior no tecido adiposo visceral (WAJCHENBERG,

2000).

Outro fator que pode atestar a relação entre a obesidade visceral e a resistência à

insulina seria a hipertrofia dos adipócitos, em decorrência da qual muitas alterações ocorrem

na função secretora deste em relação aos adipócitos normais. Diversos estudos analisaram as

funções das proteínas secretadas pelo tecido adiposo e suas influências no metabolismo

corporal e chegou-se à hipótese de que talvez algumas proteínas e/ou citocinas secretadas

por ele sejam responsáveis pela relação entre a adiposidade visceral e a resistência à insulina

(MICHEL & CABANAC, 1999). Foi demonstrado, por exemplo, que o tecido adiposo é

capaz de secretar a adiponectina, uma proteína caracterizada por suas propriedades

antiinflamatórias e antitrombóticas (MATSUBARA, KATAYOSE e MARUOKA, 2003) e

9

que apresenta suas concentrações diminuídas na obesidade (WAJCHENBERG, 2000).

Conseqüentemente, seu efeito apresenta-se reduzido, podendo levar a um quadro de

inflamação característico da obesidade (MATSUBARA, KATAYOSE et al., 2003). Esta

característica inflamatória da obesidade tem sido muito estudada.

Estudos in vitro demonstraram que o TAV secreta grandes quantidades de

mediadores inflamatórios, como a proteína C reativa, a interleucina-6 (IL-6) e o fator de

necrose tumoral α (TNF-α) (FAIN, MADAN, HILER, CHEEMA e BAHOUTH, 2004). Em

associação a este fato, indivíduos com obesidade visceral possuem maiores concentrações de

marcadores inflamatórios sistêmicos, quando comparados a indivíduos com obesidade

subcutânea (TSIGOS, KYROU, CHALA, TSAPOGAS, STAVRIDIS, RAPTIS e

KATSILAMBROS, 1999). A contribuição deste depósito para a inflamação sub-clínica

observada em alguns indivíduos obesos pode ser a causa da relação entre adiposidade

visceral e síndrome metabólica (WEISS, BRANDAUER et al., 2007). Dentre as adipocinas,

citocinas e quimiocinas secretadas pelo TAV, vale ressaltar:

- Leptina: é um hormônio secretado principalmente pelo tecido adiposo branco

(VAN HARMELEN, REYNISDOTTIR et al., 1998). Em humanos, a expressão e secreção

de leptina são maiores no tecido adiposo subcutâneo que no tecido adiposo visceral (HUBE,

LIETZ, IGEL, JENSEN, TORNQVIST, JOOST e HAUNER, 1996; RUSSELL, LI et al.,

2004), Já em ratos, a expressão de leptina parece ser maior no tecido adiposo visceral (LI,

MATHENY, NICOLSON, TUMER e SCARPACE, 1997; ZHANG, GUO, DIAZ, HEO e

LEIBEL, 2002). Ela age através de receptores expressos central e perifericamente, sendo

uma de suas principais funções ser um sinal aferente para o sistema nervoso central (SNC),

atuando em um feedback negativo, regulando a quantidade de tecido adiposo (NEGRAO &

LICINIO, 2000), o peso corporal e o apetite (KOERNER, KRATZSCH e KIESS, 2005).

Evidências sugerem que a leptina promove oxidação de lipídios e diminui o acúmulo

ectópico de gordura, aumentando, deste modo, a sensibilidade à insulina (HEYMSFIELD,

GREENBERG, FUJIOKA, DIXON, KUSHNER, HUNT, LUBINA, PATANE, SELF,

HUNT e MCCAMISH, 1999). Este efeito seria mediado pela ativação da AMPK (proteína

quinase ativada pelo AMP) através de seu efeito direto no músculo esquelético e por seu

efeito indireto através do eixo hipotalâmico no sistema nervoso central. A AMPK é uma

indicadora intracelular de energia e tem papel importante na regulação da oxidação de

ácidos graxos. A AMPK é ativada quando a razão celular de AMP:ATP aumenta após

10

diminuição dos níveis de ATP. Uma vez ativada, a AMPK inicia processos de geração de

ATP (ex.: oxidação de AG) e inibe processos de gasto de ATP (ex.: síntese de AG)

(ZHANG, CHEN, HEIMAN e DIMARCHI, 2005). Como resultado da ativação da AMPK,

ocorre também a inibição da enzima acetil coenzima-A carboxilase, levando a uma

diminuição das concentrações intracelulares de malonil-CoA e favorecendo a oxidações de

lipídios (SHIMOMURA, HAMMER, IKEMOTO, BROWN e GOLDSTEIN, 1999). A

leptina, também através da ativação da AMPK, parece ainda promover o aumento da

depleção de triacilgliceróis (TAG) (YILDIZ & HAZNEDAROGLU, 2006) e estimular a

lipólise no músculo esquelético (DYCK, HEIGENHAUSER e BRUCE, 2006) e tecido

adiposo branco (JEQUIER & TAPPY, 1999).

- Adiponectina: é uma proteína expressa, principalmente, pelo tecido adiposo branco.

Suas concentrações apresentam-se diminuídas em diversos quadros de obesidade e

resistência à insulina e, de acordo com alguns autores, esta diminuição, em associação ao

aumento da liberação de AGL, seria o principal fator para se relacionar a obesidade visceral

ao desenvolvimento da resistência à insulina (LEBOVITZ & BANERJI, 2004).

Manipulações terapêuticas e nutricionais que melhoram a sensibilidade à insulina como, por

exemplo, perda de peso corporal, restrição calórica e tratamento com tiazoledionas

(medicamento anti-diabético), aumentam a expressão e as concentrações plasmáticas de

adiponectina (COMBS, WAGNER, BERGER, DOEBBER, WANG, ZHANG, TANEN,

BERG, O'RAHILLY, SAVAGE, CHATTERJEE, WEISS, LARSON, GOTTESDIENER,

GERTZ, CHARRON, SCHERER e MOLLER, 2002). Estudo realizado por GUERRE-

MILLO (2004), aponta o TNF-α e a IL-6 como potentes inibidores da expressão de

adiponectina no tecido adiposo.

- TNF-α: é uma proteína transmembrana, liberada na circulação como uma proteína

solúvel. Esta citocina possui dois receptores principais que são expressos em diversos

tecidos, incluindo o músculo esquelético e o tecido adiposo (HOTAMISLIGIL, ARNER,

ATKINSON e SPIEGELMAN, 1997). Evidências sugerem que, em humanos, há maior

liberação desta citocina pelo tecido adiposo visceral quando em comparação ao subcutâneo.

Sua expressão encontra-se aumentada na obesidade e diminui em decorrência da perda de

peso ou pela melhora na sensibilidade à insulina (GUERRE-MILLO, 2004). O TNF-α é

ainda um potente inibidor da expressão e secreção da adiponectina (IWAKI, MATSUDA,

11

MAEDA, FUNAHASHI, MATSUZAWA, MAKISHIMA e SHIMOMURA, 2003), o que

denota sua ação no desenvolvimento da resistência à insulina

- IL-6: o tecido adiposo é responsável por produzir de 10 a 30% de toda interleucina-

6 circulante. Suas concentrações estão inversamente relacionadas com a sensibilidade à

insulina. Assim como o TNF-α a IL-6 é um potente inibidor da expressão e secreção de

adiponectina e sua expressão encontra-se aumentada na obesidade (IWAKI, MATSUDA et

al., 2003).

Em resumo, o acúmulo de tecido adiposo visceral pode levar a uma piora da ação da

insulina. Um possível método para a investigação desta relação seria a diminuição desse

depósito e, conseqüentemente, de suas possíveis implicações na secreção de proteínas e na

ação da insulina, através da lipectomia e do treinamento físico – estratégias que adotaremos

neste estudo.

2.3 Lipectomia e Sensibilidade à Insulina

Lipectomia é a retirada cirúrgica do tecido adiposo (BARZILAI, SHE et al., 1999).

Quando realizada no tecido adiposo subcutâneo, se assemelha à cirurgia de lipoaspiração

amplamente utilizada com fins estéticos. Foi verificado, porém, que o peso corporal do

indivíduo que se submete a essa cirurgia é recuperado em pouco tempo (SHI &

BARTNESS, 2005). HAMILTON & WADE (1988) verificaram o retorno do peso corporal

três semanas após a lipectomia. Já a gordura corporal em ratos lipectomizados foi

recomposta em quatro semanas no estudo de (MICHEL & CABANAC, 1999). Eles

realizaram lipectomia e falsa-lipectomia em ratos e analisaram o consumo de ração (que

permaneceu semelhante ao grupo controle), o peso corporal e o conteúdo de gordura

corporal.

No estudo de MAUER & BARTNESS (1997), em hamsters siberianos, foi realizada a

retirada de tecido adiposo inguinal e epididimal apenas do lado direito ou esquerdo, com o

objetivo de analisar se ocorreria um crescimento compensatório do outro lado desse depósito

ou em outro local. A retirada de parte do tecido adiposo epididimal não resultou em

reposição. Já a retirada do tecido adiposo inguinal foi compensada pelo crescimento do

tecido adiposo epididimal. Os autores ainda observaram que, em alguns depósitos, quanto

maior a quantidade de tecido retirada, maior era a compensação e que esta provavelmente

12

deve ser regulada por algum mecanismo que reconhece e sinaliza o local em que foi feita a

retirada e, conseqüentemente, onde deve ser feita a reposição.

HAUSMAN, LU, RYAN, FLATT e HARRIS (2004) estudaram os mecanismos

responsáveis por esse crescimento compensatório após a lipectomia. Foi realizada a retirada

bilateral do tecido adiposo epididimal de ratos wistar e analisados seu consumo alimentar e

gasto energético após a cirurgia. A ingestão energética não foi diferente entre os grupos dos

animais lipectomizados e dos falso-operados, tendo sido detectado aumento de 2,4% no

gasto energético – diferença pequena, mas significativa – nos dias 29-31 após a cirurgia.

A partir da diminuição do tecido adiposo, uma série de adaptações ocorre no

organismo. Algumas proteínas secretadas por ele são moduladas pela quantidade de

triacilgliceróis presentes no tecido adiposo. Uma hipótese seria a de que uma modulação na

secreção e/ou atividade de algumas delas, ocasionada pela diminuição do tecido adiposo,

poderia exercer uma melhora na resistência à insulina (RAVUSSIN, KLIMES et al., 2002)

que teria se desenvolvido devido ao seu acúmulo.

GABRIELY, MA et al. (2002) utilizaram ratos idosos (com 20 meses de idade) que

possuíam ação hepática e periférica prejudicadas da insulina, dividindo os animais em cinco

grupos experimentais: no primeiro grupo, foi realizada a retirada de tecido adiposo visceral

– epididimal – dos ratos idosos; no segundo grupo, foi feita a retirada de tecido adiposo

subcutâneo – inguinal –, na mesma quantidade que no primeiro; o terceiro grupo foi falso-

operado; o quarto grupo foi falso-operado e submetido a restrição energética de 60% do

valor calórico total desde os três meses de idade; o quinto grupo foi composto por ratos

jovens (dois meses de idade) falso-operados. Após a remoção de aproximadamente 18% do

total de gordura corporal, foi verificada uma melhora da sensibilidade à insulina nos animais

idosos, que se equiparou aos valores obtidos no grupo dos ratos jovens. No mesmo trabalho

também foram publicados dados de um experimento no qual foi feita a retirada do tecido

adiposo epididimal de ratos Zucker modificados geneticamente, modelo de obesidade

associada ao diabetes. Os animais estavam com dois meses de idade, período em que eles

ainda não tinham desenvolvido a intolerância à glicose. O estudo demonstrou que a remoção

deste tecido preveniu a progressiva piora da ação da insulina e atrasou o início do diabetes

nesses animais. A partir dos resultados encontrados, foi proposto que a resistência à insulina

e o desenvolvimento do diabetes podem ser prevenidos em ratos idosos através da

diminuição do acúmulo de tecido adiposo visceral que ocorre com o envelhecimento.

13

No estudo de KIM, KIM e LEE (1999) foi realizada a retirada do tecido adiposo

visceral e subcutâneo de ratos com obesidade induzida por glutamato monosódico. O estudo

informa que a quantidade de tecido retirado foi de acordo com o peso corporal de cada

animal, sem especificar a quantidade exata. Esses animais apresentavam elevadas

concentrações de ácidos graxos livres, insulina e aumentada produção hepática de glicose.

No grupo em que foi feita a retirada do tecido adiposo visceral, os valores de produção

hepática de glicose diminuíram aos valores normais. Porém, não houve diferença

significativa na sensibilidade à insulina e nas concentrações de insulina de jejum.

Alguns estudos que utilizaram a lipectomia para redução da gordura visceral em

animais relataram maior ação da insulina na homeostase da glicose, porém para podermos

considerar a retirada de tecido adiposo visceral como importante procedimento na melhora

da ação insulínica (BARZILAI, SHE et al., 1999; KIM, KIM et al., 1999; FRAYN, 2000;

GABRIELY, MA et al., 2002), mais estudos precisam ser realizados em procedimentos

experimentais, para posterior testagem em humanos.

O tecido adiposo possui diversas proteínas e citocinas, como os PPAR (receptor

ativado por proliferadores de peroxissoma) γ e α e PGC-1α (receptor γ coativador-1α de

receptor ativado por proliferadores de peroxissoma). Evidências sugerem uma estreita

relação entre os PPARs e o desenvolvimento do diabetes, obesidade, dislipidemias e

inflamação (LEFEBVRE, CHINETTI, FRUCHART e STAELS, 2006). Deste modo, através

da retirada de parte deste tecido, essas substâncias também podem ter sua atividade

modificada.

2.4 PPARs

Os PPARS são fatores de transcrição da família de receptores nucleares, possui três

principais subtipos que são: PPARα, PPARγ e PPAR-delta (BALAKUMAR, ROSE,

GANTI, KRISHAN e SINGH, 2007). Eles são caracterizados por seu padrão de distribuição

nos tecidos e por sua função metabólica (HARRINGTON, BRITT, WILSON, MILLIKEN,

BINZ, LOBE, OLIVER, LEWIS e IGNAR, 2007). Sendo uma de suas principais funções a

regulação global do metabolismo de lipídios (MUOIO & KOVES, 2007).

O PPARα foi o primeiro subtipo identificado em roedores em 1990 por ISSEMANN

& GREEN (1990). Desde então, descobrem-se cada vez mais substâncias capazes de ativar

os PPARS como, por exemplo, ácidos graxos, eicosanódies, prostaglandinas e alguns

14

composotos sintéticos utilizados no tratamento do diabetes e de dislipidemias (TAVARES,

HIRATA e HIRATA, 2007). A partir desta descoberta, estudos têm sido realizados

utilizando-os como possível alvo no tratamento farmacológico e dietoterápico.

De acordo com TAVARES, HIRATA et al. (2007) o mecanismo de ação dos PPARs

ocorre através da regulação da expressão do gene-alvo pela ligação a elementos específicos

responsivos aos proliferadores de peroxissoma situados em sítios regulatórios de cada gene.

O receptor liga-se a esses elementos responsivos como um heterodímero, juntamente com

um fator protéico adicional, o receptor do ácido 9-cis retinóico. Sob atuação de agonistas, a

conformação do PPAR é alterada e estabilizada, criando um sítio de ligação, com posterior

recrutamento de coativadores transcricionais, resultando em aumento na transcrição gênica.

2.4.1 PPARα

O PPARα é expresso principalmente no músculo esquelético (GILDE, VAN DER

LEE, WILLEMSEN, CHINETTI, VAN DER LEIJ, VAN DER VUSSE, STAELS e VAN

BILSEN, 2003), em tecidos com capacidade oxidativa, como fígado e rim, e também em

alguns outros tecidos, como células endoteliais vasculares, macrófagos e linfócitos T

(TENENBAUM, MOTRO e FISMAN, 2005). Sua expressão é estimulada durante o jejum e

influenciada por alguns hormônios, como o do crescimento, leptina e insulina (LEFEBVRE,

CHINETTI et al., 2006).

A ativação deste receptor tem demonstrado estimular a regulação de genes envolvidos

no metabolismo hepático, na oxidação de ácidos graxos no músculo esquelético

(HARRINGTON, BRITT et al., 2007) e no metabolismo de lipoproteínas, melhorando as

concentrações de triacilgliceróis, HDL e o perfil lipídico aterogênico, enquanto também

modula a inflamação e a resistência à insulina (PATSOURIS, MULLER et al., 2004). Sua

ação no processo inflamatório foi demonstrada a partir de estudo realizado em animais com

deficiência de PPARα, no qual os animais apresentavam resposta prolongada após um

estímulo inflamatório (DEVCHAND, KELLER, PETERS, VAZQUEZ, GONZALEZ e

WAHLI, 1996).

A glicose diminui a expressão do PPARα no pâncreas, levando a uma redução na

oxidação de lipídios e acúmulo de TG – uma das possíveis causas da lipotoxidade

(RODUIT, MORIN, MASSE, SEGALL, ROCHE, NEWGARD, ASSIMACOPOULOS-

JEANNET e PRENTKI, 2000). O PPARα parece exercer papel importante no metabolismo

15

dos carboidratos, uma vez que ratos com deficiência desta proteína apresentam acentuada

hipoglicemia de jejum, com queda de 50% da glicemia após 24 horas de jejum (KERSTEN,

SEYDOUX, PETERS, GONZALEZ, DESVERGNE e WAHLI, 1999). Após estes

resultados, pesquisas começaram a ser realizadas com o intuito de verificar outras possíveis

relações entre o PPARα e o controle glicêmico.

Estudo de PARK, ZHANG, ZHANG, WU, CHEN, CHA, SU, HWANG, FAN,

DAVIS, STRIKER, ZHENG, BREYER e GUAN (2006) utilizou fenofibrato, agonista do

PPARα, no tratamento de animais com diabetes tipo 2 e verificou que, após oito semanas de

tratamento, o grupo que recebeu o fenofibrato apresentou acentuada redução na glicemia de

jejum, na hemoglobina glicada, nas concentrações de insulina de jejum e melhora na

resistência à insulina. Além disso, este grupo apresentou significativa diminuição do

consumo alimentar e do peso corporal. NADEAU, EHLERS, AGUIRRE, REUSCH e

DRAZNIN (2007) utilizaram ratos zuker com obesidade e diabetes e realizaram tratamento

com fenofibrato. Após este procedimento, verificaram redução da expressão gênica de

lipídios intramiocelulares e melhora na sensibilidade à insulina. Já em humanos, esse efeito

não foi observado. CREE, NEWCOMER, HERNDON, QIAN, SUN, MORIO,

ZWETSLOOT, DOHM, FRAM, MLCAK, AARSLAND e WOLFE (2007) realizaram o

tratamento com fenofibrato em idosos saudáveis e resistentes à insulina e, após o período de

tratamento, os autores verificaram que tanto o grupo de tratamento, quanto o grupo controle

apresentaram melhora na concentrações de TG e colesterol total, mas relataram que não

foram observadas alterações nas concentrações de lipídios intramiocelulares e hepáticos e

nem melhora nas concentrações de AGL, glicose, insulina ou na sensibilidade à insulina.

Estudo de CHA, HAN, SU, ZHANG, FAN, BREYER e GUAN (2007) utilizou ratos

idosos, knockout e selvagem, com resistência à insulina induzida por dieta hiperlipídica e

verificaram que o grupo selvagem apresentou severa resistência à insulina, maior

concentração plasmática de colesterol e maior excreção urinária na razão

albumina/creatinina. Deste modo, os autores concluíram que a deficiência de PPARα

protege ratos idosos no desenvolvimento da resistência à insulina.

OKI, KOIDE, NAKANISHI, NAKASHIMA e YAMANE (2007) relataram que, após

três meses de tratamento com fenofibrato, indivíduos com hipertrigliceridemia apresentaram

menores concentrações de colesterol total, triacilgliceróis, LDL e aumento nas

concentrações plasmáticas de HDL e adiponectina, mas não verificaram melhora na

16

sensibilidade à insulina apesar do aumento nas concentrações de adiponectina. Uma grande

limitação deste estudo, porém, é não apresentar um grupo controle.

No entanto, os resultados ainda são controversos. ANDERLOVA, DOLEZALOVA,

HOUSOVA, BOSANSKA, HALUZIKOVA, KREMEN, SKRHA e HALUZIK (2007)

verificaram que, após três meses de tratamento com fenofibrato, mulheres obesas com

diabetes tipo 2 apresentaram diminuição nas concentrações de TG. No entanto, as

concentrações de glicose e de hemoglobina glicada aumentaram após o tratamento com

fenofibrato e, após o tratamento, não foram observadas alterações na sensibilidade à

insulina, através do clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico.

Deste modo, podemos verificar que os resultados são inconclusivos sobre os reais

efeitos do PPARα no metabolismo glicolítico e lipídico. Além disso, ainda não existem

dados sobre o efeito da retirada de parte do tecido adiposo na expressão gênica desta

proteína.

2.4.2 PPARγ

Este receptor nuclear é essencial para a adipogênese e sensibilidade à insulina

(SPIEGELMAN, 1998). Após a heterodimerização com o receptor retinóico, ele é ativado

por certos ligantes, conhecidos como promotores da sensibilidade à insulina, glitazonas e

tiazolidinedionas, utilizados no tratamento oral antidiabético (FORMAN, TONTONOZ,

CHEN, BRUN, SPIEGELMAN e EVANS, 1995)

Foram descobertas três isoformas do PPARγ: o PPARγ1, PPARγ2 e PPARγ3, que

diferem em sua extremidade 5’, como conseqüência de diferentes promotores e ao splicing

alternativo. O PPARγ1 é expresso em vários tecidos, incluindo coração, cólon, intestino

delgado e grosso, rins, pâncreas e baço. O PPARγ2 é expresso no tecido adiposo e o

PPARγ3 tem expressão restrita a macrófagos e intestino grosso (TAVARES, HIRATA et al.,

2007).

O PPARγ possui expressão mais acentuada no tecido adiposo quando comparado a

outros tecidos como músculo esquelético, pâncreas e fígado (VIDAL-PUIG, CONSIDINE,

JIMENEZ-LINAN, WERMAN, PORIES, CARO e FLIER, 1997). Pesquisas que tentaram

verificar possíveis diferenças na expressão gênica deste receptor entre depósitos de gordura

obtiveram resultados conflitantes. LEFEBVRE, LAVILLE, VEGA, RIOU, VAN GAAL,

AUWERX e VIDAL (1998) verificaram que essa proteína possui sua expressão gênica

17

menor no tecido adiposo visceral em sujeitos com IMC (índice de massa corporal) menor de

30kg/m2, mas não encontraram essa mesma relação em sujeitos obesos – o que, de acordo

com os autores, indica que a expressão fica aumentada no tecido adiposo visceral na

obesidade.

Ele está envolvido na proliferação e diferenciação dos adipócitos e seus agonistas

melhoram a sensibilidade à insulina através do estoque de ácidos graxos e inibição da

síntese de adipocinas (STAELS & FRUCHART, 2005). Nos adipócitos, ele regula a

expressão de diversos genes envolvidos no metabolismo de lipídios, como a acil-CoA

sintetase, a lipase de lipoproteínas (LPL) e a carnitina palmitoil transferase 1 (TAVARES,

HIRATA et al., 2007). Deste modo, o PPARγ está intimamente relacionado à regulação do

metabolismo lipídico.

O PPARγ é o principal regulador da adipogênese, além de estimular a produção de

pequenos adipócitos sensíveis à insulina. Estudo in vivo demonstrou que o PPARγ tem a

capacidade de induzir a apoptose em adipócitos maiores e a diferenciação em adipócitos

menores. Deste modo, como os adipócitos menores são mais sensíveis à insulina, este pode

ser um mecanismo pelo qual o PPARγ produz maior captação de glicose dependente de

insulina (WAJCHENBERG, 2000).

Estudo realizados com a deficiência do PPARγ no tecido adiposo verificaram que esta

proteína é uma mediadora essencial na manutenção da sensibilidade à insulina corporal. Ela

exerceria essa função através de sua capacidade de proteger outros tecidos (fígado, músculo

esquelético e pâncreas) de um excessivo aporte de AGL e de garantir adequada produção e

secreção de adipocinas, como adiponectina e leptina, pelo tecido adiposo (KINTSCHER &

LAW, 2005). Já a deleção do PPARγ no músculo esquelético ocasionou o desenvolvimento

de resistência à insulina, sendo que a taxa de captação de glicose mediada pela insulina

estava reduzida em 80% (HEVENER, HE, BARAK, LE, BANDYOPADHYAY, OLSON,

WILKES, EVANS e OLEFSKY, 2003).

Assim como com o PPARα, muitos estudos estão sendo desenvolvidos com o objetivo

de se utilizar agonistas do PPARγ no tratamento do diabetes, sendo a tiazolidinediona e

rosiglitazona as mais utilizadas.

Estudo realizado em pacientes com diabetes tipo 2 que necessitam de altas doses de

insulina verificou que, após oito meses de tratamento, houve diminuição da concentração de

hemoglobina glicada e das necessidades de insulina, melhora na sensibilidade hepática à

18

insulina e diminuição na deposição hepática de gordura (JUURINEN, KOTRONEN,

GRANER e YKI-JARVINEN, 2008).

Experimentos demonstraram que ratos zucker com obesidade e diabetes obtiveram

melhora na glicemia, hiperinsulinemia e hiperlipidemia. No entanto, os animais também

apresentaram aumento do peso corporal e aumento da expressão gênica de lipídios

intramiocelulares após tratamento de vinte e cinco semanas com rosiglitazona (NADEAU,

EHLERS et al., 2007).

Este aumento do peso corporal já foi relatado por outros. HARRINGTON, BRITT et

al.) 2007) utilizaram ratos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica e submeteram os

animais a diferentes tratamentos com os agonistas das PPARs. Após o tratamento, os autores

verificaram que ao passo que o agonista do PPARα induziu a uma leve perda de peso, o

agonista do PPARγ ocasionou um aumento do peso e da massa corporal. Estes dados estão

de acordo com estudo de CECIL, WATT, PALMER e HETHERINGTON (2006), que

realizaram tratamento com agonista do PPARγ e verificaram, além da melhora da ação da

insulina e diminuição da glicose plasmática, aumento do peso corporal e aumento da

adiposidade.

2.4.3 PGC-1α

O PGC-1α é um coativador da PPAR e sua ação tem sido fortemente relacionada ao

desenvolvimento do diabetes tipo 2 (PUIGSERVER & SPIEGELMAN, 2003). Ele é um

coativador tanto do PPARα quanto do PPARγ, que regulam a captação de ácidos graxos e a

beta-oxidação (WU, PUIGSERVER e SPIEGELMAN, 1999).

A regulação gênica eucariótica é coordenada por diversos fatores, num equilíbrio

dinâmico que controla a transcrição de milhões de genes no núcleo da célula humana

(SOYAL, KREMPLER, OBERKOFLER e PATSCH, 2006). A PGC-1α possui a capacidade

de se ligar e ativar diversos fatores de transcrição, sendo que ela não se liga diretamente ao

DNA, mas regula programas celulares específicos através de interações com outros fatores

reguladores que se ligam ao DNA (NORRBOM, SUNDBERG, AMELN, KRAUS,

JANSSON e GUSTAFSSON, 2004).

A PGC-1α é expressa no tecido adiposo, no coração, no cérebro, nos rins, na

musculatura esquelética, no fígado e no pâncreas. Na musculatura esquelética, ela ativa vias

metabólicas importantes, como a oxidação de ácidos graxos, a termogênese, a oxidação

19

fosforilativa e a biogênese mitocondrial (STAIGER, STAIGER, HAAS, WEISSER,

MACHICAO e HARING, 2005).

No tecido muscular esquelético, a captação de glicose é mediada pelo GLUT4, ou

através da cascata de sinalização da insulina ou pela via da AMPK, mediada pela contração

muscular (RICHTER, NIELSEN, JORGENSEN, FROSIG e WOJTASZEWSKI, 2003). Nas

fibras musculares do tipo I, de contração lenta, a expressão gênica da PGC-1α é rapidamente

aumentada pela ativação da AMPK pelo exercício (SPARKS, XIE, KOZA, MYNATT,

HULVER, BRAY e SMITH, 2005). Ela está positivamente relacionada ao treinamento

aeróbio (FRANKS & LOOS, 2006) – até mesmo uma única série de exercícios possui a

capacidade de aumentar a expressão desta proteína (BAAR, WENDE, JONES, MARISON,

NOLTE, CHEN, KELLY e HOLLOSZY, 2002) – sendo que suas concentrações voltam a

valores normais cerca de 24 horas após o término da última sessão de treino (PILEGAARD,

SALTIN e NEUFER, 2003).

BAAR, WENDE et al. (2002) demonstraram, também, que essa proteína possui a

capacidade de aumentar a expressão gênica do GLUT4, atuando no metabolismo glicolítico.

De fato, a PGC-1α integra vias metabólicas que são utilizadas em períodos de

prolongado jejum, inclusive durante a hibernação dos mamíferos. Estas vias incluem

aumentada gliconeogênese hepática e beta-oxidação, aumentada eficiência mitocondrial,

captação de glicose independente da insulina e diminuída secreção de insulina – diminuindo,

dessa forma, a entrada de glicose no tecido adiposo e disponibilizando-a para ser utilizada

pelo rim e cérebro (SOYAL, KREMPLER et al., 2006).

Acredita-se que possa existir uma regulação entre insulina e PGC-1α, uma vez que é

sabido que a insulina também estimula o recrutamento do GLUT4. Evidências sugerem que

a insulina possui um efeito supressivo na expressão de PGC-1α (HERZIG, LONG, JHALA,

HEDRICK, QUINN, BAUER, RUDOLPH, SCHUTZ, YOON, PUIGSERVER,

SPIEGELMAN e MONTMINY, 2001).

Pesquisas realizadas apontam que tanto a redução das concentrações ou diminuição na

atividade da PGC-1α podem estar associadas ao desenvolvimento da resistência à insulina e

diabetes tipo 2 (LIANG e WARD, 2006). Diversos estudos observaram que a expressão do

PGC-1α está diminuída no músculo de indivíduos com diabetes tipo 2 (PETERSEN,

BEFROY, DUFOUR, DZIURA, ARIYAN, ROTHMAN, DIPIETRO, CLINE e

SHULMAN, 2003). Além disso, um polimorfismo deste gene, que causa diminuição de sua

20

atividade, tem sido relacionado a maior risco de desenvolver diabetes tipo 2 (HARA, TOBE,

OKADA, KADOWAKI, AKANUMA, ITO, KIMURA e KADOWAKI, 2 002).

Corroborando estes dados, estudo experimental realizou tratamento com rosiglitazona

(agonista do PPARγ) em ratos ob/ob e verificou que houve aumento da ativação da PGC-1α

em conjunto com melhora da sensibilidade à insulina (WILSON-FRITCH, NICOLORO,

CHOUINARD, LAZAR, CHUI, LESZYK, STRAUBHAAR, CZECH e CORVERA, 2004).

Conforme discutido anteriormente, outro fator que pode estar relacionado ao

desenvolvimento do diabetes tipo 2 é o consumo de dietas hiperlipídicas que, por sua vez,

também parecem exercer efeito sobre a expressão gênica da PGC-1α. Estudo de SPARKS,

XIE et al. (2005) demonstrou que após três dias de dieta os animais apresentaram

diminuição na expressão de aproximadamente 25%. A hipótese levantada pelos autores seria

a de que a dieta hiperlipídica está associada a uma diminuição da massa e da função

mitocondrial, Assim sendo, como essa proteína tem sua atividade relacionada à atividade

mitocondrial, sua expressão também diminui. Um fator que pode acarretar essa diminuição

seria o aumento da concentração de AGL ocasionado por esse padrão alimentar (COLL,

JOVE, RODRIGUEZ-CALVO, EYRE, PALOMER, SANCHEZ, MERLOS, LAGUNA e

VAZQUEZ-CARRERA, 2006).

Enfim, a dieta hiperlipídica pode provocar o aumento da adiposidade corporal e,

quando estes depósitos atingem sua capacidade máxima de estoque/oxidação, pode ocorrer o

influxo de AGL para outros tecidos ativos (pâncreas, fígado e músculo esquelético),

acarretando o desenvolvimento da resistência à insulina – o chamado efeito lipotóxico dos

AGL. Além disso, o aumento da adiposidade também pode contribuir para o

desenvolvimento da resistência à insulina através da secreção de adipocinas e quimiocinas e

pela infiltração de macrófagos que, por sua vez, secretam mais quimiocinas, que podem

alterar a ação da insulina.

3 JUSTIFICATIVA

A partir dos dados apresentados, podemos verificar que a dieta hiperlipídica, a

adiposidade corporal e a resistência à insulina parecem estar intimamente ligadas. No

entanto, suas relações ainda não estão bem esclarecidas. Por isso, estratégias que visem a

diminuição da adiposidade corporal têm sido utilizadas com o intuito de verificar possíveis

alterações na atividade e/ou expressão de algumas proteínas. Poucos desses estudos fizeram

21

uso da lipectomia e nenhum deles a utilizou em associação com a atividade física para

verificar se existe efeito sinergístico, ou qual estratégia obteria melhores resultados na

adiposidade, na sensibilidade à insulina e quais seriam seus efeitos sobre a expressão gênica

da PPARα, PPARγ e PGC-1α que possuem uma estreita relação com o ciclo de vida do

adipócito, regulando sua síntese e morte. Por isso, neste estudo iremos analisar os efeitos de

duas intervenções, lipectomia e exercício, na sensibilidade à insulina e na expressão gênica

da PPARα, PPARγ e PGC-1α.

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivos Gerais

Verificar o efeito do treinamento aeróbio de curto-prazo e da lipectomia na

sensibilidade à insulina em ratos submetidos a uma dieta hiperlipídica.

4.2 Objetivos específicos

1) Analisar o efeito da lipectomia e do treinamento aeróbio de curto prazo sobre a

sensibilidade à insulina;

2) Verificar se existe efeito sinergístico entre a lipectomia e o treinamento aeróbio de

curto prazo na sensibilidade à insulina;

3) Verificar possíveis alterações no consumo alimentar dos diferentes grupos;

4) Comparar, por meio da gordura da carcaça, o efeito da lipectomia e do exercício na

adiposidade de ratos;

5) Analisar a expressão gênica da PPARα, PPARγ e TNF- α após as intervenções;

6) Analisar a expressão protéica da PGC-1α após as intervenções;

7) Analisar o gasto energético de repouso dos animais antes e após as intervenções.

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Animais Experimentais

A amostra dos experimentos foi composta de ratos machos Wistar, adquiridos do

biotério do Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Todos os procedimentos

realizados neste estudo foram submetidos à aprovação na Comissão de Ética da Escola de

Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos no

biotério do Laboratório de Nutrição e Metabolismo Aplicado à Atividade Motora da Escola

22

de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo, onde foi realizada a maioria das

análises descritas a seguir. Os animais foram submetidos a ciclo claro-escuro invertido, com

livre acesso a água e ração hiperlipídica. O experimento teve início quando os animais se

tornaram adultos, ao atingirem peso corporal de cerca de 250g.

5.2 Protocolo Experimental

Ao atingirem o peso determinado, os animais foram mantidos nas mesmas condições

citadas anteriormente, em gaiolas individuais, recebendo ração hiperlipídica durante 60 dias.

Passado esse tempo, a intervenção teve início e os animais continuaram recebendo esta

ração. Eles foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais e submetidos e

diferentes estratégias para diminuição da gordura corporal, conforme descrito na tabela a

seguir:

TABELA 1 – Divisão dos Grupos Experimentais

Grupos Estratégia

LT Lipectomizado e Treinado

LS Lipectomizado e Sedentário

FT Falso-operado e Treinado

FS Falso-operado e Sedentário

O experimento teve duração de 12 semanas e cada grupo foi composto de pelo menos

doze animais, totalizando 48 ratos. Os animais tiveram livre acesso à alimentação durante

todo o experimento. Houve acompanhamento semanal do crescimento ponderal dos animais,

pelo peso corporal medido uma vez por semana. A quantidade de ração consumida por cada

animal foi medida duas vezes por semana. Para obter os valores de consumo alimentar foi

utilizada a medida semanal de consumo dividida pelo número de dias, obtendo-se, dessa

forma, o consumo médio diário de cada animal. Este valor foi dividido pelo peso corporal

aferido na mesma semana, resultando no valor individual em gramas de ração consumida

por gramas de peso corporal. Através dos dados individuais foi feita a média de cada grupo.

23

Os animais foram sacrificados por decapitação, seu sangue foi coletado e parte do

tecido adiposo visceral e músculo gastrocnêmio foram separados para posterior análise,

conforme descrito a seguir.

5.3 Ração hiperlipídica

A ração hiperlipídica utilizada neste estudo foi produzida através da adição de banha

de porco (Sadia®) à ração convencional (Labina, Ralston Purina do Brasil, São Paulo/SP).

Para cada 100 gramas da ração-controle foram adicionadas 20,43 gramas de banha de porco.

A composição nutricional da ração hiperlipídica está presente na tabela abaixo.

Ração Comercial RaçãoHiperlipídica gramas %VCT gramas %VCT Carboidratos e Fibras 55,16 63,2% 45,80 41,4% Proteínas 22,72 26,0% 18,86 17,0% Lipídios 4,17 10,8% 20,48 41,6% Total calórico em 100g 349 kcal 442,96 kcal

TABELA 2- Composição Nutricional da dieta hiperlipídica utilizada

5.4 Desenho Experimental

Os experimentos tiveram duração de 11 semanas e, em cada experimento, cada grupo

foi composto de 5 animais, totalizando 20 ratos por experimento. Foram realizados 4

experimentos no total. Os animais foram sacrificados na semana 11, após 48 horas da última

sessão de treinamento, e estando com 12 horas de restrição alimentar, com apenas água à

disposição. A seqüência de experimentos dentro do módulo está ilustrada na Figura 1.

FIGURA 1 - Desenho experimental.

Dieta Hiperlipídica

Análise: - Consumo Alimentar (CA) - Peso Corporal (PC)

Cirurgia

Análise: - OGTT 1 (pré-cirurgia) - Gasto Energético (pré-cirurgia) - CA/ PC

Exercício

Análise: - CA - PC

Sacrifício

Análise: - OGTT 2 e Gasto energético (pós-intervenções) - Gordura da Carcaça - CA/ PC - Índice HOMA

Semana 1 - 8 Semana 11 Semana 10 Semana 9

24

O estudo inicial (TABELA 3) foi realizado com os objetivos de avaliar a aceitação da

ração desenvolvida e seu consumo pelos animais, bem como a resposta destes na

recuperação do procedimento cirúrgico. Ficou estabelecido que se houvesse diferença no

consumo médio entre os grupos, no experimento seguinte seria realizado o pair feeding, ou

seja, a quantidade de ração seria ofertada de acordo com o grupo de menor consumo, para

garantir que os quatro grupos recebessem quantidades energéticas equivalentes. Entretanto,

como pode ser verificado nos resultados, não houve diferença significativa no consumo

médio entre os grupos e a ração continuou a ser ofertada ad libitum (à vontade). Além disso,

a recuperação dos animais após a lipectomia foi muito boa: 7 dias após a cirurgia os animais

já estavam com a cicatrização da pele concluída.

TABELA 3 - Cronograma do Estudo Inicial

Semana Atividades

0

- Aquisição dos animais junto ao biotério do

Instituto de Química da USP

- Pesagem do animais

- Início da ração hiperlipídica

0-8 - Ração hiperlipídica

- Análise do consumo de ração

9

- Lipectomia

- OGTT 1

10 - Início do treinamento de sete dias

consecutivos

11 - OGTT 2

- Sacrifício

Os animais apresentaram ótima aceitação da ração desenvolvida, tendo como consumo

médio aproximadamente 22,0 gramas de ração por dia, totalizando um aporte energético de

97,45 kcal/dia. Conforme visto em outros estudos de nosso laboratório, os animais que

25

recebem a ração comercial ingerem cerca de 25,0 gramas de ração por dia, gerando um

consumo médio de 87,25 kcal/dia.

No último experimento não foram realizadas as análises do consumo alimentar e do

peso corporal, pois os experimentos anteriores foram suficientes para que conseguíssemos

dados consistentes sobre esses parâmetros.

TABELA 4 - Cronograma dos Experimentos 1, 2 e 3

* Análises que não foram realizadas no Experimento 3.

Semana Atividades

0 - Aquisição dos animais junto ao biotério do

Instituto de Química da USP

- Pesagem do animais

- Início da ração hiperlipídica

0-8 - Ração hiperlipídica

- Análise do peso corporal animais *

- Análise do consumo de ração*

9 - Análise do consumo de ração e peso corporal*

- Análise do consumo de oxigênio*

- OGTT 1

- Lipectomia

10 - Análise do consumo de ração e peso corporal*

- Recuperação

- Início do treinamento

11 - Análise do consumo de ração e peso corporal*

- Análise do consumo de oxigênio*

- OGTT 2

- Sacrifício

26

5.5 Treinamento

O treinamento dos animais foi realizado durante sete dias consecutivos (HOUMARD,

COX, MACLEAN e BARAKAT, 2000; TANNER, KOVES, CORTRIGHT, PORIES, KIM,

KAHN, DOHM e HOUMARD, 2002; BLACK, MITCHELL, FREEDSON, CHIPKIN e

BRAUN, 2005), sendo que um dia antes os animais foram colocados no sistema de natação

para que houvesse uma adaptação ao meio liquido. Neste dia, os animais nadaram 20

minutos sem peso algum e depois de 1 hora foram novamente colocados no meio líquido

com carga de 2% do peso corporal por mais 20 minutos.

A carga de treinamento utilizada foi aumentada gradualmente, até alcançar 5% do

peso corporal. No último dia de treinamento os animais conseguiram permacecer, em média,

40 minutos em exercício. Quando os animais permaneciam submersos por um período de 7

a 10 segundos, eles eram retirados da água e considerávamos que eles haviam atingido a

exaustão.

Este tipo de treinamento de curto-prazo já foi previamente utilizado em outros estudos.

TANNER, KOVES et al. (2002) realizaram treinamento de sete dias consecutivos em

indivíduos saudáveis a 70% do VO2 de pico durante 1 hora e verificaram melhora na ação

da insulina através do clamp euglicêmico hiperinsulinêmico. Outro estudo realizado por

WINNICK, SHERMAN, HABASH, STOUT, FAILLA, BELURY e SCHUSTER (2007)

verificou que indivíduos com diabetes tipo 2, após sete dias de exercício aeróbio a 70%VO2

máx, apresentaram melhora periférica na sensibilidade à insulina e não hepática. Já o estudo

de TERADA, YOKOZEKI, KAWANAKA, OGAWA, HIGUCHI, EZAKI e TABATA

(2001), realizado em ratos Sprague-Dawley, verificou que, após 8 dias de treinamento

aeróbio (natação) com carga máxima de 5% do peso corporal, o conteúdo de GLUT-4 nos

animais treinados estava 66% maior do que no grupo controle, sedentário.

5.6 Métodos Analíticos

5.6.1 Gasto Energético Basal

A taxa de metabolismo de repouso dos ratos foi medida no dia do OGTT, com os

animais anestesiados pelo espirômetro Columbus Instruments' Oxymax Deluxe System. Este

sistema monitorou as concentrações de oxigênio (O2) e dióxido de carbono (CO2) de cada

animal, permitindo que, através da análise da diferença das concentrações de O2 e CO2,

27

fosse possível o cálculo do consumo de O2, da produção de CO2 e da razão de troca

respiratória (RER). Através desses dados, foi possível o cálculo do gasto energético diário

de cada animal, obtendo-se a média da taxa de metabolismo de repouso de cada grupo.

5.6.2 Análises Plasmáticas

O sangue coletado foi centrifugado a 4000 rpm para extração do soro e armazenado a

–80°C, para posterior dosagem. Foram dosados parâmetros indicativos de alterações no

metabolismo de carboidratos. Para a curva glicêmica, a amostra foi obtida da cauda dos

animais vivos.

5.6.2.1Insulinemia

Foi realizada, na semana 11, a dosagem da insulinemia de jejum, através de

radioimunoensaio com kits laboratoriais da marca Amersham Buckinghamshire, England.

5.6.2.2Glicemia

A concentração plasmática de glicose foi dosada com kits laboratoriais, através de

teste enzimático colorimétrico da marca Celm. A glicemia de jejum foi analisada na

semana 9 – antes da lipectomia – e na semana 11 – 48 horas após a última sessão de

exercício.

5.6.2.3Teste Oral de Tolerância à Glicose

Para a estimativa da captação sistêmica de glicose, foram realizados testes orais de

tolerância à glicose (OGTT) em cada animal. Os animais permaneceram, em média, 14

horas em privação alimentar, após as quais receberam, via gavagem, solução de glicose a

10%, num total de 2g/kg de peso. A glicemia foi dosada de sangue coletado da veia caudal.

As dosagens foram realizadas imediatamente antes da administração da sobrecarga de

glicose e aos 10, 20, 30, 60, 90 e 120 minutos após, possibilitando o traçado da curva

glicêmica (ISHIDA, MIZUNO, MURAKAMI e SHIMA, 1996). Para a interpretação desse

parâmetro foi realizado o cálculo da área sob a curva, conforme demonstrado por

(MATTHEWS, ALTMAN, CAMPBELL e ROYSTON, 1990).

28

5.6.2.4Índice HOMA (Homeostatic Model Assessment)

Este índice foi estabelecido conforme metodologia descrita por WALLACE, LEVY e

MATTHEWS (2004), utilizando a glicemia (mmol/l) e insulinemia (mU/l) de jejum da

semana 11. Os valores obtidos na insulina e glicose de jejum são utilizados na seguinte

fórmula:

HOMA-IR= (Insulinemia de jejum X Glicemia de jejum)/22.5

Este programa possibilita ainda o cálculo de duas variáveis que estimam a

sensibilidade à insulina, Índice HOMA %S e a função das células-beta, Índice HOMA %B.

5.7 Composição Corporal

Para a determinação da composição corporal, as carcaças dos animais sacrificados

foram congeladas para posterior homogeneização. As carcaças foram acrescidas de água

destilada (em quantidade equivalente ao peso da carcaça) e autoclavadas por 30 minutos. Em

seguida, foram homogeneizadas com auxílio de um liquidificador e uma amostra do

homogenato foi utilizada para determinação do conteúdo total de lipídios.

A determinação do conteúdo lipídico total foi realizada segundo a metodologia

descrita por STANSBIE, BROWNSEY, CRETTAZ e DENTON (1976). As amostras foram

incubadas com 3,0 ml de KOH (30%) por 15 minutos a 70°C, sendo acrescidas de 3 ml de

álcool etílico absoluto e incubadas por mais 2 horas a esta temperatura. Os ácidos graxos

livres da fração lipídica foram extraídos 3 vezes, sendo que inicialmente foram 2,5ml de

ácido sulfúrico em gelo e, em seguida, foram adicionados 8 ml de éter de petróleo e

colocados em banho à temperatura ambiente com agitação horizontal por 10 minutos,

seguidos de centrifugação por 1 minuto a 1500 rpm. O sobrenadante foi separado e

reservado com auxílio de pipeta Pasteur. Os mesmos procedimentos foram repetidos com

6,0 ml e 4,0 ml de éter de petróleo. Os sobrenadantes foram acrescidos de água destilada,

separados com bomba a vácuo e a mistura de gordura e éter permaneceu 24 horas em capela

à temperatura ambiente para evaporação do éter. O total de gordura foi, então, pesado e

calculado.

5.8 Expressão Gênica da PPARα, PPARγ e TNF-α

Após o período de intervenção, foi feita a expressão gênica da PPARα e TNF-α no

músculo gastrocnêmio dos animais. A expressão gênica da PPARγ foi realizada no tecido

29

adiposo epididimal e no músculo gastrocnêmio (VIDAL-PUIG, CONSIDINE et al., 1997).

O método utilizado foi o de Real Time RT-PCR.

5.8.1 Extração do ácido ribonucleico (RNA)

Foi realizada a extração do RNA pelo método TRIzol(Invitrogen Brasil, São Paulo).

Parte do tecido adiposo epididimal e o músculo esquelético gastrocnêmio foram rapidamente

congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -80º C. Para a extração foram

utilizados 100mg de tecido/ ml Trizol® e homogeneizados em aparelho Politron. As

amostras foram precipitadas com cerca de 200µL de clorofórmio e centrifugadas por 15

minutos a 12000g (4°C) para a obtenção do RNAtot (a fase superior) que foi precipitada

com 500µL de álcool isopropílico e incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente. Os

pellets, agora visíveis, foram serão lavados com etanol 75% e as amostras centrifugadas por

5 minutos a 7500g, a 4°C. O álcool foi removido e os pellets secos à temperatura ambiente

por 15 minutos. As amostras foram solubilizadas em água-DEPC. Para avaliação da

concentração e pureza do RNAtotal, foram realizados ensaios espectrofotométricos sob

comprimento de onda de 260 a 280 nm. A razão A260/280 é proporcional à concentração de

RNAtot na amostra (SAMBROOK & GETHING, 1989).

5.8.2 Verificação da Integridade do RNA por eletroforese

Amostras de 1µL do RNA total foram diluídas em 8µL de água ultrapura e 1µL de

corante (Orange G, Acros Organics, New Jersey, USA), aplicadas em gel de agarose 1%

(0,3g agarose, 30mL de TAE Buffer 1x, 3 µL de brometo de etídio) e submetidas a uma

voltagem de 60 mV (power Pac BasicTM Bio-Rad, Hercules, CA, USA) por 30 minutos. A

integridade do RNA foi constatada pela visualização das bandas de RNA ribossômico, 28S e

18S, e ausência de rastros do RNA no gel. As amostras que se mostraram íntegras foram

utilizadas como substrato para a transcrição reversa.

5.8.3 Transcrição reversa do RNA (RT)

Transcrição reversa é um processo que converte as moléculas do RNA em ácido

desoxirribonucléico complementar (cDNA). As amostras do RNA do músculo esquelético

gastrocnêmio e do tecido adiposo epididimal foram submetidas à transcrição reversa pela

30

ação da enzima transcriptase reversa, utilizando o kit SuperScript First-Strand Synthesis

System for RT-PCR (Invitrogen, São Paulo, Brasil). Conforme procedimento-padrão do kit,

as amostras utilizadas no experimento foram incubadas em um termociclador (Mastercycler

Gradient, Eppendorf, Hamburg, Germany). Inicialmente, uma mistura contendo 1000 ng/µL

de RNA total, 1 µL de dNTP mix 10mM, 1µL de random hexaners (50 ng/µL) e 8µL de H2O

DEPC (dietil pirocarbonato) foi incubada durante 5 minutos a 65º C. A seguir, após adição

de 9µL de uma solução contendo 2µL de tampão RT 10x, 4µL de MgCl2 25mM, 2µL de

DTT 0,1µL e 1µL de inibidor Rnase, RNaseOUT, a mistura foi incubada por 2 minutos a

25º C. Após o acréscimo de 1µL da enzima SuperScrip III, procedeu-se a nova incubação

por 10, 50, e 15 minutos a 25º C, 42º C, e 70º C, respectivamente. Após adição de 1µL de

Rnase H, a solução foi incubada por 20 minutos a 37º C.

5.8.4 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (Real Time-PCR)

Os primers utilizados foram sintetizados baseando-se na seqüência conhecida de bases

nitrogenadas descritas no GenBank (TABELA 5).

PPARα Sense 5' TGC TAT AAT TTG CTG TGG AGA TCG 3'

Antisense 5' TGA CTC GGT CTT CTT GAT GAC CT 3'

PPARγ Sense 5' TGT CAT TAT TCT CAG TGG AGA CCG 3' Antisense 5' CAG CAG GTT GTC TTG GAT GT 3'

TNF-α Sense 5' CTC CAC CAA GGA AGT TTT CC,3' Antisense 5' CAC CCC GAA GTT CAG TAG AC3'

TABELA 5 – Sequência de bases dos primers da PPARα, PPARγ e TNF-α

Para cada amostra utilizamos 0,25 µL de cDNA, 0,4 µL de cada primer (10 pmol/µL)

e 5 µL de SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido),

completando o volume final da reação para 10 µL com H2O DEPC. As condições de

amplificação foram padronizadas para cada gene estudado, levando-se em consideração a

temperatura ideal e curva de dissociação de cada um. Uma relação comparativa entre os

ciclos da reação (CT) foi usada para determinar a expressão gênica, em relação ao controle

HPRT (proteína constitutiva). Para cada amostra, também foi descontado o valor de

expressão basal correspondente ao CT do grupo-controle. O valor usado para demonstrar a

31

expressão relativa dos genes alvo foi calculado utilizando a expressão 2-∆∆CT (previamente

descrita por K. Livak – PE – Applied Biosystems; Sequence Detector User Bulletin 2).

Para cada amostra foram realizadas triplicatas e utilizada a média das mesmas para

análises.

5.9 Expressão Protéica da PGC-1α

Western blot

Parte do músculo gastrocnêmio foi homogeneizada por meio de homogeneizador

Polytron (PT-K Brinkman Instruments) em volumes (100 mg de tecido para 1 ml de tampão)

de tampão de lise hipotônico contendo tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0),

sacarose 0,3 M, DTT 0,5 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0), PMSF 0,3 mM, NaF 10 mM e

coquetel de inibidor de fosfatase (1:100; Sigma-Aldrich-EUA). Em seguida o

homogeneizado foi centrifugado a 12.000 rpm por 30 minutos a 4oC para a separação do

sobrenadante, a partir do qual a concentração de proteína total das amostras foi analisada por

meio do método de Bradford (Biorad-EUA).

Posteriormente, as amostras foram solubilizadas a uma concentração final de 1% de

SDS (sodium-dodecyl-sulfate) e em seguida as proteínas presentes nas amostras foram

separadas eletroforeticamente em gel de SDS-poliacrilamida. Então, as proteínas foram

transferidas para membranas de nitrocelulose em tampão de transferência contendo Tris 25

mM, glicina 192 mM, metanol 20% e SDS 0,1%. Posteriormente, as membranas foram

lavadas 3 vezes (10 minutos cada) com solução tampão (TBS) sob agitação constante em

temperatura ambiente. Em seguida, o bloqueio dos sítios antigênicos inespecíficos foi

realizado por meio de uma mistura contendo TBS com o detergente tween 20 (0,1%) e leite

desnatado (5%), por 120 minutos, também em temperatura ambiente e com agitação

constante. A seguir as membranas foram incubadas com o anticorpo primário (PGC1 - Santa

Cruz Biotechnology) diluído (1:1000) na solução bloqueadora a 4oC, por 12 horas, com

agitação constante. Após a incubação com o anticorpo primário, as membranas foram

novamente lavadas conforme já descrito. Em seguida, as membranas foram incubadas com o

anticorpo secundário (Anti-goat - Santa Cruz Biotechnology) diluído (1:3000) em solução

bloqueadora, por uma hora e meia, em temperatura ambiente e com agitação constante. Após

a incubação com o anticorpo secundário, as membranas foram lavadas conforme já descrito

32

para remover o excesso de anticorpo. Por fim, a imuno-detecção foi realizada por meio do

método de quimioluminescência, de acordo com as instruções do fabricante (Enhancer

Chemi-Luminescence, Amersham Biosciences, NJ-USA). Buscando certificar que a massa de

proteína total carregada em cada poço foi a mesma, os géis foram corados com comassie

blue e a densidade de pontos das suas bandas foi quantificada pelo programa Scion Image. O

mesmo procedimento foi realizado com as bandas da proteína alvo.

5.10 Lipectomia

A cirurgia foi realizada nos animais sob anestesia geral, intraperitoneal (pentobarbital

50 mg/kg), a partir de incisão na região central para a retirada do máximo possível de

gordura visceral (BARZILAI, SHE et al., 1999; MICHEL & CABANAC, 1999;

GABRIELY, MA et al., 2002). Os ratos do grupo falso-operado sofreram a mesma

intervenção cirúrgica, até mesmo a manipulação dos intestinos, porém não foi retirada a

gordura. Ao final da cirurgia foi realizada sutura na incisão. Durante todo o procedimento

foi utilizado material cirúrgico esterilizado.

5.11 Análise dos Dados

Os dados foram organizados dentro de cada um dos 4 grupos experimentais,

apresentando-os na forma de média com correspondentes desvio-padrão ou erro-padrão.

Foram calculadas análises de variância (ANOVA) para medidas repetidas e teste pos-hoc de

Tuckey, objetivando testar a significância das diferenças entre os grupos. Esta análise foi

utilizada para comparar os valores entre os grupos no OGTT, consumo alimentar, gasto

energético e peso corporal. Para os valores de insulina, glicemia de jejum, Índice HOMA e

gordura da carcaça, foi realizada ANOVA one-way e teste post-hoc de Tuckey. O nível de

significância foi determinado em p < 0,05. As análises estatísticas foram realizadas com

auxílio do software SAS 8.0 .

6 RESULTADOS

6.1 Consumo de Ração

Conforme pode ser verificado na FIGURA 2, não houve diferença significativa entre

os grupos até a semana 8 (p≥0,99), período no qual os animais permaneceram

exclusivamente recebendo a ração ad libitum. Esse dado é de grande relevância para o

33

projeto, pois demonstra que antes das intervenções o consumo alimentar de todos os grupos

era equivalente.

Na semana 11 o grupo FT apresentou peso corporal significativamente menor do que o

grupo FS.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

1 2 3 4 5 6 7 8

Semana

g ra

ção/

g P

C

LT LS FT FS

FIGURA 2 - Consumo de ração nas semanas de 1 a 8, segundo grupo experimental; Grupo

LT (n=13); LS (n=11); FT (n=14) e FS (n=13).

Vale ressaltar que esta análise foi realizada com os animais divididos nos quatro

grupos do estudo, com o objetivo de verificar possíveis diferenças. No entanto, ela também

foi realizada dividindo-se os animais em apenas dois grupos, Lipectomia (L) e Falso-

Operado (F), visto que seria este o modo pelo qual eles seriam tratados após a cirurgia –

período em que qualquer diferença que houvesse, tanto no consumo de ração quanto no peso

corporal dos animais, ocorreria em função do procedimento cirúrgico. Esta distinção no

tratamento estatístico foi realizada, portanto, apenas na semana 9, após a cirurgia. Na

semana 10 eles voltaram a ser analisados em quatro grupos distintos.

A FIGURA 3 apresenta os dados obtidos no consumo de ração das semanas 8, pré-

cirurgia, e na semana 9, pós-cirurgia, com os animais divididos nos dois grupos

experimentais. Conforme dito anteriormente, na semana 8 não houve diferença no consumo

alimentar entre os grupos (p=0,8). Ao compararmos o consumo alimentar dos animais na

semana 8 com seu consumo na semana 9, houve uma diminuição significativa no consumo

34

alimentar tanto intragrupos (p=0,00) como intergrupos (p=0,00). Já na semana 9, o grupo L

apresentou consumo alimentar significativamente maior (0,041 ± 0,06 g ração/g peso

corporal) em comparação ao grupo F (0,037 ± 0,02 g ração/g peso corporal, p=0,02).

FIGURA 3 – Consumo de ração nas semanas 8 e 9, após a lipectomia, segundo grupo

experimental; Grupo L (n=17); Grupo F (n=14); * p=0,00 para os grupos L e F na semana 8

quando comparados à semana 9 e # p=0,02 para o grupo L em comparação ao grupo F.

Na semana 10 os animais foram novamente divididos em seus grupos de origem (LT,

LS, FT e FS) e não foi observada diferença significativa no consumo alimentar entre os

grupos (p>0,8).

6.2 Peso Corporal

Assim como no consumo de ração, não foi observada diferença significativa de peso

(p≥0,99) entre os grupos até a semana 8 (FIGURA 4). Esse dado demonstra, novamente, que

antes das intervenções os grupos experimentais apresentavam comportamento semelhante.

35

0

100

200

300

400

500

600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Semana

Pes

o C

orp

oral

(gr

amas

)

LT LS FT FS

FIGURA 4 – Peso corporal, segundo grupo experimental; Grupo LT (n=8); LS (n=9); FT

(n=10) e FS (n=8).

Nas semanas 9, 10 e 11 não foram observadas diferenças significativas, sendo o peso

corporal médio final do grupo LT 493,5 ± 41,7 gramas, do grupo LS 514,7 ±56,1 gramas, do

grupo FT 494,6 ± 36,4 gramas e do grupo FS 517,8 ± 44,1 gramas .

6.3 Gordura da Carcaça

A quantidade de gordura da carcaça não foi diferente entre os grupos (p>0,05), tendo

sido retiradas, em média, 5,2 ± 2,9 gramas do grupo LT e 4,3 ±1,6 gramas do grupo LS. Em

porcentagem de gordura corporal foram retiradas 16,5 ±7,2% do grupo LT e 13,8 ±4,5% do

grupo LS (FIGURA 5).

36

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1

g lip

ídio

/g c

arca

çaLT LS FT FS

FIGURA 5 – Conteúdo lipídico da carcaça, segundo grupo experimental (p>0,9); Grupo LT

(n=10); LS (n=8); FT (n=8) e FS (n=10).

6.4 Teste Oral de Tolerância à Glicose (OGTT)

No OGTT pré-intervenções (FIGURA 6), realizado na semana 9, não foram

observadas diferenças significativas na área abaixo da curva entre os grupos (p>0,1). Este

dado confirma, mais uma vez, a homogeneidade entre os grupos antes das intervenções.

37

0

50

100

150

0 10 20 30 60 90 120

Tempo (minutos)

Glic

emia

(m

g/dL

)

LT LS FT FS

FIGURA 6 - Teste oral de tolerância à glicose pré-intervenções (OGTT 1), segundo grupo

experimental; Grupo LT (n=6); LS (n=7); FT (n=8) e FS (n=6).

No OGTT pós-intervenções (FIGURA 7) o grupo LS apresentou glicemia

significativamente maior aos 10 e 20 minutos (p<0,02), quando comparado ao grupo FS, e

aos 30 e 60 minutos, quando comparado aos grupos LT (p<0,03) e FT (p<0,04).

FIGURA 7 – Teste oral de tolerância à glicose pós-intervenções (OGTT 2); de acordo com

grupo experimental; Grupo LT (n=7); LS (n=8); FT (n=7) e FS (n=8); * p<0,02 LS

comparado ao FS; # LS comparado aos grupos LT (p<0,03) e FT (p<0,04).

38

Não foi observada diferença significativa na área abaixo da curva pré-intervenções

(p≥0,6; LT-2810±247,9; LS-3174,2±411,6; FT-2978,2±488,0 e FS-2984,4±566,4). A

FIGURA 8 mostra os resultados obtidos na análise da área baixo da curva pós-intervenções.

O grupo LS apresentou maior área quando comparada ao grupo-controle FS (p=0,033).

FIGURA 8 – Área abaixo da curva (AUC) pós-intervenções, de acordo com grupo

experimental. Grupo LT (n=7); LS (n=8); FT (n=7) e FS (n=8); * p<0,033 LS comparado ao

FS.

6.5 Glicemia de Jejum

Na TABELA 6 estão presentes os valores de glicemia de jejum pré e pós-intervenções.

Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos (p≥0,45).

TABELA 6 – Glicemia de jejum pré e pós-intervenções, segundo grupo experimental;

Grupo LT (n=7); LS (n=8); FT (n=7) e FS (n=8).

39

6.6 Insulinemia de Jejum

Os grupos LT e FT apresentaram insulinemia de jejum significativamente menor

quando comparados, respectivamente, aos grupos LS (p=0,000 e p=0,004) e FS (p=0,001 e

p=0,008).

FIGURA 9 – Insulina de jejum pós-intervenções, segundo grupo experimental; Grupo LT

(n=10); LS (n=12); FT (n=12) e FS (n=9); * LT comparado aos grupos LS e FS e # FT

comparado aos grupo LS e FS.

Ao corrigir os valores de insulina de jejum pelo peso corporal, o grupo LT

permaneceu com menor insulina por grama de peso quando comparado aos grupos LS

(p=0,031) e FS (p=0,023), porém não foi observada diferença significativa entre o grupo FT

em relação aos demais (FIGURA 10).

40

FIGURA 10 – Insulina de Jejum (uUI/mL) corrigida pelo peso corporal (gramas), segundo

grupo experimental; Grupo LT (n=10); LS (n=12); FT (n=12) e FS (n=9); * LT comparado

aos grupos LS e FS.

6.7 Índice HOMA

No Índice HOMA–IR (FIGURA 11) os grupos LT e FT apresentaram menor

resistência à insulina quando comparados aos grupos LS (p=0,007) e FS (p=0,003),

respectivamente. Já o Índice HOMA – %S demonstrou que o grupo LT apresentou melhor

sensibilidade à insulina quando comparado aos demais grupos (p≤0,04, FIGURA 12).

41

FIGURA 11 – Índice HOMA-IR, segundo grupo experimental; Grupo LT (n=10); LS

(n=12); FT (n=12) e FS (n=9); * LT comparado ao grupo LS e # FT comparado ao grupo FS.

FIGURA 12 – Índice HOMA %S, segundo grupo experimental; Grupo LT (n=10); LS

(n=12); FT (n=12) e FS (n=9); * LT comparado aos demais grupos.

42

6.8 Consumo de Oxigênio

Não foram observadas diferenças significativas pré ou pós-intervenções entre os

grupos (TABELA 7, p≥0,3).

TABELA 7 – Consumo de oxigênio pré e pós-intervenções, segundo grupo experimental;

Grupo LT (n=8); LS (n=10); FT (n=10) e FS (n=8).

6.9 Expressão Gênica – curvas de dissociação

Abaixo estão presentes as curvas de dissociação que demonstram que foi amplificado

apenas um produto.

FIGURA 13 – Curvas de dissociação do housekeeping HPRT à esquerda e do PPARα no

músculo esquelético gastrocnêmio à direita.

43

FIGURA 14 - Curvas de dissociação do PPARγ no tecido adiposo epididimal à esquerda e

do PPARγ no músculo esquelético gastrocnêmio à direita.

6.10 Expressão Gênica da PPARα

Não foram observadas diferenças significativas na expressão gênica da PPARα no

músculo esquelético gastrocnêmio (LT - 1,99±1,6 unidade relativa; LS - 1,17±1,0 unidade

relativa; FT - 2,01±1,5 unidade relativa e FS - 1,51±1,2 unidade relativa; p≥0,7).

6.11 Expressão Gênica da PPARγ

Foi observada diferença significativa na expressão gênica do PPARγ no tecido adiposo

epididimal (FIGURA 15). O grupo LS apresentou maior expressão quando comparado ao

grupo FT (p=0,03) e o grupo LT apresentou maior expressão quando comparado ao grupo

LS (p= 0,04).

44

FIGURA 15 – Expressão gênica do PPARγ no tecido adiposo epididimal, segundo grupo

experimental; Grupo LT (n=3); LS (n=4); FT (n=3) e FS (n=4); * LT comparado ao LS e FT

e # FS comparado ao LS e FT.

O grupo LT apresentou expressão gênica do PPARγ no músculo esquelético

gastrocnêmio significativamente menor quando comparado ao grupo FS (p=0,05, FIGURA

16).

45

FIGURA 16 – Expressão gênica do PPARγ no músculo esquelético gastrocnêmio, segundo

grupo experimental; Grupo LT (n=5); LS (n=5); FT (n=4) e FS (n=5); * LT comparado ao

FS.

6.12 Expressão Gênica da TNF-α

O grupo LS apresentou expressão gênica significativamente maior do TNF-α (p< 0,05)

quando comparado ao grupo LT e, apresentou uma forte tendência quando comparado aos

grupos FT (p=0,067) e FS (p=0,07).

46

FIGURA 17 – Expressão gênica do TNF-α no músculo esquelético gastrocnêmio, segundo

grupo experimental; Grupo LT (n=4); LS (n=4); FT (n=3) e FS (n=3); * LS comparado ao

LT.

6.13 Expressão Protéica PGC-1α

Conforme pode ser observado na FIGURA 18, a proteína PGC1 (peso molecular de 91

kDa) apresentou maior expressão no grupo LS em relação ao grupo FS (19%). Já no grupo

LT sua expressão mostrou-se diminuída (38%) em relação ao grupo LS.

Inferior às bandas da proteína PGC-1α encontram-se as bandas dos géis, as quais não

apresentaram diferença estatística entre os grupos, mostrando que os poços de todos os

grupos foram carregados com massas iguais de proteína total.

91 kDa

LT LS FT FS

47

FIGURA 18 – Expressão protéica da PGC-1α no músculo esquelético gastrocnêmio,

segundo grupo experimental; Grupo LT (n=8); LS (n=5); FT (n=5) e FS (n=8); * LS

comparado ao LT e # LS comparado ao FS.

7 DISCUSSÃO

De acordo com os resultados obtidos até a semana 8, os animais não apresentaram

diferença significativa no consumo de ração (FIGURA 2), peso corporal (FIGURA 4),

OGTT 1 (FIGURA 6) e glicemia de jejum (TABELA 2) pré-intervenções. Estes resultados

demonstram que os grupos estavam homogêneos antes da cirurgia e que alterações em

algum desses parâmetros, após esse período, podem ter sido em decorrência das

intervenções realizadas – lipectomia e treinamento.

Na semana 9, após a lipectomia, os dois grupos L (lipectomia) e F (falso-operado)

apresentaram menor consumo alimentar quando comparados à semana anterior. O grupo L

apresentou uma queda de 20% do seu aporte energético na semana 9 em comparação à

semana 8, enquanto o grupo F apresentou uma queda de 27%. Já na semana 9, após a

lipectomia, o grupo L apresentou consumo alimentar 11% maior quando comparado ao

grupo F. Ao contrário do observado em nosso estudo, MAUER, HARRIS et al. (2001), em

sua revisão da literatura sobre lipectomia, relataram que ela ocasiona uma recuperação

compensatória do tecido retirado sem um aumento no consumo energético. Corroborando

nosso estudo, SHI, STRADER, WOODS e SEELEY (2007) realizaram a retirada de parte

48

do tecido inguinal e verificaram que ratos machos wistar possuem seu consumo energético

aumentado após a lipectomia. No entanto, este maior consumo alimentar não foi observado

por todos. BUENO, OYAMA, ESTADELLA, HABITANTE, BERNARDES, RIBEIRO e

OLLER DO NASCIMENTO (2005) realizaram a retirada de parte do tecido adiposo

epididimal e retroperitoneal de ratos machos wistar. Não foram observadas quaisquer

diferenças no consumo alimentar entre os grupos, sendo que uma semana após a cirurgia, o

peso corporal do grupo lipectomizado foi significativamente menor do que o do grupo falso-

operado e permaneceu deste modo por trinta dias após a cirurgia.HAUSMAN, LU et al.

(2004), assim como em nosso estudo, realizaram a retirada bilateral do tecido adiposo

epididimal de ratos machos wistar e verificaram uma diminuição significativa do consumo

alimentar e do peso corporal no grupo lipectomizado até três dias após a cirugia. Após este

período os valores encontrados se equipararam aos do grupo-controle. Já no estudo de

HARRIS, HAUSMAN e BARTNESS (2002) no qual foi realizada a retirada de tecido

adiposo epididimal, os autores também relataram peso corporal significativamente menor do

grupo lipectomizado na semana seguinte à lipectomia. No entanto, esta diferença de peso foi

recuperada em apenas três dias após a cirurgia. Deste modo, assim como em nosso estudo,

uma semana após a cirurgia, já não havia diferença de peso corporal entre os grupos. Os

dados de consumo alimentar não foram divulgados.

A quantidade de tecido adiposo retirado – em média 1,0% do peso corporal – não

apresentou diferença significativa entre os grupos. Os estudos que realizaram lipectomia

diferem quanto à quantidade de gordura corporal retirada: HAUSMAN, LU et al. (2004)

relatam a retirada de aproximadamente 0,9%; HARRIS, HAUSMAN et al. (2002)

realizaram a retirada de aproximadamente 1,4%; KIM, KIM et al. (1999) retiraram cerca de

1%; BARZILAI, SHE et al. (1999) realizaram a retirada de aproximadamente 1,7%;

GABRIELY, MA et al. (2002) retiraram, em média, 3,3%. Ao analisarmos a gordura da

carcaça, não obtivemos diferença significativa entre os grupos.

LACY & BARTNESS (2005) relatam que a lipectomia leva a um aumento

compensatório na massa do tecido não retirado em diversas espécies, inclusive ratos, que irá

resultar na restauração do conteúdo de gordura corporal. Estes dados nos levam a acreditar

que, em nosso estudo, houve uma compensação ou uma regeneração do tecido adiposo

retirado. De fato, MAUER, HARRIS et al. (2001) relatam que o grau de recuperação ou

49

compensação do tecido retirado varia de acordo com o depósito retirado e pode ocorrer em

algumas semanas ou meses, sendo a compensação muito mais comum.

MAUER & BARTNESS (1994) relataram em seu estudo que a retirada de parte do

tecido adiposo epididimal de hamsters siberianos resultou em aumento compensatório no

tecido adiposo inguinal e retroperitoneal. BUENO, OYAMA et al. (2005) também não

conseguiram observar uma regeneração do tecido adiposo retirado, tanto retroperitoneal

quanto epididimal. No entanto, como não houve diferença no conteúdo lipídico da carcaça,

os autores sugeriram ter ocorrido uma compensação do tecido retirado. Nossos resultados

estão de acordo com essa premissa, uma vez que, apesar da grande quantidade de gordura

retirada em nosso estudo, não foi verificada diferença na gordura da carcaça dos animais ao

final do experimento, ou seja, 2 semanas após a cirurgia. Este período de compensação

encontrado em nosso estudo mostrou-se muito curto quando comparado a outros estudos,

que demoraram em média de 4 a 16 semanas para encontrar esse resultado (LACY &

BARTNESS, 2005). Conforme relatamos anteriormente, uma vez que o grupo

lipectomizado apresentou consumo alimentar cerca de 11% maior na semana seguinte à

lipectomia, acreditamos que, de algum modo, esse procedimento ocasionou alteração

metabólica que resultou no aumento do consumo alimentar do grupo, facilitando a

compensação no crescimento do tecido adiposo retirado. Ou seja, a retirada de parte do

tecido adiposo epididimal gerou mecanismo compensatório que resultou no aumento do

consumo energético deste grupo e estimulou a recuperação do tecido adiposo nos grupos

lipectomizados.

Um possível mecanismo pelo qual essa alteração pode ter ocorrido seria pela ação da

leptina. Existe alta correlação entre as concentrações plasmáticas de leptina e a massa de

tecido adiposo (NEGRAO & LICINIO, 2000; SPEAKMAN, STUBBS e MERCER, 2002;

KOERNER, KRATZSCH et al., 2005). Deste modo, quão maior a quantidade de tecido

adiposo, maior a quantidade de leptina produzida e liberada na circulação (CONSIDINE &

CARO, 1996). Deste modo, a retirada de parte do tecido adiposo epididimal pode ter

ocasionado uma diminuição nas concentrações circulantes de leptina que, por sua vez, pode

ter desencadeado uma resposta compensatória, como o aumento do consumo energético

observado em nosso estudo.

De fato, ROSENBAUM, NICOLSON, HIRSCH, MURPHY, CHU e LEIBEL (1997),

CONSIDINE & CARO (1996) e OSTLUND, YANG, KLEIN e GINGERICH (1996)

50

relataram que a perda ou ganho de peso corporal parecem provocar, respectivamente, a

diminuição e o aumento das concentrações de leptina. Em homens obesos, a perda de 10%

do peso corporal resultou na redução de 53% da leptina sérica (CONSIDINE & CARO,

1996), enquanto o ganho de 10% do peso corporal causou o aumento de 300% deste

marcador (KOLACZYNSKI, OHANNESIAN, CONSIDINE, MARCO e CARO, 1996).

Outro fator que pode ter influenciado no aumento da velocidade de compensação da

gordura seria a dieta hiperlipídica consumida pelos animais. Este padrão alimentar pode ter

estimulado a diferenciação e a proliferação de adipócitos. Estudo verificou que ratos

submetidos à dieta hiperlipídica apresentaram estimulação na via de sinalização dos

receptores acoplados à proteína G que parece estimular a diferenciação dos adipócitos, tanto

em ratos quanto em humanos (GOTOH, HONG, IGA, HISHIKAWA, SUZUKI, SONG,

CHOI, ADACHI, HIRASAWA, TSUJIMOTO, SASAKI e ROH, 2007).

Outro possível efeito da dieta hiperlipídica acentuando os efeitos deletérios da

obesidade seria através da estimulação da infiltração de macrófagos no tecido adiposo.

Estudo realizado em ratos submetidos a dieta hiperlipídica (45% de gordura) verificou que

esta dieta possui a capacidade de aumentar a infiltração de macrófagos em,

aproximadamente, 55% (WEISBERG, MCCANN, DESAI, ROSENBAUM, LEIBEL e

FERRANTE, 2003). Este dado se torna relevante a partir do momento em que evidências

sugerem que a obesidade é um estado inflamatório crônico de intensidade leve (ITO,

SUGANAMI, MIYAMOTO, YOSHIMASA, TAKEYA, KAMEI e OGAWA, 2007),

resultante principalmente da hipertrofia do adipócito e resultante, também, do aumento da

atividade de macrófagos residentes no tecido adiposo e de macrófagos infiltrados (GIL,

CUBI e AGUILERA, 2007). Estudos anteriores já demonstraram que, na obesidade, o tecido

adiposo sofre uma acentuada infiltração de macrófagos (BERG & SCHERER, 2005) e que

esta infiltração precede ou coincide com o início da resistência à insulina em ratos obesos

(XU, BARNES, YANG, TAN, YANG, CHOU, SOLE, NICHOLS, ROSS, TARTAGLIA e

CHEN, 2003).

O mecanismo pelo qual ocorre o recrutamento da infiltração de macrófagos no tecido

adiposo ainda não está bem estabelecido, mas a MCP-1 (macrophage chemoattractant

protein-1) parece exercer papel fundamental (YU, KIM, KWON e KAWADA, 2006). Esta

quimiocina é secretada principalmente por pré-adipócitos e por adipócitos maduros

(GERHARDT, ROMERO, CANCELLO, CAMOIN e STROSBERG, 2001) e sua expressão

51

aumenta em animais obesos (WEISBERG, MCCANN et al., 2003) e em ratos submetidos a

dieta hiperlipídica – aumento este mais severo no tecido adiposo epididimal, em comparação

ao inguinal (CHEN, MUMICK, ZHANG, LAMB, DAI, WEINGARTH, MUDGETT,

CHEN, MACNEIL, REITMAN e QIAN, 2005). Ratos com deficiência de MCP-1 que

receberam dieta hiperlipídica apresentaram alterações no metabolismo glicolítico e lipídico

e, quando comparados ao grupo controle, eles também se mostraram menos suscetíveis a

desenvolverem obesidade induzida pela dieta (RULL, ESCOLA-GIL, JULVE, ROTLLAN,

CALPE-BERDIEL, COLL, ARAGONES, MARSILLACH, ALONSO-VILLAVERDE,

CAMPS, BLANCO-VACA e JOVEN, 2007).

Além de seu papel na infiltração de macrófagos, a MCP-1 parece estar intimamente

relacionada à hipertrofia de adipócitos (ITO, SUGANAMI et al., 2007). DIGIROLAMO,

FINE, TAGRA e ROSSMANITH (1998) estudaram as diferenças regionais no crescimento

e na celularidade do tecido adiposo em ratos wistar e verificaram que o aumento da massa

do tecido adiposo epididimal se dá, principalmente, por hipertrofia dos adipócitos. Deste

modo, o provável aumento da adiposidade pode estar relacionado com o aumento da

secreção de MCP-1 no tecido adiposo. Sendo assim, a dieta hiperlipídica pode ter acarretado

aumento na expressão de MCP-1 no tecido adiposo epididimal dos animais lipectomizados,

ocasionando a hipertrofia dos adipócitos resultantes e, também, estimulando a infiltração de

macrófagos que, por sua vez, irão secretar citocinas e quimiocinas que agravam o quadro da

obesidade como, por exemplo, interleucina 6 e TNF-α (fator de necrose tumoral-α)

(ZEYDA, FARMER, TODORIC, ASZMANN, SPEISER, GYORI, ZLABINGER e

STULNIG, 2007).

Após o treinamento, foram observadas diferenças significativas do teste oral de

tolerância à glicose, sendo que o grupo LS apresentou pior tolerância à glicose quando

comparado ao grupo FS. Este resultado encontrado em nosso estudo contraria outros dados

da literatura onde foi verificado que a retirada de parte do tecido adiposo visceral ocasiona

melhora no metabolismo glicolítico (BARZILAI, SHE et al., 1999; KIM, KIM et al., 1999;

GABRIELY, MA et al., 2002; HAUSMAN, LU et al., 2004). Interessantemente, este grupo

apresentou maior expressão gênica do TNF-α, citocina pró-inflamatória altamente

correlacionada com o aparecimento da resistência à insulina. Ela é expressa em maior

quantidade no músculo esquelético de homens com resistência à insulina e diabetes, quando

comparados à sujeitos sensíveis à insulina (SAGHIZADEH, ONG, GARVEY, HENRY e

52

KERN, 1996). No entanto, os mecanismos pelos quais esta citocina atua na resistência à

insulina ainda são desconhecidas.

JOVE, PLANAVILA, SANCHEZ, MERLOS, LAGUNA e VAZQUEZ-CARRERA

(2006) estudaram o efeito in vitro da gordura saturada na expressão do TNF-α e verificaram

que houve um aumento de até 2,5 vezes em sua expressão gênica e protéica e este aumento

estava inversamente correlacionado com as concentrações de GLUT4 e a captação de

glicose. Esta diminuição da concentração de TNF-α com concomitante aumento da

concentração de GLUT4 já havia sido verificado por KIRWAN & DEL AGUILA (2003).

BORST, LEE, CONOVER, SHEK E BAGBY (2004) realizaram a administração de um

anti-TNF-α, composto que neutraliza o efeito desta citocina, em ratos Sprague-Dawley, e

verificaram que a administração deste composto resultou em aumento de mais 60% na

transporte muscular de glicose.

Um dos possíveis mecanismos pelos quais o TNF-α exerceria um efeito na resistência

à insulina seria diminuindo a sinalização da insulina. Evidências sugerem que o TNF-α ativa

quinases de serina/treonina que atuam no receptor de insulina e na IRS-1, ocasionando

prejuízo na ligação desta proteína com o receptor de insulina e inibindo a propagação do

sinal (YU & GINSBERG, 2005).

Além de seu efeito no transporte de glicose e na cascata de sinalização da insulina o

TNF-α parece regular a produção de algumas adipocinas, alterando sua secreção. Estudos

verificaram que a esta citocina possui a capacidade de diminuia expressão gênica da

adiponectina e aumentar a expressão das interleucinas 1 e 6 (RUAN, HACOHEN, GOLUB,

VAN PARIJS e LODISH, 2002). Atuando, mais uma vez, no desenvolvimento do quadro de

resistência à insulina.

No entanto, como grupo o LT não apresentou este aumento na expressão gênica do

TNF-α pudemos constatar que o treinamento exerceu um efeito protetor neste grupo. Há

evidências de que o treinamento aeróbio possui um efeito anti-inflamatório. De fato, alguns

estudos já verificaram que o treinamento aeróbio diminui tanto as concentrações plasmáticas

de TNF-α (KADOGLOU, PERREA, ILIADIS, ANGELOPOULOU, LIAPIS e ALEVIZOS,

2007) quanto sua expressão protéica (FERRIER, NESTEL, TAYLOR, DREW e

KINGWELL, 2004). O treinamento no grupo LT se mostrou efetivo em alguns momentos

do OGTT, nos quais este grupo apresentou, inclusive, glicemia significativamente menor

que a do grupo LS. Deste modo, podemos observar que o treinamento de fato exerceu um

53

efeito protetor no grupo LT. Há evidências na literatura de que o treinamento aeróbio

moderado pode melhorar a tolerância à glicose, a sensibilidade à insulina e a ação da

insulina no transporte da glicose no músculo esquelético (PEREIRA & LANCHA, 2004;

HOLLOSZY, 2005). Ao observarmos os resultados obtidos na concentração de insulina

tanto absoluta quanto relativa, verificamos que o treinamento aeróbio de curto-prazo

ocasionou uma significativa redução nas concentrações de insulina circulante nos grupos

treinados LT e FT, quando comparados aos grupos sedentários LS e FS. Podemos associar

esta potencialização da ação da insulina no transporte de glicose no músculo esquelético

após o treinamento ao aumento da expressão de GLUT-4 (CHIU, CHOU, CHO, HO, IVY,

HUNT, WANG e KUO, 2004), às respostas adaptativas de enzimas envolvidas na oxidação

de fosforilação da glicose (PEREIRA & LANCHA, 2004) e ao aumento da atividade da

AMPK, que promove a ampliação da sensibilidade à insulina através do aumento da

oxidação de gordura (GREENBERG & OBIN, 2006).

Em associação ao exposto, ao analisarmos os resultados obtidos no Índice HOMA –

modelo matemático que nos permite estimar a resistência à insulina, sensibilidade à insulina

e função das células beta – verificamos que o grupo LT e o grupo FT apresentaram menor

resistência à insulina quando comparados ao grupo LS e FS, respectivamente. Tais

resultados mais uma vez indicam o efeito do treinamento aeróbio de curto prazo na ação da

insulina, conforme já demonstrado em outros estudos (HOUMARD, COX et al., 2000;

TERADA, YOKOZEKI et al., 2001; TANNER, KOVES et al., 2002; BLACK, MITCHELL

et al., 2005; WINNICK, SHERMAN et al., 2007). Um dado interessante encontrado em

nosso estudo foi que o grupo LT apresentou melhor sensibilidade à insulina quando

comparado aos demais grupos. Este é o primeiro estudo em que se demonstra um possível

efeito sinergístico do treinamento e da lipectomia na sensibilidade à insulina.

Em nosso estudo não foram observadas diferenças significativas no consumo de

oxigênio pré e pós-intervenções. Foi sugerido que a lipectomia pudesse diminuir o gasto

energético de repouso, facilitando assim o aumento do peso corporal. No entanto, os dados

presentes na literatura são conflitantes. LAMBERT, LAMBERT, HUDSON, STEYN,

LEVITT, CHARLTON e NOAKES (2001) não verificaram quaisquer alterações no

consumo de oxigênio decorrente da retirada de tecido adiposo subcutâneo em mulheres

eutróficas. Em contrapartida, estudo de D'ANDREA, GRELLA, RIZZO, GRELLA,

NICOLETTI, BARBIERI e PAOLISSO (2005) observaram aumento na taxa do

54

metabolismo de repouso, em mulheres obesas, após a retirada de grande volume de tecido

adiposo subcutâneo. Em ratos, HAUSMAN, LU et al. (2004) verificaram uma pequena

redução (2,4%) do gasto energético em decorrência da lipectomia na quarta semana após a

cirurgia. Deste modo, mais estudos precisam ser conduzidos para verificarmos o efeito da

retirada de parte do tecido adiposo na taxa metabólica basal e se este efeito é dependente da

quantidade de tecido retirada e/ou do depósito retirado.

Com relação ao treinamento, há indício de que ele é capaz de aumentar a taxa de

metabolismo de repouso. De acordo com POEHLMAN & HORTON (1989) os mecanismos

responsáveis por tal efeito incluem: maior atividade do sistema nervoso simpático, aumento

da atividade de hormônios da tireóide ou ainda, aumento do fluxo de substratos e aumento

na síntese de proteínas. No entanto, apesar de alguns trabalhos terem observado este

aumento (POEHLMAN, MELBY e GORAN, 1991; SJODIN, FORSLUND,

WESTERTERP, ANDERSSON, FORSLUND e HAMBRAEUS, 1996) outros não

verificaram este mesmo resultado (BROEDER, BURRHUS, SVANEVIK e WILMORE,

1992; WILMORE, STANFORTH, HUDSPETH, GAGNON, DAW, LEON, RAO,

SKINNER e BOUCHARD, 1998). Um fator que pode ter contribuído para o resultado

encontrado em nosso estudo seria decorrente do tempo de mensuração após a última sessão

de treino – realizamos esta análise 48 horas após a última sessão. De fato, estudos anteriores

também não verificaram aumento da taxa de metabolismo de repouso em 19 (MELANSON,

SHARP, SEAGLE, DONAHOO, GRUNWALD, PETERS, HAMILTON E HILL, 2005) ou

22 horas após a última sessão (HUNTER, SEELHORST E SNYDER, 2003). No entanto,

DOLEZAL, POTTEIGER, JACOBSEN E BENEDICT (2000) e WILMORE, STANFORTH

et al. (1998) relatam ter observado este aumento até 48 horas após a última sessão de

treinamento aeróbio. Deste modo, nosso estudo está de acordo com estudos anteriores que

não observaram aumento da taxa de metabolismo de repouso 48 horas após a última sessão

de treino.

Não houve diferença significativa na expressão gênica da PPARα no tecido muscular

esquelético e, nesse sentido, nossos dados vão ao encontro dos relatados por HELGE,

BENTLEY, SCHJERLING, WILLER, GIBALA, FRANCH, TAPIA-LALIENA,

DAUGAARD e ANDERSEN (2007), que não verificaram alteração na expressão protéica e

gênica da PPARα em sujeitos submetidos a doze semanas de dieta hiperlipídica e/ou cinco

dias de treinamento de força. Já KANNISTO, CHIBALIN, GLINGHAMMAR, ZIERATH,

55

HAMSTEN e EHRENBORG (2006) verificaram em seu estudo que quatro semanas de dieta

hiperlipídica (55% de gordura) ocasionaram um aumento significativo na expressão da

PPARα no músculo esquelético, quando comparado ao grupo controle que recebeu ração

comercial.

Não encontramos dados na literatura sobre a expressão gênica do PPARα após a

lipectomia. Deste modo, este é o primeiro relato de que a lipectomia não ocasiona alterações

na expressão gênica do PPAR α no músculo esquelético de ratos submetidos à dieta

hiperlipídica.

Com relação à expressão gênica do PPARγ, sua expressão estava significativamente

reduzida no músculo esquelético do grupo LT quando comparado ao grupo controle, FS.

Este dado contradiz os resultados presentes na literatura, que apontam que uma maior

atividade da PPARγ no músculo esquelético estaria relacionada a uma melhora na ação da

insulina (DI GREGORIO, YAO-BORENGASSER, RASOULI, VARMA, LU, MILES,

RANGANATHAN, PETERSON, MCGEHEE e KERN, 2005; JUURINEN, KOTRONEN

et al., 2008). Conforme demonstrado anteriormente o grupo LT estava com a sensibilidade à

insulina significativamente maior que o grupo FT. Deste modo, nossos dados contrapõem os

estudos que verificaram que verificaram que o aumento da expressão do PPARγ, no

músculo esquelético, estaria relacionado com melhor sensibilidade à insulina.

Com relação ao tecido adiposo, observamos que o grupo LT apresentou maior

expressão gênica da PPARγ quando comparado aos grupos LS e FT. Este dado demonstra

que o treinamento não foi capaz de impedir o aumento da adipogênese e lipogênese no TAV

desses animais, o que explicaria também a compensação do tecido adiposo retirado nesse

grupo. De fato, há indícios na literatura de que uma maior atividade da PPARγ também está

relacionada a aumento do peso e da adiposidade corporal (HARRINGTON, BRITT et al.,

2007; NADEAU, EHLERS et al., 2007). Deste modo, talvez esta maior expressão do

PPARγ no tecido adiposo do grupo LT e FS signifique que estes grupos estejam

desenvolvendo maior adiposidade quando comparados aos demais. Esta hipótese está de

acordo com o estudo de BUENO, OYAMA et al. (2005) que verificaram que a lipectomia

ocasionou um aumento da lipogênese tanto no local onde a gordura foi retirada quanto na

carcaça como um todo.

Como o grupo LT apresentou maior expressão do que o LS, pode-se sugerir que esta

seria uma resposta adaptativa protetora do organismo do animal impedindo uma possível

56

diminuição nos estoques de gordura e criando um mecanismo através do qual a deposição de

gordura seria estimulada. De fato diversos autores defendem a idéia de que o organismo

animal tende a permanecer em equilíbrio tanto com relação ao peso quanto à adiposidade

corporal, deste modo, qualquer tentativa de tirá-lo deste equilíbrio, seja pela restrição

alimentar ou pela retirada do tecido adiposo, ocasionaria a ativação de respostas que teriam

o objetivo de contrapor esse efeito (KENNEDY, 1953; MICHEL & CABANAC, 1999).

Tais respostas compensatórias são controladas pelo cérebro, uma vez que o hipotálamo

recebe informações sobre a quantidade de tecido adiposo estocado (THORBURN &

PROIETTO, 1998) através da leptina (NEGRAO & LICINIO, 2000).

Outro fator que pode explicar a diminuída expressão do PPARγ no grupo LS é a pior

tolerância à glicose apresentada por este grupo. Acreditamos que essa piora na tolerância à

glicose teria ocasionado uma diminuição na expressão gênica do PPARγ, uma vez que já foi

relatado que a atividade desta proteína está intimamente relacionada com a melhora na

tolerância à glicose (DI GREGORIO, YAO-BORENGASSER et al., 2005; JUURINEN,

KOTRONEN et al., 2008) e a diminuição na atividade dela está relacionada com resistência

à insulina e diabetes tipo 2 (BALAKUMAR, ROSE et al., 2007).

Além disso, estudos experimentais têm demonstrado que a PPARγ tem a capacidade

de estimular a apoptose dos adipócitos maiores e a diferenciação de adipócitos menores que,

por sua vez, são mais sensíveis à ação da insulina (WAJCHENBERG, 2000). Deste modo,

uma maior expressão de PPARγ no tecido adiposo destes animais pode estar relacionada a

um aumento da sensibilidade à insulina no grupo LT. No entanto, esta hipótese não se aplica

ao grupo controle, que apresentou diminuída sensibilidade à insulina quando comparado ao

grupo LT.

Pelos resultados observados em nosso estudo, o treinamento por si só não foi capaz de

induzir respostas adaptativas na expressão da PPARγ. Talvez, assim como ocorrido no

consumo de oxigênio, os efeitos do treinamento nesta proteína tenham sido transitórios,

durando menos 48 horas. Corroborando esta hipótese, MAHONEY, PARISE, MELOV,

SAFDAR E TARNOPOLSKY (2005) demonstraram em seu estudo que o exercício (tanto

uma sessão quanto o treinamento) foi capaz de aumentar a expressão da PPARγ no músculo

esquelético de homens sedentários apenas 3 horas após a última sessão, mas não 48 horas

após.

57

Não foi observado, em nosso estudo, um aumento da expressão protéica da PGC-1α

em decorrência do treinamento. De fato, são controversos na literatura os efeitos do

treinamento físico na expressão de PGC-1α na musculatura esquelética (TUNSTALL,

MEHAN, WADLEY, COLLIER, BONEN, HARGREAVES e CAMERON-SMITH, 2002;

PILEGAARD, SALTIN et al., 2003; RUSSELL, LI et al., 2004). Isso pode ser explicado

pelos treinamentos utilizados nos estudos, que apresentam variações de toda ordem: de

intensidade, de tipos de exercícios, de duração da sessão e do protocolo de treinamento, e de

intervalo entre as sessões.

Uma possível hipótese para a obtenção deste resultado pode ser porque em nosso

estudo o sacrifício dos animais foi realizado 48 horas após a última sessão de treinamento.

Em função disso, as concentrações dessa proteína poderiam ter se normalizado. De fato, os

estudos que analisaram o efeito do treinamento aeróbio na expressão gênica e/ou protéica da

PGC-1α realizaram as análises até 24 horas após a última sessão de treinamento em ratos

(TAYLOR, LAMB, HURST, CHESSER, ELLINGSON, GREENWOOD, PORTER,

HERWAY e WINDER, 2005; SRIWIJITKAMOL, IVY, CHRIST-ROBERTS,

DEFRONZO, MANDARINO e MUSI, 2006); e 36 horas após a última sessão, em humanos

(KUHL, RUDERMAN, MUSI, GOODYEAR, PATTI, CRUNKHORN, DRONAMRAJU,

THORELL, NYGREN, LJUNGKVIST, DEGERBLAD, STAHLE, BRISMAR,

ANDERSEN, SAHA, EFENDIC e BAVENHOLM, 2006). Apesar de não termos observado

uma diferença na expressão gênica da PGC-1α no grupo treinado, foi demonstrado por

LEICK, WOJTASZEWSKI, JOHANSEN, KIILERICH, COMES, HELLSTEN, HIDALGO

e PILEGAARD (2007) que esta proteína não é necessária para as respostas adaptativas no

metabolismo aeróbio induzidas pelo treinamento físico na musculatura esquelética.

Baseando-se no exposto e nos dados do presente trabalho, é razoável sugerir que a

PGC-1α não é fundamental na musculatura esquelética para a ativação das vias metabólicas

supracitadas em decorrência do treinamento físico, uma vez que foi demonstrado neste

estudo que o treinamento de curto-prazo a que os animais foram submetidos foi capaz de

ocasionar uma melhora na ação da insulina.

Com relação à elevação da expressão protéica de PGC-1α na musculatura esquelética

encontrada no grupo LS, este parece ser o primeiro resultado na literatura apontando o efeito

de uma intervenção cirúrgica na regulação desta proteína.

58

RICHARDSON, KASHYAP, BAJAJ, CUSI, MANDARINO, FINLAYSON,

DEFRONZO, JENKINSON E MANDARINO (2005) demonstraram em seu estudo que

altas concentrações de AGL ocasionam diminuição da expressão gênica da PGC-1α. Logo,

uma hipótese para o resultado observado em nosso estudo seria a de que esta aumentada

expressão protéica possa estar relacionada a uma possível diminuição dos AGL circulantes

ocasionada pela lipectomia. Ou seja, ao retiramos parte do tecido adiposo epididimal dos

animais, houve uma diminuição do influxo de AGL, diminuindo a supressão causada por

eles na PGC-1α. E aumentando, assim, a sua expressão no músculo esquelético.

Surpreendentemente, este mesmo grupo, apresentou pior tolerância à glicose quando

comparado ao grupo controle – o que vai na contramão dos resultados obtidos por todos os

outros grupos pesquisa (SOYAL, KREMPLER et al., 2006; CRUNKHORN, DEARIE,

MANTZOROS, GAMI, DA SILVA, ESPINOZA, FAUCETTE, BARRY, BIANCO e

PATTI, 2007; WU & BOSS, 2007; DE FILIPPIS, ALVAREZ, BERRIA, CUSI,

EVERMAN, MEYER e MANDARINO, 2008). No entanto, o aumento na expressão de

PGC-1α no fígado está positivamente correlacionado ao desenvolvimento de intolerância à

glicose e diabetes tipo 2 em ratos (KOO, SATOH, HERZIG, LEE, HEDRICK,

KULKARNI, EVANS, OLEFSKY e MONTMINY, 2004). Deste modo, talvez, a lipectomia

ocasione uma resposta na regulação desta proteína semelhante a estes quadros.

Deste modo, os resultados encontrados em nosso estudo demonstram que a retirada

de parte do tecido adiposo epididimal dos animais ocasionou um aumento da expressão

protéica da PGC-1α, quando comparado ao grupo FS e acreditamos que este efeito se deve a

diminuição de AGL circulantes ocasionada pela cirurgia, além disso, existe a possibilidade

de que o aumento na expressão protéica esteja relacionado com a piora na tolerância à

glicose deste grupo.

8 CONCLUSÕES

Através dos resultados obtidos em nosso estudo concluímos que:

- A lipectomia ocasionou um aumento do consumo alimentar na semana seguinte a sua

realização, sem qualquer alteração do peso corporal. Além disso, não foram observadas

diferenças significativas na adiposidade corporal dos animais, sugerindo que este aumento

do consumo energético pode ter ocasionado maior deposição de gordura nestes grupos.

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- O treinamento aeróbio de curto prazo ocasionou melhora na sensibilidade à insulina,

mas não conseguiu prevenir o aumento da adiposidade nos grupos lipectomizados;

- A lipectomia ocasionou piora na tolerância à glicose possivelmente relacionada com

a aumentada expressão gênica de TNF-α observada neste grupo;

- Apresentamos evidências também de que a lipectomia em associação ao treinamento

teve um efeito sinergístico, ocasionando melhora na sensibilidade à insulina;

- A lipectomia não ocasionou alterações na expressão gênica da PPARα no músculo

esquelético dos animais;

- O grupo que realizou a lipectomia em associação ao treinamento e o grupo controle

apresentaram uma aumentada expressão gênica do PPARγ no tecido adiposo epididimal dos

animais, quando comparados aos grupos que realizaram apenas lipectomia e treinamento.

Este dado sugere que, talvez, estes grupos possam estar com uma maior estimulação da

lipogênese quando comparados aos demais grupos;

- O grupo lipectomizado e treinado apresentou menor expressão gênica da PPARγ no

músculo esquelético, quando comparado ao grupo controle;

- A lipectomia ocasionou aumento na expressão gênica da PGC-1α no tecido muscular

esquelético.

Por fim, pudemos verificar que tanto a regulação da lipectomia em associação ou não

treinamento se mostrou bastante complexa. A lipectomia ocasionou um aumento do

consumo alimentar que pode ter acarretado em um aumento da adipogênese neste grupo e,

quando em associação ao treinamento ocasionou melhora na sensibilidade à insulina. Além

disso, nosso trabalho apresentou dados novos, que ainda não haviam sido relatados na

literatura e, por isso, necessitam ser confirmados por trabalhos futuros. Deste modo, a

realização da lipectomia, em animais, parece sugerir alterações que podem ser conseguidas,

em humanos, através de uma dieta equilibrada e treinamento físico que, acima de tudo, não

colocam a vida do paciente em risco.

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